ויקירפואה - תרומות המשתמש [he]

בטא-גלקטוזידאז - Beta-galactosidase

2016-03-10T11:01:05Z

בן עמי סלע:

{{בדיקת מעבדה
|שם עברי={{רווח קשיח}}
|שם לועזי=β-galactosidase
|קיצור=β-gal, β-D-Galactoside galactohydrolase, lactase, Beta-galactosidase
|תמונה=
|כיתוב תמונה=
|מעבדה=[[כימיה בדם]]
|תחום=בירור [[מחלות אגירה]]
|יחידות מדידה=
|טווח ערכים תקין=בלויקוציטים-2.11-3.95 U/g protein, או מעל 1.56 ננומול/דקה/למיליגרם חלבון ; בבדיקת האנזים בפלזמה-≥5.0 nmol/h/mL ; בפיברובלסטים-מעל 7.11 ננומול'/דקה/מיליגרם חלבון.
|יוצר הערך=[[משתמש:בן עמי סלע|פרופ' בן-עמי סלע]]
|אחראי הערך=
}}
'''מטרת הבדיקה''': אבחון של GM1 gangliosidosis, מחלת Morquio B ו-galactosialidosis.

==תכונות האנזים β-galactosidase==

האנזים β-galactosidase (ידוע גם כ-β-gal), הוא אנזים הידרוליטי המקטלז את הביקוע של β-galactosides ליצירת מונו-סכרידים על ידי שבירת קשר גליקוזידי. β-galactosides הם מבנים סוכריים המכילים galactose, עם קשר גליקוזידי מעל מולקולת הסוכר. מצעים לאנזימים השונים מסוג β-galactosidase, כוללים את הגנגליוזיד GM1, לקטוז כמו גם lactosylceramides, וכן גליקופרואטינים. β-gal הוא אקסוגליקוזידאז המבקע את הקשר ה-β-גליקוזידי בין שייר גלקטוזה והמבנה האורגני אליו הוא קשור, וחיוניותו הפיזיולוגית באדם רבה.

תפקידו העיקרי של β-gal הוא כספק מפתח של אנרגיה בכך שהוא מבקע לקטוזה לגלקטוזה ולגלוקוזה. חשיבותו גם בהקשר של אי-סבילות ללקטוזה (lactose intolerance) באנשים הסובלים מחסר האנזים lactase, ביכולתו ליצור חלב ומוצרי חלב נוספים, חופשיים מלקטוזה. ל-β-gal ול-lactase יש פעילות דומה, ואמנם בתעשיית מוצר החלב מאפשרים לאלה הלוקים בחסר מולד של lactase לצרוך מוצרים אלה, על ידי טיפול תעשייתי של סוגי יוגורט וגבינות מסוימות ב-β-gal על מנת לבקע לקטוזה לפני צריכת פריטים אלה על ידי פלח האוכלוסייה החסר lactase. לאחרונה, נחקר האנזים β-gal כטיפול אפשרי לאי-סבילות ל-lactase, על ידי gene replacement therapy, בהחדרת הגן לאנזים זה ל-DNA, על מנת שאנשים החסרים lactase יוכלו לבקע לקטוזה בדרך החלופית (Salehi וחב' ב- Human Gene Therapy משנת 2009).

==המבנה של האנזים β-galactosidase:==

ל- β-galactosidaseיש הומולוגים אחדים בהסתמך על רצף חומצות האמינו שלו. אנזימים נוספים דוגמת β-glucosidase, 6-phospho-beta-galactosidase, β-mannosidase ו- lactase-phlorizin hydrolase הם בעלי מבנה דומה, אך יש להם כמובן פונקציות שונות. בין המעכבים את פעילות β-galactosidase, ניתן למנות את L-ribose, יוד (מעכב לא-תחרותי), ומעכבים תחרותיים כגון phenylthyl thio-beta-D-galactoside או PETG, D-galactonolactone, isopropyl thio-beta-D-galactoside או IPTG וכמובן גלקטוזה. β-galactosidase הוא אקסוגליקוזידאז שמבצע הידרוליזה של הקשר ה-β גליקוזידי הנוצר בין גלקטוזה לבין המבנה האורגני אליו הוא מחובר. האנזים β-galactosidase יכול לעשות הידרוליזה גם של סוכרים כמו fucose ו-arabinose, אך ביעילות נמוכה בהרבה. בחיידק E. coli הגן LacZ המקודד ל- β-galactosidase, נמצא כחלק מהמערכת המושרית lac operon, המשופעת בנוכחות לקטוזה כאשר רמות גלוקוזה נמוכות.

כבר בשנת 1970 דיווחו Fowler וחב' ב-J Biol Chem על ריצוף 1,024 חומצות האמינו של E. coli המופיעות במונומר של האנזים, (אנליזה של חומצות האמינו של אנזים זה באדם על פיFowler ו-Zabin מונה 1,170 חומצות אמינו לכל מונומר), ואילו המבנה התלת ממדי שלו פוענח ב-1994. מדובר באנזים הומו-טטרמרי בעל משקל מולקולארי של 464,000 עד 540,000 דלטון (Cohen ו-Mire משנת 1971), כאשר כל יחידה של האנזים שמשקלה המולקולארי 135,000 דלטון מורכבת מ-5 מקטעים (domains) בלתי-זהים במבנם, כאשר המקטע השלישי והמרכזי מכיל את האתר הפעיל (Jacobson וחב' ב-Nature משנת 1994). על פי Melcher ו-Messe משנת 1973, לכל מונומר מכיל אתר פעיל שיכול להיות פעיל באופן בלתי תלוי במונומרים אחרים.

האתר הפעיל של האנזים מורכב מאלמנטים הלקוחים מ-2 תת-יחידות של הטטרמר. ברצף האמינו-טרמינאלי של האנזים, מופיע α-פפטיד ששיירים 22-31 בו מסייעים לייצב צרור המורכב מ-4 גדילים (helices), ואילו שיירים 13 ו-15 שלו תורמים לשפעול הדימר, ואמנם כאשר מסירים את המקטע ה-N טרמינאלי נוצר דימר בלתי פעיל. בחיידק E. coli שייר Glu-461 נחשב פעם כנוקלאופיל (Juers וחב' ב-Protein Sci משנת 2012), אך כיום ידוע ש-Glu-461 הוא קטליסט חומצי, ולעומת זאת Glu-567 הוא הנוקלאופיל האמיתי, הנקשר לתוצר הביניים ה-galactosyl (על פי Gebler וחב' ב-J Biol Chem משנת 1992). באדם, הנוקלאופיל של ריאקציית ההידרוליזה הוא השייר Glu-268 (על פי McCarter וחב' ב-J Biol Chem משנת 1997 ). שייר Gly-794 חיוני לפעילות האנזים, בכך שהוא אחראי לשמור עליו בקונפורמציה "פתוחה" בקישורו למצע.

בשנת 1995 הציעו Dimri וחב' ב-Proc Natl Acad Sci USA קיומו של איזופורם חדש של β-galactosidase עם פעילות אופטימאלית ב-pH 6.0 והגדירו אותו כ-SA-β-gal או Senescence Associated β-gal, הבא לביטוי באופן ספציפי בתאים מזדקנים או כאלה הנמצאים באי יכולת בלתי הפיכה לגדול. פותחו מספר שיטות כמותיות למדידת איזופורם זה (Bassaneze וחב' ב-Anal Biochem משנת 2008, ו-Kindell ב-באותו כתב עת משנת 2005, כמו גם Itahana וחב' ב-Methods Mol Biol משנת 2007). אך הסתבר שאיזופורם זה נובע מביטוי-יתר והצטברות של β-galactosidase ליזוזומאלי (Lee וחב' ב-Aging Cell משנת 2005), ושביטויו אינו חלק מתהליך הזדקנות התא. אף-על-פי-כן איזופורם זה נותר בשימוש נרחב כמדד להזדקנות תאים ולמותם הממשמש ובא, כיוון שהוא אמין ונוח לזיהוי.

==מנגנון פעולת האנזים==

האנזים β-galactosidase יכול לקטלז באורגניזם 2 ריאקציות שונות בתכלית. באחת, הוא יכול לעבור דרך תהליך הקרוי "טרנס-גלקטוזילציה" ליצירת allolactose, תוך יצירה של לולאת משוב חיובית ליצירת β-gal. אך האנזים יכול גם לבצע הידרוליזה של לקטוזה ליצירת גלקטוזה וגלוקוזה, כאשר האחרון ימשיך דרכו למעגל הגליקוליזה (Matthews ב-C. R. Biol משנת 2005). האתר הפעיל של β-galactosidase, מקטלז את ההידרוליזה של המצע הדיסכרידי שלו על ידי 2 סוגי התקשרות למצע: "שטחי" ו"עמוק". גלקטוזידים כמו PETG ו-IPTG יקשרו לאתר ה"שטחי" כאשר האנזים נמצא בקונפורמציה "פתוחה", בעוד שאנאלוגים כמו L-ribose ו-D-galctonolactone יקשרו לאתר ה"העמוק" כאשר האנזים בקונפורמציה "סגורה".

הריאקציה האנזימטית מורכבת מ-2 שלבים כימיים, גלקטוזילציה (K2) ודה-גלקטוזילציה (K3). בשלב הגלקטוזילציה הראשון שייר Glu461 תורם פרוטון לחמצן הגליקוזידי, מה שמביא ללקטוז קשור קו-ולנטית ל-Glu537. בשלב הדה-גלקטוזילציה השני, הקשר הקו-ולנטי נשבר כאשר Glu461 מקבל פרוטון, ומוסיף מולקולת מים לגלקטוזה. שני מצבי המעבר האלה, מתרחשים ברצף באתר "העמוק" של האנזים. כאשר מים משתתפים בריאקציה נוצרת גלקטוזה, שאם לא כן, כאשר D-glucose משמש כ-"acceptor" בשלב השני, מתרחש תהליך של טרנס-גלקטוזילציה. נעשה חישוב של מדידה קינטית שמצא שטטרמרים בודדים של האנזים מקטלזים ריאקציות בקצב של 38,500 ריאקציות בדקה. לצורך של פעילות אופטימאלית של האנזים הוא נעזר ביונים של אשלגן (+K) ומגנזיום (++Mg). קשר β של המצע מבוקע על ידי קבוצת הקצה הקרבוקסילי בשרשרת הצדדית של חומצה גלוטמית.

בחיידק E. coli הגן lacZ המקודד ל-β-galactosidase, מהווה חלק ממערכת lac operon המושרית ומשופעלת בנוכחות lactose כאשר רמות גלוקוזה נמוכות. האנזים β-gal דומה ברצף חומצות האמינו שלו להידרולאזות גליקוזידיות אחרות כמו beta-glucosidase, וכן phospho-β-galactosidase{{כ}}-6 ו-β-mannosidase. אך למרות שאנזימים אלה דומים במבנה שלהם יש להם כמובן תפקידים שונים. β-galctosidase מעוכב על ידי L-ribose, ובאופן לא-תחרותי על ידי יוד. כמו כן הוא מעוכב באופן תחרותי על ידי גלקטוזה, phenylthyl thio-β-D-galactoside או PETG, על ידי isopropyl thio-β-D-galactoside או IPTG וכן על ידי D-galactonolactone (על פי Juers וחב' ב-Biochemistry משנת 2003).

;β-Galactosidase מקטלז את הריאקציה הבאה:

[[קובץ:Β-Galactosidase1.png|מרכז|500 פיקסלים]]

האנזים נפוץ מאוד, החל במיקרו-אורגניזמים, חיות וצמחים. האנזים ממקור החיידק E. coli strain K12, נלמד בעיקר במעבדתו של Anfinsen בהקשר לניסויים גנטיים על רגולציה של גנים בסינתזה של חלבונים (Craven וחב' משנת 1965). האנזים יכול לשמש לקביעת רמת לקטוזה בדם ובנוזלי גוף אחרים. שימוש חשוב נוסף של אנזים זה הוא בטכנולוגיית עיבוד המזון. נושא חשוב במיוחד הוא השימוש בו לטיפול בחלבכדי להתמודד עם בעייתם של אלה עם חחסר האנזים lactase הסובלים מאי-סבילות ללקטוזה. לצורך זה יש להסיר את הסוכר גלקטוזה מלקטוזה ובאופן חרושתי נרחב משיגים זאת על ידי קישור האנזים β-Galactosidase למצע קבוע ובהבאתו במגע עם החלב המטופל (Khare ו-Gupta משנת 1988, ו-Park ו-Hoffman משנת 1990).

==שימושי האנזים==

בדיקת β-galactosidase מתבצעת לעתים תכופות בסוגיות גנטיות, בביולוגיה מולקולארית, ובמדעי החיים. ניתן לגלות פעילות אנזים זה על ידי שימוש במצע X-gal, המייצר צבע כחול חזק לאחר ביקועו על ידי האנזים, וקל לזיהוי ולכימות. אנזים זה נמצא בשימוש רווח בביולוגיה מולקולארית, כסמן לניטור של ביטוי גני. אנזים זה מבטא גם תופעה הידועה כ-α-complementation, היוצרת את הבסיס לסריקה של שבטים (clones) ריקומביננטיים. אנזים זה יכול להיות מבוקע לשני פפטידים, LacZα ו- LacZΩ, שאינם פעילים כשלעצמם, אך כאשר 2 פפטידים אלה נמצאים ביחד, הם מתלכדים באופן ספונטאני ליצירה מחודשת של האנזים השלם הפעיל. תכונה זו מנוצלת ב-vectors רבים, כאשר הנוכחות של הגן lacZα בפלסמיד יכולה להשלים ב-trans גן מוטנטי אחר המקודד ל- LacZΩ בזנים מעבדתיים ספציפיים של E. coli.

יחד עם זאת, כאשר מחדירים מקטעי DNA לתוך ה-vector, היצירה של LacZα משתבשת, והתאים אינם מראים כל פעילות של β-galactosidase. הנוכחות או החסר של פעילות β-galactosidase יכולים להתגלות על ידי המצע X-gal, המייצר צבע כחול אופייני כאשר הוא נבקע על ידי האנזים, באופן המאפשר גילוי נוח של נוכחות או היעדרות תוצר השיבוט בפלסמיד. במחקרים על טרנסלוקציות כרומוזומאליות בלויקמיה, Dobson וחב' השתמשו בחלבון איחוי של LacZ בעכברים (EMBO J משנת 2000), תוך ניצול הנטייה של האנזים β-galactosidase לעבור אוליגומריזציה, כדי להציע תפקיד פוטנציאלי של האוליגומר בתפקוד של חלבון איחוי ב-MLL (על פי Krivstov ו-Armstrong ב-Nature Rev Cancer משנת 2007).

==Evolved β-galactosidase==

מספר סוגי חיידקים שונים, כולל E.coli, מכילים גנים נוספים של β-galactosidase. גן שני הקרוי evolved β-galactosidase או ebgA, התגלה כאשר זני חיידקים עם חסר של הגן lacZ, אך עדיין מכילים את הגן lacY המקודד ל- galactoside permease, הוכנסו למדיום המכיל לקטוזה כמקור יחיד של פחמן. לאחר פרק זמן התחילו מספר מושבות לצמוח. יחד עם זאת, חלבון EbgA שקודד הוא lactase שאינו אפקטיבי ואינו מאפשר לחיידקים צמיחה על לקטוזה. שתי צורות של מוטציות נקודתיות שיפרו באופן דרמטי את פעילות האנזיםebg עם לקטוזה כמצע (Hall ב-J Bacteriol משנת 1977, ו-J Mol Biol משנת 1981). כתוצאה מכך האנזים המוטנטי מסוגל לבוא במקום האנזים lacZ β-galactosidase {{כ}} (stokes וחב' ב-Moi Biol Evol משנת 1985). שני הגנים EbgA ו-LacZ הם בעלי זהות של 50% ברמת ה-DNA, ויש ביניהם זהות של 33% ברמת הרכב חומצות האמינו להן הם מקודדים (Elliott וחב' ב-Bichem J משנת 1992). האנזים הפעיל ebg הוא תלכיד (aggregate) של תוצרי הגנים ebgA ו-ebgC ביחס של 1:1 עם הצורה הפעילה של אנזימי ebg המהווה הֶטֶרוֹ-אוקטמר α4 β4.

==תרחישים קליניים בחסר האנזים==

חסר של האנזים כרוך בשלושה מפגעים אוטוזומאליים-רצסיבים השונים בתכלית אחד מהשני פרט לעובדה ששלושתם מחלות אגירה ליזוזומאלית: GM1 gangliosidosis, מחלת Morquio B הידועה כ- (mucopolysaccharidosis type IVB (MPS IVB ו-galactosialidosis. מחלת GM1 gangliosidosis ו- MPS IVB הם מפגעים הקשורים למוטציות דו-אלליות בגן GLB1, ואילו galactosialidosis נגרם על ידי מוטציות בגן CTSA (או cathepsin A), מה שגורם לירידה בפעילות של β-galactosidase ושל sialidase.

==GM1 gangliosidosis==

מחלת GM1 gangliosidosis היא מפגע אגירה ליזוזמאלי נדיר המועבר באופן אוטוזומלי-רצסיבי ומאופיין ביוכימית על ידי חסר בפעילות האנזים β-galactosidase, ומבחינה קלינית במגוון של תסמינים נוירו-ויסצראליים, אופתלמולוגיים ודיסמורפיים. המפגע אינו מוגבל מבחינה אתנית, אם כי שכיחותו הגלובאלית אינה ידועה. מקובל להניח שהוא מופיע באחד מ-100-200 אלף לידות-חי, ושכיחות גדולה מזו נמצא במלטה ובברזיל, וכן באנשים ממוצא קפריסאי או ממוצא צועני Roma.

ישנם 3 סוגים של GM1 gangliosidosis בהתבסס על גיל הופעת התסמינים:
#צורה של החמרה מהירה בתסמיני המחלה, המופיעה לפני גיל 6 חודשים (type 1 GM1 gangliosidosis);
#צורת מחלה המתגלה בגיל ילדות מאחר יותר (מגיל 7 חודשים עד 3 שנים) עם פיגור בהתפתחות מוטורית וקוגניטיבית (type 2 GM1 gangliosidosis);
#צורת מחלה כרונית המופיעה בגיל מבוגר יותר של 3-30 שנה (type 3 GM1 gangliosidosis), המאופיינת בעיקר על ידי דיסטוניה מפושטת, ובה חומרת התסמינים היא במתאם עם רמת הפעילות של β galactosidase. המפגע הזה נגרם על ידי מוטציות בגן GLB1 המקודד לאנזים והממוקם על הזרוע הקצרה של כרומוזום 3 בעמדה 3p22.3. עד היום זוהו למעלה מ-165 מוטציות. פעילות חלקית או אפסית של האנזים גורמת להצטברות טוקסית של הגנגליוזיד GM1 ברקמות הגוף, ובעיקר במערכת העצבים המרכזית.

אבחון המחלה עלול להיות קשה בגלל מגוון התסמינים הרחב שיכול להופיע בחלקו גם במפגעים אחרים. החשד בכיוון של מחלת אגירה עשוי להתעורר על בסיס תווי פנים גסים, פיגור פסיכו-מוטורי, נקודה אדומה-כהה ב-macula של העין, חניכיים היפר-טרופיים, craniofacial dysostosis וכבד וטחול מוגדלים. משטח דם המצביע על לימפוציטים עם וקואולות, וכן בדיקת שתן המצביעה על נוכחות אוליגו-סכרידים הם ממצאים מכוונים מובהקים. נמצאו גם תאי קצף דמויי-Gaucher בבחינת מח עצם. האבחון מאושר על ידי ביוכימית של רמת פעילות β-galactosidase, ו/או על ידי בחינה מולקולארית-גנטית. יש לשלול מפגע משולב של חסר באנזימים β-galactosidase ו-nuraminidase הגורם ל-galactosialidosis. אבחון בהיריון יכול להתבצע על ידי מדידת פעילות האנזים או בסיסי השלייה או בנוזל מי השפיר.

בתלות בסוג המוטציות באותן גן, 2 מפגעים שונים לחלוטין יכולים לנבוע מהחסר באנזים הליזוזומלי β-galactosidase. המוטציה הראשונה הפוגעת בספציפיות של האנזים לגבי מצע כגון GM1-ganglioside, תגרום ל-.GM1-gangliosidosis מחלת אגירה זו מביאה להצטברות גנגליוזיד זה בעיקר בחומר האפור של המוח. יש למחלה זו 3 תת-סוגים קליניים בתלות ברמת האנזים המופחתת בתאים. Type 1, או infantile GM1 gangliosidosis, היא הצורה השכיחה ביותר ומאופיינת בעיכוב התפתחותי כבר בגיל 0-6 חודשים, היפוטוניה, dysostosis multiplex, בכבד וטחול מוגדלים, בתווי פנים גסים, בכשל שגשוגי (FTT), ובעיוותים שלדיים. בערך במחצית הנפגעים מוצאים ברשתית cherry red spot. עם התקדמות המחלה, שכיחים פרכוסים וספסטיות, כאשר התמותה חלה בגיל שנה עד שנתיים. Type 2, או juvenile GM1 gangliosidosis, מתאפיינת בקצב התקדמות אטי יותר מאשרType 1, והתסמינים מתונים יותר ומתחילים בערך בגיל 7 חודשים עד 3 שנים, בתחילה ההתפתחות תקינה, ובהמשך יש איבוד קואורדינציה, וחולשת שרירים. בנוסף, בדרך כלל יש דעיכה מהירה בתפקודים מוטוריים ומנטאליים. תוחלת החיים הממוצעת נעה בין 3-10 שנים. Type 3, או adult GM1 gangliosidosis, צורה נדירה ביותר עם שכיחות של 1 לכל 100 עד 200 אלף לידות-חי. הליקוי מתגלה בשנים שבין 13-30 שנה,עם בעיות מתקדמות בדיבור, הפרעות הליכה וספסטיות. במשך הזמן מורגשת דעיכה אינטלקטואלית עם מאפיינים [[פרקינסון|פרקינסוניים]] ודיסטוניה.

==מחלת Morquio==

המוטציה השנייה, משפיעה על ספציפיות האנזים למצע keratan sulphate, גורמת למחלת הידועה גם כ-MPS-IVB. מחלה זו שהיא אוטוזומאלית-רצסיבית, מאופיינת על ידי הצטברות של הגליקוזאמינוגליקאן keratan sulphate בעיקר בתאי סחוס במערכת השלד. המחלה מאופיינת על ידי דיספלזיה שלדית חריפה הגורמת לגמדות קשה, עקמת (scoliosis), וכן kyphosis, ו-gibbus חמור הגורם לאנגולציה. כמו כן מוצאים pectus carinatum או "חזה יונה" המאופיין בהתבלטות של החזה מעל עצם החזה והצלעות, rib falaring או בלט צלעות, וכן היצרות של עמוד השדרה באזור ה-cranio-cervical, genu valgum ("רגלי X"), חרשות, היפופלזיה אודונטואידית, אך אינטליגנציה נורמאלית ב-2 המינים כיוון שאין מעורבות של מערכת העצבים המרכזית. כן אופייניים למחלת Morquio type B קול מעובה, טחול וכבד מוגדלים, קשיחות במפרקים, ואף מחלת לב.

==Galactosialidosis==

למטופלים המאובחנים עם galactosialidosis יש עלייה אופיינית של אוליגוסכרידים וירידה ברמות האנזים neuraminidase. מומלץ למדוד פעילות neuraminidase כמו גם לבצע אנליזה מולקולארית של CTSA כדי לאשר את האבחון של galactosialidosis. התרחיש galactosialidosis אף הוא יכול להיות מסווג לשלושה תת-סוגים בהתאם לגיל הופעת התסמינים והתקדמותם. מאפיינים שכיחים של תת הסוג המוקדם-האינפנטילי הם hydrops fetalis (או בצקת עוברית שעלולה להתרחש ב-15% מהמקרים בשל אי התאמה של גורם Rh, או במנגנונים אחרים), בקע מפשעתי, עיכוב התפתחותי וכבד וטחול מוגדלים. תסמינים נוספים שנכרכו עם תת-סוג זה של galactosialidosis הם תווי פנים גסים, התעכרות הקרנית, הופעת cherry spot ברשתית, כשל כלייתי, ו-cardiomegaly. מוות מתרחש בדרך כלל בסוף שנת החיים הראשונה. תת הסוג השני, late infantile type, מכיל רבים מהתסמינים של צורת המחלה האינפנטילית, ויכול לכלול גם איבוד שמיעה, וקומה נמוכה. תת הסוג השלישי ה-juvenile/adult form, יכול לכלול ataxia, פרכוסים, התעכרות הקרנית, פגיעה אינטלקטואלית ההולכת ומחריפה, cherry spot, איבוד שמיעה וראיה ואי תקינות של עמוד השדרה.

==הוראות לביצוע הבדיקה==

לצורך מדידת רמת האנזים בפלזמה יש ליטול דם במבחנה כימית (פקק צהוב או אדום). יש לפסול דגימות המוליטיות במיוחד, אם כי ניתן לקבל דגימות בדרגת המוליזה מתונה. שיטת הבדיקה פלואורימטרית בדרך כלל תוך שימוש במצע המלאכותי methyl-umbelliferyl-β-galactopyranoside{{כ}}-4.

==מדידת β-Galactosidase בלויקוציטים==
הבדיקה מתבצעת בדגימת דם מלא, הנלקח במבחנות ספירת דם (EDTA, פקק סגלגל) או מבחנת הפרין (פקק ירוק). יש לערבב בעדינות את תכולת הדם במבחנה, כדי שיבוא במגע יעיל עם נוגד הקרישה. אין לסרכז את הדגימה, ויש להעביר את המבחנה בצורה זו למעבדה, לא יאוחר מ-72 שעות מנטילת הדם. יש לפסול דגימות מאוד המוליטיות או דגימות מוקפאות. שיטת הבדיקה פלואורומטרית. מדידת רמת האנזים בלויקוציטים מומלצת לאבחון GM1 gangliosidosis ומחלת Morquio B. שיטה זו אינה מומלצת לגילוי נשאים של מחלות אלה.

==ראו גם==
* [[מדריך בדיקות מעבדה|חזרה לדף מדריך בדיקות מעבדה]]
* [[אבחון מחלות ומפגעים מטבוליים-גנטיים|בדיקות מעבדה - אבחון מחלות ומפגעים מטבוליים-גנטיים]]
* [[אבחון תסמנות גנטיות|בדיקות מעבדה - אבחון תסמנות גנטיות]]

{{ייחוס בן עמי}}

[[קטגוריה:בדיקות מעבדה - אבחון מחלות ומפגעים מטבוליים-גנטיים]]
[[קטגוריה:בדיקות מעבדה - אבחון תסמנות גנטיות]]
[[קטגוריה:בדיקות מעבדה: גנטיקה]]
[[קטגוריה:בדיקות מעבדה: כימיה בדם]]

Human placental lactogen

2016-03-06T10:40:32Z

בן עמי סלע:

{{בדיקת מעבדה
|שם עברי={{רווח קשיח}}
|שם לועזי=Human placental lactogen
|קיצור=hPL, human chorionic somatomammotropin, HCS, choriomammotropin, placental growth hormone.
|תמונה=
|כיתוב תמונה=
|מעבדה=[[כימיה בדם]]
|תחום=תפקודי השלייה.
|יחידות מדידה=
|טווח ערכים תקין=עלייה הדרגתית ברמת hPL מ-0.5 מיקרוגרם/מ"ל בשבוע ה-5 להיריון, עד לרמה מרבית של 12.0 מיקרוגרם/מ"ל בשבוע ה-36 להיריון.
|יוצר הערך=[[משתמש:בן עמי סלע|פרופ' בן-עמי סלע]]
|אחראי הערך=
}}

== מטרת הבדיקה ==

מדידת רמת hPL נועדה לבחון את התפקוד של השלייה, שכן תוצאות נמוכות משמעותית עלולות להצביע על אי-ספיקה של השלייה.

==מבנה ההורמון==

ההורמון השלייתי hPL הוא פוליפפטיד מונומרי בעל משקל מולקולארי של 22,125 דלטון, המורכב מ-191 חומצות אמינו. במולקולת ההורמון ישנם 2 קשרים די-סולפידיים, ןהוא מכיל 8 סלילונים (helices). המבנה הגבישי של hPL נקבע על ידי X-ray diffraction עם רזולוציה של 2.0 Å על ידי Walsh ו- Kossiakoff ב-J Mol Biol משנת 2006). המבנה והתפקיד של hPL דומים לאלה של הורמון הגדילה האנושי (GH), וכן הוא דומה במבנהו ל-somatotropin. ובפעילויותיו הוא מנוגד לאינסולין. hPL מופרש במהלך ההיריון על ידי ה-syncytiotrophoblast השלייתי. ההורמון hPL משפיע על המהלך המטבולי של אישה בהיריון, כדי לסייע לאספקת אנרגיה לעובר. בדומה ל-GH האנושי, hPL מקודד על ידי גנים על זרוע הארוכה של כרומוזום 17 בעמדה 17q22-24. ההורמון hPL זוהה לראשונה בשנת 1963 על ידי Josimovich וחב' ב-Endocrinology.

ההורמון hPL מופיע רק במהלך ההיריון , כאשר רמתו בדמה של האם עולה במקביל להתפתחות ההיריון ולצמיחת העובר וגידול השלייה בהתאם. שיטות רגישות במיוחד מגלות כבר הפרשה בשלייה של רמות זעירות של hPL ימים אחדים לאחר השרשת הביצית המופרית. הריכוז הגבוה ביותר מושג סביב השבוע ה-35 להיריון, ורמות מוגברות שלו נמדדות בהריונות מרובי-עוברים. כמות קטנה ביותר של hPL חודרת לצירקולציה של העובר, ותקופת מחצית החיים של hPL היא כ-15 דקות.

מדידת רמת hPL אינה נהוגה עדיין בשגרת המעקב הקליני אחר מהלך ההיריון והתפתחות העובר, כיוון שמדדים אחרים קלים יותר למדידה ונחשבים אמינים יותר. נקודה נוספת המחלישה את מעמדו של hPL כמדד להיריון תקין, היא העובדה שדווח על הריונות נורמאליים לחלוטין בהם לא ניתן היה לגלות כלל בדמה של האישה ההרה רמות ניתנות למדידה של hPL.

==רמות תקינות של hPL בנסיוב האם==

בשבוע ה-5-6 להיריון רמת hPL היא 0.5 מיקרוגרם/מ"ל, עד שבוע 14 עולה רמת hPL ל-0.08-1.3 מיקרוגרם/מ"ל, בשבוע ה-20 להיריון רמת hPL היא 0.12-1.4 מיקרוגרם/מ"ל, בשבוע ה-22 מגיעה רמת hPL ל-1.45-2.9 מיקרוגרם/מ"ל, בשבוע ה-26 להיריון הריכוז של הורמון זה מגיע 2.5-5.0 מיקרוגרם/מ"ל, ובשבוע ה-30 ל-4.5-6.5 מיקרוגרם/מ"ל. בשבוע ה-34 להיריון רמת hPL מגיעה ל-5.0-8.0 מיקרוגרם/מ"ל ובשבוע ה-38 ועד ללידה נרשמות הרמות הגבוהות ביותר בתחום של 5.5-10.5 מיקרוגרם/מ"ל. לשם השוואה בנשים לא הרות ובגברים, רמת hPL היא בין 0.0-0.1 מיקרוגרם/מ"ל. (מתוך Pagana ו-Pagana ב-Mosby's Diagnostic Lab Test Reference 9th ed משנת 2009).

==פעילויות פיזיולוגיות של hPL==

hPL מסייע לאופטימליזציה של המטבוליזם של חומרי תזונה בחצי הראשון של ההיריון אם כי
ההנחה היא שתרומתו לעובר בתחום הזה במחצית השנייה של ההיריון היא זניחה. בנוסף לפעילותו הלקטוגנית בגירוי יצירת חלב והגדלת רקמת השד, הוא בעל השפעות סומאטוטרופית ולוּטאוֹטרופית.

ההורמון מפרק שומנים של האם על מנת לספק אנרגיה לעובר המתפתח. על ידי הפעולה האחרונה,יופיעו בדמה של האם ריכוזים גבוהים יותר של חומצות שומן, שתנוצלנה על ידי האם למטרת אנרגיה, ובכך "ייחסך" הסוכר גלוקוזה לעובר. גם קטונים (ketones) שנוצרים בדמה של האם מחומצות השומן החופשיות, יכולים לעבור דרך השלייה לעובר באופן שהוא יכול לנצלם. תהליכים אלה עשויים לסייע לתזונת העובר גם במקרים בהם תזונת האם אינה אידיאלית. חסר של hPL במהלך ההיריון, גורם לעובר שגשוג לא-תקין כמו גם משפיע על שגשוג התינוק בתקופה שלאחר הלידה.

בפעילותו הוא "מחקה" את פעילות prolactin, יחד עם זאת לא ברור כלל אם יש ל-hPL תפקיד ביצירת חלב בבלוטות השד. לגבי הנקודה האחרונה יש הגורסים דווקא שהורמון זה מכין את בלוטות החלב לתהליך ה-lactation אם כי העובדה שהוא נעלם למעשה עם הלידה מפחיתה את הסיכוי שהוא מעודד הפרשת קולוסטרום מיד אחריה.

להורמון זה יש פעילויות חלשות הדומות לאלה של הורמון גדילה, המסייעות ליצירת רקמות חלבוניות באופן דומה לפעולת GH, אך בסדרי גודל הנמוכים פי-100 בהשוואה ל-GH )על פי Guyton ו-Hall ב-Text Book of Medical Physiology, 11th ed משנת 2005).

hPL נחשב ל"אנטגוניסט של אינסולין" בכך שהוא יכול לגרום להקטין את רגישות האישה ההרה לאינסולין על ידי הגברת העמידות לאינסולין ולאי-סבילות לסוכרים באישה ההרה, ובכך להגביר ריכוזי גלוקוזה בדמה. הקטנת ניצול גלוקוזה על ידי תאי השריר באם, מסייעת לניצול טוב יותר של הסוכר על ידי רקמות העובר ולסייע להתפתחותו, מה שגורם באם להגברת פעילות תאי בתא בלבלב. מצב של היפוגליקמיה כרונית גורם לעלייה בריכוזי hPL. השפעותיו אלו יכולות לסייע להיווצרות סוכרת הריון.

כאמור, ל-hPL יש גם השפעה על המטבוליזם של חלבון, באופן שמגדיל את זמינותן של חומצות אמינו לעובר. ההורמון משיג זאת על ידי על ידי הפחתת השימוש של האם בחלבונים למטרות אנרגיה, והגדלת יכולת הסינתזה של חלבונים. בעובר, hPL דרך קולטנים לקטוגניים וייתכן גם דרך קולטן ספציפי ל-hPL, יכול לגרום למודולציה של שגשוג העובר. hPL משפיע בעובר על המטבוליזם על ידי הגברת יצירת insulin-like growth factor, אינסולין, הורמונים של יותרת הכליה, ואף על יצירת ה-surfactant בריאות.

==רמות hPL בתרחישים שונים==

תוצאות hPL מתקבלות נמוכות ביתר לחץ-דם (טוקסמיה), בפיגור בהתפתחות העובר, באיומי הפלה ובהפלות ספונטניות, בכוריוקרצינומה, באי-ספיקה של השלייה, בהופעה של מולה בועית (hydatidiform mole), וב-post-maturity syndrome בה ההיריון מתמשך מעבר למועד הלידה המחושב. ערכי hPL הנמוכים מ-4.0 מיקרוגרם/מ"ל לאחר השבוע ה-30 להיריון, נחשבים כערכים קריטיים.

תוצאות של hPL מתקבלות מוגברות בהריונות מרובי עוברים (תאומים ומעלה) ושלייה, בשאת שפירה של השלייה הידועה כ-placental site trophoblastic tumor, כשתאי השאת ידוע כמפרישים hPL (על פי Whitney ב-Am J Nurs משנת 2009). כמו כן מוגברים ערכי hPL ב-intact molar pregnancy, בתרחישים של אי-התאמה של ה-Rh, ובסוכרת.

== הוראות לביצוע הבדיקה ==

אין צורך בהכנות מיוחדות לבדיקה כגון צום. יש ליטול דם במבחנה כימית (פקק אדום או צהוב), ולאחר סרכוז יש להקפיא את הנסיוב, ולשלחו למעבדה קפוא. אין לקבל דגימת נסיוב בטמפרטורת החדר. הדגימה יציבה 4 שעות בטמפרטורת החדר, יום אחד בקירור, ועד 3 חודשים בהקפאה. שיטת המדידה המקובלת היא ELISA.

==ראו גם==
* [[מדריך בדיקות מעבדה|חזרה לדף מדריך בדיקות מעבדה]]
* [[מדדי פוריות ורבייה|בדיקות מעבדה - מדדי פוריות ורבייה]]

{{ייחוס בן עמי}}

[[קטגוריה:בדיקות מעבדה: כימיה בדם]]
[[קטגוריה:בדיקות מעבדה - מדדי פוריות ורבייה]]

פפטיד דמוי הורמון פאראתירואידי - Parathyroid hormone-related protein

2016-02-14T09:29:10Z

בן עמי סלע:

{{בדיקת מעבדה
|שם עברי=פפטיד דמוי הורמון פאראתירואידי
|שם לועזי=Parathyroid hormone-related protein
|קיצור=PTHrP; PTH Related Peptide
|תמונה=
|כיתוב תמונה=
|מעבדה=[[אנדוקרינולוגיה בדם]]
|תחום=גורם הורמונאלי מרכזי במטבוליזם של סידן בגוף
|יחידות מדידה=
|טווח ערכים תקין=פחות מ-2 פיקומול' למ"ל, או 14-27 פיקוגרם למ"ל
|יוצר הערך=[[משתמש:בן עמי סלע|פרופ' בן-עמי סלע]]
|אחראי הערך=
}}

==מטרת הבדיקה==

אבחון מטופלים החשודים לתרחיש של היפר-קלצמיה של ממאירות (HHM או humoral hypercalcemia of malignancy), או אבחון של מטופלים עם היפר-קלצמיה מסיבה לא ידועה). רמת PTHrP יכולה לשמש גם לניטור יעילות הטיפול האנטי-סרטני.

==בסיס פיזיולוגי==

PTHrP הוא חלבון חבר במשפחת ההורמון PTH. הוא מופרש על ידי תאים סרטניים אך יש לו גם תפקידים בפיזיולוגיה התקינה של גוף האדם. PTHrP בא לביטוי באתרים רבים בגוף, ויש לו פעילות אנדוקרינית, פאראקרינית ואינטרה-קרינית, ובכך הוא משפיע על מגוון של תרחישים פיזיולוגיים ופתולוגיים, בנוסף לתפקידיו בבניית איברים (Wysolmerski ב-J Clin Endocrinol Metabol משנת 2012, ו-McCauley ו-Marin ב-J Bone Miner Res משנת 2012).

[[קובץ:PTH2.jpg|400px|ממוזער|מרכז|תפקידיו הפיזיולוגיים של PTHrP]]

[[קובץ:PTH1.jpg|400px|ממוזער|מרכז|הפעילויות הפאראקריניות של PTHrP: חלבון זה בעל השפעה על הזקיקים (follicles) של השיער ושל קרטינוציטים, בעל השפעה על הסחוס, תאי שריר חלק בכלי הדם, רקמת עצם, התפתחות רקמת השד, בלוטת הלבלב, ותהליך בקיעת השיניים בילדים (tooth eruption).]]

PTHrP הוא פפטיד מונומרי הקיים במספר איזופורמים, שגודלם נע בין 60 חומצות אמינו ועד 173 חומצות אמינו, הנוצרים על ידי תהליך splicing דיפרנציאלי, ומעורבות של האנזים prohormone convertase. החלבון PTHrP מיוצר בריכוזים נמוכים על ידי כל רקמות הגוף. תפקידיו הפיזיולוגיים אינם ברורים באופן מוחלט, וניתן לחלקם לארבע קטגוריות, שלא כולן באות לביטוי על ידי כל אחד מהאיזופורמים ולבטח לא כולם באים לביטוי בכל הרקמות: א. טרנספורט של סידן משני צידי האפיתל בעיקר בכליות וברקמת השד; ב. הרפיה של שריר חלק ברחם, בשלפוחית השתן, במערכת העיכול, ובדופן העורקים; ג. וויסות של שגשוג תאים; ד. התמיינות (דיפרנציאציה) של תאים ואפופטוזיס במגוון רקמות. כיוון ש-PTHrP הוא מרכיב חיוני של הריון תקין והתפתחות עוברית, חסר או פגם של חלבון זה קטלני בעוברי יונקים.

עניין רב ומחקר רחב ממדים מתחילת שנות ה-90, הם תולדה של הממצאים על היות PTHrP מיוצר באופן נורמאלי ברקמות רבות בהן הוא פועל באופן פאראקריני. ישנם רק שלושה מצבים, בהם PTHrP מופיע בצירקולציה ופועל באופן אנדוקריני: א) התסמונת ההיפרקצמית של ממאירות (HHM) בה מיוצר PTHrP על ידי השאתות ונודד דרך הדם לרקמת העצם וגורם לספיגת עצם (Burtis וחב' ב-J Clin Endocrinol Metabol משנת 1992, ו-Grill וחב' באותו כתב עת משנת 1991); ב) תהליך ההנקה (lactation) בו PTHrP נוצר בבלוטות החלב בשד ומגיע לצירקולציה (Grill וחב' ב-Clin Endocrinol משנת 1992); ג) החיים העובריים, בהם PTHrP מווסת את הטרנספורט של סידן מהאם לעובר דרך השליה (Kovacs וחב' ב-Proc Natl Acad Sci USA משנת 1996).

PTHrP זוהה כגורם להיפרקלצמיה של מצבי ממאירות בשנת 1987, על ידי Martin וחב' במלבורן על ידי שבודדו אותו משורת תאים של סרטן ריאה באדם (Proc Natl Acad Sci USA משנת 1987). באותה עת זיהו Rodan וחב' (J Clin Invest משנת 1983) חלבון זה המופרש מתאים אוסטאובלסטים, וכן זיהו Burtis וחב' (J Biol Chem משנת 1987) תאים שמקורם בסרטן שד חלבון שמשקלו המולקולארי 17,000 דלטון בעל פעילות מעודדת את האנזים adenylate cyclase), ואילו Strewler וחב' משנת 1987 ב-J Clin Invest, בודדו משורת תאים של סרטן כליה את החלבון שבדיעבד זוהה כ-PTHrP. לאחר מכן הראו Miao וחב' על ידי פגיעה בעכברים בגן המקודד ל-PTHrP שהדבר קטלני בעכברים אלה על ידי פגיעה במערכת העצמות, על ידי מניעת צמיחת העצם הטרבקולארית (Endocrinology משנת 2004).

ממצא אחרון זה הצביע על החשיבות הפיזיולוגית הניכרת של PTHrP. בשנים שחלפו מאז נמצא ש-PTHrP ו-PTH מקודדים על ידי גנים הקשורים זה לזה המהווים חלק ממשפחת גדולה יותר של ה-PTH gene. הקשר האבולוציוני הזה, מאפשר ל-חלבונים אלה להיקשר לאותו קולטן הידוע כ-type 1 PTH/PTHrP Receptor, מה שמסביר מדוע היפרקלצמיה של הממאירות דומה לזו הופיעה בהיפר-פארא-תירואידיזם. במקור, היו סבורים ש-PTHrP קשור בעיקר בתסמונת פארא-נאופלסטית, אך כיום כבר ברור ש-PTHrP קשור לתרחישים של אוסטאופורוזיס, אוסטאו-ארתריטיס, וסרטן השד, ואף נמצא ש-PTHrPעצמו עשוי לשמש כתרפיה של אוסטאופורוזיס וסוכרת.

כיום קיימת כבר ההכרה בדבר הפיזור הרחב של PTHrP ברקמות נרחבות בגוף, ולפעילויות האנדוקרינית, הפאראקרינית והאינטרה-קרינית, המניעות מספר תרחישים פיזיולוגיים ופתולוגיים, וכן בדבר תפקידו המרכזי ב-organogenesis. במחקר חלוצי קלאסי של מטופל עם קרצינומה של הכליות והיפרקלצמיה משנת 1941 ב-N Eng J Med, העלה Fuller Albright את ההשערה שמספר גידולים סרטניים יכולים לגרום להיפרקלצמיה, על ידי הפרשה של PTH או של "חלבון מאוד דומה ל-PTH". אכן בתרחיש של "היפרקלצמיה של ממאירות" יש ל-PTHrP פעילות דומה לזו של PTH, וכאשר שאת סרטנית מפרישה PTHrP הדבר גורם ישירות להיפרקלצמיה (Broadus וחב' ב-N Eng J Med משנת 1988). כיוון שהיפרקלצמיה הנגרמת על ישי PTHrP היא לעתים הסימן המוקדם של ממאירות, היא נחשבת כתופעה פארא-נאופלסטית.

===הסינתזה והמבנה של PTHrP===

PTHrP של אדם מקודד על ידי גן בודד (PTHLH) הנמצא על הזרוע הקצרה של כרומוזום 12 (עפ"י Strewler וחב' ב-J Clin Invest משנת 1987, ו-Suvaוחב' ב-Science משנת 1987). על ידי splicing חלופי, נוצר מגוון של סוגי mRNA, המקודדים ל-3 איזופורמים של PTHrP בעלי 139, 141 ו-173 חומצות אמינו. כבר מהתחלת המחקר הייתה הכרה שהגנים PTHLH ו-PTH קשורים זה לזה, כאשר ה-exon/intron של המקטע ב-2 גנים אלה המקודד לרצפי pre-pro שלהם, והחלק ההתחלתי של 2 הפפטידים הבשלים זהה לחלוטין. יתרה מכך, הקטעים של 2 הגנים המקודדים את הקצה ה-N טרמינאלי של PTH ו-PTHrP המופרשים לצירקולציה, הם בעלי הומולוגיה ניכרת, הבאה לביטוי בהיותם זהים ב-8 מתוך 13 חומצות האמינו (עפ"י Mangin וחב' ב-Proc Natl Acad Sci USA משנת 1988), וכן בהיותם בעלי מבנה שניוני דומה לאורך 21 חומצות האמינו הבאות.

ממצא אחר של Kemp וחב' שהופיע ב-Science בשנת 1987, היה שבדומה למה שידוע לגבי PTH גם במקרה של PTHrP כל פעילותו הביולוגית נכללת ב-34 חומצות האמינו בקצה ה-N טרמינאלי. רצפים הומולוגיים אלה, מאפשרים לשני הפפטידים להיקשר לאותו קולטן ולשפעל אותו, מה שעשוי להסביר מדוע PTHrP גורם להיפרקלצמיה של ממאירות. כל החברים במשפחת הגן PTH, הופיעו במקביל לאבולוציה של בעלי החוליות, כנראה כתוצאה מדופליקציה של גן קדמון בודד. בין כל חברי משפחת הגן PTH, הגן PTHLH הוא בעל המבנה הגנומי המורכב ביותר ואת השוֹנוּת הרבה ביותר בין מיני בעלי חיים שונים, מה שמשקף כנראה את המגוון הגדול של תפקודי PTHrP ברקמות השונות. אכן, המגוון הגדול של פעילויות פיזיולוגיות של PTHrP בא לביטוי בכך שהרכב חומצות האמינו של חלבון זה השתמר באופן בולט באדם, חולדה, עכבר, תרנגולת, ובכלב עד לחומצת אמינו 111. מעניין לציין שאפילו PTHrP של דג fugu הוא בעל הומולוגיה של 53% עם PTHrP של האדם.

[[קובץ:PTH3.jpg|600px|ממוזער|מרכז|מולקולת האם של PTHrP מכילה בקצה האמינו טרמינאלי שלה signal peptide שעובר ביקוע פרוטאוליטי ליצירת הקודמן המכיל 139 חומצות אמינו.{{ש}}קודמן זה עובר ביקועים אנזימטיים נוספים, ליצירת פפטיד דמוי-PTH בעל 36 ח' אמינו, פפטיד נוסף החל בח' אמינו 38 עד 94, ופפטיד קרבוקסי-טרמינאלי בעל פעילות osteostatin, החל בח' אמינו 107 עד 139.]]

===הפפטידים של PTHrP והקולטנים שלו===

הפפטיד PTHrP 1-36 מופרש ממספר סוגי תאים כמו תאי לב, מוח, שריר השלד, שלפוחית השתן, צינורות המרה, מערכת החיסון, כבד, רחם ואשכים, כמו גם איברים אנדוקריניים הכוללים את בלוטת יותרת המוח ותאי C בבלוטת התריס (Orloff וחב' ב-Endocr Rev משנת 1994 ו-Ureña וחב' ב-Endocrinology משנת 1993), אך הצורות הארוכות יותר של הפפטידים בקצה האמיני של PTHrP, מופרשות גם מקרטינוציטים ומתאי אפיתל של בלוטות השד, במקרים של סרטן העור ובתקופת הנקה (Burtis וחב' ב-N Eng J Med משנת 1990, וכן Sowers וחב' ב-JAMA משנת 1996 ו-VanHouten וחב' ב-J Clin Invest משנת 2003).

ההפרשה של הפפטידים המוגדרים כ-midregion כולל חומצות אמינו 38-94, 39-95 ו-38-101 תוארה גם כן (Soifer וחב' ב-J Biol Chem משנת 1992), אם כי הביולוגיה של פפטידים האחרונים אינה ברורה, פרט לעובדה שה-mid-region של PTHrP מעודד טרנספורט של סידן בשִליָה וקשור למודולציה של ביקרבונאט בכליות. כמו כן, המקטעים ה-C טרמינאלים של PTHrP המורכבים מחומצות אמינו 107-138 ו-109-138 תוארו ותפקידם הוא בעיכוב יצירת אוסטאוקלסטים ובעידוד השגשוג של אוסטאובלסטים (Philbrick וחב' ב-Physiol Rev משנת 1996).

בשנת 1991 התפרסם ב-Science מחקרם של Juppner וחב', בו תואר בידודו של הקולטן של PTHrP, כאשר מחקרים בעכברי knock out עם פגיעה בקולטן זה, הדגימו את החשיבות של PTHrP (עפ"י Lanske וחב' ב-Science משנת 1996) אותה קבוצת חוקרים אף הדגימה במאמר משנת 1998 ב-Endocrinology, שאותו קולטן יכול לשמש את 2 הליגנדים, PTH ו-PTHrP. כמעט 20 שנה חלפו עד לפרסום של Miao וחב' משנת 2005 ב-J Clin Invest בו הודגמה חשיבותו של PTHrP המופרש מאוסטאובלסטים, כגורם אנאבולי פוטנטי בכל הקשור ליצירת עצם.

===הפעילות התוך גרעינית של PTHrP ופעילותו כ-intracrine factor===

בנוסף לפעילויות האנדוקריניות והפאראקריניות של PTHrP המופרש מרקמות שונות, יש ראיות מוצקות לכך שצורה מסוימת של PTHrP אינה מופרשת, ועל ידי הכוונתו של הורמון זה לגרעין תאים יש לו שם פעילות גרעינית כגון זו הקשורה למודולציה של אפופטוזיס בתאים אלה. בין היתר, שעתוק של הגן PTHLH יכול להשפיע עת מניעת ההפרשה של PTHrP אל מחוץ לתאים, והכוונתו לגרעין התאים (Fiaschi-Taesch וחב' ב-Endocrinology משנת 2003). תנועת PTHrP לתוך גרעין התא מושפעת מרצף של חומצות אמינו בין עמדות 84 ו-93 המשפיע על התנועה הדו-כיוונית של PTHrP אל תוך הגרעין, והחוצה ממנו (Roth וחב' ב-J Biol Chem משנת 2011). נראה שהזרחון של PTHrP בעמדה Thr85 על ידי cyclin-dependent kinase p34cdc2, משחקת תפקיד בהחדרת PTHrP לגרעין התא.

לא הרבה ידוע על הפעילות התוך-גרעינית של PTHrP. ידוע שהוא נקשר ל-RNA ובמספר תאים הוא ממוקם בגרעינון (nucleolus), מה שמרמז לכך ש-PTHrP קשור לוויסות התנועה של RNA, לדינאמיקה של ריבוזומים ואף לתרגום של חלבונים. בתאים בתרבית נמצא ש-PTHrP גרעיני, משפיע על שגשוג תאים, אך גם על אפופטוזיס, ולעתים הוא פועל לנטרול פעילותו של THrP המופרש מתאים. בתאי סרטן השד, המעי הגס והערמונית, נראה ש-PTHrP מעודד שגשוגם של תאים אלה, מגן עליהם מפני אפופטוזיס, ומעודד את כושר נדידתם, בה בשעה ש-PTHrP המופרש מתאים אלה, מעכב את שגשוג התאים הללו ומעודד בהם אפופטוזיס (Park וחב' ב-Endocr Related Cancer משנת 2012, ו-Shen וחב' ב-Exp Cell Res משנת 2004).

PTHrP גרעיני נמצא גם כמעודד את השגשוג של תאי שריר חלק וסקולאריים in vitro ו-in vivo על ידי השריית הביטוי של c-myc ושל skp2, שבתגובה מפחיתים את רמות מעכב מחזור חלוקת התא, p27. לעומת זאת ל-PTHrP המופרש מהתא יש השפעות מנוגדות.

===תפקיד PTHrP במערכת העצם והשלד===

החשיבות הפיזיולוגית של PTHrP במערכת השלד הייתה מוכרת מאז שהתברר שפגיעה ביצירת הורמון זה בעכברים מייד לאחר הלידה גרמה למותם כתוצאה מכשל נשימתי, מה שיוחס לפגם ביצירת קופסת הצלעות שלהם (Karaplis וחב' ב-Genes Dev משנת 1994). תרחיש זה מבליט את ההבדל בין PTHrP לבין PTH שפגיעה בגן שלו הייתה פחות דרמטית בעכברים יילודים (Miao וחב' ב-J Clin Invest משנת 2002). החשיבות של PTHrP בהתפתחות השלד מבחינת הפגמים ביצירתו הנגרמים בחסרים של הורמון זה chondrodysplasia ו-premature epiphyseal closure, הודגמה בעוברי עכברים על ידי Amizuka וחב' ב-J Cell Biol משנת 1994, העיקר לגבי יצירת סחוס אפיפיזיאלי בלתי תקין ושינויים ביצירת עצם אנדוכונדראלית.

נמצא שעכברי PTHrP(+/-) עם חסר חלקי של PTHrP, נורמאליים פנוטיפית בלידה, אך לאחר 3 חודשים הם בעלי מסת עצם נמוכה, עם ירידה בולטת בעובי העצם הטרבקולארית, ועלייה ניכרת במספר האדיפוציטים במח העצם (Amizuka וחב' ב-Dev Biol משנת 1996). חוקרים אלה מצאו שעכברים עם גנוטיפ PTHrP(+/-), לוקים בגיוס של precursors של מח העצם, וכן יש באוסטאובלסטים שלהם רמת אפופטוזיס גבוהה בהשוואה לעכברים תקינים. עכברים פגומים לגבי יצירת PTHrP נמצאו גם בעלי יצירה מופחתת של אוסטאוקלסטים.

במודלים של בעלי-חיים נמצא שביטוי-יתר או ביטוי-חסר של PTHrP, נקבע על ידי האופן בו מגיב הקצה ה-N טרמינאלי של ההורמון עם הקולטן PTRH1 על מנת לסנכרן את קצב ההתמיינות של הכונדרוציט, ולשמור על גידול סדיר של עצמות ארוכות (Kronenberg ב-Ann NY Acad Sci משנת 2006). פלטת הגדילה מורכבת מעמודות של כונדרוציטים מתחלקים ומתמיינים הגדלים בהדרגה לשלב של כונדרוציטים קדם-היפרטרופיים ולאחר מכן לכונדרוציטים היפרטרופיים. PTHrP מופרש בעיקר על ידי בונדרוציטים לא-בשלים בקצות העמודות המתוארות, בתגובה למולקולה אחרת הידועה כ-IHH או Indian hedgehog, המיוצרת על ידי כונדרוציטים היפרטופיים מתמיינים. בתגובה, PTHrP משפעל את הקולטן PTHR1 הממוקם על פני תאים מתחלקים וקדם-היפרטרופיים כדי לשמר את קצב החלוקות שלהם ולהאט את קצב ההתמיינות שלהם לתאים היפרטרופיים. באופן זה, IHH ו-PTHrP פועלים במין לולאת משוב שלילית כדי לווסת את קצב ההתמיינות של כונדרוציטים.

לאחרונה התגלו פרטים רבים על מארג האיתותים דרכם מפעיל PTHrP את השפעתו על התמיינותם של כונדרוציטים. שתי קבוצות מחקר הראו ש-IHH מגביר את ביטויו של PTHrP בפלטת הגדילה על ידי החלשת הפעילות של גורם השיעתוק Gli3 (עפ"י Koziel וחב'ב-Development משנת 2005). הדרך בה פועל PTHrP על כונדרוציטים דרך הקולטן PTHR1, נעשית על ידי השפעול של Gα3, על ידי יצירת cAMP ועל ידי פעילות האנזים protein kinase A, כאשר בתגובה משתתפים בסדרת אירועים הכוללים זרחון של SOX9, עיכוב ביטויו של p57, והשריית הפעילות של Gli3, Bcl-2 ו-cyclin D1. בדיעבד פעילות PTHrP מזרחנת ופוגעת בשני גורמי השעתוק Runx2 ו-Runks3, החיוניים להתמיינות של כונדרוציטים (Marino ב-Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes ).

לאחרונה הודגם ש-PTHrP יכול להשתתף במודולציה של התמיינות כונדרוציטים על ידי וויסות התנועה של histone deacetylase לתוך גרעין התא, מה שגורם לוויסות פעילותם של גורמי השעתוק Zfp521, MEF2, ו-Runks2 (עפ"י Correa וחב' ב-Dev Cell משנת 2010 ו-Seriwatanachai וחב' ב-FASEB Jמשנת 2011). מסלול זה נדרש לפעילות PTHrP. יתרה מכך, הוכר לאחרונה שמוטציות בגנים של PTHrP ושל HDAC4 גורמות לצורה של chondrodysplasia type E הידועה גם כ-brachydactyly type E, המזכירה אי-סדירויות במטופלים עם מוטציות בגן GNAS, מה שמרמז שכל שלושת הגנים נמצאים על אותו מסלול גנטי (Williams וחב' ב-Am J Hum Genet משנת 2010). מחקר עדכני של Hirai וחב' משנת 2011 ב-Proc Natl Acad Sci USA, בו השתמשו בגישה גנטית לפגיעה בגן של PTHrP בכונדרוציטים במהלך התקופה שלאחר הלידה של עכברים, מצא ש-PTHrP מווסת גם את ההתמיינות של כונדרוציטים ומשמר אותם בפלטת הגדילה הבשלה. הדבר מרמז על האפשרות שאובדן האיתות של PTHrP יכול לגרום ל"סגירה" של פלטת הגדילה, בשלב ההתבגרות (Wang וחב' ב-J Bone Miner Res משנת 2011).

PTHrP מיוצר גם באתרים סחוסיים אחרים כמו ב-perichondrium המקיף את רצועות ה-hyaline המשמשות להארכת הצלעות ותורמות לאלסטיות של קירות בית החזה, והידועות כ-costal cartilages, וכן מקיף את הכונדרוציטים הסוּב-ארטיקולאריים. PTHrP מבוטא גם באופן בולט בנקודות הנעיצה של רצועות וגידים לתוך העצם, ותורם לבניית מכלולים אלה בעת תהליך גדילת השלד.

ל-PTHrP יש תפקידים אנאבוליים חשובים בעצם, ומתוך לימוד מעורבותו של חלבון זה בביולוגיה התקינה של רקמות סחוס ועצם, אין הדבר מפתיע ששינויים בתפקוד PTHrP קשורים למפגעי שלד. הדוגמה הבולטת ביותר היא HHM בו PTHrP בצירקולציה המגיב עם הקולטן PTHR1 בשלד גורם לתהליך ספיגת עצם ושחרור סידן להופעת היפרקלצמיה. מוטציות loss-of-function בגן של PTHR1 גורמות ל-Blomstrand's chondrodysplasia הגורמת למות העובר ברחם (Nissenson ב-Endocrinology משנת 1998). בנוסף, מוטציות loss-of-function בגן של PTHLH גורמות לתסמונת הכוללת קומה נמוכה, עצמות מטקרפליות קצרות בידים, גרורות סרטניות, וקשיי לימודים. נראה שהפעילות האנאבּולית של PTHrP בעצם עשויה להיות שימושית בטיפול באוסטאופורוזיס (Horwitz וחב' ב-J Clin Endocrinol Metabol משנת 2010).

השפעול של PPR שהוא הקולטן המשותף של PTH/PTHrP, מגרה 2 חלבוני G הטרודימריים, Gs ו-Gq. אנליזה גנטית מראה שהשפעול של Gs מתווך בפעילות PTHrP לשמור על כונדרוציטים שיתחלקו וישגשגו, ואילו השפעול של Gq נוגד את הפעילות האחרונה. כאשר משופעל Gs, יש פעילות במסלול התוך-תאי בו חל דיכוי סינתזה של p57 שהוא מעכב של cyclin-CDK, וכתוצאה מכך יש שגשוג של כונדרוציטים.

לעומת זאת, ל-PTHrP יש גם פעילות להאטה של תהליכי התמיינות בכונדרוציטים, מה שמתבצע על ידי זרחון של גורם השעתוק SOX9, וכן על ידי דיכוי הסינתזה של mRNA המקודד לגורם השעתוק Runx2. מסלולים אלה וודאי אחרים שעדיין לא התגלו, חוברים על מנת לווסת את קצב ההתמיינות של כונדרוציטים בפלטת הגדילה בתגובה ל-PTHrP.

לקצה ה-N טרמינאלי של PTHrP יש הומולוגיה עם קצה זה ב-PTH, לכן שני חלבונים אלה יכולים להיקשר לאותו קולטן, הידוע כ-type 1 PTH receptorאו PTHR1. אך בניגוד ל-PTH המסוגל להיקשר רק לסוג קולטנים יחיד, PTHrP מסוגל להיקשר למגוון גדול יותר של קולטים. אכן, PTHrP יכול לגרות את רוב הפעילויות שמשרה PTH, כולל הגברת ספיגת עצם, והגברת הספיגה מחדש בקצה הרחיקני (דיסטאלי) של אבוביות הכליה, ועיכוב הטרנספורט של פוספאט באבוביות הקריבניות (פרוקסימאליות). יחד עם זאת, הסבירות של PTHrP לגרות יצירת קלציטריול (1,25dihydroxy vitamin D) נמוכה יותר מזו של PTH. לכן, PTHrP אינו מגביר ספיגת סידן במעי.

===תפקיד PTHrP בהתפתחות בלוטות החלב בשד===

מחקרים על PTHrP ועל הקולטן PTHR1 בעכברי knock-out, העלו שאיתות על ידי הורמון זה נחוץ ליצירת ה-mammary glands העובריים (Hens וחב' ב-Breast Cancer Res משנת 2007). עוברי אדם הלוקים ב-Blomstrad's chondrodysplasia חסרים אף הם רקמת שד, מה שמוכיח שאיתות של PTHrP חיוני להתפתחות השד גם באדם (Wysolmerski וחב' ב-J Clin Endocrinol Metabol משנת 2001). בלוטות השד נוצרות בעובר בתהליך של שקיעה פנימה (invagination) של תאים אפידרמליים אל תוך סטרומה שומנית מתפתחת, באופן היוצר מעין צינורית שמתפתחת בהמשך למערכת ה-mammary ducts (עפ"י Robinson ב-Nat Rev Genet משנת 2007).

בעוברים של עכבר ואדם, תאי אפיתל בנבט של רקמת השד מייצרים PTHrP, אשר מגיב עם קולטני PTHR1 המופיעים על פני התאים המזנכימאלים המקיפים. אינטראקציה זו חיונית להתמיינות תקינה של התאים המזנכימאלים, אשר בתגובה מעודדים את הצמיחה של הצינורות (ducts) האפיתליאלים. איבוד האיתות של PTHrP מונע את ה"דו-שיח" החיוני בין תאי האפיתל והתאים המזנכימאלים, מה שעוצר את התפתחות רקמת השד כבר בשלב הנבט. PTHrPגורם למודולציה של איתותי Wnt ו-BMP, כמו גם לביטוי במזנכימה של מספר גורמי שעתוק, כולל הקולטן לאנדרוגנים, Max2 ו-Lef1, כאשר כל אלה תורמים לצמיחה של צינורות עובריים ברקמת השד (Hens וחב' ב-Dev Dyn משנת 2009).

לאחר הלידה, ממשיך PTHrP להיות מבוטא ברמה נמוכה בתאים מיו-אפיתליאלים, כאשר הקולטן PTHR1 מבוטא בתוך הסטרומה מסביב לצינוריות השד. בתקופה הבוגרת, PTHrP מבוטא באופן ניכר על ידי תאי אפיתל בשד בתקופת ההנקה, וכמויות ניכרות שלו מופרשות לחלב (Budayr וחב' ב-Proc Natl Acad Sci USA משנת 1989), אך תפקידו בחלב אינו ברור. יחד עם זאת, PTHrP מופרש גם מרקמת השד לצירקולציה, והוא משתתף בוויסות הסיסטמי של סידן והמטבוליזם של העצם בעת ההנקה. רקמת העצם של האם משמשת כמקור סידן ליצירת חלב, וידוע שבנשים מניקות יש איבוד מהיר של רקמת עצם.

רמות מוגברות של PTHrP בצירקולציה, תואמות איבוד רקמת עצם באדם, כאשר CaSR או calcium-sensing receptor, שהוא קולטן הקשור ל-G-protein type C, ה"חש" בריכוזים חוץ-תאיים של יון הסידן, ומדכא את הפרשת PTHrP מתאי השד (VanHouten וחב' ב-J Clin Invest משנת 2004). תהליך זה מבטא באופן קלאסי לולאת משוב שלילי אנדוקרינית, בה PTHrP מגייס סידן מעצם השלד, כאשר בתגובה מעוכבת הפרשת PTHrP מרקמת השד. מהבנת תפקידו של PTHrP בהגברת ספיגת העצם בעת הנקה, אין זה מפתיע ש-PTHrP תורם גם להמסת רקמת עצם (osteolysis) בתהליך יצירת גרורות לעצם. אי לכך, תאי סרטן שד גרורתיים לעצם מייצרים יותר PTHrP מאשר תאי הגידול הראשוני (Akhtari וחב' ב-Cancer Biol The משנת 2008).

נמצא ש-TGF-β המופרש באזורי ספיגת עצם, מגביר את יצירת PTHrP על ידי מסלול איתותים אליו קשור גורם השעתוק Gli2 (עפ"י Johnson וחב' ב-Cancer Res משנת 2011). בתגובה, מגביר PTHrP את קישורו של גורם השעתוק NF-κB לקולטנו, ומפחית את היצור של osteoprotegerin ובכך מגדיל את כמות התאים האוסטאוקלסטים ואת פעילותם האוסטאוליטית. בנוסף, בניגוד למתרחש בתאי שד תקינים, איתות של CaSR בתאי סרטן שד מגרה בהם את יצירת PTHrP. במחקרם של Henderson וחב' ב-Cancer Res משנת 2006, נחקרו 526 מקרים של סרטן שד בהם נמצא שביטוי של PTHrP היה מנבא בלתי-תלוי למהלך קליני יותר שפיר. גם Li וחב' במחקרם בעכברים שהופיע ב- J Clin Invest משנת 2011, הראו שפגיעה בגן ל-PTHLH האריכה באופן דרמטי את הלטנטיות של סרטן השד והאטה את התפתחות השאת.

===תפקיד PTHrP בטרנספורט של סידן בשלייה===

סידן מועבר דרך השלייה מהאם לעובר (Kovacs ב-J Clin Endocrinol Metabol משנת 2001), כאשר השלייה מייצרת PTHrP שמסייע לשמור על רמת סידן תקינה בעובר. הראשונים שהדגימו את פעילות PTHrP במעבר סידן דרך דופן השלייה היו Rodda וחב' ב-J Endocrinol משנת 1998. בשנת 1990 פרסמו Care וחב' ב-Exp Physiol, ולאחר מכן Wu וחב' ב-J Biol Chem משנת 1996, שדווקא הפפטידים "הפנימיים" ב-PTHrP, דהיינו 67-86 ו-38-94 הם הפפטידים הפעילים ביותר בתחום זה, כאשר לחומצות האמינו בקצה ה-N טרמינאלי של PTHrP אין פעילות דומה. נתון זה רומזים לכך שיש בשלייה קולטנים ספציפיים ל-mid-region של PTHrP. ניסויים בעכברים של Simmonds וחב', בהם נעשתה מניפולציה גנטית אישרו שאמנם ל-PTHrP יש תפקיד בוויסות של הטרנספורט של סידן בשלייה, שחיוני לתהליך המינרליזציה של השלד בעובר (Crit Rev Eukaryot Gene Expr משנת 2012).

===תפקיד PTHrP בהרפיה של שריר חלק===

דוגמה לפעילות הפאראקרינית של PTHrP ניתן למצוא בהשפעתו על תאי שריר חלק בדופן כלי-דם. PTHrP מופרש משריר חלק באיברים רבים, בדרך כלל בתגובה ל-stretching המופעל על שריר זה. כבר משנות ה-20 היה ידוע שהזרקה של תמצית של יותרת בלוטת התריס גרמה בחיות להגברה בזרימת הדם ולהפחתת לחץ הדם (Charbon וחב' ב-Eur J Pharmacol משנת 1968, וכן Wang וחב' באותו כתב עת משנת 1984 ו-Mok וחב' ב-Endocr Rev משנת 1989). אך כאשר התגלה PTHrP, התברר שפעילות זו של הרפיית כלי-דם אינה תפקידו של PTH, אלא היא נובעת מהשפעה פיזיולוגית מקומית של PTHrP המשפיעה גם על שריר חלק בקיבה, במעי, ברחם, בשלפוחית השתן וכן בדופן העורקית (עפ"י Philbrick וחב' ב-Physiol Rev משנת 1996, וכן Qian וחב' ב-Endocrinology משנת 1999, ו-Martin וחב' ב-J Endocrinol משנת 1997).

בשנת 1991 הראו Roca-Cusache וחב' ב-J Pharmacol Exp Ther, ש-PTHrP הבא לביטוי בשריר חלק פועל באופן מהיר להרחבת כלי הדם במנגנון שאינו תלוי באנדותל, כאשר מכווץ כלי דם כמו angiotensin II, משרה עלייה מהירה ביצירת PTHrP (עפ"י Pirola וחב' ב-J Biol Chem משנת 1993). נראה שדווקא ה-PTHrP של גרעין התא, חיוני במיוחד בוויסות השגשוג של תאי שריר חלק בדופן כלי הדם. ל-PTHrP עלולה להיות גם השפעה שלילית, ונמצא שלאחר פרוצדורה אנגיופלסטית של פתיחת כלי דם עם בלון, יש הגברה ביצירת PTHrP, מה שעלול להגביר שגשוג תאי שריר חלק, מה שיכול לעבות את שכבת ה-neointima (עפ"י Fiaschi-Taesch וחב' ב-Circulation משנת 2004, ו-Sicari וחב' ב-J Endocrinology משנת 2012).

===תפקיד PTHrP בבלוטת הלבלב===

בפנקריאס, תאי האיים נמצאו מייצרים PTHrP וכן נושאים את הקולטנים ל-PTH ול-PTHrP, כאשר השפעת PTHrP היא בהגברה משמעותית ברמת סידן בתוך תאי β (עפ"י Vascavada וחב' ב-J Biol Chem משנת 1996) ובשפעול של האנזים phospholipase C (עפ"י Vasvada וחב' ב-Diabetes משנת 2007). מחקרם של Drucker וחב' ב-Mol Endocrinol משנת 2011, הראה שכל ארבעת הסוגים של תאי בלוטת הלבלב, α, β, δ ו-pancreatic polypeptide cells, מייצרים PTHrP. יצירת-יתר של PTHrP כמו גם החדרה של הפפטיד ה-N טרמינאלי 1-36 של חלבון זה לעכברים, מגבירה את יצירת תאי β (עפ"י Gutalu וחב' ב-Diabetes משנת 2010) ומפחית תהליכי אפופטוזיס של תאים אלה, מה שגורם להיפוגליקמיה המושרית על ידי יצירת עודף של אינסולין (Cebrian וחב' ב-Diabetes משנת 2002). ניסויים עדכניים בעכברים, הראו שהזרקות תת-עוריות יומיות של PTHrP 1-36, מגבירות את שגשוגם של תאי β, משפרות את ה-glucose tolerance, ויכולות להילקח בחשבון כטיפול פוטנציאלי בסוכרת (Williams וחב' ב-Diabetologia משנת 2011).

===החלבון PTHrP והשן===

שיניים מתפתחות מוקפות על ידי עצם והן חייבות לפרוץ דרך הכיסוי של הקריפטה הדנטאלית כדי להופיע בחלל הפה. בקיעת שיניים (tooth eruption) דורשת קואורדינציה מרחבית של עצמות הלסת, כאשר אוסטאוקלסטים חייבים לספוג את רקמת העצם המכסה את כתר השן על מנת לאפשר לה לבקוע ולהופיע, ואילו אוסטאובלסטים אמורים ליצור עצם בבסיס השן, כדי לאפשר לה להידחף אל מחוץ לקריפטה. PTHrP מיוצר באופן נורמאלי על ידי תאי ה-stellate reticulum שהם מארג של תאים אפיתליאלים במרכז ה-enamel האפיתליאלי (Beck וחב' ב-Cell Tissue Res משנת 1995, וכן Ouyang וחב' ב-J Bone Miner Res משנת 2000 ו-Tenorio ו-Hughes ב-Arch Oral Biol משנת 1996).

בשנת 1998 פרסמו Philbrick וחב' ב-Proc Natl Acad Sci USA שעל ידי שימוש ב-cytokeratin שהוא טרנסגן של K14-PTHrP, ניתן היה להראות שהחלפת PTHrP באפיתליום של ה-enamel, החזירה לתקינות את פעולת בקיעת השיניים. כיוון שאוסטאוקלסטים אינם מכילים קולטנים מסוג PPR, הממצא הזה תומך בתפקיד ההתפתחותי של PTHrP בהשפעה על אוסטאוקלסטים לפלס דרך לבקיעת השן. תפקידו של PTHrP הוא לאותת לתאי הזקיק הדנטאלי לעודד את יצירת האוסטאוקלסטים מעל הקריפטה. בהיעדר PTHrP לא נוצרים אוסטאוקלסטים אלה, ולא מתרחשת בקיעת השיניים הצעירות.

===מגבלות הבדיקה===

אין לבצע בדיקה זו כדי לשלול ממאירות או על מנת לבחון חולי סרטן לתרחיש של היפר-קלצמיה של ממאירות. PTHrP יכול להיות מוגבר בנשים הרות או מניקות כמו גם ביילודים. תרחישים לא ממאירים שתוארו בהקשר של רמות מוגברות של PTHrP בפלזמה, כוללים systemic lupus erythematosus, לימפאדנופתיה הקשורה ל-HIV, מצב של lymphedema של החזה, וכן במקרה שלך גידולים שפירים של השחלות, הכליות, ושל המערכת הנוירואנדוקרינית (Burtis ב-Clin Chem משנת 1992).

בגלל המוּרכּבוּת של האיזופורמים של PTHrP, ההבדלים בשיטות המדידה השונות של PTHrP והמחסור בסטנדרט כיול אחיד, קיים קושי בהשוואה של רמות הורמון זה או של האיזופורמים שלו בתרחישים שונים. תערובת של האיזופורמים יכולה לפגוע בלינאריות של תוצאות הבדיקה בדגימות פלזמה של מטופלים, ולמנוע קביעה מדויקת של ריכוזי PTHrP (עפ"י Wu וחב' ב-Mayo Clin Proc משנת 1997).

===המשמעות של תוצאות תקינות ובלתי-תקינות של PTHrP===

ריכוזים נמוכים ביותר של-PTHrP עד כדי כאלה שלא ניתן לגלותם הן תוצאות נורמאליות. בנשים מיניקות ניתן לגלות את PTHrP. רמות מוגברות של PTHrP עם רמות מוגברות של סידן בדם, נגרמות בדרך כלל על ידי תהליכים סרטניים. PTHrP יכול להיווצר על ידי סוגי סרטן שונים, כולל סרטן ריאות, שד, ראש וצוואר, מערכת העיכול, שלפוחית השתן והשחלות כמו גם בלויקמיה ובלימפומה. בתלות באוכלוסייה הנבדקת, עד 80% מהנבדקים עם שאתות ממאירות והיפרקלצמיה, יסבלו מ-HHM או humoral hypercalcemia of malignancy. רמה גבוהה של PTHrP היא הסיבה להיפרקלצמיה בערך ב-2/3של חולי הסרטן. בנבדקים אלה בנוסף להיפרקלצמיה ניתן יהיה לגלות גם היפו-פוספטמיה, hypercalciuria, רמות מוגברות של פוספטאזה בסיסית בנסיוב ו-hyperphosphaturia. רמות מוגברות של PTHrP מוצאים גם בנבדקים עם מחלת כליות.

במטופלים עם ממצאים ביוכימיים המרמזים, אם כי לא מוכיחים מצב של היפר-פאראתירואידיזם ראשוני (דהיינו היפרקלצמיה, אך רמות נורמאליות או קרובות לנורמה של פוספאט ושל PTH, כאשר רמת האחרון היא בתחום הנורמה (אם כי מעל 30 פיקוגרם/מ"ל), ניתן לקחת בחשבון אפשרות של HHM, בעיקר אם המטופל קשיש, ובעל היסטוריה של ממאירות, או של גורמי סיכון לממאירות. רמות מוגברות של PTHrP במטופל האחרון, מצביעים על HHM כסיבה להיפרקלצמיה.

==הוראות לביצוע הבדיקה==

ברוב ערכות הבדיקה יש העדפה לנטילת דם במבחנות EDTA (פקק סגלגל) לאחר צום של 8 שעות. הסרכוז נעשה בצנטריפוגה מקוררת, ויש לפסול דגימות המוליטיות באופן בולט. הפלזמה המופרדת יציבה לצורך הבדיקה עד 7 ימים בטמפרטורת החדר, עד 30 יום בקירור, ועד שנה בהקפאה. יש מעבדות המבצעות את הבדיקה בפלזמה שנלקחה במבחנת הפארין (פקק ירוק), אלא שאז יציבות הדגימה שונה: 7 ימים בטמפרטורת החדר או בקירור, וחודש בהקפאה. רצוי לכלול במבחנת נטילת הדם מעכב פרוטאזות דוגמת aprotinin או leupeptin, ויש המשתמשים במעכב הפרוטאזות PPACK או Phe-Pro-Arg-chlomethylketone.

שיטות המדידה: ניתן למדוד רמת PTHrP או על ידי שילוב של שיטת HPLC ו- Tandem Mass Spectrometry, או בשיטת ICMA או immunochemiluminometric assay, תוך שימוש ב-2 נוגדנים שנוקו על ידי כרומטוגרפיית-זיקה מנסיוב של עז מחוסנת כנגד המקטע 1-86 של PTHrP. אחד מ-2 הנוגדנים מסומן עם acridinium ester כנוגדן גלאי (tracer), כאשר הנוגדן השני מקובע על פני כדורונים זעירים (beads). כאשר הפלזמה מכילה PTHrP נוגדן ה-tracer נקשר אל ה-beads וניתן לגילוי וכימות (עפ"י Wu וחב' ב-Ann Clin Lab Sci משנת 1997).

[[קובץ:PTH4.jpg|600px|ממוזער|מרכז|מסלול זרימה של בדיקת מעבדה לרמת PTHrP ]]

==ראו גם==
* [[מדריך בדיקות מעבדה|חזרה לדף מדריך בדיקות מעבדה]]
* [[מפגעים הורמונאליים|בדיקות מעבדה - מפגעים הורמונאליים]]

{{ייחוס|[[משתמש:בן עמי סלע|פרופ' בן עמי סלע]]}}

[[קטגוריה:בדיקות מעבדה - מפגעים הורמונאליים]]
[[קטגוריה:בדיקות מעבדה: אנדוקרינולוגיה]]

7-Dehydrocholesterol-delta 7-reductase

2016-02-02T13:10:24Z

בן עמי סלע:

{{שם שגוי|{{D}}7-Dehydrocholesterol-delta 7-reductase}}
{{בדיקת מעבדה
|שם עברי={{רווח קשיח}}
|שם לועזי={{D}}7-dehydrocholesterol-delta 7-reductase
|קיצור=DHCR7
|תמונה=
|כיתוב תמונה=
|מעבדה=[[כימיה בדם]]
|תחום=אבחון תסמונת Smith-Lemli-Opitz
|יחידות מדידה=
|טווח ערכים תקין=רמה אפסית של 7Dehydrocholesterol
|יוצר הערך=[[משתמש:בן עמי סלע|פרופ' בן-עמי סלע]]
|אחראי הערך=
}}
==האנזים reductase{{כ}}-7{{כ}} ‎7-dehydrocholesterol-delta==
אנזים זה מקודד באדם על ידי הגן DHCR7 הממוקם על הזרוע הארוכה של כרומוזום 11 באתר 11q13.4 {{כ}} (Moebius וחב' ב-Proc Natl Acad Sci USA משנת 1998, ו-Wassif וחב' ב-Am J Hum Genet משנת 1998). אנזים זה מקטלז את השלב האחרון ברצף הריאקציות המובילות ליצירת [[כולסטרול]] מתוצר הביניים dehydrocholesterol{{כ}}-7 (להלן DHC{{כ}}-7) תוך שימוש ב-NADPH. אנזים זה הוא למעשה delta-7-sterol reductase המסיר את הקשר הכפול בין פחמנים 7 ו-8 במולקולה של DHC{{כ}}-7, קשר שנוצר על ידי האנזים sterol delta8-delta7 isomerase. חוסר האנזים DHC reductase{{כ}}-7 הוא הגורם הישיר לתסמונת Smith-Lemli-Opitz (על פי Waterham וחב' ב-Biochem Biophys Acta משנת 2000, ו-Fitzky וחב' ב-Proc Natl Acad Sci USA משנת 1998, וכן Wassif וחב' ב-Am J Hum Genet משנת 1998). יצוין שתסמונת Smith- Lemli- Opitz תוארה לראשונה על ידי שלושת חוקרים אלה במאמר משנת 1964 ב-J Pediatr.

האנזים DHCR7 מאוד יעיל בחיזור של DHC7, אך הוא מסוגל לחזר גם את הקשר הכפול בין פחמנים 7-8 של סטרולים נוספים. רצף חומצות האמינו המקודד על ידי הגן DHCR7 אמור להכיל 475 חומצות אמינו כמו גם מספר motifs של חלבונים, ביניהם מספר motifs של sterol reductase. הוא מכיל מה שקרוי SSD או sterol sensing domain שנחוץ כנראה להתקשרות למצעים סטרוליים. האנזים מכיל גם מספר אתרי זרחון, כולל אתרים ספציפיים לאנזימים הרגולטוריים protein kinase C ו-tyrosine kinase.

==מוטציות בגן DHCR7==
המשקל המולקולארי של האנזים DHCR7 באדם הוא 54,489 דלטון, עם 475 חומצות אמינו והוא בעל נקודה איזואלקטרית של 9.05. הגן המקודד לאנזים זה הוא באורך של 14,100bp ומכיל 9 אֶקסונים ו-8 introns {{כ}}(Porter ב-Eur J Hum Genet משנת 2008), כאשר ה-mRNA התואם הוא באורך של bp{{כ}}2,786 (כאשר שאר הרצף של DNA הוא אינטרוני). על פי Witsch-Baumgartner וחב' ב-Hum Mutation משנת 2001, אֶקסונים 3-9 מקודדים לאנזים. בגן זה ישנן קומבינציות של אינטרונים ואקסונים, ואזור של opening reading frame המכיל 1,425 נוקלאוטידים ונמצא אחרי ה-promoter.

מעניין שהמבנה של הגן DHCR7 בחולדה דומה מאוד לזה שבאדם. הרמות הגבוהות ביותר של ביטוי הגן DHCR7 התגלו בבלוטת האדרנל, באשכים, בכבד ובמוח. ביטוי הגן מושרה על ידי רמות נמוכות של sterol דרך SREBP או sterol regulatory binding proteins. כפי שצוין, האנזים DHCR7 מקטלז את החיזור של DHC7 לכולסטרול, כמו גם את החיזור של dehydrodesmosterol{{כ}}-7 ל-desmosterol. לשם כך זקוק האנזים ל-NADPH כקופקטור, והוא גם כורך פעילות של cytochrome-450 oxidoreductase. ההשערה היא שהאנזים DHCR7 מכיל גם ברזל, והוא מהווה חלבון אינטגראלי בממברנה של הרטיקולום האנדופלזמי, ומכיל 9 מקטעים (domains) טרנס-ממברנאליים.

בהינתן ש-SLOs הוא מפגע אוטוזומאלי-רצסיבי, נדרשות מוטציות בשני העותקים של כרומוזום 11 כדי לגרום למפגע (Yu ו-Patel ב-Clin Genet משנת 2005). עד כה זוהו למעלה מ-150 מוטציות בגן זה, בהן 130 מוטציות missense (עם פגיעה בנוקלאוטיד בודד) שהן השכיחות ביותר ומהוות 87.6% מכלל המוטציות ב-SLOs, כאשר פגיעתן בפעילות האנזים חלקית בלבד, ולעומתן 25 מוטציות Null שהן שכיחות פחות, אך פגיעתן בפעילות האנזים קשה בהרבה (Correa-Cerro ו-Porter ב-Mol Genet Metab משנת 2005). בין מוטציות Null אלו נמנות 8 מוטציות nonsense, חמש מוטציות המוגדרות כ-splice site, שמונה מוטציות שֶמֶט או deletion, שתי מוטציות insertion, ומוטציית indel אחת (שהיא מוטציית "תערובת" בה יכולים להופיע insertions או deletions של נוקלאוטידים). יש הכורכים מוטציות missense אלו בהתרחשות הפלות ספונטניות.

המוטציה השכיחה ביותר ב-DHCR7 היא מוטציית IVS8-1G>C או c.832-1G>C, המהווה 28.2% מכלל מקרי SLOs. מוטציה זו פוגעת בחיבור בין exon8 ו-exon9, מה שגורם ל-insertion של 134bp של רצף אינטרוני של נוקלאוטידים לתוך ה-mRNA של DHCR7. תרחיש זה מביא ל-frameshift ולהופעה מוקדמת של stop codon (נחשבת למוטציית nonsense או Null mutation). חולים עם מוטציה זו התגלו לראשונה באיים הבריטיים, עם שכיחות נשאים (carriers) של 1.09% באוכלוסייה לבנה ממוצא אירופי. בהמשך נמצא שהנשאוּת של מוטציה זו בקרב אוכלוסיות Caucasian בעולם כולו עומדת על כ-3%, והיא נמוכה יותר בקרב אסייאנים ואפריקאים.

המוטציה השנייה בשכיחותה (10.4%) היא 278C>T בה מתיונין בעמדה 93 משוחלף על ידי תראונין. זו מוטציית missense עם תסמינים מתונים, וזו המוטציה השכיחה ביתר באוכלוסיות של איטלקים, קובּאנים, ואלה ממוצא ים תיכוני. המוטציה השלישית בשכיחותה )6.0%) היא 452G>A, שהיא מוטציית nonsense עם טריפטופן קצה בעמדה 151, המונעת את יצירת האנזים. משערים שהיא החלה בדרום פולין וכיום היא שכיחה בעיקר במדינות צפון אירופה. מוטציות נוספות בסדר שכיחות יורד הן: מוטציית missense הידועה כ- 1210C>T עם ארגינין במקום ציסטאין בעמדה 404 עם שכיחות של 5.2% (על פי Witsch-Baumgartner וחב' ב-Am J Hum Genet משנת 2000); מוטציה 976G>T עם ואלין במקום לאוצין בעמדה 1326 ושכיחות של 5.0%; מוטציה C<T1054 עם ארגינין במקום טריפטופאן בעמדה 352 ושכיחות של 3.2%; מוטציה 1342G>A עם חומצה גלוטמית במקום ליזין בעמדה 448 ושכיחות של 3.2%; מוטציה 1228G>A עם גליצין במקום סרין בעמדה 410 ושכיחות של 2.2%; מוטציה 725G>A עם ארגינין במקום ציסטאין בעמדה 242 ושכיחות של 1.8%; מוטציה 506C>T עם סרין במקום לאוצין בעמדה 169 ושכיחות של 1.7%; מוטציה 906C>G עם פניל-אלנין במקום לאוצין בעמדה 302 ושכיחות של 1.3%; מוטציה 725G>A עם ארגינין במקום היסטידין בעמדה 242 ושכיחות של 1.0%. שתיים עשרה מוטציות אלו מהוות ביחד 69.2% מכלל המוטציות ב-SLOs. ברוב החולים עם SLOs נתגלו 2 מוטציות Null בגן, או עם שתי מוטציות בלולאה 8-9, ואילו במקרים של 1-2 מוטציות בלולאה 1-2, או עם מוטציה אחת בקצה ה- N טרמינאלי, הפנוטיפ היה קל בהרבה ורק במקרים נדירים התגלתה רק מוטציה אחת (Waterham ו-Hennekam ב-Am J Hum Genet משנת 2012).

[[קובץ:DHCR7-1.png|מרכז|500 פיקסלים]]

הדגמה של מיקומו של האנזים dehydrocholesterol reductase{{כ}}-7 בממברנת התא (בחלק העליון של התרשים) כאשר הסגמנטים הטרנס-ממברנאליים 4 עד 8 מייצגים את המקטע (domain) המשומר ביותר ובעל הזיקה הגבוהה למצעים סטרוליים (Fitzky וחב' ב-Proc Natl Acad Sci USA משנת 1998). מקומן של מוטציות Null (בשחור) ומוטציות missense (באפור) מודגש. בחלק התחתון של התרשים מתואר ארגון ה-intron-exon כאשר הרצפים המקודדים מסומנים באפור.

==תסמונת Smith-Lemli-Opitz==

תסמונת Smith-Lemli-Opitz (להלן SLOs) היא מפגע אוטוזומאלי-רצסיבי הנוצר על ידי מוטציה בגן DHCR7 מה שגורם לחסר באנזים reductase {{כ}}7{{כ}} dehydrocholesterol-delta{{כ}}-7, וכתוצאה מכך להצטברות בפלזמה של שני הקודמנים של כולסטרול, (DHC{{כ}}-7) {{כ}}dehydrocholesterol{{כ}}-7 ו-(DHC{{כ}}-8){{כ}}
dehydrocholesterol{{כ}}-8. קלינית התסמינים יכולים לכלול [[מיקרוצפאלי]], [[פיגור בגדילה]], [[פיגור התפתחותי]], תווי פנים דיסמורפיים , [[חך שסוע]] (cleft palate), פגמים בגפיים ובעיקר 2-3 syndatyly באצבעות הרגליים וכן פולידקטיליה פוסטאקסיאלית (הופעת אצבע נוספת או חלקה ליד אצבעות כף היד), וכן עיוותים במבנה הלב והכליות וחסכים קוגניטיביים.

[[קובץ:DHCR7-2.png|ממוזער|מרכז|500 פיקסלים|סינדקטיליה של אצבעות 2 ו-3 בכף הרגל]]

==השכיחות של SLOs==

שכיחות מפגע זה מוערכת בין 1:20,000 ל-1:40,000 לידות-חי (Tint וחב' ב-N Eng J Med משנת 1994, ו- Nowaczyk וחב' ב-J Pediatr משנת 2004), אם כי באלה ממוצא צפון או מרכז אירופי השכיחות מוערכת בין 1:10,000 ל-1:60,000 (על פי Porter ב-Mol Genet Metab משנת 2000 ו-Yu ו-Patel ב-Clin Genet משנת 2005). בקרב אלה ממוצא אסיאתי או אפריקני SLOs פחות שכיחה (Wright וחב' ב-Am J Med Genet משנת 2003). ייתכן מאוד שהשכיחות גבוהה יותר שכן האבחון של SLOs בקרב נשים מוחמץ לעתים יותר מאשר בקרב גברים, בגלל חסר של אנומליות באברי המין הבולטים באופן מובהק יותר בגברים הלוקים במחלה.

מחקר של Battaile וחב' ב-Mol Genet Metab משנת 2001 כלל בדיקה של 1,503 טיפות דם מיובשות שנלקחו מסקר יילודים, כאשר ב-16 מתוכן נמצאה המוטציה IVS8-1G>C. נתון זה שימש לחישוב השכיחות של 1:30 של נשאים, המנבאת שכיחות של SLOs בין 1:1,590 ל-1:13,500. חישוב זה של שכיחות צפויה של SLOs הגבוהה משמעותית מזו הנצפית קלינית באופן מעשי, יכול להיות מוסבר או על ידי תמותה מוגברת של עוברים הפגועים עם SLOs ברחם, או מלידה של יילודים מתים עם פגיעת SLOs, או מדיווח-חסר של פרטים פגועים באופן מתון, בהם לא מופיעים התסמינים החיצוניים האופייניים למחלה.

[[קובץ:DHCR7-3.png|ממוזער|מרכז|500 פיקסלים|פתוגנזה של תסמונת Smith-Lemli-Opitz]]

==מודלים גנטיים של SLOs בחיות==

עכברים וחולדות משמשים הרבה לבחינת פרמטרים שונים של SLOs שכן מבנה האנזים DHCR7 של מכרסמים אלה דומה לזה של אדם. שתי דרכים מקובלות לקבלת תסמיני SLOs הן או על ידי שימוש בחומרים טרטוגנים או על ידי מניפולציות גנטיות ליצירת מוטציות בגן האמור בחיות אלו.

מודלים גנטיים מיוצרים על ידי פגיעה ישירה (knocking out) בגן DHCR7. מחקר של Wassif וחב' ב-Hum Mol Genet משנת 2001, תאר פגיעה בגן זה בתאי גזע עובריים של עכברים. בדומה למקובל באדם, עכברים הטרוזיגוטיים (בהם רק באלל חד נוצרה מוטציה) הם נורמאליים פנוטיפית, והם זווגו עם עכברים בהם המוטציה מופיעה באלל הנגדי. העכברים ההומוזיגוטים לפגם זה שנולדו, מתו כבר ביום הראשון לחייהם, בגלל הכשל שלהם לינוק, והראו בפרק חייהם הקצר מאפיינים דומים לאלה המופיעים בבני אדם עם SLOs. היו להם רמות נמוכות של כולסטרול, רמות מוגברות של 7{{כ}}DHC ו-8{{כ}}DHC, היו במשקל נמוך יותר בלידתם מזה של עכברים בריאים מאותו זן, תנועתם הייתה מוגבלת יותר, ואף ניכרו בהם עיוותים cranio-facial. ממצאים אלה מוסברים בכך שכולסטרול במכרסמים יכול לעבור את השליה, והוא חיוני להתפתחות העובר. באדם, מעט מאוד מהכולסטרול של האם מועבר לעובר.

יחד עם זאת, המגוון המשמעותי בחומרת התסמינים, אפילו בקרב אנשים עם מוטציות דומות בגן DHCR7, מרמז לכך שקיימות השפעות משמעותיות על הפנוטיפ מעבר למוטציות האמורות (Porter ב- Mol Genet Metab משנת 2000). גורם חשוב אחד עשוי לכלול את הטרנספורט של כולסטרול מהאם לעובר בשלב מוקדם של ההיריון. פנוטיפ חמור יותר של המחלה נמצא בתינוקות שנולדו לאימהות בעלות האלל APOE E2 שעלול להפריע לקישור של ליפופרוטאינים ממקור האם המכילים apo E בשליה (Witsch-Baumgartner וחב' ב-J Med Genet משנת 2004, ו-Woollett ב-Am J Clin Nutr משנת 2005).

מודלים טרטוגניים מושרים על ידי האכלת חולדות או עכברים בהיריון עם מעכבים של DCHR7. שני מעכבים שכיחים הם BM15766 או chlorocinnamyl) piperazin-4-yl]ethyl)-benzoic acid{{כ}}-4)-1]-2)-4 ו- AY9944 או
trans-l,4-bis(2-chlorobenzylaminomethy1)cyclohexane dihydrochloride. המעכב AY9944 משרה holoprosencephaly ועיוותים מיניים כפי שמוצאים באנשים עם SLOs (על פי Wolf וחב' ב-J Lipid Res משנת 1996), וכן לפגוע בקולטן לסרוטונין שהוא פגם אחר שמוצאים בחולים עם SLOs (על פי Xu וחב' ב-Bichem Biophys Acta משנת 1996). המעכב השני-BM15766 גורם לחuסר כולסטרול וחומצות מרה כפי שמוצאים במחלה זו באדם. מגבלה אחת של מעכבים אלה בחיות היא שרמות DHC{{כ}}-7 ו-DHC{{כ}}-8 נמוכות יותר ממה שמקובל בחולי SLOs. הנתון האחרון יכול להיות מוסבר על ידי העובדה שבני-אדם חולים חווים חסם קבוע של פעילות DHCR7, בעוד שעכברים וחולדות המטופלים במעכבים אלה חווים רק חסמים חולפים. יתרה מכך, זנים שונים של עכברים וחולדות עמידים יותר לפעולת המעכבים הטרטוגנים ולכן עלולים להיות פחות יעילים במודלים בחיות ל-SLOs.

==חסר כולסטרול, הגורם העיקרי ל-SLOs==

לכולסטרול יש תפקיד חיוני בתהליכים תאיים והתפתחותיים רבים. בנוסף להיותו מרכיב בממברנת התא, הוא משמש קודמן (precursor) של מספר מולקולות חיוניות בשגשוג תאים ובהתמיינות (differentiation) שלהם, בגליקוזילציה של חלבונים, ובמסלול איתות תאיים. הביוסינתזה של כולסטרול והמרתו לתרכובות חשובות אחרות כמו הורמונים אחדים מורכבת ביותר, וכורכת מספר גדול של תוצרי ביניים ותהליכים אנזימטיים. מפגעים הנובעים מחסר של אנזימים אלה, מביאים להצטברות תוצרי הביניים ומניעה של יצירת כולסטרול כמו גם תוצרי ביניים הנמצאים במסלול הביוסינתזה של כולסטרול. ממצאים קליניים המשותפים למפגעים בביוסינתזה של כולסטרול, כוללים עיוותי שלד מוּלדים, תווי פנים דיסמורפיים, פיגור התפתחותי פסיכו-מוטורי וכשל שגשוגי (FTT).

==המטבוליזם והתפקוד של כולסטרול==

כולסטרול יכול להתקבל מהמזון אך הוא יכול להיווצר גם על מסלולי מטבוליזם בגוף עצמו, שמתרחשים בעיקר בכבד, אך גם במעיים. ראוי לציין שכולסטרול אינו יכול לעבור דרך מחסום דם-מוח (BBB), כך שבתוך המוח הביוסינתזה שלו היא המקור היחיד של מולקולה זו (Patti וחב' ב-Neuroscience משנת 2010). באדם, הסינתזה של כולסטרול מתחילה במסלול ה-mevalonate המוביל לסינתזה של FPP או farnesyl pyrophosphate. מסלול זה משתמש ב-2 מולקולות של acetyl-CoA וב-2 מולקולות של NADPH ליצור mevalonate, העובר מטבוליזם ליצירת IPP או isopentenyl pyrophosphate תוך שימוש ב-3 מולקולות ATP. משלב זה 3 מולקולות IPP נחוצות ליצור מולקולה אחת של FPP. השילוב של 2 מולקולות FPP מביא ליצירת squalene מה שמייצג את הצעד המחויב הראשון ליצירת כולסטרול, שכן squalene מביא ליצירת lanosterol ממנו יש מספר מסלולים המוליכים לביוסינתזה של כולסטרול. הצעד הנחשב ל-rate limiting הוא ההפיכה של hydroxy-3-methylglutaryl-CoA{{כ}}-3 (או HMG-CoA) ל-mevalonate, צעד המקוטלז על ידי האנזים HMG-CoA reductase.

[[קובץ:DHCR7-4.png|ממוזער|מרכז|500 פיקסלים|רצף הריאקציות והשלבים בביוסינתזה של כולסטרול]]

מספר ריאקציות מורכבות מביאות את lanosterol ליצירת zymosterol. בנקודה זו חל פיצול במסלול יצירת כולסטרול. באדם, המסלול העיקרי ידוע כמסלול Kandutsch-Russel (על פי Nowaczyk ו-Waye ב-Clin Genet משנת 2001), בו zymosterol עובר מטבוליזם ליצירת α-cholesta-7,24-dien-3β-ol{{כ}}-5, ממנו ל-lathosterol, וממנו ל-dehydrocholesterol{{כ}}-7, או DHC7. המטבוליט האחרון הוא הקודמן המידי של כולסטרול, והאנזים DHCR7 הוא האחראי להפיכתו לכולסטרול. אנזים זה מחזר את הקשר הכפול על פחמן 7 של DHC7 ליצירת תוצר לא אסטרי, ומוטציות באנזים זה אחראיות לפגמים המופיעים ב-SLOs. במסלול אחר המביא לסינתזה של כולסטרול, DHCR7 דרוש לחיזור של dehydrodesmosterol{{כ}}-7 ליצירת desmosterol.

==הרגולציה של סינתזת כולסטרול==

מסלול הסינתזה של כולסטרול מורכב ונמצא תחת בקרה העוברת בעיקר דרך האנזים HMG-CoA reductase, ומתבצעת על ידי לולאת משוב הרגישה לרמות כולסטרול בתאים. ארבעת השלבים העיקריים של בקרה זו הם כדלקמן:

הסינתזה של האנזים HMG-CoA reductase מבוקרת על ידי SREBP או sterol regulatory element binding protein, שהוא גורם שעתוק שאינו פעיל כאשר רמות כולסטרול גבוהות, ונכנס לפעולה כאשר רמות אלו נמוכות. כאשר רמות כולסטרול נופלות, משתחרר SREBP מממברנת גרעין התא או מהרטיקולום האנדופלזמי ונודד לגרעין וגורם לשעתוק של הגן ל-HMG-CoA reductase. התרגום על פני mRNA של HMG-CoA reductase מעוכב על ידי נגזרות של mevalonate וכן על ידי כולסטרול המגיע מהמזון. הפירוק וההפחתה של HMG-CoA reductase מבוקרים באופן הדוק: כאשר החלק של אנזים זה הקשור לרטיקולום האנדופלזמי קולט איתותים, כגון עליה ברמת כולסטרול, הוא עובר פירוק פרוטואליטי. כאשר HMG-CoA reductase עובר זרחון, פעילותו פוחתת. משמעות הדבר שכאשר רמת האנרגיה (ATP) בתא נמוכה, סינתזת כולסטרול פוחתת.

==תפקידו של כולסטרול==

כולסטרול הוא אחד הליפידים המרכזיים הכרוכים בתהליכים מטבוליים, בתפקוד התאי, ובמבנה התא. בעיקר חשיבותו בבקרה על הנוזליות (fluidity) של השכבה הכפולה (bilayer) של פוספוליפידים בממברנת התא. יתרה מכך, כולסטרול מהווה מרכיב ב-lipid rafts, שהם צברים של חלבונים וליפידים (כולל כולסטרול וספינגוליפידים) ה"שטים" בתוך ממברנת התא, ומהווים חלק חשוב בתפקוד הממברנה. חלקיקי ה-lipid rafts מאורגנים או קשוחים יותר מאשר ה-bilayer העוטף אותם, ותפקידם חשוב בעיקר בכך שחלבונים שונים הם בעלי זיקה גבוהה אליהם. קישור זה חיוני בהעברת איתותים (signals) בינתאיים. כולסטרול פועל ספציפית כ"דבק" ב-lipid rafts אלה, ובהעדרו מתרחש תהליך הפרדה בין חלבונים למרכיבי ממברנה אחרים (Simons וחב' ב-J Clin Invest משנת 2002).

בהינתן ששכיחותו הניכרת בממברנות תאים, כולסטרול כרוך במידה רבה בתהליכי טרנספורט מסוימים. הוא עשוי להשפיע על תפקודן של תעלות יונים וטרנספורטרים ממברנאלים אחרים. לדוגמה, כולסטרול נחוץ לפעילות קישור ליגנדים של הקולטן לסרוטונין (Singh וחב' ב-Biochem Biophys Res Commun משנת 2007). בנוסף, כולסטרול מאוד חיוני בתהליכי exocytosis. כמו כן, כולסטרול קשור למודולציה של תכונות ממברנאליות, ועשוי לווסת את האיחוי של vesicles בתוך הממברנה. בהינתן שתאי עצב תלויים מאוד בתהליכי exocytosis להעברת איתותים (impulses) יש לכולסטרול תפקיד מאוד חיוני במערכת העצבים (Linetti וחב' ב-J Cell Science משנת 2010).

מסלול רלוונטי במיוחד בו נוטל כולסטרול חלק, הוא מסלול ה-hedgehog signaling המעביר מידע חיוני לתאים עובריים הנחוץ להתפתחותם. מסלול זה חיוני כאמור בשלב התפתחות העובר, ונוטל חלק בקביעת הרקמה אליה אמורים התאים העובריים לנדוד באמבריוגנזה. חלבוני hedgehog כרוכים גם בשעתוק של גנים המווסתים את ההתמיינות והשגשוג של תאים. כולסטרול חשוב למסלול זה כיון שהוא נקשר קו-וולנטית לחלבוני hedgehog ומשפעל אותם (Herz וחב' ב-Nat Genet משנת 1997). בריכוזי כולסטרול נמוכים, פעילות איתות זו נפגעת כמו גם התמיינות התאים (Ingham ב-Current Biol משנת 2008). מצב זה עלול לתרום לריבוי המומים המולדים אותם מזהים בלית תינוקות פגועים עם SLOs. חלבון איתות ייחודי המשתייך למשפחת חלבוני hedgehog הואSHH או sonic hedgehog החשוב להתפתחות מערכת העצבים המרכזית. חלבוני Hedgehog אחרים כרוכים כנראה בהתפתחות אברי הרבייה והשלד.

כולסטרול הוא קודמן של מולקולות חשובות רבות, כולל חומצות מרה, אוקסיסטרולים, נוירו-סטרואידים גלוקו-קורטיקואידים, מינראלו-קורטיקואידים (החיוניים למאזן האוסמוטי), וסטרואידי-המין (כגון אסטרוגן וטסטוסטרון, כמו גם בהתפתחות העוברות של אברי הרבייה). לבסוף, כולסטרול הוא מרכיב עיקרי במיאלין העוטף את האקסונים של תאי עצב לצורך הבידוד החשמלי שלהם. תהליך המיאלינציה מתרחש באופן אינטנסיבי בשלבי התפתחות העובר, מה שמדגיש את החיוניות בביו-סינתזה של כולסטרול בשלבים אמבריונאליים.

==זיהוי נשאים==

כיוון שקיימת חפיפה ניכרת בין תחומי הריכוזים של כולסטרול ו-DHC{{כ}}-7 בנסיוב של נשאי המחלה ושל אנשים בריאים, לא ניתן לקבוע את הסטאטוס של נשאים על ידי מדידה של רמת כולסטרול ו-DHC{{כ}}-7. לעומת זאת, ניתן לקבוע בוודאות באופן ביוכימי את נשאוּת המחלה על ידי שימוש בפיברובלסטים (Shefer וחב' ב-Metabolism משנת 1997). ניתן כמו כן לקבוע נשאוּת על ידי אנליזה מולקולארית-גנטית אם ידועות המוטציה או המוטציות שגרמו ל-SLOs בבני משפחה אחרים.

==הריונות בסיכון גבוה ל-SLOs ובחינה prenatal של SLOs בהיריון==

בהריונות שיש בהם סיכון של 25% ל-SLOs על פי סיפור משפחתי, תוצאה של רמות לא תקינות של DHC{{כ}}-7 בנוזל מי-שפיר בשבועות 15-18 (על פי Abuelo וחב' וכן Rossiter וחב' ב-Am J Med Genet משנת 1995, וכן Dallaire וחב' ב-Prenat Diagn משנת 1995, כמו גם Griffiths וחב' ב-Clin Chem משנת 2008), או ברקמה המופקת מדגימות של סיסי שליה (CVS) בשבועות 10-12 להיריון (Mills וחב' ב-Pediatr Res משנת 1996, ו-Sharp וחב' ב-Prenat Diagn משנת 1997), נחשבות אבחוניות. יש לנקוט בזהירות באבחון פרטים עם סיפור משפחתי של צורה מתונה של SLOs, ובמקרים אלה יש להדגים את חסר האנזים בתאים ממקור השלייה (amniocytes) שמגדלים בתרבית.

אם שתי מוטציות ב-DHCR7 זוהו בעובר הנבדק, ראוי לבצע בחינה גנטית מולקולארית במקום בדיקה ביוכימית, כדי לחזור ולהבהיר תוצאות בלתי-פסקניות (Loeffler וחב' ב-Prenat Diagn משנת 2002, ו-Waye וחב' באותו כתב עת משנת 2007). בעוּבּרים עם אנומליות מולדות מרובות, ניתן לאבחן SLOs בבדיקה סונוגראפית. פיגור בשגשוג של העובר (IUGR) אופייני אף הוא במקרים של SLOs. מאפיינים של תווי-פנים לא תקינים ניתן לאבחן בדיקת על-שמע כבר בשבוע ה-18 להיריון (Nowaczyk ו-Irons ב-Am J Med Genet משנת 2012, ו-Quelin וחב' ב-Eur J Med Genet מאותה שנה). יחד עם זאת, יצוין שממצאי בדיקת על-שמע יכולים להתקבל תקינים בעיקר במקרים מתונים של SLOs (על פי Goldenberg וחב' ב-Am J Med Genet משנת 2004).

כאשר לאישה בהיריון מוצאים בנסיוב רמות נמוכות של estriol חופשי, או ממצאי בדיקה "משולשת" או בדיקה מורחבת של 4 פרמטרים המתאימים לתסמונת trisomy אלא שתוצאות האנליזה הקריוטיפּית תקינות, זה יכול לשמש מדד של SLOs או של חסר באנזים steroid sulfatase. מחקר של Shackleton וחב' שפורסם ב-1999 ב-J Clin Endocrinol Metab, הראו נוכחות יוצאת דופן של estriols האופייניים לסוס שהיוו למעלה ממחצית האסטרוגנים שהופרשו על ידי אישה שברחמה עובר פגוע עם SLOs. כך זוהו estratetraene-3,16α,17β-triol{{כ}}-7{{כ}},(10){{כ}}3,5 וכן estrapentaene-3,16α,17β-triol{{כ}}-6,8{{כ}}(10){{כ}}1,3,5.

==תסמינים פיזיים של SLOs==
התסמינים השכיחים ביותר הם מיקרוצפאלי, היצרוּת המרחק בין הרקות, ptosis, אף קצר, המאנגיומה קפילארית של האף, לסת קטנה מאוד (מיקרוגנטיה) וקפלים אפיקנטליים בזוויות העין. מאפיינים פיסיים אחרים שיכולים להופיע כוללים: אוזניים במנח נמוך ונטייה לקיפול לאחור, חך נוקשה צר ומוגבה, חך או שפה שסועים, ניוון של הקורפוס קלוסום, היפופלזיה צרבראלית, אונה מצחית קטנה בממדיה, פולידקטיליה של אצבעות הרגליים או הידיים, סידקטיליה של אצבעות 2 ו-3 בכף הרגל, בוהן קצרה, עיוותים באצבעות אחרות, איבר מין זכרי דמויי אבר מין נקבי, פגמים מולדים לבביים, אי-סדירות של הכליות, הריאות, הכבד והעיניים.

כיוון שכולסטרול הוא קודמן של הורמונים סטרואידים, כולל קורטיזול, אלדוסטרון וטסטוסטרון, ניתן להבין את היקפן של הבעיות האנדוקריניות המופיעות כולל היפוגליקמיה, יתר לחץ-דם ואי-סדירות אלקטרוליטית. אי-ספיקה של האדרנל עלולה לגרום לאי-סדירות אלקטרוליטית חמורה (Chemaitikky וחב' ב-Horm Res משנת 2003). גברים עם SLOs חמור, סובלים מרמות נמוכות מאוד של טסטוסטרון (Chasalow וחב' ב-Steroids משנת 1985).

Park וחב' ב-J Pediatr משנת 1968 וכן Lin וחב' ב-Am J Med Genet משנת 1997,דווחו על עד 50% מאלה עם SLOs הסובלים מפגמים לבביים הקשורים לבעיות קרדיו-רספירטוריות. בחולים אלה אובחנו גם בעיות מורפולוגיות של אונות הריאה שמעורבותם ניכרת בבעיות נשימתיות בחולים אלה (Donnai וחב' ב-J Med Genet משנת 1986, ו- Quélin וחב' ב-Eur J Med Genet משנת 2011). בערך רבע מהלוקים ב-SLOs ובלים מפגמים ואי-סדירות בפעולת הכליות כגון היפופלזיה כלייתית, ציסטות קורטיקליות בכליות, הידרונפרוזיס, אי-סדיקות מבנית של המערכת המאספת (Nowaczyk וחב' ב-Am J Med Genet משנת 2001, ו-Ryan וחב' באותו כתב עת משנת 1998).

==ממצאים קליניים==

חוסר כולסטרול המאפיין SLOs היא תופעה הנוגעת במגוון גדול של מפגעים צפויים במערכות גוף שונות (Ryan וחב' ב-J Med Genet משנת 1998). לידת עכוז טרם-עת שכיחה. היילודים והתינוקות בהמשך מפגינים כוח יניקה דל, רגזנות, ו-FTT (על פי Pinsky ו-DiGeorge ב-J Pediatr משנת 1965). בעיות ההזנה נובעות מהיפוטוניה, חוסר קואורדינציה מוטורית פומית, ובעיות גסטרואנטרליות הקשורות לחוסר תנועתיות או תנועתיות דלה במערכת העיכול, עצירות ורפלוקס גסטרו-אזופגאלי. בעיות ההזנה עלולות לנבוע גם מהיצרות שוער הקיבה (pyloric stenosis) ו[[מחלת הירשפרונג]] הכרוכה בחלק ממקרי SLOs (על פי Dallaire ו-Fraser ב-J Pediatr משנת 1966, וכן Patterson וחב' באותו כתב עת משנת 1983 ו-Lipson ו-Hayes באותו כתב עת משנת 1984). מחלת כבד יכולה להופיע במגוון רחב של תסמינים מכולסטאזיס חמור עד עליה מתונה באנזימי כבד.

תסמינים מולדים של [[ירוד]] (cataract) מופיעים ב-20% ממקרי SLOs (על פי Finley וחב' ב-J Pediatr משנת 2012, ו-Goodwin וחב' ב-Am J Med Genet משנת 2008). ממצאים אופתלמולוגיים אחרים כוללים ptosis, אטרופיה או היפופלזיה של עצב הראייה, ניסטגמוס ופזילה (Atchaneeyasakul וחב' ב-Am J Med Genet משנת 1998). שינויים בתגובה הפוטו-רצפטורית של הקנים (rods) בילדים עם SLOs דווחה על ידי Elias וחב' ב-Arch Ophthalmol בשנת 2003, וכן דווח על שינויים דומים במבוגרים עם SLOs (על פי Garry וחב' ב-Doc Opthalmol משנת 2010).

==מאפיינים התנהגותיים בחולי SLOs==
במקרים של רמת משכל נמוכה שמוצאים לעתים בחולי SLOs, הם יכולים להגיב באופן שלילי או על ידי יתר-אקטיביות לגירויים תחושתיים שונים. ברבים מהחולים מוצאים התנהגות אגרסיבית הכוללת נטייה לפגיעה עצמית (כגון הכאה עצמית בידיים או חבטת הראש בקיר או ברהיטים או להפרעות שינה (Tiemey וחב' ב-Am J Med Genet משנת 2001). ניתן למצוא בהם נטייה בולטת לרגזנות.

מעניין לציין שהתנהגות אוטיסטית והיפר-אקטיביות מזוהים לעתים קרובות בילדים עם SLOs (על פי Bukelis וחב' ב-Am J Psychiatry משנת 2007). ההתנהגות האוטיסטית האופיינית ביותר באלה עם SLOs היא תנועה נמרצת וממושכת של פלג הגוף העליון (opisthokinesis), מתיחת פלג הגוף העליון ומחיאות כפיים מדי פעם. יש המעריכים שב-46-53% מהמאובחנים עם SLOs ניתן להבחין בתסמינים המופיעים בקשת האוטיסטית (Sikora וחב' ב-Am J Med Genet משנת 2006). בחלקם ניכרת אי-שליטה עצמית וחסכי תקשורת וקשרים חברתיים (התנהגויות נוספות הכרוכות עם SLOs יכולות להיכרך עם אי-סדירויות פיסיקאליות. כמו בעיות ההזנה (Diaz-Stransky ו-Tiemey ב-Am J Med Genet משנת 2012).

הפגיעה הקוגניטיבית בחולי SLOs יכולה כאמור להיות גבולית אך להגיע גם לרמת משל נמוכה משמעותית (Mueller וחב' ב-Am J Med Genet משנת 2003, וכן Lowry ו-Yong באותו כתב עת משנת 1980).

==אבחון מבדיל==
למרות שבתסמינים רבים ניתן למצוא עיוותי-גוף המופיעים ב-SLOs כגון פולידקטיליה, חך שסוע או היפּוֹספּדיאס (כאשר פתח השופכה ממוקם בחלק התחתון של הפין), רק לעתים נדירות תסמינים אלה יכילו יותר מ-2 עיוותים משותפים ל-SLOs. במקרים אלה הממצאים הביוכימיים הנלווים עשויים לסייע בהבדלה בין SLOs לבין תסמינים אחרים. מבחינה ביוכימית, רק ב-SLOs ניתן למצוא רמות מוגברות של 7-DHC במקביל לרמות נמוכות של כולסטרול בפלזמה. בין התסמינים האחרים עם אי-סדירות בביו-סינתזה של סטרולים ניתן לציין את desmosterolosis (בה ניתן למצוא macrocephaly או microcephaly, גשר-אף היפופלסטי, רכסים מכתשיים (alveolar ridges) מעובים, קשרירים (nodules) בחניכיים, חך שסוע, פגיעה במערכת הוורידית של הריאות, עיוותים באברי מין, גפיים קצרות ואוסטאו-סקלרוזיס), ו-lathosterolosis (בה ניתן למצוא microcephaly, מצח צר, גשר-אף משוקע, חך שסוע, כבד שומני ואי-סדירויות המטולוגיות), או תרחיש בגברים של X-linked chondrodysplasia punctata, קשים להבדלה קלינית מ-SLOs,אך המדדים הביוכימיים שונים בתכלית.

הספקטרום הקליני של המחלה רחב, כאשר באלה עם תסמינים מתונים ניתן למצוא רק סינדקטיליה של אצבעות 2-3 בכפות הרגליים וחסר קוגניטיבי קל. מפגעים אחרים של ביוסינתזה של כולסטרול, הכוללים חסר באנזים desmosterol reductase וכן sitosterolemia, יכולים להראות תסמינים דומים לאלה של SLOs, וניתן לאבחן מפגעים אלה באופן ביוכימי על ידי בדיקה כמותית של סטרולים בפלזמה.

==רמות כולסטרול בנסיוב==
למרות שמׅתאם מדויק בין רמות כולסטרול בנסיוב לבין הממצאים הקליניים אינו מעשי, רוב המחקרים זיהו מתאם הפוך בין רמות כולסטרול בנסיוב לבין החומרה של תסמיני SLOs (Tint וחב' ב-J Pediatr משנת 1995, ו-Waterham ו-Hennekam ב-Am J Med Genet משנת 2012). התמותה בקרב אלה עם SLOs גבוהה במיוחד כאשר רמות כולסטרול אצלם נמוכות במיוחד (כ-10 מיליגרם/ד"ל). למרות שרוב המאובחנים עם SLOs מראים היפו-כולסטרולמיה, רמות כולסטרול בנסיוב בבריאים ובחולים עם SLOs יכולים להיות חופפים, בעיקר אם הלוקים במפגע הם בגיל מבוגר יותר או שהם בעלי פנוטיפ מתון של המחלה (Kelley וחב' ב-Am J Med Genet משנת 1996). יצוין שבערך ב-10% ממקרי SLOs רמות כולסטרול בנסיוב נורמאליות.
==הנזק הנגרם מרמה מוגברת של DHC{{כ}}-7==

רבים מהתסמינים ב-SLOs נובעים מההשפעה הטוקסית של DHC{{כ}}-7, שפוגע בעיקר בטרנספורט התוך-תאי של כולסטרול. רמה מוגברת של DHC{{כ}}-7 מביאה לפירוק מוגבר של האנזים HMG-CoA reductase. בנוסף, DHC{{כ}}-7 הוא הליפיד הפעיל ביותר בתרחיש הפראוקסידציה של ליפידים, ולכן עלול לתרום לעקה חמצונית סיסטמית. כידוע, פראוקסידציה של ליפידים פוגעת בממברנות תאים, ויכולה להרוס חלקיקים (organells) תוך-תאיים הקשורים לממברנות. למרות הדמיון המבני ביניהם, DHC{{כ}}-7 אינו מסוגל לבוא במקום כולסטרול ב-lipid rafts . בנוסף, חסר כולסטרול מגביר את הנזילוּת של ממברנת התא, מה שעלול להגביר הפרשה בלתי נורמאלית של גרנולות תאיות. שינויים ממברנאליים אלה עלולים להפריע לדה-גרנולציה של תאי-פיטום (mast cells) המושרית על ידי הקולטן של IgE, וליצירה של ציטוקינים, הקשורים בתגובות אלרגיות (Porter ב-Eur J Hum Genet משנת 2008). גם הקולטן שלNMDA מושפע כמו גם יכולת הקישור לקולטן של סרוטונין בהיפוקאמפוס. גם האינטראקציה בין תאים נפגעת מהשינויים הממברנאליים המופיעים ב-SLOs. נמצא שב-SLOs פוחתת גם ה-exocytosis של חלקיקים (vesicles) בסינפסה, כתוצאה מפגיעה ביכולת הקישור של חלקיקים אלה לממברנות.

הנגזר של DHC{{כ}}-7 המשחק תפקיד בעקה החמצונית הוא 3β,5α-dihydroxy-cholest-7-en-6-one הידוע כ-DHCEO. נגזר זה נוצר מתוצר עיקרי של פראוקסידציה של DHC{{כ}}-7, הידוע כ- DHC-5α,6α-epoxide{{כ}}-7. נמצא ש-DHCEO טוקסי לתאי עצב בקליפת המוח ולתאי glia. משערים שגם רגישות היתר לאור מגלים חולים עםSLOs , נובעת מהעקה החמצונית (Anstey ב- J Photochem Photobiol משנת 2001). מחקר של Valencia וחב' הראו ב-Free Radical Biol Med ש-DHC{{כ}}-7 מזרז את העקה החמצונית הנגרמת בקרטינוציטים בחשיפה ל-UVA. יש לציין שרמות מוגברות של הקודמנים של כולסטרול כגון DHC{{כ}}-7, יכולים להתגלות גם בנבדקים עם היפר-כולסטרולמיה או באנשים המטופלים ב-haloperidol , וכן באלה המטופלים ב- aripiprazole או ב-trazodone ללא קשר ל-SLOs (על פי Hall וחב' ב-Mol Genet Metab משנת 2013). יחד עם זאת, היחס של cholesterol{{כ}}/DHC{{כ}}-7 מוגבר רק בנבדקים עם SLOs.

לרוב מכריע של הלוקים ב-SLOs יש גם רמות נמוכות של כולסטרול במוח, שמשמעותו שריכוזו של כל נגזר סטרולי של כולסטרול במוח יהיה נמוך. לדוגמה, ניתן למצוא ב-SLOs רמות נמוכות של נוירוסטרואידים, הנוטלים חלק בהעברת איתותים בתוך המוח, וייצורם מתבצע אף הוא במוח.

נוירוסטרואידים מגיבים עם קולטנים ספציפיים במוח, ונקשרים לתעלות יונים הקשורות לפעילות של נוירוטרנסמיטורים. באופן ספציפי הם גורמים למודולציה של הקולטנים שלGABA ושל NMDA, וגורמים לשיכוך ולהרגעה, לשיפור זיכרון, ועוד. כיוון שחלק מתסמיני SLOs כגון היפראקטיביות ודאגנות מייצגים השפעות הפוכות לאלה הנגרמות על ידי נוירוסטרואידים, יש להניח שהפחתה בריכוזם של האחרונים קשורה לכך (Marcos וחב' ב-Steroids משנת 2004).

==שיטות לגילוי 7DHC==
יש מספר שיטות לגלות רמות של 7DHC בפלזמת הדם, ואחת מהן היא שימוש בריאגנט Liebermann–Burchard. זו שיטה קולורימטרית פשוטה שנוחה לשימוש בבדיקות סקר אוכלוסיות בהיקף גדול. הוספת ריאגנט זה לדגימת הפלזמה הנבדקת מביאה באופן מידי להופעת צבע סגול, שהופך בהדרגה לכחול כהה, כאשר בדגימות דם תקינות הוספת הריאגנט האמור מותירה את הדגימה חסרת-צבע שבהדרגה עובר לצבע תכלכל (Xiong וחב' ב-Chem Phys Lipids משנת 2002).

דרך אחרת לגילוי 7DHC נעשית בשיטה של Gas Chromatography-Mass Spectrometry (או (GC-MS על פי Kelley ב-Clin Chim Acta משנת 1995. גרסה רגישה במיוחד של גז כרומטוגרפיה המאפשרת גילוי ריכוזים נמוכים של 7DHC ידועה כ- SIM-GC/MSאו selected ion monitoring gas chromatography/mass-spectrometry. שיטות נוספות לזיהוי מקרי SLOs כוללות את time-of-flight mass spectrometry שניתן לבצע על טיפות דם מיובשות על נייר סופג (Zimmerman וחב' ב-Am J Med Genet משנת 1997), כמו גםparticle-beam LC/MS וכן electrospray ionization tandem MS (על פי Johnson וחב' ב-J Lipid Res משנת 2001), שניתן להשתמש בהן לזיהוי 7DHC בדגימות פלזמה, בנוזל מי-שפיר, בסיסי שליה ואף בשתן.

== הוראות לביצוע הבדיקה ==
יש להיות בצום של לפחות 12 שעות לפני נטילת הדם. בתינוקות יש לקחת דם סמוך להנקה או ההזנה הבאה. את הדם יש ליטול במבחנת סודיום-הפארין (פקק ירוק) כבחירה ראשונה, אם כי גם מבחנת ספירת דם (EDTA פקק סגלגל) מתקבלת. יש לסרכז את הדם לא יאוחר מ-30 דקות מלקיחתו. ניתן לשמור את הפלזמה המופרדת עד 7 ימים בקירור, או עד 90 יום בהקפאה.

==ראו גם==

* [[מדריך בדיקות מעבדה|חזרה לדף מדריך בדיקות מעבדה]]
* [[אבחון מחלות ומפגעים מטבוליים-גנטיים|בדיקות מעבדה - אבחון מחלות ומפגעים מטבוליים-גנטיים]]

{{ייחוס|[[משתמש:בן עמי סלע|פרופ' בן עמי סלע]]}}

[[קטגוריה:בדיקות מעבדה - אבחון מחלות ומפגעים מטבוליים-גנטיים]]
[[קטגוריה:בדיקות מעבדה: כימיה בדם]]

7-Dehydrocholesterol-delta 7-reductase

2016-02-02T12:03:02Z

בן עמי סלע:

{{שם שגוי|{{D}}7-Dehydrocholesterol-delta 7-reductase}}
{{בדיקת מעבדה
|שם עברי={{רווח קשיח}}
|שם לועזי={{D}}7-dehydrocholesterol-delta 7-reductase
|קיצור=DHCR7
|תמונה=
|כיתוב תמונה=
|מעבדה=[[כימיה בדם]]
|תחום=אבחון תסמונת Smith-Lemli-Opitz
|יחידות מדידה=
|טווח ערכים תקין=רמה אפסית של 7-Dehydrocholesterol
|יוצר הערך=[[משתמש:בן עמי סלע|פרופ' בן-עמי סלע]]
|אחראי הערך=
}}
==האנזים reductase{{כ}}-7{{כ}} ‎7-dehydrocholesterol-delta==
אנזים זה מקודד באדם על ידי הגן DHCR7 הממוקם על הזרוע הארוכה של כרומוזום 11 באתר 11q13.4 {{כ}} (Moebius וחב' ב-Proc Natl Acad Sci USA משנת 1998, ו-Wassif וחב' ב-Am J Hum Genet משנת 1998). אנזים זה מקטלז את השלב האחרון ברצף הריאקציות המובילות ליצירת [[כולסטרול]] מתוצר הביניים dehydrocholesterol{{כ}}-7 (להלן DHC{{כ}}-7) תוך שימוש ב-NADPH. אנזים זה הוא למעשה delta-7-sterol reductase המסיר את הקשר הכפול בין פחמנים 7 ו-8 במולקולה של DHC{{כ}}-7, קשר שנוצר על ידי האנזים sterol delta8-delta7 isomerase. חוסר האנזים DHC reductase{{כ}}-7 הוא הגורם הישיר לתסמונת Smith-Lemli-Opitz (על פי Waterham וחב' ב-Biochem Biophys Acta משנת 2000, ו-Fitzky וחב' ב-Proc Natl Acad Sci USA משנת 1998, וכן Wassif וחב' ב-Am J Hum Genet משנת 1998). יצוין שתסמונת Smith- Lemli- Opitz תוארה לראשונה על ידי שלושת חוקרים אלה במאמר משנת 1964 ב-J Pediatr.

האנזים DHCR7 מאוד יעיל בחיזור של DHC7, אך הוא מסוגל לחזר גם את הקשר הכפול בין פחמנים 7-8 של סטרולים נוספים. רצף חומצות האמינו המקודד על ידי הגן DHCR7 אמור להכיל 475 חומצות אמינו כמו גם מספר motifs של חלבונים, ביניהם מספר motifs של sterol reductase. הוא מכיל מה שקרוי SSD או sterol sensing domain שנחוץ כנראה להתקשרות למצעים סטרוליים. האנזים מכיל גם מספר אתרי זרחון, כולל אתרים ספציפיים לאנזימים הרגולטוריים protein kinase C ו-tyrosine kinase.

==מוטציות בגן DHCR7==
המשקל המולקולארי של האנזים DHCR7 באדם הוא 54,489 דלטון, עם 475 חומצות אמינו והוא בעל נקודה איזואלקטרית של 9.05. הגן המקודד לאנזים זה הוא באורך של 14,100bp ומכיל 9 אֶקסונים ו-8 introns {{כ}}(Porter ב-Eur J Hum Genet משנת 2008), כאשר ה-mRNA התואם הוא באורך של bp{{כ}}2,786 (כאשר שאר הרצף של DNA הוא אינטרוני). על פי Witsch-Baumgartner וחב' ב-Hum Mutation משנת 2001, אֶקסונים 3-9 מקודדים לאנזים. בגן זה ישנן קומבינציות של אינטרונים ואקסונים, ואזור של opening reading frame המכיל 1,425 נוקלאוטידים ונמצא אחרי ה-promoter.

מעניין שהמבנה של הגן DHCR7 בחולדה דומה מאוד לזה שבאדם. הרמות הגבוהות ביותר של ביטוי הגן DHCR7 התגלו בבלוטת האדרנל, באשכים, בכבד ובמוח. ביטוי הגן מושרה על ידי רמות נמוכות של sterol דרך SREBP או sterol regulatory binding proteins. כפי שצוין, האנזים DHCR7 מקטלז את החיזור של DHC7 לכולסטרול, כמו גם את החיזור של dehydrodesmosterol{{כ}}-7 ל-desmosterol. לשם כך זקוק האנזים ל-NADPH כקופקטור, והוא גם כורך פעילות של cytochrome-450 oxidoreductase. ההשערה היא שהאנזים DHCR7 מכיל גם ברזל, והוא מהווה חלבון אינטגראלי בממברנה של הרטיקולום האנדופלזמי, ומכיל 9 מקטעים (domains) טרנס-ממברנאליים.

בהינתן ש-SLOs הוא מפגע אוטוזומאלי-רצסיבי, נדרשות מוטציות בשני העותקים של כרומוזום 11 כדי לגרום למפגע (Yu ו-Patel ב-Clin Genet משנת 2005). עד כה זוהו למעלה מ-150 מוטציות בגן זה, בהן 130 מוטציות missense (עם פגיעה בנוקלאוטיד בודד) שהן השכיחות ביותר ומהוות 87.6% מכלל המוטציות ב-SLOs, כאשר פגיעתן בפעילות האנזים חלקית בלבד, ולעומתן 25 מוטציות Null שהן שכיחות פחות, אך פגיעתן בפעילות האנזים קשה בהרבה (Correa-Cerro ו-Porter ב-Mol Genet Metab משנת 2005). בין מוטציות Null אלו נמנות 8 מוטציות nonsense, חמש מוטציות המוגדרות כ-splice site, שמונה מוטציות שֶמֶט או deletion, שתי מוטציות insertion, ומוטציית indel אחת (שהיא מוטציית "תערובת" בה יכולים להופיע insertions או deletions של נוקלאוטידים). יש הכורכים מוטציות missense אלו בהתרחשות הפלות ספונטניות.

המוטציה השכיחה ביותר ב-DHCR7 היא מוטציית IVS8-1G>C או c.832-1G>C, המהווה 28.2% מכלל מקרי SLOs. מוטציה זו פוגעת בחיבור בין exon8 ו-exon9, מה שגורם ל-insertion של 134bp של רצף אינטרוני של נוקלאוטידים לתוך ה-mRNA של DHCR7. תרחיש זה מביא ל-frameshift ולהופעה מוקדמת של stop codon (נחשבת למוטציית nonsense או Null mutation). חולים עם מוטציה זו התגלו לראשונה באיים הבריטיים, עם שכיחות נשאים (carriers) של 1.09% באוכלוסייה לבנה ממוצא אירופי. בהמשך נמצא שהנשאוּת של מוטציה זו בקרב אוכלוסיות Caucasian בעולם כולו עומדת על כ-3%, והיא נמוכה יותר בקרב אסייאנים ואפריקאים.

המוטציה השנייה בשכיחותה (10.4%) היא 278C>T בה מתיונין בעמדה 93 משוחלף על ידי תראונין. זו מוטציית missense עם תסמינים מתונים, וזו המוטציה השכיחה ביתר באוכלוסיות של איטלקים, קובּאנים, ואלה ממוצא ים תיכוני. המוטציה השלישית בשכיחותה )6.0%) היא 452G>A, שהיא מוטציית nonsense עם טריפטופן קצה בעמדה 151, המונעת את יצירת האנזים. משערים שהיא החלה בדרום פולין וכיום היא שכיחה בעיקר במדינות צפון אירופה. מוטציות נוספות בסדר שכיחות יורד הן: מוטציית missense הידועה כ- 1210C>T עם ארגינין במקום ציסטאין בעמדה 404 עם שכיחות של 5.2% (על פי Witsch-Baumgartner וחב' ב-Am J Hum Genet משנת 2000); מוטציה 976G>T עם ואלין במקום לאוצין בעמדה 1326 ושכיחות של 5.0%; מוטציה C<T1054 עם ארגינין במקום טריפטופאן בעמדה 352 ושכיחות של 3.2%; מוטציה 1342G>A עם חומצה גלוטמית במקום ליזין בעמדה 448 ושכיחות של 3.2%; מוטציה 1228G>A עם גליצין במקום סרין בעמדה 410 ושכיחות של 2.2%; מוטציה 725G>A עם ארגינין במקום ציסטאין בעמדה 242 ושכיחות של 1.8%; מוטציה 506C>T עם סרין במקום לאוצין בעמדה 169 ושכיחות של 1.7%; מוטציה 906C>G עם פניל-אלנין במקום לאוצין בעמדה 302 ושכיחות של 1.3%; מוטציה 725G>A עם ארגינין במקום היסטידין בעמדה 242 ושכיחות של 1.0%. שתיים עשרה מוטציות אלו מהוות ביחד 69.2% מכלל המוטציות ב-SLOs. ברוב החולים עם SLOs נתגלו 2 מוטציות Null בגן, או עם שתי מוטציות בלולאה 8-9, ואילו במקרים של 1-2 מוטציות בלולאה 1-2, או עם מוטציה אחת בקצה ה- N טרמינאלי, הפנוטיפ היה קל בהרבה ורק במקרים נדירים התגלתה רק מוטציה אחת (Waterham ו-Hennekam ב-Am J Hum Genet משנת 2012).

[[קובץ:DHCR7-1.png|מרכז|500 פיקסלים]]

הדגמה של מיקומו של האנזים dehydrocholesterol reductase{{כ}}-7 בממברנת התא (בחלק העליון של התרשים) כאשר הסגמנטים הטרנס-ממברנאליים 4 עד 8 מייצגים את המקטע (domain) המשומר ביותר ובעל הזיקה הגבוהה למצעים סטרוליים (Fitzky וחב' ב-Proc Natl Acad Sci USA משנת 1998). מקומן של מוטציות Null (בשחור) ומוטציות missense (באפור) מודגש. בחלק התחתון של התרשים מתואר ארגון ה-intron-exon כאשר הרצפים המקודדים מסומנים באפור.

==תסמונת Smith-Lemli-Opitz==

תסמונת Smith-Lemli-Opitz (להלן SLOs) היא מפגע אוטוזומאלי-רצסיבי הנוצר על ידי מוטציה בגן DHCR7 מה שגורם לחסר באנזים reductase {{כ}}7{{כ}} dehydrocholesterol-delta{{כ}}-7, וכתוצאה מכך להצטברות בפלזמה של שני הקודמנים של כולסטרול, (DHC{{כ}}-7) {{כ}}dehydrocholesterol{{כ}}-7 ו-(DHC{{כ}}-8){{כ}}
dehydrocholesterol{{כ}}-8. קלינית התסמינים יכולים לכלול [[מיקרוצפאלי]], [[פיגור בגדילה]], [[פיגור התפתחותי]], תווי פנים דיסמורפיים , [[חך שסוע]] (cleft palate), פגמים בגפיים ובעיקר 2-3 syndatyly באצבעות הרגליים וכן פולידקטיליה פוסטאקסיאלית (הופעת אצבע נוספת או חלקה ליד אצבעות כף היד), וכן עיוותים במבנה הלב והכליות וחסכים קוגניטיביים.

[[קובץ:DHCR7-2.png|ממוזער|מרכז|500 פיקסלים|סינדקטיליה של אצבעות 2 ו-3 בכף הרגל]]

==השכיחות של SLOs==

שכיחות מפגע זה מוערכת בין 1:20,000 ל-1:40,000 לידות-חי (Tint וחב' ב-N Eng J Med משנת 1994, ו- Nowaczyk וחב' ב-J Pediatr משנת 2004), אם כי באלה ממוצא צפון או מרכז אירופי השכיחות מוערכת בין 1:10,000 ל-1:60,000 (על פי Porter ב-Mol Genet Metab משנת 2000 ו-Yu ו-Patel ב-Clin Genet משנת 2005). בקרב אלה ממוצא אסיאתי או אפריקני SLOs פחות שכיחה (Wright וחב' ב-Am J Med Genet משנת 2003). ייתכן מאוד שהשכיחות גבוהה יותר שכן האבחון של SLOs בקרב נשים מוחמץ לעתים יותר מאשר בקרב גברים, בגלל חסר של אנומליות באברי המין הבולטים באופן מובהק יותר בגברים הלוקים במחלה.

מחקר של Battaile וחב' ב-Mol Genet Metab משנת 2001 כלל בדיקה של 1,503 טיפות דם מיובשות שנלקחו מסקר יילודים, כאשר ב-16 מתוכן נמצאה המוטציה IVS8-1G>C. נתון זה שימש לחישוב השכיחות של 1:30 של נשאים, המנבאת שכיחות של SLOs בין 1:1,590 ל-1:13,500. חישוב זה של שכיחות צפויה של SLOs הגבוהה משמעותית מזו הנצפית קלינית באופן מעשי, יכול להיות מוסבר או על ידי תמותה מוגברת של עוברים הפגועים עם SLOs ברחם, או מלידה של יילודים מתים עם פגיעת SLOs, או מדיווח-חסר של פרטים פגועים באופן מתון, בהם לא מופיעים התסמינים החיצוניים האופייניים למחלה.

[[קובץ:DHCR7-3.png|ממוזער|מרכז|500 פיקסלים|פתוגנזה של תסמונת Smith-Lemli-Opitz]]

==מודלים גנטיים של SLOs בחיות==

עכברים וחולדות משמשים הרבה לבחינת פרמטרים שונים של SLOs שכן מבנה האנזים DHCR7 של מכרסמים אלה דומה לזה של אדם. שתי דרכים מקובלות לקבלת תסמיני SLOs הן או על ידי שימוש בחומרים טרטוגנים או על ידי מניפולציות גנטיות ליצירת מוטציות בגן האמור בחיות אלו.

מודלים גנטיים מיוצרים על ידי פגיעה ישירה (knocking out) בגן DHCR7. מחקר של Wassif וחב' ב-Hum Mol Genet משנת 2001, תאר פגיעה בגן זה בתאי גזע עובריים של עכברים. בדומה למקובל באדם, עכברים הטרוזיגוטיים (בהם רק באלל חד נוצרה מוטציה) הם נורמאליים פנוטיפית, והם זווגו עם עכברים בהם המוטציה מופיעה באלל הנגדי. העכברים ההומוזיגוטים לפגם זה שנולדו, מתו כבר ביום הראשון לחייהם, בגלל הכשל שלהם לינוק, והראו בפרק חייהם הקצר מאפיינים דומים לאלה המופיעים בבני אדם עם SLOs. היו להם רמות נמוכות של כולסטרול, רמות מוגברות של 7{{כ}}DHC ו-8{{כ}}DHC, היו במשקל נמוך יותר בלידתם מזה של עכברים בריאים מאותו זן, תנועתם הייתה מוגבלת יותר, ואף ניכרו בהם עיוותים cranio-facial. ממצאים אלה מוסברים בכך שכולסטרול במכרסמים יכול לעבור את השליה, והוא חיוני להתפתחות העובר. באדם, מעט מאוד מהכולסטרול של האם מועבר לעובר.

יחד עם זאת, המגוון המשמעותי בחומרת התסמינים, אפילו בקרב אנשים עם מוטציות דומות בגן DHCR7, מרמז לכך שקיימות השפעות משמעותיות על הפנוטיפ מעבר למוטציות האמורות (Porter ב- Mol Genet Metab משנת 2000). גורם חשוב אחד עשוי לכלול את הטרנספורט של כולסטרול מהאם לעובר בשלב מוקדם של ההיריון. פנוטיפ חמור יותר של המחלה נמצא בתינוקות שנולדו לאימהות בעלות האלל APOE E2 שעלול להפריע לקישור של ליפופרוטאינים ממקור האם המכילים apo E בשליה (Witsch-Baumgartner וחב' ב-J Med Genet משנת 2004, ו-Woollett ב-Am J Clin Nutr משנת 2005).

מודלים טרטוגניים מושרים על ידי האכלת חולדות או עכברים בהיריון עם מעכבים של DCHR7. שני מעכבים שכיחים הם BM15766 או chlorocinnamyl) piperazin-4-yl]ethyl)-benzoic acid{{כ}}-4)-1]-2)-4 ו- AY9944 או
trans-l,4-bis(2-chlorobenzylaminomethy1)cyclohexane dihydrochloride. המעכב AY9944 משרה holoprosencephaly ועיוותים מיניים כפי שמוצאים באנשים עם SLOs (על פי Wolf וחב' ב-J Lipid Res משנת 1996), וכן לפגוע בקולטן לסרוטונין שהוא פגם אחר שמוצאים בחולים עם SLOs (על פי Xu וחב' ב-Bichem Biophys Acta משנת 1996). המעכב השני-BM15766 גורם לחuסר כולסטרול וחומצות מרה כפי שמוצאים במחלה זו באדם. מגבלה אחת של מעכבים אלה בחיות היא שרמות DHC{{כ}}-7 ו-DHC{{כ}}-8 נמוכות יותר ממה שמקובל בחולי SLOs. הנתון האחרון יכול להיות מוסבר על ידי העובדה שבני-אדם חולים חווים חסם קבוע של פעילות DHCR7, בעוד שעכברים וחולדות המטופלים במעכבים אלה חווים רק חסמים חולפים. יתרה מכך, זנים שונים של עכברים וחולדות עמידים יותר לפעולת המעכבים הטרטוגנים ולכן עלולים להיות פחות יעילים במודלים בחיות ל-SLOs.

==חסר כולסטרול, הגורם העיקרי ל-SLOs==

לכולסטרול יש תפקיד חיוני בתהליכים תאיים והתפתחותיים רבים. בנוסף להיותו מרכיב בממברנת התא, הוא משמש קודמן (precursor) של מספר מולקולות חיוניות בשגשוג תאים ובהתמיינות (differentiation) שלהם, בגליקוזילציה של חלבונים, ובמסלול איתות תאיים. הביוסינתזה של כולסטרול והמרתו לתרכובות חשובות אחרות כמו הורמונים אחדים מורכבת ביותר, וכורכת מספר גדול של תוצרי ביניים ותהליכים אנזימטיים. מפגעים הנובעים מחסר של אנזימים אלה, מביאים להצטברות תוצרי הביניים ומניעה של יצירת כולסטרול כמו גם תוצרי ביניים הנמצאים במסלול הביוסינתזה של כולסטרול. ממצאים קליניים המשותפים למפגעים בביוסינתזה של כולסטרול, כוללים עיוותי שלד מוּלדים, תווי פנים דיסמורפיים, פיגור התפתחותי פסיכו-מוטורי וכשל שגשוגי (FTT).

==המטבוליזם והתפקוד של כולסטרול==

כולסטרול יכול להתקבל מהמזון אך הוא יכול להיווצר גם על מסלולי מטבוליזם בגוף עצמו, שמתרחשים בעיקר בכבד, אך גם במעיים. ראוי לציין שכולסטרול אינו יכול לעבור דרך מחסום דם-מוח (BBB), כך שבתוך המוח הביוסינתזה שלו היא המקור היחיד של מולקולה זו (Patti וחב' ב-Neuroscience משנת 2010). באדם, הסינתזה של כולסטרול מתחילה במסלול ה-mevalonate המוביל לסינתזה של FPP או farnesyl pyrophosphate. מסלול זה משתמש ב-2 מולקולות של acetyl-CoA וב-2 מולקולות של NADPH ליצור mevalonate, העובר מטבוליזם ליצירת IPP או isopentenyl pyrophosphate תוך שימוש ב-3 מולקולות ATP. משלב זה 3 מולקולות IPP נחוצות ליצור מולקולה אחת של FPP. השילוב של 2 מולקולות FPP מביא ליצירת squalene מה שמייצג את הצעד המחויב הראשון ליצירת כולסטרול, שכן squalene מביא ליצירת lanosterol ממנו יש מספר מסלולים המוליכים לביוסינתזה של כולסטרול. הצעד הנחשב ל-rate limiting הוא ההפיכה של hydroxy-3-methylglutaryl-CoA{{כ}}-3 (או HMG-CoA) ל-mevalonate, צעד המקוטלז על ידי האנזים HMG-CoA reductase.

[[קובץ:DHCR7-4.png|ממוזער|מרכז|500 פיקסלים|רצף הריאקציות והשלבים בביוסינתזה של כולסטרול]]

מספר ריאקציות מורכבות מביאות את lanosterol ליצירת zymosterol. בנקודה זו חל פיצול במסלול יצירת כולסטרול. באדם, המסלול העיקרי ידוע כמסלול Kandutsch-Russel (על פי Nowaczyk ו-Waye ב-Clin Genet משנת 2001), בו zymosterol עובר מטבוליזם ליצירת α-cholesta-7,24-dien-3β-ol{{כ}}-5, ממנו ל-lathosterol, וממנו ל-dehydrocholesterol{{כ}}-7, או DHC7. המטבוליט האחרון הוא הקודמן המידי של כולסטרול, והאנזים DHCR7 הוא האחראי להפיכתו לכולסטרול. אנזים זה מחזר את הקשר הכפול על פחמן 7 של DHC7 ליצירת תוצר לא אסטרי, ומוטציות באנזים זה אחראיות לפגמים המופיעים ב-SLOs. במסלול אחר המביא לסינתזה של כולסטרול, DHCR7 דרוש לחיזור של dehydrodesmosterol{{כ}}-7 ליצירת desmosterol.

==הרגולציה של סינתזת כולסטרול==

מסלול הסינתזה של כולסטרול מורכב ונמצא תחת בקרה העוברת בעיקר דרך האנזים HMG-CoA reductase, ומתבצעת על ידי לולאת משוב הרגישה לרמות כולסטרול בתאים. ארבעת השלבים העיקריים של בקרה זו הם כדלקמן:

הסינתזה של האנזים HMG-CoA reductase מבוקרת על ידי SREBP או sterol regulatory element binding protein, שהוא גורם שעתוק שאינו פעיל כאשר רמות כולסטרול גבוהות, ונכנס לפעולה כאשר רמות אלו נמוכות. כאשר רמות כולסטרול נופלות, משתחרר SREBP מממברנת גרעין התא או מהרטיקולום האנדופלזמי ונודד לגרעין וגורם לשעתוק של הגן ל-HMG-CoA reductase. התרגום על פני mRNA של HMG-CoA reductase מעוכב על ידי נגזרות של mevalonate וכן על ידי כולסטרול המגיע מהמזון. הפירוק וההפחתה של HMG-CoA reductase מבוקרים באופן הדוק: כאשר החלק של אנזים זה הקשור לרטיקולום האנדופלזמי קולט איתותים, כגון עליה ברמת כולסטרול, הוא עובר פירוק פרוטואליטי. כאשר HMG-CoA reductase עובר זרחון, פעילותו פוחתת. משמעות הדבר שכאשר רמת האנרגיה (ATP) בתא נמוכה, סינתזת כולסטרול פוחתת.

==תפקידו של כולסטרול==

כולסטרול הוא אחד הליפידים המרכזיים הכרוכים בתהליכים מטבוליים, בתפקוד התאי, ובמבנה התא. בעיקר חשיבותו בבקרה על הנוזליות (fluidity) של השכבה הכפולה (bilayer) של פוספוליפידים בממברנת התא. יתרה מכך, כולסטרול מהווה מרכיב ב-lipid rafts, שהם צברים של חלבונים וליפידים (כולל כולסטרול וספינגוליפידים) ה"שטים" בתוך ממברנת התא, ומהווים חלק חשוב בתפקוד הממברנה. חלקיקי ה-lipid rafts מאורגנים או קשוחים יותר מאשר ה-bilayer העוטף אותם, ותפקידם חשוב בעיקר בכך שחלבונים שונים הם בעלי זיקה גבוהה אליהם. קישור זה חיוני בהעברת איתותים (signals) בינתאיים. כולסטרול פועל ספציפית כ"דבק" ב-lipid rafts אלה, ובהעדרו מתרחש תהליך הפרדה בין חלבונים למרכיבי ממברנה אחרים (Simons וחב' ב-J Clin Invest משנת 2002).

בהינתן ששכיחותו הניכרת בממברנות תאים, כולסטרול כרוך במידה רבה בתהליכי טרנספורט מסוימים. הוא עשוי להשפיע על תפקודן של תעלות יונים וטרנספורטרים ממברנאלים אחרים. לדוגמה, כולסטרול נחוץ לפעילות קישור ליגנדים של הקולטן לסרוטונין (Singh וחב' ב-Biochem Biophys Res Commun משנת 2007). בנוסף, כולסטרול מאוד חיוני בתהליכי exocytosis. כמו כן, כולסטרול קשור למודולציה של תכונות ממברנאליות, ועשוי לווסת את האיחוי של vesicles בתוך הממברנה. בהינתן שתאי עצב תלויים מאוד בתהליכי exocytosis להעברת איתותים (impulses) יש לכולסטרול תפקיד מאוד חיוני במערכת העצבים (Linetti וחב' ב-J Cell Science משנת 2010).

מסלול רלוונטי במיוחד בו נוטל כולסטרול חלק, הוא מסלול ה-hedgehog signaling המעביר מידע חיוני לתאים עובריים הנחוץ להתפתחותם. מסלול זה חיוני כאמור בשלב התפתחות העובר, ונוטל חלק בקביעת הרקמה אליה אמורים התאים העובריים לנדוד באמבריוגנזה. חלבוני hedgehog כרוכים גם בשעתוק של גנים המווסתים את ההתמיינות והשגשוג של תאים. כולסטרול חשוב למסלול זה כיון שהוא נקשר קו-וולנטית לחלבוני hedgehog ומשפעל אותם (Herz וחב' ב-Nat Genet משנת 1997). בריכוזי כולסטרול נמוכים, פעילות איתות זו נפגעת כמו גם התמיינות התאים (Ingham ב-Current Biol משנת 2008). מצב זה עלול לתרום לריבוי המומים המולדים אותם מזהים בלית תינוקות פגועים עם SLOs. חלבון איתות ייחודי המשתייך למשפחת חלבוני hedgehog הואSHH או sonic hedgehog החשוב להתפתחות מערכת העצבים המרכזית. חלבוני Hedgehog אחרים כרוכים כנראה בהתפתחות אברי הרבייה והשלד.

כולסטרול הוא קודמן של מולקולות חשובות רבות, כולל חומצות מרה, אוקסיסטרולים, נוירו-סטרואידים גלוקו-קורטיקואידים, מינראלו-קורטיקואידים (החיוניים למאזן האוסמוטי), וסטרואידי-המין (כגון אסטרוגן וטסטוסטרון, כמו גם בהתפתחות העוברות של אברי הרבייה). לבסוף, כולסטרול הוא מרכיב עיקרי במיאלין העוטף את האקסונים של תאי עצב לצורך הבידוד החשמלי שלהם. תהליך המיאלינציה מתרחש באופן אינטנסיבי בשלבי התפתחות העובר, מה שמדגיש את החיוניות בביו-סינתזה של כולסטרול בשלבים אמבריונאליים.

==זיהוי נשאים==

כיוון שקיימת חפיפה ניכרת בין תחומי הריכוזים של כולסטרול ו-DHC{{כ}}-7 בנסיוב של נשאי המחלה ושל אנשים בריאים, לא ניתן לקבוע את הסטאטוס של נשאים על ידי מדידה של רמת כולסטרול ו-DHC{{כ}}-7. לעומת זאת, ניתן לקבוע בוודאות באופן ביוכימי את נשאוּת המחלה על ידי שימוש בפיברובלסטים (Shefer וחב' ב-Metabolism משנת 1997). ניתן כמו כן לקבוע נשאוּת על ידי אנליזה מולקולארית-גנטית אם ידועות המוטציה או המוטציות שגרמו ל-SLOs בבני משפחה אחרים.

==הריונות בסיכון גבוה ל-SLOs ובחינה prenatal של SLOs בהיריון==

בהריונות שיש בהם סיכון של 25% ל-SLOs על פי סיפור משפחתי, תוצאה של רמות לא תקינות של DHC{{כ}}-7 בנוזל מי-שפיר בשבועות 15-18 (על פי Abuelo וחב' וכן Rossiter וחב' ב-Am J Med Genet משנת 1995, וכן Dallaire וחב' ב-Prenat Diagn משנת 1995, כמו גם Griffiths וחב' ב-Clin Chem משנת 2008), או ברקמה המופקת מדגימות של סיסי שליה (CVS) בשבועות 10-12 להיריון (Mills וחב' ב-Pediatr Res משנת 1996, ו-Sharp וחב' ב-Prenat Diagn משנת 1997), נחשבות אבחוניות. יש לנקוט בזהירות באבחון פרטים עם סיפור משפחתי של צורה מתונה של SLOs, ובמקרים אלה יש להדגים את חסר האנזים בתאים ממקור השלייה (amniocytes) שמגדלים בתרבית.

אם שתי מוטציות ב-DHCR7 זוהו בעובר הנבדק, ראוי לבצע בחינה גנטית מולקולארית במקום בדיקה ביוכימית, כדי לחזור ולהבהיר תוצאות בלתי-פסקניות (Loeffler וחב' ב-Prenat Diagn משנת 2002, ו-Waye וחב' באותו כתב עת משנת 2007). בעוּבּרים עם אנומליות מולדות מרובות, ניתן לאבחן SLOs בבדיקה סונוגראפית. פיגור בשגשוג של העובר (IUGR) אופייני אף הוא במקרים של SLOs. מאפיינים של תווי-פנים לא תקינים ניתן לאבחן בדיקת על-שמע כבר בשבוע ה-18 להיריון (Nowaczyk ו-Irons ב-Am J Med Genet משנת 2012, ו-Quelin וחב' ב-Eur J Med Genet מאותה שנה). יחד עם זאת, יצוין שממצאי בדיקת על-שמע יכולים להתקבל תקינים בעיקר במקרים מתונים של SLOs (על פי Goldenberg וחב' ב-Am J Med Genet משנת 2004).

כאשר לאישה בהיריון מוצאים בנסיוב רמות נמוכות של estriol חופשי, או ממצאי בדיקה "משולשת" או בדיקה מורחבת של 4 פרמטרים המתאימים לתסמונת trisomy אלא שתוצאות האנליזה הקריוטיפּית תקינות, זה יכול לשמש מדד של SLOs או של חסר באנזים steroid sulfatase. מחקר של Shackleton וחב' שפורסם ב-1999 ב-J Clin Endocrinol Metab, הראו נוכחות יוצאת דופן של estriols האופייניים לסוס שהיוו למעלה ממחצית האסטרוגנים שהופרשו על ידי אישה שברחמה עובר פגוע עם SLOs. כך זוהו estratetraene-3,16α,17β-triol{{כ}}-7{{כ}},(10){{כ}}3,5 וכן estrapentaene-3,16α,17β-triol{{כ}}-6,8{{כ}}(10){{כ}}1,3,5.

==תסמינים פיזיים של SLOs==
התסמינים השכיחים ביותר הם מיקרוצפאלי, היצרוּת המרחק בין הרקות, ptosis, אף קצר, המאנגיומה קפילארית של האף, לסת קטנה מאוד (מיקרוגנטיה) וקפלים אפיקנטליים בזוויות העין. מאפיינים פיסיים אחרים שיכולים להופיע כוללים: אוזניים במנח נמוך ונטייה לקיפול לאחור, חך נוקשה צר ומוגבה, חך או שפה שסועים, ניוון של הקורפוס קלוסום, היפופלזיה צרבראלית, אונה מצחית קטנה בממדיה, פולידקטיליה של אצבעות הרגליים או הידיים, סידקטיליה של אצבעות 2 ו-3 בכף הרגל, בוהן קצרה, עיוותים באצבעות אחרות, איבר מין זכרי דמויי אבר מין נקבי, פגמים מולדים לבביים, אי-סדירות של הכליות, הריאות, הכבד והעיניים.

כיוון שכולסטרול הוא קודמן של הורמונים סטרואידים, כולל קורטיזול, אלדוסטרון וטסטוסטרון, ניתן להבין את היקפן של הבעיות האנדוקריניות המופיעות כולל היפוגליקמיה, יתר לחץ-דם ואי-סדירות אלקטרוליטית. אי-ספיקה של האדרנל עלולה לגרום לאי-סדירות אלקטרוליטית חמורה (Chemaitikky וחב' ב-Horm Res משנת 2003). גברים עם SLOs חמור, סובלים מרמות נמוכות מאוד של טסטוסטרון (Chasalow וחב' ב-Steroids משנת 1985).

Park וחב' ב-J Pediatr משנת 1968 וכן Lin וחב' ב-Am J Med Genet משנת 1997,דווחו על עד 50% מאלה עם SLOs הסובלים מפגמים לבביים הקשורים לבעיות קרדיו-רספירטוריות. בחולים אלה אובחנו גם בעיות מורפולוגיות של אונות הריאה שמעורבותם ניכרת בבעיות נשימתיות בחולים אלה (Donnai וחב' ב-J Med Genet משנת 1986, ו- Quélin וחב' ב-Eur J Med Genet משנת 2011). בערך רבע מהלוקים ב-SLOs ובלים מפגמים ואי-סדירות בפעולת הכליות כגון היפופלזיה כלייתית, ציסטות קורטיקליות בכליות, הידרונפרוזיס, אי-סדיקות מבנית של המערכת המאספת (Nowaczyk וחב' ב-Am J Med Genet משנת 2001, ו-Ryan וחב' באותו כתב עת משנת 1998).

==ממצאים קליניים==

חוסר כולסטרול המאפיין SLOs היא תופעה הנוגעת במגוון גדול של מפגעים צפויים במערכות גוף שונות (Ryan וחב' ב-J Med Genet משנת 1998). לידת עכוז טרם-עת שכיחה. היילודים והתינוקות בהמשך מפגינים כוח יניקה דל, רגזנות, ו-FTT (על פי Pinsky ו-DiGeorge ב-J Pediatr משנת 1965). בעיות ההזנה נובעות מהיפוטוניה, חוסר קואורדינציה מוטורית פומית, ובעיות גסטרואנטרליות הקשורות לחוסר תנועתיות או תנועתיות דלה במערכת העיכול, עצירות ורפלוקס גסטרו-אזופגאלי. בעיות ההזנה עלולות לנבוע גם מהיצרות שוער הקיבה (pyloric stenosis) ו[[מחלת הירשפרונג]] הכרוכה בחלק ממקרי SLOs (על פי Dallaire ו-Fraser ב-J Pediatr משנת 1966, וכן Patterson וחב' באותו כתב עת משנת 1983 ו-Lipson ו-Hayes באותו כתב עת משנת 1984). מחלת כבד יכולה להופיע במגוון רחב של תסמינים מכולסטאזיס חמור עד עליה מתונה באנזימי כבד.

תסמינים מולדים של [[ירוד]] (cataract) מופיעים ב-20% ממקרי SLOs (על פי Finley וחב' ב-J Pediatr משנת 2012, ו-Goodwin וחב' ב-Am J Med Genet משנת 2008). ממצאים אופתלמולוגיים אחרים כוללים ptosis, אטרופיה או היפופלזיה של עצב הראייה, ניסטגמוס ופזילה (Atchaneeyasakul וחב' ב-Am J Med Genet משנת 1998). שינויים בתגובה הפוטו-רצפטורית של הקנים (rods) בילדים עם SLOs דווחה על ידי Elias וחב' ב-Arch Ophthalmol בשנת 2003, וכן דווח על שינויים דומים במבוגרים עם SLOs (על פי Garry וחב' ב-Doc Opthalmol משנת 2010).

==מאפיינים התנהגותיים בחולי SLOs==
במקרים של רמת משכל נמוכה שמוצאים לעתים בחולי SLOs, הם יכולים להגיב באופן שלילי או על ידי יתר-אקטיביות לגירויים תחושתיים שונים. ברבים מהחולים מוצאים התנהגות אגרסיבית הכוללת נטייה לפגיעה עצמית (כגון הכאה עצמית בידיים או חבטת הראש בקיר או ברהיטים או להפרעות שינה (Tiemey וחב' ב-Am J Med Genet משנת 2001). ניתן למצוא בהם נטייה בולטת לרגזנות.

מעניין לציין שהתנהגות אוטיסטית והיפר-אקטיביות מזוהים לעתים קרובות בילדים עם SLOs (על פי Bukelis וחב' ב-Am J Psychiatry משנת 2007). ההתנהגות האוטיסטית האופיינית ביותר באלה עם SLOs היא תנועה נמרצת וממושכת של פלג הגוף העליון (opisthokinesis), מתיחת פלג הגוף העליון ומחיאות כפיים מדי פעם. יש המעריכים שב-46-53% מהמאובחנים עם SLOs ניתן להבחין בתסמינים המופיעים בקשת האוטיסטית (Sikora וחב' ב-Am J Med Genet משנת 2006). בחלקם ניכרת אי-שליטה עצמית וחסכי תקשורת וקשרים חברתיים (התנהגויות נוספות הכרוכות עם SLOs יכולות להיכרך עם אי-סדירויות פיסיקאליות. כמו בעיות ההזנה (Diaz-Stransky ו-Tiemey ב-Am J Med Genet משנת 2012).

הפגיעה הקוגניטיבית בחולי SLOs יכולה כאמור להיות גבולית אך להגיע גם לרמת משל נמוכה משמעותית (Mueller וחב' ב-Am J Med Genet משנת 2003, וכן Lowry ו-Yong באותו כתב עת משנת 1980).

==אבחון מבדיל==
למרות שבתסמינים רבים ניתן למצוא עיוותי-גוף המופיעים ב-SLOs כגון פולידקטיליה, חך שסוע או היפּוֹספּדיאס (כאשר פתח השופכה ממוקם בחלק התחתון של הפין), רק לעתים נדירות תסמינים אלה יכילו יותר מ-2 עיוותים משותפים ל-SLOs. במקרים אלה הממצאים הביוכימיים הנלווים עשויים לסייע בהבדלה בין SLOs לבין תסמינים אחרים. מבחינה ביוכימית, רק ב-SLOs ניתן למצוא רמות מוגברות של 7-DHC במקביל לרמות נמוכות של כולסטרול בפלזמה. בין התסמינים האחרים עם אי-סדירות בביו-סינתזה של סטרולים ניתן לציין את desmosterolosis (בה ניתן למצוא macrocephaly או microcephaly, גשר-אף היפופלסטי, רכסים מכתשיים (alveolar ridges) מעובים, קשרירים (nodules) בחניכיים, חך שסוע, פגיעה במערכת הוורידית של הריאות, עיוותים באברי מין, גפיים קצרות ואוסטאו-סקלרוזיס), ו-lathosterolosis (בה ניתן למצוא microcephaly, מצח צר, גשר-אף משוקע, חך שסוע, כבד שומני ואי-סדירויות המטולוגיות), או תרחיש בגברים של X-linked chondrodysplasia punctata, קשים להבדלה קלינית מ-SLOs,אך המדדים הביוכימיים שונים בתכלית.

הספקטרום הקליני של המחלה רחב, כאשר באלה עם תסמינים מתונים ניתן למצוא רק סינדקטיליה של אצבעות 2-3 בכפות הרגליים וחסר קוגניטיבי קל. מפגעים אחרים של ביוסינתזה של כולסטרול, הכוללים חסר באנזים desmosterol reductase וכן sitosterolemia, יכולים להראות תסמינים דומים לאלה של SLOs, וניתן לאבחן מפגעים אלה באופן ביוכימי על ידי בדיקה כמותית של סטרולים בפלזמה.

==רמות כולסטרול בנסיוב==
למרות שמׅתאם מדויק בין רמות כולסטרול בנסיוב לבין הממצאים הקליניים אינו מעשי, רוב המחקרים זיהו מתאם הפוך בין רמות כולסטרול בנסיוב לבין החומרה של תסמיני SLOs (Tint וחב' ב-J Pediatr משנת 1995, ו-Waterham ו-Hennekam ב-Am J Med Genet משנת 2012). התמותה בקרב אלה עם SLOs גבוהה במיוחד כאשר רמות כולסטרול אצלם נמוכות במיוחד (כ-10 מיליגרם/ד"ל). למרות שרוב המאובחנים עם SLOs מראים היפו-כולסטרולמיה, רמות כולסטרול בנסיוב בבריאים ובחולים עם SLOs יכולים להיות חופפים, בעיקר אם הלוקים במפגע הם בגיל מבוגר יותר או שהם בעלי פנוטיפ מתון של המחלה (Kelley וחב' ב-Am J Med Genet משנת 1996). יצוין שבערך ב-10% ממקרי SLOs רמות כולסטרול בנסיוב נורמאליות.
==הנזק הנגרם מרמה מוגברת של DHC{{כ}}-7==

רבים מהתסמינים ב-SLOs נובעים מההשפעה הטוקסית של DHC{{כ}}-7, שפוגע בעיקר בטרנספורט התוך-תאי של כולסטרול. רמה מוגברת של DHC{{כ}}-7 מביאה לפירוק מוגבר של האנזים HMG-CoA reductase. בנוסף, DHC{{כ}}-7 הוא הליפיד הפעיל ביותר בתרחיש הפראוקסידציה של ליפידים, ולכן עלול לתרום לעקה חמצונית סיסטמית. כידוע, פראוקסידציה של ליפידים פוגעת בממברנות תאים, ויכולה להרוס חלקיקים (organells) תוך-תאיים הקשורים לממברנות. למרות הדמיון המבני ביניהם, DHC{{כ}}-7 אינו מסוגל לבוא במקום כולסטרול ב-lipid rafts . בנוסף, חסר כולסטרול מגביר את הנזילוּת של ממברנת התא, מה שעלול להגביר הפרשה בלתי נורמאלית של גרנולות תאיות. שינויים ממברנאליים אלה עלולים להפריע לדה-גרנולציה של תאי-פיטום (mast cells) המושרית על ידי הקולטן של IgE, וליצירה של ציטוקינים, הקשורים בתגובות אלרגיות (Porter ב-Eur J Hum Genet משנת 2008). גם הקולטן שלNMDA מושפע כמו גם יכולת הקישור לקולטן של סרוטונין בהיפוקאמפוס. גם האינטראקציה בין תאים נפגעת מהשינויים הממברנאליים המופיעים ב-SLOs. נמצא שב-SLOs פוחתת גם ה-exocytosis של חלקיקים (vesicles) בסינפסה, כתוצאה מפגיעה ביכולת הקישור של חלקיקים אלה לממברנות.

הנגזר של DHC{{כ}}-7 המשחק תפקיד בעקה החמצונית הוא 3β,5α-dihydroxy-cholest-7-en-6-one הידוע כ-DHCEO. נגזר זה נוצר מתוצר עיקרי של פראוקסידציה של DHC{{כ}}-7, הידוע כ- DHC-5α,6α-epoxide{{כ}}-7. נמצא ש-DHCEO טוקסי לתאי עצב בקליפת המוח ולתאי glia. משערים שגם רגישות היתר לאור מגלים חולים עםSLOs , נובעת מהעקה החמצונית (Anstey ב- J Photochem Photobiol משנת 2001). מחקר של Valencia וחב' הראו ב-Free Radical Biol Med ש-DHC{{כ}}-7 מזרז את העקה החמצונית הנגרמת בקרטינוציטים בחשיפה ל-UVA. יש לציין שרמות מוגברות של הקודמנים של כולסטרול כגון DHC{{כ}}-7, יכולים להתגלות גם בנבדקים עם היפר-כולסטרולמיה או באנשים המטופלים ב-haloperidol , וכן באלה המטופלים ב- aripiprazole או ב-trazodone ללא קשר ל-SLOs (על פי Hall וחב' ב-Mol Genet Metab משנת 2013). יחד עם זאת, היחס של cholesterol{{כ}}/DHC{{כ}}-7 מוגבר רק בנבדקים עם SLOs.

לרוב מכריע של הלוקים ב-SLOs יש גם רמות נמוכות של כולסטרול במוח, שמשמעותו שריכוזו של כל נגזר סטרולי של כולסטרול במוח יהיה נמוך. לדוגמה, ניתן למצוא ב-SLOs רמות נמוכות של נוירוסטרואידים, הנוטלים חלק בהעברת איתותים בתוך המוח, וייצורם מתבצע אף הוא במוח.

נוירוסטרואידים מגיבים עם קולטנים ספציפיים במוח, ונקשרים לתעלות יונים הקשורות לפעילות של נוירוטרנסמיטורים. באופן ספציפי הם גורמים למודולציה של הקולטנים שלGABA ושל NMDA, וגורמים לשיכוך ולהרגעה, לשיפור זיכרון, ועוד. כיוון שחלק מתסמיני SLOs כגון היפראקטיביות ודאגנות מייצגים השפעות הפוכות לאלה הנגרמות על ידי נוירוסטרואידים, יש להניח שהפחתה בריכוזם של האחרונים קשורה לכך (Marcos וחב' ב-Steroids משנת 2004).

==שיטות לגילוי 7DHC==
יש מספר שיטות לגלות רמות של 7DHC בפלזמת הדם, ואחת מהן היא שימוש בריאגנט Liebermann–Burchard. זו שיטה קולורימטרית פשוטה שנוחה לשימוש בבדיקות סקר אוכלוסיות בהיקף גדול. הוספת ריאגנט זה לדגימת הפלזמה הנבדקת מביאה באופן מידי להופעת צבע סגול, שהופך בהדרגה לכחול כהה, כאשר בדגימות דם תקינות הוספת הריאגנט האמור מותירה את הדגימה חסרת-צבע שבהדרגה עובר לצבע תכלכל (Xiong וחב' ב-Chem Phys Lipids משנת 2002).

דרך אחרת לגילוי 7DHC נעשית בשיטה של Gas Chromatography-Mass Spectrometry (או (GC-MS על פי Kelley ב-Clin Chim Acta משנת 1995. גרסה רגישה במיוחד של גז כרומטוגרפיה המאפשרת גילוי ריכוזים נמוכים של 7DHC ידועה כ- SIM-GC/MSאו selected ion monitoring gas chromatography/mass-spectrometry. שיטות נוספות לזיהוי מקרי SLOs כוללות את time-of-flight mass spectrometry שניתן לבצע על טיפות דם מיובשות על נייר סופג (Zimmerman וחב' ב-Am J Med Genet משנת 1997), כמו גםparticle-beam LC/MS וכן electrospray ionization tandem MS (על פי Johnson וחב' ב-J Lipid Res משנת 2001), שניתן להשתמש בהן לזיהוי 7DHC בדגימות פלזמה, בנוזל מי-שפיר, בסיסי שליה ואף בשתן.

== הוראות לביצוע הבדיקה ==
יש להיות בצום של לפחות 12 שעות לפני נטילת הדם. בתינוקות יש לקחת דם סמוך להנקה או ההזנה הבאה. את הדם יש ליטול במבחנת סודיום-הפארין (פקק ירוק) כבחירה ראשונה, אם כי גם מבחנת ספירת דם (EDTA פקק סגלגל) מתקבלת. יש לסרכז את הדם לא יאוחר מ-30 דקות מלקיחתו. ניתן לשמור את הפלזמה המופרדת עד 7 ימים בקירור, או עד 90 יום בהקפאה.

==ראו גם==

* [[מדריך בדיקות מעבדה|חזרה לדף מדריך בדיקות מעבדה]]
* [[אבחון מחלות ומפגעים מטבוליים-גנטיים|בדיקות מעבדה - אבחון מחלות ומפגעים מטבוליים-גנטיים]]

{{ייחוס|[[משתמש:בן עמי סלע|פרופ' בן עמי סלע]]}}

[[קטגוריה:בדיקות מעבדה - אבחון מחלות ומפגעים מטבוליים-גנטיים]]
[[קטגוריה:בדיקות מעבדה: כימיה בדם]]

Iduronate-2-sulfatase

2015-12-07T05:41:11Z

בן עמי סלע:

{{בדיקת מעבדה
|שם עברי=Iduronate-2-sulfatase
|שם לועזי={{רווח קשיח}}
|קיצור=Alpha-L-Idopyranosyluronic Acid 2-Sulfate Sulfahydrolase; I2S; IDS
|תמונה=
|כיתוב תמונה=
|מעבדה=גנטיקה/[[כימיה בדם]]
|תחום=אבחון [[תסמונת Hunter]]
|יחידות מדידה=
|טווח ערכים תקין=מעל 1.5 nmol/h/ml
|יוצר הערך=[[משתמש:בן עמי סלע|פרופ' בן עמי סלע]]
|אחראי הערך=
}}
==מטרת הבדיקה ==
אבחון של מחלתHunte r או mucopolysaccharidosis II תוך שימוש בדגימות דם מיובשות על נייר סופג, או בדגימות פלזמה.

== תסמונת Hunter ==

תסמונת Hunter או mucopolysaccaridosis II וגם PMP II, היא מחלת אגירה ליזוזמאלית הנובעת ממוטציה בכרומוזום X, הגורמת לחסר האנזים iduronate-2-sulfatase או IDS. המוקופוליסכרידוזות הן משפחת מפגעים הנגרמים מחסר של כל אחד מהאנזימים הקשורים בביקוע הרב-שלבי של גליקוזאמינוגליקנים (GAGs) כמו dermatan sulfate, ,heparan sulfate keratan sulfate ו-chondroitin sulfate. הצטברות של GAGs (שבעבר כונו מוקופוליסכרידים) בליזוזומים פוגעת בתפקוד של תאים, רקמות ואיברים. MPS II נגרם על ידי חסר מלא או על ידי רמה מופחתת של האנזים IDS, מה שגורם למפגע של תסמונת Hunter.

המאפיינים הקליניים וחומרת התסמינים מראים שוֹנוּת ניכרת בטווח שבין מחלה חמורה ביותר, לבין צורה מתונה יותר של התסמונת, שמופיעה בדרך כלל בשלב מאוחר יותר בחיים, עם ביטוי קליני מתון יותר. כללית, התסמינים יכולים לכלול תווי פנים גסים, קומה נמוכה, טחול וכבד מוגדלים, קול צרוד, מפרקים מוקשחים, מחלת לב, ומעורבות נוירולוגית בולטת הקשורה לפיגור התפתחותי ואף נסיגה. כיוון שתסמונת Hunter קשורה לפגם בכרומוזום X, היא מופיעה כמעט באופן בלעדי בזכרים השכיחות מוערכת של מקרה אחד ל-120,000 לידות זכר, אם כי היו דיווחים גם על נשים נשאיות תסמוניות. החלופות הטיפוליות כוללות השתלת תאי גזע המאטו-פויאטיים או תרפיה המבוססת על עירוי אנזים ריקומביננטי.

==התפקוד התקין של הגן IDS==
גן זה מקודד לאנזים iduronate-2-sulfatase האחראי לפירוק מולקולות סוכריות פולימריות כגון GAGs. באופן ספציפי אנזים זה מבקע שייר סולפאט מהמולקולה הידועה כ-sulfated α-L-iduronic acid, המהווה מרכיב ב-2 מולקולות ה-GAG, הידועות כ-heparan sulfate ו-dermatan sulfate. מיקומו המדויק של הגן IDS הוא על הזרוע הארוכה של כרומוזום X בעמדה 28, בין bp 149,478,764 ל-bp 149,505,354.
== אבחון המחלה ==
האנזים IDS פועל כ-exosulfatase בליזוזומים ומבצע הידרוליזה של הקשר האסטרי C2-sulfate, בקצה הלא-מחזר של שיירי iduronic acid בהפרן סופאט ובדרמטן סולפאט IDS הוא אחד מתוך משפחה של לפחות 9 סולפטאזות שמבקעות סולפאט-אסטרים בתאי אדם. חסר האנזים מביא להצטברות שני ה-GAGs האמורים, ולהפרשתם המשמעותית בשתן. מחלת Hunter הנגרמת כתוצאה מכך יכולה להופיע במגוון של חומרת התסמינים, זאת בגלל המגוון הגדול של מוטציות בגן IDS.

עד לפרסום של Stenson וחב' ב-Hum Mut משנת 2003 היה ידוע כבר על לפחות 309 מוטציות שונות בגן זה, מה שמסביר מגוון כה גדול בפנוטיפ הקליני של תסמונת Hunter. יחד עם זאת, מחקרים על הגנוטיפ/פנוטיפ לא סיפקו את המתאם הנדרש לנבא במדויק את חומרת התסמונת והתקדמותה בכל הלוקים בה (Froissart וחב' ב-Acta Paediatr Supple משנת 2002). בדרך כלל הצורה החמורה של התסמונת מתגלה בגיל 2-4 שנים, ויכולה להתבטא בפיגור התפתחותי מוטורי ונוירולוגי קשים, התנהגות חריגה ביותר, ומוות לפני הגעה לגיל בגרות. לעומת זאת, בלוקים בגרסת התסמונת המתונה, נשמרת רמת משכל תקינה, ואלה שורדים עם תוחלת חיים כמעט זהה לזו של אנשים בריאים (Young וחב' ב-J Med Genet משנת 1982). בשנת 1990 פרסמו Wilson וחב' ב-Proc Natl Acad Sci USA, על הבידוד והריצוף של cDNA שגודלו 2.3kb, וזיהוי 550 חומצות האמינו המופיעות באנזים IDS. אנליזה של רצץ חומצות האמינו מצאה בקצה ה-N טרמינאלי signal sequence של 25 חומצות אמינו, ולאחריו 8 חומצות אמינו המורחקות מהקודמן (precursor) של preproprotein.

ביקוע פרוטאוליטי מתרחש בכבד על מנת להביא ליצירת אנזיםIDS בּשל, בגודל של 42,000 דלטון. ראוי לציין שהרצף של החומצות אמינו ב-IDS, הוא בעל הומולוגיה ניכרת עם אנזימי sulfatase אחרים באדם, כגון סוגי A, B, ו-C של arylsulfatase, וכן glucosamine-6-sulfatase, מה שמרמז לכך שאנזימי sulfatase מהווים משפחת אנזימים קרובה אבולוציונית, שמקורה בגן קדמון ממנו היא התפלגה בתהליך של gene duplication. מחקרי המשך מצאו שאורכו של הגן IDS הוא כ-kb24, והוא מכיל תשעה exons ושמונה introns (על פי Flommen וחב' ב-Hum Mol Genet משנת 1993).

==מוטציות בגן IDS==

מחקרים מולקולאריים בשיטת Southern blotting, וריצוף של cDNA, הראו ספקטרום רחב של שינויים גנטיים החלים בגן IDS באדם (Hopwood וחב' ב-Hum Mutat משנת 1993, וכן Jonsson וחב' ב-Am J Hum Genet משנת 1995 ו-Rathmann וחב' ב-Am J Hum Genet משנת 1996). המסקנה הייתה שבחולי Hunter עם מוטציות חסר (deletions) כצפוי הופיע פנוטיפ המחלה הקשה, ואילו באלה עם מוטציות עם מוטציות נקודתיות התסמונת קלה יותר. מחקר של Li וחב' ב-J Med Genet משנת 1999, באנליזה הידועה כ-SSCP או single strand conformation polymorphism המלווה על ידי RT-PCR, לצורך גילוי מוטציות ב-cDNA של IDS, בחן 18 חולים בתסמונת Hunter ללא כל קרבה משפחתית.

מחקר זה גילה בנבדקים אלה 17 מוטציות שונות, שכללו 16 מוטציות "קלות" לפי הפירוט הבא: שבע מוטציות סלף (missence) הבאות: S71R, A82E, A85T, R88C, R468W, R468Q ו-E5231V; חמש מוטציות חסר (deletion) לפי הפירוט הבא: ΔR85, 383delAT, 596delAACA, 1148delC ו-1216delCT; שתי מוטציות החדרה (insertion) והן 208insC ו-1063insA; שתי מוטציות שׅחבּוּר (splicing) והן 1006+5g→c ו-1122→T באקסון 8; מוטציה אחת של חסר תוך-גני באקסונים 4, 5, 6 ו-7. מוטציית 596delAACA התגלתה בשני חולים שאינם קרובי משפחה. אנליזה של המוטציות A85T, R88C, R468Q, R468W ו-438C/T, לא מצאה כל פולימורפיזם לארבעת מוטציות הסלף, אך נמצאה 36% הטרוזיגוטיות של המוטציה השקטה 438C/T . תוצאות אלו מספקות עדות נוספת להטרוגניות במוטציות בגן של IDS.

== גישות מעבדתיות לבחון תסמונת Hunter ==

הלוקים בתסמונת זו באופן אופייני מכילים בשתן שלהם כמויות מוגברות של GAGs ורמות מוגברות של dermatan sulfate ושל heparan sulfate. פעילות מופחתת או חסרה של IDS בפיברובלסטים, בלויקוציטים ו/או בנסיוב, יכולה לאשר אבחון של MPS II. יחד עם זאת, בחינה אנזימטית אינה אמינה על מנת לזהות נשאים של הפגם הזה. בחינה גנטית-מולקולארית של הגן IDS מאפשר זיהוי המוטציה הגורמת למחלה בנבדקים הפגועים, וכן זיהוי של נשאי המוטציה בקרב נשים הקרובות מדרגת קרבה ראשונה. עד כה לא נקבע קשר ברור בין הגנוטיפ והפנוטיפ בתסמונת זו.

יש לשים לב שרמת האנזים IDS יכולה להיות מופחתת גם בתסמונת הידועה כ- MSD או multiple sulfatase deficiency. אם אבחון זה הוא בעל סבירות גבוהה יש לשקול מבחן ביוכימי/גנטי של סולפטאזות נוספות, או לבצע מבחן גנטי-מולקולארי של הגן SUMF 1 על מנת לשלול MSD.

== היסטוכימיה ומיקרוסקופיה ==

כמו במוקופוליסכרידוזות אחרות גם בתסמונת Hunter ניתן להשתמש בגישה היסטוכימית ובחינת תאים בהם יש הצטברות של ה-GAG הרלוונטי. באופן אופייני ניתן להבחין בווקואולות רבות בכל שטח התא. צביעת משטחים תאיים אלה עם ריאגנטים בעלי זיקה לשיירים חומציים כגון סולפאט (SO4-) או קרבוקסיל (-COO) המהווים מרכיבים של ה-GAGs השונים, מתקבל צביעה בצבע סגול בולט (מטאכרומזיה). שימוש במיקרוסקופ אלקטרוני מאפשר לראות בבירור את הווקואולות הגדולות שאינן אלא ליזוזומים תפוחים מאוד המכילים חומר אמורפי מגורגר האופייני לאגירת פוליסכרידים שונים (Neufeld ו-Munenzer ב-Metabolic & Basis of Inherited Diseases משנת 2001).

==שיטות אבחון שונות של אגירת MPS II==

כאשר מתעורר חשד לתסמונת Hunter ניתן בשלב הראשון לנסות ולאתר הפרשת MPS II בשתן, זאת על ידי כרומטוגרפיה על רובד דק (TLC) של צלולוז-אצטאט וצביעת הפלטות בהשלמת ההרצה עם הריאגנט Alcian Blue. ההפרדה אינה אידיאלית במובן שקשה להשיג הפרדה טובה בין ה-GAGs האחרים לבין MPS II.

מקובל יותר לבצע אבחון אנזימטי בתמצית של לויקוציטים, לאחר בידודם מהדם המלא. ניתן לבצע בדיקה אנזימטית גם בתרבית תאים, כגון תרבית של פיברובלסטים, תאים שמבודדים מהנוזל האמניוטי לאחר איסוף מי שפיר, או שמבצעים בדיקה אנזימטית זו בחומר של סיסי-שליה (chorionic villi). בדיקה אנזימטית בתאי מי השפיר או בסיסי שליה, מאפשרים לגלות עובר פגוע בבדיקה טרום לידתית, במשפחה עם היסטוריה של ילדים קודמים עם תסמונת Hunter.

==המבדק הפלואורימטרי האנזימטי לקביעת פעילות IDS==

בשנת 2001 תיארו Voznyi וחב' ב- J Inherit Metab Dis, שיטה פלואורומטרית לקביעת פעילות האנזים. הם סנתזו מצע ספציפי, 4methylumbelliferyl-α-iduronate 2-sulphate, כדי שישמש למדידת פעילות iduronate-2-sulphate sulphatase הליזוזומאלי. המבדק נעשה בפיברובלסטים, לויקוציטים ובפלזמה שמקורם בחולים שונים המאובחנים עם MPS, ובכל הדגימות האלה נמצאו ערכי פעילות אנזים שהיו נמוכים מ-5% מפעילות האנזים בקבוצת ביקורת.

האבחון של עוברים בסכנה של MPS II בשבוע ה-12-14 של ההיריון, נוסה כבר מסוף שנות ה-60 על ידי מדידת ההצטברות של 35S-mucopolysaccharide בנוזל מי שפיר בתרבית, על ידי Fratantoni וחב' ב-N Eng J Med משנת 1969, ו-Kleijer וחב' ב-Clin Genet משנת 1979). לאחר מכן בוצע אבחון זה על ידי אלקטרופורזה דו-ממדית של GAGs בנוזל מי-שפיר על ידי Mossman ו-Patrick ב-Prenat Diagn משנת 1982, ו-Kleijer וחב' ב-Lancet משנת 1984). בשנת 1979 פרסם Hopwood על הכנת מצע חדש למדידת פעילות האנזים IDS מדובר במצע רדיואקטיבי שהוכן מ-dermatan sulfate והוא 4O-alfa-L-iduronosyl-D-[3H] anhydromannitol 6-sulfate. אך השיטה הרדיואקטיבית היא בעלת מספר שלבים ומסורבלת יחסית לביצוע, וכן אינה ידידותית לסביבה.

בשנת 2002 דיווחו Kuelemans וחב' ב-Prenat Diagn על שימוש במצע שסנתזו חוקרים אלה קודם לכן, ומדובר ב-4methylumbelliferyl-alpha- iduronate 2-sulphate
המתאים לאנזים IDS, ובעזרתו הם בחנו 174 עוברים שהיו בסכנה ל-MPS II. מתוכם אובחנו 27 עוברים זכרים עם רמה נמוכה ביותר של IDS. בשנת 2006 פרסמו Dean וחב' ב-Clin Chem שיטת מדידה של פעילות IDS הן בשיטת גילוי פעילות האנזים עם מצע ה-4-MU-sulfate וכן על ידי immunoassay. בשיטה האימונולוגית התאפשרה מדידת רמת האנזים בטיפות דם מיובשות ב-2 שלבים, על ידי שימוש בערכה של lanthanide fluorescent immunoassay של DELFIA®. בשיטה זו פלטות microtiter צופו עם נוגדן פוליקלונלי ממקור עז המכוון כנגד IDS. לאחר שטיפות בבופר מתאים, מונחות פיסות הנייר המכיל דם מיובש על גבי בארות הפלטה, לתקופת הדגרה, ולאחר שטיפות נוספות מוסף לבארות נוגדן פןליקלונלי שני המכוון כנגד האנזים IDS אליו קשור היסוד europium מממשפחת הלנטנידים המשמש בגלל ה-phosphorescence שלו שניתן לכימות על ידי DELFIA 1234 fluorometer.

התרשימים למטה מדגימים את תוצאות 2 הגישות של מדידת IDS במחקר של Dean וחב'.

[[קובץ:Iduronate1.gif|מרכז|550 פיקסלים]]

רמת האנזים IDS המבוססת על ריכוזו כחלבון (A) או על פעילותו (B) בטיפות דם של חולים עם MPS II ובאנשים בריאים. (לקוח מ-Dean וחב' ב-Clinical Chemistry משנת 2006). 2202006 2006).

[[קובץ:Iduronate2.gif|מרכז|550 פיקסלים]]

רמת האנזים IDS המבוססת על ריכוזו כחלבון (A) או על פעילותו (B) בדגימות פלזמה בחולים עם MPS II ובאנשים בריאים. (לקוח מ-Dean וחב' ב-Clinical Chemistry משנת 2006).

== הוראות לביצוע הבדיקה ==

הבדיקה יכולה להתבצע בגרסה של טיפת דם מלא המיובש על גבי נייר Guthrie, או על דם מלא הנלקח במבחנה. בשיטת טיפת הדם המיובשת ניתן להשתמש גם בנייר סופג מסוג Whatman Protein Saver 903 Paper, אך ניתן גם להשתמש ב- Ahlstrom 226 filter paper או ב-Munktell Blood Spot Collection Card (T493). יש לשלוח לפחות 2 טיפות דם מיובשות. חלופת נטילת דם לתינוק מתחת לגיל 1 שנה, היא על ידי שימוש בדוקרן לקבלת מספר טיפות דם מהאצבע.

לאחר האפליקציה של הדם המלא על נייר הבדיקה בטמפרטורת החדר, יש להשאיר את טופס הנייר למשך 3 שעות בעמדה מאוזנת. אין לחשוף את נייר הבדיקה עם הדם המיובש לחום או לקרני שמש ישירות. יש לשמור את טופס נייר הבדיקה במקום יבש בטמפרטורת החדר רצוי במעטפה אטומה עד המשלוח למעבדה. רצוי שהאפליקציה של הדם על נייר הבדיקה תיעשה באופן מלא ורציף, ואין להוסיף טיפת דם נוספת על גבי טיפה שהוספה קודם לכן כדי למנוע מספר שכבות דם שבאות לביטוי בצורת "טבעות" דם נראות לעין. דגימות דם מלא בצורת טיפות מיובשות יציבות בתנאי חושך וטמפרטורת החדר עד 3 חודשים.

אפשרות נוספת היא ביצוע הבדיקה בדם מלא. יש להעדיף נטילת דם במבחנת ספירת-דם (EDTA, פקק סגלגל), אך ניתן גם להשתמש במבחנה כימית (פקק אדום או צהוב). אין לפסול דגימות המוליטיות, ליפמיות ואיקטריות. הדם צריך להישלח למעבדה בקירור (יציב בטמפרטורה זו משך 7 ימים).
הבדיקה מתבצעת בשיטה אנזימטית פלואורומטרית; שיטה אחרת היא זו של Tandem Mass Spectrometry על פי Wang וחב' ב-Clinical Chemistry משנת 2007.

==ראו גם==
* [[מדריך בדיקות מעבדה|חזרה לדף מדריך בדיקות מעבדה]]
* [[אבחון תסמנות גנטיות|בדיקות מעבדה - אבחון תסמנות גנטיות]]

{{ייחוס|[[משתמש:בן עמי סלע|פרופ' בן עמי סלע]]}}

[[קטגוריה:בדיקות מעבדה - אבחון תסמנות גנטיות]]
[[קטגוריה:בדיקות מעבדה: גנטיקה]]
[[קטגוריה:בדיקות מעבדה: כימיה בדם]]

Iduronate-2-sulfatase

2015-12-07T05:39:22Z

בן עמי סלע:

{{בדיקת מעבדה
|שם עברי=Iduronate-2-sulfatase
|שם לועזי={{רווח קשיח}}
|קיצור=Alpha-L-Idopyranosyluronic Acid 2-Sulfate Sulfahydrolase; I2S; IDS
|תמונה=
|כיתוב תמונה=
|מעבדה=גנטיקה/[[כימיה בדם]]
|תחום=אבחון [[תסמונת Hunter]]
|יחידות מדידה=
|טווח ערכים תקין=מעל 1.5 nmol/h/ml
|יוצר הערך=[[משתמש:בן עמי סלע|פרופ' בן עמי סלע]]
|אחראי הערך=
}}
==מטרת הבדיקה ==
אבחון של מחלתHunte r או mucopolysaccharidosis II תוך שימוש בדגימות דם מיובשות על נייר סופג, או בדגימות פלזמה.

== תסמונת Hunter ==

תסמונת Hunter או mucopolysaccaridosis II וגם PMP II, היא מחלת אגירה ליזוזמאלית הנובעת ממוטציה בכרומוזום X, הגורמת לחסר האנזים iduronate-2-sulfatase או IDS. המוקופוליסכרידוזות הן משפחת מפגעים הנגרמים מחסר של כל אחד מהאנזימים הקשורים בביקוע הרב-שלבי של גליקוזאמינוגליקנים (GAGs) כמו dermatan sulfate, ,heparan sulfate keratan sulfate ו-chondroitin sulfate. הצטברות של GAGs (שבעבר כונו מוקופוליסכרידים) בליזוזומים פוגעת בתפקוד של תאים, רקמות ואיברים. MPS II נגרם על ידי חסר מלא או על ידי רמה מופחתת של האנזים IDS, מה שגורם למפגע של תסמונת Hunter.

המאפיינים הקליניים וחומרת התסמינים מראים שוֹנוּת ניכרת בטווח שבין מחלה חמורה ביותר, לבין צורה מתונה יותר של התסמונת, שמופיעה בדרך כלל בשלב מאוחר יותר בחיים, עם ביטוי קליני מתון יותר. כללית, התסמינים יכולים לכלול תווי פנים גסים, קומה נמוכה, טחול וכבד מוגדלים, קול צרוד, מפרקים מוקשחים, מחלת לב, ומעורבות נוירולוגית בולטת הקשורה לפיגור התפתחותי ואף נסיגה. כיוון שתסמונת Hunter קשורה לפגם בכרומוזום X, היא מופיעה כמעט באופן בלעדי בזכרים השכיחות מוערכת של מקרה אחד ל-120,000 לידות זכר, אם כי היו דיווחים גם על נשים נשאיות תסמוניות. החלופות הטיפוליות כוללות השתלת תאי גזע המאטו-פויאטיים או תרפיה המבוססת על עירוי אנזים ריקומביננטי.

==התפקוד התקין של הגן IDS==
גן זה מקודד לאנזים iduronate-2-sulfatase האחראי לפירוק מולקולות סוכריות פולימריות כגון GAGs. באופן ספציפי אנזים זה מבקע שייר סולפאט מהמולקולה הידועה כ-sulfated α-L-iduronic acid, המהווה מרכיב ב-2 מולקולות ה-GAG, הידועות כ-heparan sulfate ו-dermatan sulfate. מיקומו המדויק של הגן IDS הוא על הזרוע הארוכה של כרומוזום X בעמדה 28, בין bp 149,478,764 ל-bp 149,505,354.
== אבחון המחלה ==
האנזים IDS פועל כ-exosulfatase בליזוזומים ומבצע הידרוליזה של הקשר האסטרי C2-sulfate, בקצה הלא-מחזר של שיירי iduronic acid בהפרן סופאט ובדרמטן סולפאט IDS הוא אחד מתוך משפחה של לפחות 9 סולפטאזות שמבקעות סולפאט-אסטרים בתאי אדם. חסר האנזים מביא להצטברות שני ה-GAGs האמורים, ולהפרשתם המשמעותית בשתן. מחלת Hunter הנגרמת כתוצאה מכך יכולה להופיע במגוון של חומרת התסמינים, זאת בגלל המגוון הגדול של מוטציות בגן IDS.

עד לפרסום של Stenson וחב' ב-Hum Mut משנת 2003 היה ידוע כבר על לפחות 309 מוטציות שונות בגן זה, מה שמסביר מגוון כה גדול בפנוטיפ הקליני של תסמונת Hunter. יחד עם זאת, מחקרים על הגנוטיפ/פנוטיפ לא סיפקו את המתאם הנדרש לנבא במדויק את חומרת התסמונת והתקדמותה בכל הלוקים בה (Froissart וחב' ב-Acta Paediatr Supple משנת 2002). בדרך כלל הצורה החמורה של התסמונת מתגלה בגיל 2-4 שנים, ויכולה להתבטא בפיגור התפתחותי מוטורי ונוירולוגי קשים, התנהגות חריגה ביותר, ומוות לפני הגעה לגיל בגרות. לעומת זאת, בלוקים בגרסת התסמונת המתונה, נשמרת רמת משכל תקינה, ואלה שורדים עם תוחלת חיים כמעט זהה לזו של אנשים בריאים (Young וחב' ב-J Med Genet משנת 1982). בשנת 1990 פרסמו Wilson וחב' ב-Proc Natl Acad Sci USA, על הבידוד והריצוף של cDNA שגודלו 2.3kb, וזיהוי 550 חומצות האמינו המופיעות באנזים IDS. אנליזה של רצץ חומצות האמינו מצאה בקצה ה-N טרמינאלי signal sequence של 25 חומצות אמינו, ולאחריו 8 חומצות אמינו המורחקות מהקודמן (precursor) של preproprotein.

ביקוע פרוטאוליטי מתרחש בכבד על מנת להביא ליצירת אנזיםIDS בּשל, בגודל של 42,000 דלטון. ראוי לציין שהרצף של החומצות אמינו ב-IDS, הוא בעל הומולוגיה ניכרת עם אנזימי sulfatase אחרים באדם, כגון סוגי A, B, ו-C של arylsulfatase, וכן glucosamine-6-sulfatase, מה שמרמז לכך שאנזימי sulfatase מהווים משפחת אנזימים קרובה אבולוציונית, שמקורה בגן קדמון ממנו היא התפלגה בתהליך של gene duplication. מחקרי המשך מצאו שאורכו של הגן IDS הוא כ-kb24, והוא מכיל תשעה exons ושמונה introns (על פי Flommen וחב' ב-Hum Mol Genet משנת 1993).

==מוטציות בגן IDS==

מחקרים מולקולאריים בשיטת Southern blotting, וריצוף של cDNA, הראו ספקטרום רחב של שינויים גנטיים החלים בגן IDS באדם (Hopwood וחב' ב-Hum Mutat משנת 1993, וכן Jonsson וחב' ב-Am J Hum Genet משנת 1995 ו-Rathmann וחב' ב-Am J Hum Genet משנת 1996). המסקנה הייתה שבחולי Hunter עם מוטציות חסר (deletions) כצפוי הופיע פנוטיפ המחלה הקשה, ואילו באלה עם מוטציות עם מוטציות נקודתיות התסמונת קלה יותר. מחקר של Li וחב' ב-J Med Genet משנת 1999, באנליזה הידועה כ-SSCP או single strand conformation polymorphism המלווה על ידי RT-PCR, לצורך גילוי מוטציות ב-cDNA של IDS, בחן 18 חולים בתסמונת Hunter ללא כל קרבה משפחתית.

מחקר זה גילה בנבדקים אלה 17 מוטציות שונות, שכללו 16 מוטציות "קלות" לפי הפירוט הבא: שבע מוטציות סלף (missence) הבאות: S71R, A82E, A85T, R88C, R468W, R468Q ו-E5231V; חמש מוטציות חסר (deletion) לפי הפירוט הבא: ΔR85, 383delAT, 596delAACA, 1148delC ו-1216delCT; שתי מוטציות החדרה (insertion) והן 208insC ו-1063insA; שתי מוטציות שׅחבּוּר (splicing) והן 1006+5g→c ו-1122→T באקסון 8; מוטציה אחת של חסר תוך-גני באקסונים 4, 5, 6 ו-7. מוטציית 596delAACA התגלתה בשני חולים שאינם קרובי משפחה. אנליזה של המוטציות A85T, R88C, R468Q, R468W ו-438C/T, לא מצאה כל פולימורפיזם לארבעת מוטציות הסלף, אך נמצאה 36% הטרוזיגוטיות של המוטציה השקטה 438C/T . תוצאות אלו מספקות עדות נוספת להטרוגניות במוטציות בגן של IDS.

== גישות מעבדתיות לבחון תסמונת Hunter ==

הלוקים בתסמונת זו באופן אופייני מכילים בשתן שלהם כמויות מוגברות של GAGs ורמות מוגברות של dermatan sulfate ושל heparan sulfate. פעילות מופחתת או חסרה של IDS בפיברובלסטים, בלויקוציטים ו/או בנסיוב, יכולה לאשר אבחון של MPS II. יחד עם זאת, בחינה אנזימטית אינה אמינה על מנת לזהות נשאים של הפגם הזה. בחינה גנטית-מולקולארית של הגן IDS מאפשר זיהוי המוטציה הגורמת למחלה בנבדקים הפגועים, וכן זיהוי של נשאי המוטציה בקרב נשים הקרובות מדרגת קרבה ראשונה. עד כה לא נקבע קשר ברור בין הגנוטיפ והפנוטיפ בתסמונת זו.

יש לשים לב שרמת האנזים IDS יכולה להיות מופחתת גם בתסמונת הידועה כ- MSD או multiple sulfatase deficiency. אם אבחון זה הוא בעל סבירות גבוהה יש לשקול מבחן ביוכימי/גנטי של סולפטאזות נוספות, או לבצע מבחן גנטי-מולקולארי של הגן SUMF 1 על מנת לשלול MSD.

== היסטוכימיה ומיקרוסקופיה ==

כמו במוקופוליסכרידוזות אחרות גם בתסמונת Hunter ניתן להשתמש בגישה היסטוכימית ובחינת תאים בהם יש הצטברות של ה-GAG הרלוונטי. באופן אופייני ניתן להבחין בווקואולות רבות בכל שטח התא. צביעת משטחים תאיים אלה עם ריאגנטים בעלי זיקה לשיירים חומציים כגון סולפאט (SO4-) או קרבוקסיל (-COO) המהווים מרכיבים של ה-GAGs השונים, מתקבל צביעה בצבע סגול בולט (מטאכרומזיה). שימוש במיקרוסקופ אלקטרוני מאפשר לראות בבירור את הווקואולות הגדולות שאינן אלא ליזוזומים תפוחים מאוד המכילים חומר אמורפי מגורגר האופייני לאגירת פוליסכרידים שונים (Neufeld ו-Munenzer ב-Metabolic & Basis of Inherited Diseases משנת 2001).

==שיטות אבחון שונות של אגירת MPS II==

כאשר מתעורר חשד לתסמונת Hunter ניתן בשלב הראשון לנסות ולאתר הפרשת MPS II בשתן, זאת על ידי כרומטוגרפיה על רובד דק (TLC) של צלולוז-אצטאט וצביעת הפלטות בהשלמת ההרצה עם הריאגנט Alcian Blue. ההפרדה אינה אידיאלית במובן שקשה להשיג הפרדה טובה בין ה-GAGs האחרים לבין MPS II.

מקובל יותר לבצע אבחון אנזימטי בתמצית של לויקוציטים, לאחר בידודם מהדם המלא. ניתן לבצע בדיקה אנזימטית גם בתרבית תאים, כגון תרבית של פיברובלסטים, תאים שמבודדים מהנוזל האמניוטי לאחר איסוף מי שפיר, או שמבצעים בדיקה אנזימטית זו בחומר של סיסי-שליה (chorionic villi). בדיקה אנזימטית בתאי מי השפיר או בסיסי שליה, מאפשרים לגלות עובר פגוע בבדיקה טרום לידתית, במשפחה עם היסטוריה של ילדים קודמים עם תסמונת Hunter.

==המבדק הפלואורימטרי האנזימטי לקביעת פעילות IDS==

בשנת 2001 תיארו Voznyi וחב' ב- J Inherit Metab Dis, שיטה פלואורומטרית לקביעת פעילות האנזים. הם סנתזו מצע ספציפי, 4methylumbelliferyl-α-iduronate 2-sulphate, כדי שישמש למדידת פעילות iduronate-2-sulphate sulphatase הליזוזומאלי. המבדק נעשה בפיברובלסטים, לויקוציטים ובפלזמה שמקורם בחולים שונים המאובחנים עם MPS, ובכל הדגימות האלה נמצאו ערכי פעילות אנזים שהיו נמוכים מ-5% מפעילות האנזים בקבוצת ביקורת.

האבחון של עוברים בסכנה של MPS II בשבוע ה-12-14 של ההיריון, נוסה כבר מסוף שנות ה-60 על ידי מדידת ההצטברות של 35S-mucopolysaccharide בנוזל מי שפיר בתרבית, על ידי Fratantoni וחב' ב-N Eng J Med משנת 1969, ו-Kleijer וחב' ב-Clin Genet משנת 1979). לאחר מכן בוצע אבחון זה על ידי אלקטרופורזה דו-ממדית של GAGs בנוזל מי-שפיר על ידי Mossman ו-Patrick ב-Prenat Diagn משנת 1982, ו-Kleijer וחב' ב-Lancet משנת 1984). בשנת 1979 פרסם Hopwood על הכנת מצע חדש למדידת פעילות האנזים IDS מדובר במצע רדיואקטיבי שהוכן מ-dermatan sulfate והוא 4O-alfa-L-iduronosyl-D-[3H] anhydromannitol 6-sulfate. אך השיטה הרדיואקטיבית היא בעלת מספר שלבים ומסורבלת יחסית לביצוע, וכן אינה ידידותית לסביבה.

בשנת 2002 דיווחו Kuelemans וחב' ב-Prenat Diagn על שימוש במצע שסנתזו חוקרים אלה קודם לכן, ומדובר ב-4methylumbelliferyl-alpha- iduronate 2-sulphate
המתאים לאנזים IDS, ובעזרתו הם בחנו 174 עוברים שהיו בסכנה ל-MPS II. מתוכם אובחנו 27 עוברים זכרים עם רמה נמוכה ביותר של IDS. בשנת 2006 פרסמו Dean וחב' ב-Clin Chem שיטת מדידה של פעילות IDS הן בשיטת גילוי פעילות האנזים עם מצע ה-4-MU-sulfate וכן על ידי immunoassay. בשיטה האימונולוגית התאפשרה מדידת רמת האנזים בטיפות דם מיובשות ב-2 שלבים, על ידי שימוש בערכה של lanthanide fluorescent immunoassay של DELFIA®. בשיטה זו פלטות microtiter צופו עם נוגדן פוליקלונלי ממקור עז המכוון כנגד IDS. לאחר שטיפות בבופר מתאים, מונחות פיסות הנייר המכיל דם מיובש על גבי בארות הפלטה, לתקופת הדגרה, ולאחר שטיפות נוספות מוסף לבארות נוגדן פןליקלונלי שני המכוון כנגד האנזים IDS אליו קשור היסוד europium מממשפחת הלנטנידים המשמש בגלל ה-phosphorescence שלו שניתן לכימות על ידי DELFIA 1234 fluorometer.

התרשימים למטה מדגימים את תוצאות 2 הגישות של מדידת IDS במחקר של Dean וחב'.

[[קובץ:Iduronate1.gif|מרכז|550 פיקסלים]]

רמת האנזים IDS המבוססת על ריכוזו כחלבון (A) או על פעילותו (B) בטיפות דם של חולים עם MPS II ובאנשים בריאים. (לקוח מ-Dean וחב' ב-Clinical Chemistry משנת 2006). 2202006 2006).

[[קובץ:Iduronate2.gif|מרכז|550 פיקסלים]]

רמת האנזים IDS המבוססת על ריכוזו כחלבון (A) או על פעילותו (B) בדגימות פלזמה בחולים עם MPS II ובאנשים בריאים. (לקוח מ-Dean וחב' ב-Clinical Chemistry משנת 2006).

== הוראות לביצוע הבדיקה ==

הבדיקה יכולה להתבצע בגרסה של טיפת דם מלא המיובש על גבי נייר Guthrie, או על דם מלא הנלקח במבחנה. בשיטת טיפת הדם המיובשת ניתן להשתמש גם בנייר סופג מסוג Whatman Protein Saver 903 Paper, אך ניתן גם להשתמש ב- Ahlstrom 226 filter paperאו ב-Munktell Blood Spot Collection Card (T493). יש לשלוח לפחות 2 טיפות דם מיובשות. חלופת נטילת דם לתינוק מתחת לגיל 1 שנה, היא על ידי שימוש בדוקרן לקבלת מספר טיפות דם מהאצבע.

לאחר האפליקציה של הדם המלא על נייר הבדיקה בטמפרטורת החדר, יש להשאיר את טופס הנייר למשך 3 שעות בעמדה מאוזנת. אין לחשוף את נייר הבדיקה עם הדם המיובש לחום או לקרני שמש ישירות. יש לשמור את טופס נייר הבדיקה במקום יבש בטמפרטורת החדר רצוי במעטפה אטומה עד המשלוח למעבדה. רצוי שהאפליקציה של הדם על נייר הבדיקה תיעשה באופן מלא ורציף, ואין להוסיף טיפת דם נוספת על גבי טיפה שהוספה קודם לכן כדי למנוע מספר שכבות דם שבאות לביטוי בצורת "טבעות" דם נראות לעין. דגימות דם מלא בצורת טיפות מיובשות יציבות בתנאי חושך וטמפרטורת החדר עד 3 חודשים.

אפשרות נוספת היא ביצוע הבדיקה בדם מלא. יש להעדיף נטילת דם במבחנת ספירת-דם (EDTA, פקק סגלגל), אך ניתן גם להשתמש במבחנה כימית (פקק אדום או צהוב). אין לפסול דגימות המוליטיות, ליפמיות ואיקטריות. הדם צריך להישלח למעבדה בקירור (יציב בטמפרטורה זו משך 7 ימים).
הבדיקה מתבצעת בשיטה אנזימטית פלואורומטרית; שיטה אחרת היא זו של Tandem Mass Spectrometry על פי Wang וחב' ב-Clinical Chemistry משנת 2007.

==ראו גם==
* [[מדריך בדיקות מעבדה|חזרה לדף מדריך בדיקות מעבדה]]
* [[אבחון תסמנות גנטיות|בדיקות מעבדה - אבחון תסמנות גנטיות]]

{{ייחוס|[[משתמש:בן עמי סלע|פרופ' בן עמי סלע]]}}

[[קטגוריה:בדיקות מעבדה - אבחון תסמנות גנטיות]]
[[קטגוריה:בדיקות מעבדה: גנטיקה]]
[[קטגוריה:בדיקות מעבדה: כימיה בדם]]

Iduronate-2-sulfatase

2015-12-07T05:36:26Z

בן עמי סלע:

{{בדיקת מעבדה
|שם עברי=Iduronate-2-sulfatase
|שם לועזי={{רווח קשיח}}
|קיצור=Alpha-L-Idopyranosyluronic Acid 2-Sulfate Sulfahydrolase; I2S; IDS
|תמונה=
|כיתוב תמונה=
|מעבדה=גנטיקה/[[כימיה בדם]]
|תחום=אבחון [[תסמונת Hunter]]
|יחידות מדידה=
|טווח ערכים תקין=מעל 1.5 nmol/h/ml
|יוצר הערך=[[משתמש:בן עמי סלע|פרופ' בן עמי סלע]]
|אחראי הערך=
}}
==מטרת הבדיקה ==
אבחון של מחלתHunte r או mucopolysaccharidosis II תוך שימוש בדגימות דם מיובשות על נייר סופג, או בדגימות פלזמה.

== תסמונת Hunter ==

תסמונת Hunter או mucopolysaccaridosis II וגם PMP II, היא מחלת אגירה ליזוזמאלית הנובעת ממוטציה בכרומוזום X, הגורמת לחסר האנזים iduronate-2-sulfatase או IDS. המוקופוליסכרידוזות הן משפחת מפגעים הנגרמים מחסר של כל אחד מהאנזימים הקשורים בביקוע הרב-שלבי של גליקוזאמינוגליקנים (GAGs) כמו dermatan sulfate, ,heparan sulfate keratan sulfate ו-chondroitin sulfate. הצטברות של GAGs (שבעבר כונו מוקופוליסכרידים) בליזוזומים פוגעת בתפקוד של תאים, רקמות ואיברים. MPS II נגרם על ידי חסר מלא או על ידי רמה מופחתת של האנזים IDS, מה שגורם למפגע של תסמונת Hunter.

המאפיינים הקליניים וחומרת התסמינים מראים שוֹנוּת ניכרת בטווח שבין מחלה חמורה ביותר, לבין צורה מתונה יותר של התסמונת, שמופיעה בדרך כלל בשלב מאוחר יותר בחיים, עם ביטוי קליני מתון יותר. כללית, התסמינים יכולים לכלול תווי פנים גסים, קומה נמוכה, טחול וכבד מוגדלים, קול צרוד, מפרקים מוקשחים, מחלת לב, ומעורבות נוירולוגית בולטת הקשורה לפיגור התפתחותי ואף נסיגה. כיוון שתסמונת Hunter קשורה לפגם בכרומוזום X, היא מופיעה כמעט באופן בלעדי בזכרים השכיחות מוערכת של מקרה אחד ל-120,000 לידות זכר, אם כי היו דיווחים גם על נשים נשאיות תסמוניות. החלופות הטיפוליות כוללות השתלת תאי גזע המאטו-פויאטיים או תרפיה המבוססת על עירוי אנזים ריקומביננטי.

==התפקוד התקין של הגן IDS==
גן זה מקודד לאנזים iduronate-2-sulfatase האחראי לפירוק מולקולות סוכריות פולימריות כגון GAGs. באופן ספציפי אנזים זה מבקע שייר סולפאט מהמולקולה הידועה כ-sulfated α-L-iduronic acid, המהווה מרכיב ב-2 מולקולות ה-GAG, הידועות כ-heparan sulfate ו-dermatan sulfate. מיקומו המדויק של הגן IDS הוא על הזרוע הארוכה של כרומוזום X בעמדה 28, בין bp 149,478,764 ל-bp 149,505,354.
== אבחון המחלה ==
האנזים IDS פועל כ-exosulfatase בליזוזומים ומבצע הידרוליזה של הקשר האסטרי C2-sulfate, בקצה הלא-מחזר של שיירי iduronic acid בהפרן סופאט ובדרמטן סולפאט IDS הוא אחד מתוך משפחה של לפחות 9 סולפטאזות שמבקעות סולפאט-אסטרים בתאי אדם. חסר האנזים מביא להצטברות שני ה-GAGs האמורים, ולהפרשתם המשמעותית בשתן. מחלת Hunter הנגרמת כתוצאה מכך יכולה להופיע במגוון של חומרת התסמינים, זאת בגלל המגוון הגדול של מוטציות בגן IDS.

עד לפרסום של Stenson וחב' ב-Hum Mut משנת 2003 היה ידוע כבר על לפחות 309 מוטציות שונות בגן זה, מה שמסביר מגוון כה גדול בפנוטיפ הקליני של תסמונת Hunter. יחד עם זאת, מחקרים על הגנוטיפ/פנוטיפ לא סיפקו את המתאם הנדרש לנבא במדויק את חומרת התסמונת והתקדמותה בכל הלוקים בה (Froissart וחב' ב-Acta Paediatr Supple משנת 2002). בדרך כלל הצורה החמורה של התסמונת מתגלה בגיל 2-4 שנים, ויכולה להתבטא בפיגור התפתחותי מוטורי ונוירולוגי קשים, התנהגות חריגה ביותר, ומוות לפני הגעה לגיל בגרות. לעומת זאת, בלוקים בגרסת התסמונת המתונה, נשמרת רמת משכל תקינה, ואלה שורדים עם תוחלת חיים כמעט זהה לזו של אנשים בריאים (Young וחב' ב-J Med Genet משנת 1982). בשנת 1990 פרסמו Wilson וחב' ב-Proc Natl Acad Sci USA, על הבידוד והריצוף של cDNA שגודלו 2.3kb, וזיהוי 550 חומצות האמינו המופיעות באנזים IDS. אנליזה של רצץ חומצות האמינו מצאה בקצה ה-N טרמינאלי signal sequence של 25 חומצות אמינו, ולאחריו 8 חומצות אמינו המורחקות מהקודמן (precursor) של preproprotein.

ביקוע פרוטאוליטי מתרחש בכבד על מנת להביא ליצירת אנזיםIDS בּשל, בגודל של 42,000 דלטון. ראוי לציין שהרצף של החומצות אמינו ב-IDS, הוא בעל הומולוגיה ניכרת עם אנזימי sulfatase אחרים באדם, כגון סוגי A, B, ו-C של arylsulfatase, וכן glucosamine-6-sulfatase, מה שמרמז לכך שאנזימי sulfatase מהווים משפחת אנזימים קרובה אבולוציונית, שמקורה בגן קדמון ממנו היא התפלגה בתהליך של gene duplication. מחקרי המשך מצאו שאורכו של הגן IDS הוא כ-kb24, והוא מכיל תשעה exons ושמונה introns (על פי Flommen וחב' ב-Hum Mol Genet משנת 1993).

==מוטציות בגן IDS==

מחקרים מולקולאריים בשיטת Southern blotting, וריצוף של cDNA, הראו ספקטרום רחב של שינויים גנטיים החלים בגן IDS באדם (Hopwood וחב' ב-Hum Mutat משנת 1993, וכן Jonsson וחב' ב-Am J Hum Genet משנת 1995 ו-Rathmann וחב' ב-Am J Hum Genet משנת 1996). המסקנה הייתה שבחולי Hunter עם מוטציות חסר (deletions) כצפוי הופיע פנוטיפ המחלה הקשה, ואילו באלה עם מוטציות עם מוטציות נקודתיות התסמונת קלה יותר. מחקר של Li וחב' ב-J Med Genet משנת 1999, באנליזה הידועה כ-SSCP או single strand conformation polymorphism המלווה על ידי RT-PCR, לצורך גילוי מוטציות ב-cDNA של IDS, בחן 18 חולים בתסמונת Hunter ללא כל קרבה משפחתית.

מחקר זה גילה בנבדקים אלה 17 מוטציות שונות, שכללו 16 מוטציות "קלות" לפי הפירוט הבא: שבע מוטציות סלף (missence) הבאות: S71R, A82E, A85T, R88C, R468W, R468Q ו-E5231V; חמש מוטציות חסר (deletion) לפי הפירוט הבא: ΔR85, 383delAT, 596delAACA, 1148delC ו-1216delCT; שתי מוטציות החדרה (insertion) והן 208insC ו-1063insA; שתי מוטציות שׅחבּוּר (splicing) והן 1006+5g→c ו-1122→T באקסון 8; מוטציה אחת של חסר תוך-גני באקסונים 4, 5, 6 ו-7. מוטציית 596delAACA התגלתה בשני חולים שאינם קרובי משפחה. אנליזה של המוטציות A85T, R88C, R468Q, R468W ו-438C/T, לא מצאה כל פולימורפיזם לארבעת מוטציות הסלף, אך נמצאה 36% הטרוזיגוטיות של המוטציה השקטה 438C/T . תוצאות אלו מספקות עדות נוספת להטרוגניות במוטציות בגן של IDS.

== גישות מעבדתיות לבחון תסמונת Hunter ==

הלוקים בתסמונת זו באופן אופייני מכילים בשתן שלהם כמויות מוגברות של GAGs ורמות מוגברות של dermatan sulfate ושל heparan sulfate. פעילות מופחתת או חסרה של IDS בפיברובלסטים, בלויקוציטים ו/או בנסיוב, יכולה לאשר אבחון של MPS II. יחד עם זאת, בחינה אנזימטית אינה אמינה על מנת לזהות נשאים של הפגם הזה. בחינה גנטית-מולקולארית של הגן IDS מאפשר זיהוי המוטציה הגורמת למחלה בנבדקים הפגועים, וכן זיהוי של נשאי המוטציה בקרב נשים הקרובות מדרגת קרבה ראשונה. עד כה לא נקבע קשר ברור בין הגנוטיפ והפנוטיפ בתסמונת זו.

יש לשים לב שרמת האנזים IDS יכולה להיות מופחתת גם בתסמונת הידועה כ- MSD או multiple sulfatase deficiency. אם אבחון זה הוא בעל סבירות גבוהה יש לשקול מבחן ביוכימי/גנטי של סולפטאזות נוספות, או לבצע מבחן גנטי-מולקולארי של הגן SUMF 1 על מנת לשלול MSD.

== היסטוכימיה ומיקרוסקופיה ==

כמו במוקופוליסכרידוזות אחרות גם בתסמונת Hunter ניתן להשתמש בגישה היסטוכימית ובחינת תאים בהם יש הצטברות של ה-GAG הרלוונטי. באופן אופייני ניתן להבחין בווקואולות רבות בכל שטח התא. צביעת משטחים תאיים אלה עם ריאגנטים בעלי זיקה לשיירים חומציים כגון סולפאט (SO4-) או קרבוקסיל (-COO) המהווים מרכיבים של ה-GAGs השונים, מתקבל צביעה בצבע סגול בולט (מטאכרומזיה). שימוש במיקרוסקופ אלקטרוני מאפשר לראות בבירור את הווקואולות הגדולות שאינן אלא ליזוזומים תפוחים מאוד המכילים חומר אמורפי מגורגר האופייני לאגירת פוליסכרידים שונים (Neufeld ו-Munenzer ב-Metabolic & Basis of Inherited Diseases משנת 2001).

==שיטות אבחון שונות של אגירת MPS II==

כאשר מתעורר חשד לתסמונת Hunter ניתן בשלב הראשון לנסות ולאתר הפרשת MPS II בשתן, זאת על ידי כרומטוגרפיה על רובד דק (TLC) של צלולוז-אצטאט וצביעת הפלטות בהשלמת ההרצה עם הריאגנט Alcian Blue. ההפרדה אינה אידיאלית במובן שקשה להשיג הפרדה טובה בין ה-GAGs האחרים לבין MPS II.

מקובל יותר לבצע אבחון אנזימטי בתמצית של לויקוציטים, לאחר בידודם מהדם המלא. ניתן לבצע בדיקה אנזימטית גם בתרבית תאים, כגון תרבית של פיברובלסטים, תאים שמבודדים מהנוזל האמניוטי לאחר איסוף מי שפיר, או שמבצעים בדיקה אנזימטית זו בחומר של סיסי-שליה (chorionic villi). בדיקה אנזימטית בתאי מי השפיר או בסיסי שליה, מאפשרים לגלות עובר פגוע בבדיקה טרום לידתית, במשפחה עם היסטוריה של ילדים קודמים עם תסמונת Hunter.

==המבדק הפלואורימטרי האנזימטי לקביעת פעילות IDS==

בשנת 2001 תיארו Voznyi וחב' ב- J Inherit Metab Dis, שיטה פלואורומטרית לקביעת פעילות האנזים. הם סנתזו מצע ספציפי, 4-methylumbelliferyl-α-iduronate 2-sulphate, כדי שישמש למדידת פעילות iduronate-2-sulphate sulphatase הליזוזומאלי. המבדק נעשה בפיברובלסטים, לויקוציטים ובפלזמה שמקורם בחולים שונים המאובחנים עם MPS, ובכל הדגימות האלה נמצאו ערכי פעילות אנזים שהיו נמוכים מ-5% מפעילות האנזים בקבוצת ביקורת.

האבחון של עוברים בסכנה של MPS II בשבוע ה-12-14 של ההיריון, נוסה כבר מסוף שנות ה-60 על ידי מדידת ההצטברות של 35S-mucopolysaccharide בנוזל מי שפיר בתרבית, על ידי Fratantoni וחב' ב-N Eng J Med משנת 1969, ו-Kleijer וחב' ב-Clin Genet משנת 1979). לאחר מכן בוצע אבחון זה על ידי אלקטרופורזה דו-ממדית של GAGs בנוזל מי-שפיר על ידי Mossman ו-Patrick ב-Prenat Diagn משנת 1982, ו-Kleijer וחב' ב-Lancet משנת 1984). בשנת 1979 פרסם Hopwood על הכנת מצע חדש למדידת פעילות האנזים IDS מדובר במצע רדיואקטיבי שהוכן מ-dermatan sulfate והוא 4-O-alfa-L-iduronosyl-D-[3H] anhydromannitol 6-sulfate. אך השיטה הרדיואקטיבית היא בעלת מספר שלבים ומסורבלת יחסית לביצוע, וכן אינה ידידותית לסביבה.

בשנת 2002 דיווחו Kuelemans וחב' ב-Prenat Diagn על שימוש במצע שסנתזו חוקרים אלה קודם לכן, ומדובר ב-4-methylumbelliferyl-alpha-iduronate 2-sulphate
המתאים לאנזים IDS, ובעזרתו הם בחנו 174 עוברים שהיו בסכנה ל-MPS II. מתוכם אובחנו 27 עוברים זכרים עם רמה נמוכה ביותר של IDS. בשנת 2006 פרסמו Dean וחב' ב-Clin Chem שיטת מדידה של פעילות IDS הן בשיטת גילוי פעילות האנזים עם מצע ה-4-MU-sulfate וכן על ידי immunoassay. בשיטה האימונולוגית התאפשרה מדידת רמת האנזים בטיפות דם מיובשות ב-2 שלבים, על ידי שימוש בערכה של lanthanide fluorescent immunoassay של DELFIA®. בשיטה זו פלטות microtiter צופו עם נוגדן פוליקלונלי ממקור עז המכוון כנגד IDS. לאחר שטיפות בבופר מתאים, מונחות פיסות הנייר המכיל דם מיובש על גבי בארות הפלטה, לתקופת הדגרה, ולאחר שטיפות נוספות מוסף לבארות נוגדן פןליקלונלי שני המכוון כנגד האנזים IDS אליו קשור היסוד europium מממשפחת הלנטנידים המשמש בגלל ה-phosphorescence שלו שניתן לכימות על ידי DELFIA 1234 fluorometer.

התרשימים למטה מדגימים את תוצאות 2 הגישות של מדידת IDS במחקר של Dean וחב'.

[[קובץ:Iduronate1.gif|מרכז|550 פיקסלים]]

רמת האנזים IDS המבוססת על ריכוזו כחלבון (A) או על פעילותו (B) בטיפות דם של חולים עם MPS II ובאנשים בריאים. (לקוח מ-Dean וחב' ב-Clinical Chemistry משנת 2006). 2202006 2006).

[[קובץ:Iduronate2.gif|מרכז|550 פיקסלים]]

רמת האנזים IDS המבוססת על ריכוזו כחלבון (A) או על פעילותו (B) בדגימות פלזמה בחולים עם MPS II ובאנשים בריאים. (לקוח מ-Dean וחב' ב-Clinical Chemistry משנת 2006).

== הוראות לביצוע הבדיקה ==

הבדיקה יכולה להתבצע בגרסה של טיפת דם מלא המיובש על גבי נייר Guthrie, או על דם מלא הנלקח במבחנה. בשיטת טיפת הדם המיובשת ניתן להשתמש גם בנייר סופג מסוג Whatman Protein Saver 903 Paper, אך ניתן גם להשתמש ב- Ahlstrom 226 filter paperאו ב-Munktell Blood Spot Collection Card (T493). יש לשלוח לפחות 2 טיפות דם מיובשות. חלופת נטילת דם לתינוק מתחת לגיל 1 שנה, היא על ידי שימוש בדוקרן לקבלת מספר טיפות דם מהאצבע.

לאחר האפליקציה של הדם המלא על נייר הבדיקה בטמפרטורת החדר, יש להשאיר את טופס הנייר למשך 3 שעות בעמדה מאוזנת. אין לחשוף את נייר הבדיקה עם הדם המיובש לחום או לקרני שמש ישירות. יש לשמור את טופס נייר הבדיקה במקום יבש בטמפרטורת החדר רצוי במעטפה אטומה עד המשלוח למעבדה. רצוי שהאפליקציה של הדם על נייר הבדיקה תיעשה באופן מלא ורציף, ואין להוסיף טיפת דם נוספת על גבי טיפה שהוספה קודם לכן כדי למנוע מספר שכבות דם שבאות לביטוי בצורת "טבעות" דם נראות לעין. דגימות דם מלא בצורת טיפות מיובשות יציבות בתנאי חושך וטמפרטורת החדר עד 3 חודשים.

אפשרות נוספת היא ביצוע הבדיקה בדם מלא. יש להעדיף נטילת דם במבחנת ספירת-דם (EDTA, פקק סגלגל), אך ניתן גם להשתמש במבחנה כימית (פקק אדום או צהוב). אין לפסול דגימות המוליטיות, ליפמיות ואיקטריות. הדם צריך להישלח למעבדה בקירור (יציב בטמפרטורה זו משך 7 ימים).
הבדיקה מתבצעת בשיטה אנזימטית פלואורומטרית; שיטה אחרת היא זו של Tandem Mass Spectrometry על פי Wang וחב' ב-Clinical Chemistry משנת 2007.

==ראו גם==
* [[מדריך בדיקות מעבדה|חזרה לדף מדריך בדיקות מעבדה]]
* [[אבחון תסמנות גנטיות|בדיקות מעבדה - אבחון תסמנות גנטיות]]

{{ייחוס|[[משתמש:בן עמי סלע|פרופ' בן עמי סלע]]}}

[[קטגוריה:בדיקות מעבדה - אבחון תסמנות גנטיות]]
[[קטגוריה:בדיקות מעבדה: גנטיקה]]
[[קטגוריה:בדיקות מעבדה: כימיה בדם]]

מבדק רמת האנזים Thiopurine methyltransferase

2015-12-01T05:27:16Z

בן עמי סלע:

{{בדיקת מעבדה
|שם עברי=מבדק רמת האנזים Thiopurine methyltransferase
|שם לועזי={{רווח קשיח}}
|קיצור=thiopurine S-methyltransferase, TPMT, TPMT Genotype, TPMT phenotype, TPMT rbc, myelotoxicity.
|תמונה=
|כיתוב תמונה=
|מעבדה=כימיה/טוקסיקולוגיה [[כימיה בדם|בדם]] או [[כימיה ברוק|ברוק]]
|תחום=
|יחידות מדידה=
|טווח ערכים תקין=רמה נורמאלית: מעל 15.0 יחידות/מ"ל כדוריות אדומות; רמה נורמאלית-נמוכה: 10.1-14.9 יחידות/מ"ל RBC; רמה בנשאים הטרוזיגוטיים של החסר באנזים: 6.0-11.0 יחידות/מ"ל RBC; רמה בנשאים הומוזיגוטיים עם חסר באנזים: 0.0-5.9 יחידות/מ"ל RBC.
|יוצר הערך=[[משתמש:בן עמי סלע|פרופ' בן-עמי סלע]]
|אחראי הערך=
}}
==מטרת הבדיקה==

בהתבסס על סקירת הספרות בתחום הטיפולים האונקולוגיים, בדיקת הגנוטיפ והפנוטיפ של האנזים thiopurine methyltransferase לגילוי מוטציות המשנות את רמת האנזים או פעילותו, נחשבת למבדק הכרחי קלינית, לפני התחלת הטיפול ב-azathiopurine {{כ}}(AZA) או ב-6-mercaptopurine {{כ}}(6-MP), באם המינון המקובל של תכשירים אלה אינו משיג התגובה התרפויטית הצפויה.

התיופורינים הם prodrugs המותמרים בתוך התאים ליצירת הנוקלאוטידים הציטו-טוקסיים מסוג 6-thioguanine, לקבלת ההשפעה התרפויטית (Mcleod ו-Siva ב-Pharmacogenetics משנת 2002, ו-Higgs וחב' באותו כתב עת משנת 2010). לאחר נטילה פומית, AZA נספג במהירות במעי ועובר התמרה ל-6-MP בתהליך לא-אנזימטי. כמתואר בתרשים למטה, שלושה מסלולים מתחרים על המטבוליזם של 6-MP, והם: TPMT, קסנטין אוקסידאז (XO), ו- hypoxanthine guanine phosphoribosyltransferase {{כ}}(HGPRT). רוב המטבוליזם של 6-MP מתרחש בכבד (Zimm וחב' ב-N Eng J Med משנת 1983).

[[קובץ:Azathioprine.png|ממוזער|מרכז|500 פיקסלים|מטבוליזם של התכשיר התיופוריני azathioprine.]]

Azathioprine (שם מותג Imuran), המהווה prodrug של 6-mercaptopurine (שם מותג Purinethol), נחשב כתכשיר יעיל לדיכוי תגובת מערכת החיסון בטיפולים של מפגעי מעי דלקתיים, בפרט בחולים עם מחלה שאינה מגיבה לסטרואידים. לדוגמה, כ-50% מהמטופלים עם [[מחלת קרוהן]] זקוקים לסטרואידים במהלך הטיפול, ומתוכם כ-50% יפגינו עמידות לסטרואידים או לתלות בסטרואידים, ובהתאם יהיו מועמדים לטיפול immunosuppressive. טיפול ב-azathioprine מבטל את הצורך בקורטיקוסטרואידים בערך ב-75% מהמטופלים. בנוסף, azathioprine נחשב טיפול יעיל במפגעים של יצירת נׇצוּר (fistula).

אלא שהשימוש ב-azathioprine מוגבל הן בשל משך פעילותו הארוך (3-4 חודשים) והן בשל השפעתו הטוקסית לכבד, דיכוי מח העצם, פנקראטיטיס, כמו גם תגובות אלרגיות. יש הכורכים טיפול ממושך ב-azathioprione בממאירות. כתוצאה מתופעות לוואי אלו, פחות מ-5% מחולי קרוהן טופלו אי-פעם ב-azathioprine.

בדיקת פעילותו של TPMT לגילוי רמה נמוכה של האנזים נועדה למנוע טוקסיות חמורה לתאים הֶמׇאטופּויאטים במח העצם, העלולה לגרום ל-myelosuppression, כתוצאה מטיפול ב-azathioprine או ב-MP-6. מינון מופחת של תרופות אלה עשוי להפחית את הטוקסיות שלהן (Relling וחב' ב-Clin Pharmacol Ther משנת 2011).

== בסיס פיזיולוגי ==

Azathioprine הוא אנלוג של purine המפריע לסינתזה של DNA ומעכב בעיקר את השגשוג של תאים המתחלקים במהירות, בעיקר אלה של מערכת החיסון. לפיכך, משמש תכשיר זה כמדכא של תאי חיסון בעיקר באלה העוברים ניתוח השתלת איברים, בעוד שהמטבוליט של azathioprine, הידוע כ-6-mercaptopurine, משמש לטיפול במחלות אוטו-אימוניות כמו גם ב-ALL או acute lymphoblastic leukemia, במחלות ראומטיות וכן במחלות מעי דלקתיות. במהלך המטבוליזם, האנזים hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase או HGPRT, מסב את 6-mercaptopurine לאנלוג הציטוטקסי, הנוקלאוטיד 6-thioguanine, בעוד שהאנזים thiopurine methyltransferase או TPMT גורם לאינאקטיבציה של 6-mercaptopurine על ידי המתילציה שלו ליצירת 6-methylmercaptopurine.

בערך 11% מהאוכלוסייה הם בעלי פעילות מופחתת של TPMT, וכ-0.3% באוכלוסייה הם בעלי חסר מוחלט באנזים (Weinshilboum ו-Sladek ב- Am J Hum Genetמשנת 1980). במטופלים אלה, מצטבר 6-mercaptopurine פעיל, וחלק גדול ממנו מותמר לאנלוג הציטוטוקסי, הנוקלאוטיד 6-thioguanine, העלול לגרום לטוקסיות במח העצם ודיכוי תאים מיאלואידים (Maddocks וחב' ב-Lancet משנת 1986, ו-DiPiero וחב' ב-Cleve Clin J Med משנת 2015).

את הפעילות של TPMT בדם יכולה להימדד על ידי מגוון שיטות כגון HPLC, LC-MS/MS ושיטות איזוטופיות. יש להקפיד שהבדיקה צריכה למדוד את פעילות האנזים ולא את ריכוזו, שכן הפולימורפיזם הגנטי השכיח משפיע על פעילותו האנזימטית ולא בהכרח על רמת האנזים.

==האנזים TPMT==

TPMT הוא אנזים באדם המקודד על ידי הגן TPMT, והפסבדו-גן ממוקם באתר 18q21.1 (על פי Lee וחב' ב-Drug Metab Dispos משנת 1995). משקלו המולקולארי של TPMT הוא 32,000 דלטון. האנזים thiopurine methyltransferase גורם למתילציה של תרכובות thiopurine, כאשר ה-donor של שייר ה-methyl הוא S-adenosyl-L-methionine העובר התמרה ליצירת-S-adenosyl-L-homocysteine (על פי Weinshilboum ו-Sladek ב-Am J Hum Genet משנת 1980). תרופות ממשפחת ה-thiopurine כגון 6-mercaptopurine, וכן azathioprine ו-6-thioguanine משמשות הן בכימותרפיה בעיקר בטיפול ב[[לאוקמיה]] לימפובלסטית חריפה (ALL) (על פי Marsh ב-Mol Diagn Ther משנת 2007), אך גם לדיכוי מערכת החיסון (immunosuppression) בטיפולים ב- IBS או במושתלי איברים. פולימורפיזם גנטי המשפיע על פעילות אנזים זה, כרוך בשינויים של רגישות ושל טוקסיות לתכשירי thiopurine בין מטופלים שונים.

==פרמקולוגיה==

TPMT מקטלז כאמור את ה-S-methylation של תיופורינים, אך מוטציות בגן של האנזים מפחיתות את יעילות המתילציה באופן המקטין את האינקטיבציה של 6MP, וכך גדלה טוקסיות התרופה במח העצם, מה שעלול לגרום לדיכוי תאים מיאלואידיים, לאנמיה, לנטייה לדימומים, ללאוקופניה, ולהדבקות בפתוגנים שונים (Fujita ו-Sasaki ב- Curr Drug Metab משנת 2007, וכן Oncea ו-Duley - Pharmacol Basis Therapeutics משנת 2008, ו-Evans ב- Ther Drug Monit משנת 2004).

מחקר של Sanderson ב-Gastroenterology משנת 2015 מצא שלמעלה מ-20% מהמטופלים עם IBD הפסיקו את הטיפול ב-thiopurine בגלל תופעות לוואי שהחמורה ביניהם [[לויקופניה]].

==שימוש דיאגנוסטי==

מדידת פעילות TPMT מומלצת לפני התחלת הטיפול בתכשירי thiopurine. מטופלים עם פעילות נמוכה של האנזים (עד 10% מפעילותו הנורמאלית), ובמיוחד אלה עם חסר מוחלט של פעילות זו (עד 0.3% מפעילותו הנורמאלית), הנמצאים בסיכון מוגבר לטוקסיות למח העצם המושרית על ידי התרופה המצטברת שלא עברה מתילציה כחלק מהמטבוליזם שלה. Reuther וחב' מצאו שבערך 5% מכל הטיפולים ב-thiopurine נכשלים כתוצאה מטוקסיות זו (Eur J Clin Pharmacol משנת 2004). המטופלים המגלים אי-סבילות ל-TPMT יכולים להיות מזוהים על ידי מדידה שגרתית של פעילות אנזים זה בכדוריות הדם האדומות. קיימת שונות ניכרת בהשפעת המוטציה בגן TPMT, עם הבדלים אתניים בסוגי המוטציה האחראיים לתגובות השונות של המטופלים לתכשירים דוגמת 6MP. ואריאנטים גנטיים של TPMT נכרכו גם עם טוקסיות המושרית על ידי ציספלטין בילדים עד כדי איבוד שמיעה (Ross וחב' ב-Nat Genet משנת 2009). האנזים TPMT נמצא כיום ברשימת ה-FDA של סמנים פרמאקו-גנומיים העלולים לגרום לתופעות לוואי לא רצויות בטיפול ב[[ציספלטין]].

הפעילות התרפויטית של הנוקלאוטידים מסוג 6-thioguanine נובעת מהאינקורפורציה שלהם לתוך ה-DNA והשראת אפופטוזיס של תאי T על ידי מודולציה של האיתות של Rac 1 החיוני לפעילויות תאיות רבות (Somerville וחב' ב-J Biol Chem משנת 2003). בנוסף, S-methyl-thiosine 5'-monophosphate או (MeTIMP), שנוצר על ידי מתילציה על ידי TPMT של -TIMP6 או 6-thiosine monophosphate שהוא תוצר ביניים במטבוליזם של 6-MP, יכולים גם כן לגרום לציטוטוקסיות של thiopurine על ידי עיכוב de novo של סינתזת purine (על פי Cara וחב' ב-Med Sci Monit משנת 2004).

==הפנוטיפ של TPMT==

תופעות הלוואי של תכשירי thiopurine יוחסו להצטברות של רמות גבוהות של נוקלאוטידים של thioguanine (להלן TGNs) על פי Anstey וחב' ב-J R Soc Med משנת 1992, ו-Lennard וחב' ב-Lancet משנת 1990, והגורם הקובע ביותר של TGNs היא רמת TPMT. בשנת 1980 הראו Weinshilboum ו-Sladek ב-Am J Hum Genet, שפיזור הפעילות של TPMT בכדוריות אדומות הוא תלת-מודאלי, כאשר בערך 1 מכל 300 אנשים חסר באופן מוחלט את פעילות האנזים, ב-11% מהאנשים יש פעילות נמוכה של האנזים (intermediate), ואילו ב-89% מהאנשים פעילות האנזים תקינה, וזאת למרות שהוצע שדרגת החסר של TMPT באוכלוסייה גבוהה יותר (Ford וחב' ב-Ann Clin Biochem משנת 2004, ו-Holme וחב' ב-Q J Med משנת 2002).

מאז שהחלו בבדיקות סריקה של TPMT, הצטברו ראיות לכך שיש באוכלוסייה קבוצה רביעית המהווה בערך 2%, בה ניתן למצוא פעילות אולטרה-גבוהה של אנזים זה (Sanderson וחב' ב-Ann Clin Biochem משנת 2004, ו-Hindorf וחב' ב-Ther Drug Monit משנת 2004). בחולים עם לאוקמיה לימפובלסטית תופעה זו של רמות גבוהות באופן חריג של TPMT, יכולה לנבוע מעודף כרומוזומים בתאי הסרטן, הגורם לעותקים מרובים של אללים של האנזים, והגברה ניכרת של ביטויו (Cheng וחב' ב-Nat Genet משנת 2005).

==הגנוטיפ של TPMT==

השכיחות התלת-מודאלית של פעילות TPMT, היא תוצאה של פולימורפיזם גנטי. הגן של TMPT ממוקם על הזרוע הקצרה כרומוזום 6 באתר 6p22 ואורכו 34kb. הגן מורכב מ-9 introns ומ-10 exons, כאשר 8 מה-exons מקודדים עבור TPMT שהוא חלבון בעל 245 חומצות אמינו (Szumlanski וחב' ב-DNA Cell Biol משנת 1996). האלל לפעילות התקינה של האנזים (wildtype) מסומן כ-TPMT*1. עד כה תוארו 29 ואריאנטים שונים של אללים של TPMT, כאשר 16 מתוך אללים אלה כרוכים בדרגות חסר של פעילות האנזים והם כדלקמן: 25*, 21*, 16*, 15*, 14*, 13*, 12*, 11*, 6*, 5*, 4*, ,*3C ,*3D, *3A ,*3B ו-TPMT*2, ועוד 12 אללים החשודים כגורמים להפחתת רמת TPMT, והם כדלקמן: ,*17-20, *20, 22-24*, ו-TPMT*7-10 (על פי Krynetski וחב' ב-Proc Natl Acad Sci USA משנת 1995, Otterness וחב' ב-Clin Pharmacol Ther משנת 1997, Lindquist וחב' ב-Pharmacogenetics משנת 2004, Schaeffeler וחב' ב-Hum Mut משנת 2006 ו-Lindquist וחב' ב-Pharmacogenet Genomics משנת 2007).

רוב האללים הללו האחראיים לפעילות חסרה של TPMT הם נדירים, ובמקרים אחדים זוהו רק באנשים בודדים. בלבנים (caucasians), באסייתים ובאפרו-אמריקנים, 4 פולימורפיזמים אחראיים ל-80-95% מכלל המקרים של פעילות TPMT נמוכה, והם כדלקמן: TPMT*3A המאופיין על ידי מוטנט אללי כפול G460A על אקסון 7 ו-A719G על אקסון 10, (על פי Yates וחב' ב-Ann Intern Med משנת 1997, ו-Hon וחב' ב-Hum Mol Genet משנת 1999),TPMT*3B עם מוטציה G460A ו-TPMT*3C עם המוטציה A719G, ו-TPMT*2A עם מוטציה G238C על אקסון 5 (על פי Evans ב-Ther Drug Monit משנת 2004, ו-Yates וחב' ב-Ann Intern Med משנת 1997).

==השימוש בבדיקות סריקה של TPMT==

מטופלים עם חסר בפעילות TPMT נמצאים בסיכון מוגבר לפתח דיכוי של השורה המייאלואידית בהיותם מטופלים במינונים מקובלים של תכשירי thiopurine, ונרשמו אף מקרי מוות במצב זה (Clunie ו-Lennard ב-Rheumatology משנת 2004). במטופלים עם חסר האנזים, בדרך כלל מופיעה לאוּקוֹפּניה ימים אחדים לאחר הטיפול הראשון, אך תרחיש זה יכול להופיע גם לאחר פרק זמן ארוך יותר של חודש עד חודשיים (Anstey וחב' ב-Br J Dermatol, ו-Lennard ו-Lilleyman ב-Ther Drog Monit משנת 1996). על פי הנתונים של ה-MHRA הבריטי, אירעו בבריטניה בין השנים 1963 עד 2009 במטופלים ב-azathioprine עם חסר באנזים 138 מקרי מוות, 7 מקרי מוות במטופלים ב-6-mercaptopurine, ו-3 מקרי מוות במטופלים עם 6-thioguanine.

מטופלים עם פעילות TPMT נמוכה שהם הטרוזיגוטיים לאללים מוטנטים של אנזים זה, הם בסיכון של 30-40% לפתח תופעות לא-רצויות בהיותם מטופלים במינון סטנדרטי של thiopurine, שכן באופן מעשי מטופלים אלה קיבלו מינון יתר של התרופה (Ansari וחב' ב-Aliment Pharmacol Ther משנת 2002, ו-Rolling וחב' ב- J Natl Cancer Inst משנת 1999, וכןCoenen וחב' ב-Gastroenterology משנת 2015). לעומתם, מטופלים עם רמות גבוהות מאוד של פעילות TPMT, עלולים לא להגיב למינונים המקובלים של thiopurines, והם אף בסכנה של נזק טוקסי לכבד כתוצאה מייצור מוגבר של מטבוליטים שהם תיופורינים שעברו מתילציה כגון מתיל-מרקפטופורין (MMP-6) על פי Lennard ו-Maddocks ב-J Pharm Pharmacol משנת 1983. בדיקת TPMT עשויה גם להפחית ריאקציות לא רצויות במטופלים עם פעילות TPMT נמוכה, ולשפר את יעילות התרופה במטופלים עם פעילות אולטרה-גבוהה של האנזים על ידי הפעלת מינון גבוה יותר של תכשיר.

==המלצות עדכניות בבריטניה לגבי בדיקות סריקה של TPMT==

השוואת ההנחיות לגבי טיפול ב-AZA בבריטניה מראה שוני בהמלצות לגבי מינון וניטור במפגעים השונים. לדוגמה, רק ההנחיות בתחום הדרמטולוגי ממליצות על מבדק מוקדם של TPMT והתאמת המינון על פי הסטאטוס של TPMT. בהנחיות להתנהלות במקרים של מחלות דלקתיות של המעי במבוגרים, לא מומלץ לבצע מבדק מוקדם של TPMT, זאת "כיוון שדורות של ניסיון מצאו ש-AZA בטיחותי בטיפולים במחלת קרוהן ובקוליטיס כיבית" (Carter וחב' ב-Gut משנת 2004). רשות הפורמולציות הבריטית (BNF), לא נותנת המלצות ספציפיות לגבי מבדק מוקדם של TPMT, אך היא מדגישה: " הסכנה ל-myelosuppression גדלה במטופלים עם פעילות TPMT נמוכה, במיוחד באותם מטופלים מאוד בודדים שהם הומוזיגוטים לפעילות אנזים נמוכה" ובמקרים אלה ממליצה הרשות הבריטית על התוויות-נגד במקרים של רגישות-יתר לטיפולים ב-AZA או ב-6-MP (על פי Anon ב-BNM 58, London משנת 2009).

סקר לאומי בבריטניה של Fargher וחב' משנת 2007 ב-J Clin Pharm Ther, הראה ש-67% מהקלינאים הבריטים כן בדקו פעילות TPMT לפני התחלת טיפולים ב-AZA, כאשר בין הדרמטולוגים ההיענות הייתה הגבוהה ביותר (94%) ואילו בין הגסטרו-אנטרולוגים ההיענות הייתה של 60% ובקרב הראומטולוגים רק 47%. סקר זה מרמז על כך שרק בערך מחצית הרופאים הבריטיים מבצעים בדיקת TPMT לפני התחלת טיפולים. לאחרונה הופיעה בבריטניה הנחייה ב-Drugs & Therapeutics Bulletin משנת 2009, המבוססת על ניסוי TARGET שנערך במנצ'סטר והתפרסם באוקטובר 2009, על פיה כל המטופלים ב-azathioprine צריכים להיבדק לרמת TPMT כצעד של זהירות מתבקשת.

==שיטות למדידת סריקה של TPMT ==

קיימות 2 אסטרטגיות לקבוע את הסטאטוס של TPMT, קביעת הפנוטיפ או קביעת הגנוטיפ. שתי הגישות לוקות גם בחסרונות והן מורכבות לביצוע מבחינה טכנית. ישנן מספר ערכות מסחריות זמינות, אם כי יש המשתמשים עדיין בשיטות ביתיות.

==קביעת פנוטיפ של TPMT==

פעילות TPMT באריתרוציטים נמצאה תואמת את זו שברקמות אחרות, כולל הכבד (Szumlanski וחב' ב-Pharmacogenetics משנת 1992, ו-Woodson וחב' ב-J Pharmacol Exp Ther משנת 1982). לכן למטרת phenotyping ניתן למדוד בפשטות פעילות TPMT על ידי אינקובציה של דם מלא או של תמצית (lysate) אריתרוציטים עם MP-6 או עם -TG6 עם תורם שייר מתילי דוגמת SAM או S-adenosyl-L-methionine ליצירת התוצרים מכילי שייר מתיל כגון -MMP6 או MTG-6 שהוא 6-methylguanine (על פי Weinshilbourn וחב' ב-Clin Chim Acta משנת 1978). תוצרים ממותלים אלה יכולים להתגלות במספר דרכים, כולל מדידה רדיוכימית, מס-ספקטרומטריה או על ידי HPLC על ידי גלאי בליעה (Anglicheau וחב' ב- J Chromatogr B Biomed Sci Appl משנת 2002), או על ידי גלאי פלואורסצנטי (Kroplin וחב' ב-Eur J Clin Pharmacol משנת 1998, ו-Ford וחב' ב-Ann Clin Biochem משנת 2006). כיום קיימת גם ערכה למדידת פעילות TPMT בשיטת ELISA.

יחידות המדידה של TPMT משתנות, מה שהביא לתחומי נורמה שונים בין המעבדות המבצעות בדיקה זו, אם כי באופן קלאסי פעילות האנזים מתייחסת למספר הכדוריות האדומות במבחנת הבדיקה או לרמת ההמוגלובין ב-lysate. פעילות TPMT יכולה לנבא בנבדקים תופעה של myelosuppression, אם כי נתוני רקע קדם-אנליטיים כגון משך השהות של הדגימה לפני ביצוע הבדיקה, יכולים להשפיע על פעילות האנזים, אם כי במקרה זה מדובר באנזים יציב יחסית המסוגל לשהות 7 ימים בטמפרטורת החדר ללא איבוד פעילות (Jeffray וחב' ב-Proc ACB Nat Meeting משנת 2004).

מדידת הפעילות של TPMT עלולה להיות קשה לשליטה, עם גורמים רבים המשפיעים על ריאקציית האנזים, כגון הריכוז והמקור של תורם המתיל SAM (על פי Ford וחב' ב-Ann Clin Biochem משנת 2009), טמפרטורת ומשך ההדגרה. גורמים משפיעים אלה עלולים לגרום לדיווח-יתר של תוצאות נמוכות כזובות. לא ברור עדיין אם גורמים-לא גנטיים כמן עיכוב על ידי תרופות או המצב הפיזיולוגי של הגוף בזמן ביצוע הבדיקה משפיעים באופן כללי על פעילות TPMT, או שהשפעה זו ספציפית לאיברים שונים (Ferroni וחב' ב-Eur J Clin Pharmacol משנת 1996). הכנה אופיינית של כדוריות אדומות למדידת TPMT כרוכה בשטיפות אחדות, שעשויות להרחיק תרופות מעכבות, אם כי פרוצדורה זו יכולה להפחית את המתאם בין רמת TPMT בכדוריות לבין זו הנמדדת באותו מטופל בכבד. יש להקפיד על כך שבמקרה של תרומת דם, כל מדידה של פעילות TPMT עלולה לא לשקף את רמת האנזים הזה במקבל תרומת הדם, אלא אם כן חולפים 120 יום מתאריך תרומת הדם (Ford וחב' ב-Clinical Case משנת 2004). יצוין שבכדוריות אדומות "מזדקנות" רמת פעילות האנזים TPMT נמוכה יחסית (Lennard וחב' ב-Br J Clin Pharmacol משנת 2001).

==קביעת גנוטיפ של TPMT==

קיימות דרכים אחדות לגילוי מוטציות בגן ל-TPMT שכוללות restriction digest (על פי Brouwer וחב' ב-Leukemia משנת 2001), שיטת SSCP או single strand conformational polymorphism (על פי Spire-Vayron de la Moureyre וחב' ב-Hum Mut משנת 1998), שיטת ARMS או amplification refractory mutation system (על פי Roberts וחב' ב-Clin Chim Acta משנת 2004), שיטת denaturing HPLC pyrosequencing (על פי Schaeffeler וחב' ב-Pharmacogenetics משנת 2004, ו-Haglund וחב' ב-Clin Chem משנת 2004), ושיטת היברידיזציה פלואורסצנטית (schutz וחב' ב- Clin Chem משנת 2000). חברת Qiagen מספקת ערכת real time artus TPMT LC PCR, לגילוי של *3A ,TPMT*2, *3B ו-*3C לשימוש במכשיר LightCycler.

יש לנקוט זהירות כאשר מתכננים primers עבור PCR לצורך אנליזה של TPMT, כיוון שישנם גם פסבדוגנים בלתי פעילים של TPMT על כרומוזום 18, שהם בעלי הומולוגיה של 96% עם הגן ל-TPMT (על פי Lee וחב' ב-Drug Metab Dispos משנת 1995). כיוון שפסבדו-גן בלתי פעיל זה של TPMT הוא חסר introns, נראה שלפחות primer אחד משלים את הרצף של ה-intron של TPMT, ומתגבר על הפרעה זו של הפסבדוגן.

שלא כמו בגישה הפנוטיפית, הגישה הגנוטיפית אינה מושפעת על ידי עירויי דם, או על ידי גורמים קדם-אנליטיים למרות שבמספר שיטות התוצאות מאוד תלויות בטיב ה-DNA בשימוש, וכן בטכניקת ה-restriction digest שהיא אמנם פשוטה לביצוע אך לא תמיד אמינה. במחקרים המוקדמים יותר, עיכול לא שלם של נקודת החיתוך על ידי Arc 1 בגלל נוכחות של מוטציית TPMT*3C, גרמה בדיווחי-יתר על מציאות של אללים מוטנטיים TPMT*B, שעה שלמעשה היה מדובר בנוכחות של האלל בעל המוטציה הכפולה TPMT*3A שהוא שכיח הרבה יותר (Ameyaw וחב' ב-Hum Mol Genet משנת 1999).

חיסרון עיקרי ברוב שיטות ה-genotyping הוא בכך שאין הן מזהות באיזה אלל מופיעה המוטציה. באופן היפותטי, מטופל עם גנוטיפ הומוזיגוטי לחסר פעילות TPMT, יכול להיות מוחמץ, לדוגמה, מטופל שהוא הטרוזיגוטי TPMT*1/*3A עם פעילות אנזים נמוכה, לא יכול להיות מובדל ממטופל עם סטאטוס של compound TPMT*3C/*3B heterozygous עם חסר בפעילות האנזים. ניתן להתגבר על מגבלה זו על ידי שימוש בשיטות בהן מככב RNA כגון אנליזה הידועה כ-multiplex induced heteroduplex, אך זאת רק כאשר DNA חסר באופן מוחלט, מה שקשה מאוד להשיג (Wood וחב' ב-Hum Mut משנת 2004).

סריקה של הגן השלם של TPMT שמקיפה באופן רוטיני את כל 29 האללים של TPMT, מסובכת מבחינה טכנית וגוזלת זמן רב. זאת בנוסף לשיקול שעדיין צריך להוכיח האם כל האללים הואריאנטים הללו אחראיים לחסר TPMT(על פי Tai וחב' ב-Am J Hum Genet משנת 1996, ו-Hamdan-Khali וחב' ב-Biochem Pharmacol משנת 2004). כיוון ש-TPMT*2, TPMT*3A ו-TPMT*3C מהווים 60-95% מהאללים המוטנטים לפעילות מופחתת של TPMTברוב האוכלוסיות, ה-genotyping שלTPMT מתבצע רק לאתר את המוטציות הללו. מעבדות Quest Diagnostics משתמשות בשיטת אמפליפיקציה של PCR למטרת genotyping של TPMT, ובעקבותיה SNPE או single nucleotide primer extension, לגילוי 4 הואריאנטים העיקריים של האנזים. בשיטת SNPE מכוונים לנוקלאוטידי המטרה 238, 460 ו-719, ולאחר מכן מתבצעת היברידיזציה על ידי קישור של אוליגו-נוקלאוטידים לחלקיקים זעירים (microspheres).

ה-FDA ממליץ לפני מתן טיפול ב-thiopurine לבצע בדיקת פנוטיפ או גנוטיפ של TPMT. לעומת זאת, ה-American College of Gastroenterology מעדיף דווקא את בדיקת הפנוטיפ של TPMT כיוון שמבדק זה נותן הערכה כמותית של פעילות האנזים במטופלים עם thiopurines במקרים של קוליטיס כיבית.

==פתופיזיולוגיה==

AZA, 6-MP ו-6-TG הם שלושה prodrugs בלתי-פעילים, המשמשים לטיפול במצבי מחלה מגוונים, שעוברים מטבוליזם על ידי 3 אנזימים שונים והופכים לשלושה נוקלאוטידים פעילים ביולוגית שונים של 6-thioguanine . התכשיר azathioprine (להלן AZA) עובר מטבוליזם והופך ל-6-MP, ואילו 6-MP מותמר ל-2 מטבוליטים בלתי-פעילים פרמאקולוגית, 6-thiouric acid על ידי האנזים xanthine oxidase, ו-6-methylmercapyourine (להלן 6-MMP) על ידי האנזים thiopurine S-methyltransferase (TPMT).
מטופלים הומוזיגוטיים או compound heterozygous בהם פעילות האנזים TPMT נמוכה מאוד או חסרה לחלוטין, חשופים לפעילות טוקסית של תכשירים ממשפחת thiopurines במינונים קונבנציונאליים. מטופלים הטרוזיגוטים לפעילות האנזים חשופים לסיכון מוגבר לתופעות טוקסיות של תכשירי thiopurine, במינונים קונבנציונאליים. במטופלים ללא וואריאנטים עם מוטציות, תבוא לביטוי פעילות מלאה של האנזים TPMT, עם סיכון מקובל ונורמאלי לתופעות טוקסיות של thiopurine.

==גנטיקה==

הגן TPMT מועבר בהורשה אוטוזומאלית קו-דומיננטית. עד כה זוהו 29 אללים ואריאנטים של TPMT, שרובם נכרכו עם פעילות מופחתת של האנזים in vitro, אך רק אחדים מתוכם ידועים כבעלי השפעה קלינית (Ujiie וחב' ב-משנת Pharmacogenet Genomicsמשנת 2008(. הואריאנט השכיח ביותר באוכלוסייה הלבנה (5% מהלבנים נושאים אותו) הוא TPMT*3A, והוא כולל 2 שינויי קידוד בלתי-זהים: exon 7 A154T variant ו-exon 10 Y240C variant. הואריאנט השני הנפוץ ביותר TPMT*3C, מכיל רק את exon 10 variant, והוא שכיח יותר באוכלוסייה אסייתית (בשכיחות של 2%). הוואריאנט TPMT*3B הוא נדיר ומכיל רק את exon 7 variant (על פי Otterness וחב' ב- Clin Pharmacol Therמשנת 1997). גם הוואריאנט TPMT*2 או בכינויו האחר A80P, נדיר עם פעילות קטליטית מופחתת (Krynetski וחב' ב- Proc Natl Acad Sci USA משנת 1995. ואריאנטים אחרים, כמו TPMT*8 שכיחים יותר באוכלוסיות אפריקניות (בתדירות של 2% בערך) על פי Oliveira וחב' ב-Eur J Clin Pharmacol משנת 2007.

האללים הוואריאנטים עם פעילות מופחתת של האנזים אחראיים לכ-95% ממצבי פעילותו הנמוכה עד מתונה. בוואריאנט TPMT*3A, נוקלאוטיד G בעמדה 460 מותמר ל-A, וכך Ala בעמדה 154 מותמר ל-Thr. כמו כן הנוקלאוטיד A בעמדה 719 מותמר ל-G, וכך Tyr בעמדה 240 מותמר ל-Cys. בוואריאנט TPMT*2, נוקלאוטיד G בעמדה 238 מותמר ל-A, וכך Ala בעמדה 80 מותמר ל-Pro. בוואריאנט TPMT*3B, נוקלאוטיד G בעמדה 460, מותמר ל-A, וכך Ala בעמדה 154 מותמר ל-Thr. בוואריאנט TPMT*3C, נוקלאוטיד A בעמדה 719 מותמר ל-G, וכך Tyr בעמדה 240 מותמר ל-Cys.

מלבד הרקע הגנטי של הנבדק, ישנן סיבות נוספות לסכנה מוגברת של נזק טוקסי למח העצם (myelosuppression) כתוצאה מטיפול עם תכשירים תיו-פוריניים. אינטראקציות בין מספר תרופות עלולות לעכב את פעילות האנזים TPMT. בין התרופות הללו ניתן למנות את: א. תכשירי NSAIDs כגון ibuprofen, ketoprofen, naproxen ו- mefenamic acid; ב. תכשירים משתנים כגון furosemide ו-thiazides ; ג. תכשירים לטיפול בקוליטיס כיבית כגון sulfasalazine, mesalamine ו-olsalazine. ד. מעכבי חומצה בנזואית. לכן אין להשתמש בתרופות אלה לפחות 48 שעות לפני המבדק למדידת TPMT. למרות שבחינת הגנוטיפ של TPMT עשויה לנבא את הסיכון לדיכוי המייאלואידי, יש לבצע במקביל בדיקת CBC כוללת על מנת לאשש ממצא זה במהלך הטיפול בתכשירי thiopurine. למספר קטן של נבדקים יש רמות גבוהות של פעילות TPMT. משערים שבמקרם אלה יעילות הטיפול ב- thiopurine נמוכה יותר, אך לא קיימת עדיין הסכמה כיצד נתון זה צריך להתבטא בהנחיות הטיפול (ראו טבלה).

{| class="wikitable"
|-
! פעילות TPMT גבוהה !! פעילות TPMT תקינה!! פעילות TPMT נמוכה!! {{רווח קשיח}}
|-
| >65 || 25-65 || <25 || יחידות/מיליליטר (U/mL)
|-
| כישלון טיפולי || סיכון נמוך של טוקסיות למח העצם || סיכון גבוה של טוקסיות למח העצם || כרוכה ב:
|-
| עשויה להידרש עלייה במינון מעבר למינון הסטנדרטי || אין || נדרשת הפחתה דרמטית במינון (ב-80 עד 90%) || תיקון מוצע של המינון
|}

בטבלה הבאה יש התייחסות ל-2 מטבוליטים של thiopurin שהתגלו בדם הנבדק ומשמעות ריכוזיהם:

{| class="wikitable"
|-
! המטבוליט בכדוריות אדומות !! טווח תרפויטי !! משמעות התוצאות
|-
| 6-TGN || 230-400 pmol/8 x 108 RBC || ריכוז 6-TGN הנמוך מ-230 pmol/8 x 108 RBC, יכול להצביע על תגובה מופחתת לטיפול.

ריכוז 6-TGN הגבוה מ-400 pmol/8 x 108 RBC, יכול להצביע על סיכון מוגבר ללויקופניה.
|-
| 6-MMPN|| <5700 pmol/8 x 108 RBC || ריכוז 6-MMPN הגבוה מ-5700 pmol/8 x 108 RBC, יכול להצביע על סיכון מוגבר לטוקסיות לכבד.
|}

== אפידמיולוגיה ==

;תדירות האלל על בסיס אתני

{| class="wikitable"
|-
! אתניות !! TPMT *3C!! TPMT *3B !! TPMT *3A !! TPMT *2
|-
| אפריקאנית || 0.0495 || 0 || 0.00198 || 0.000792
|-
| אסייתית || 0.0157|| 0|| 0.000112 || 0
|-
|Caucasian ||0.004205 || 0.000461 || 0.0356 || 0.0019
|-
|ים תיכונית || 0.00545 ||0.00426 ||0.0254 ||0.00408
|-
|מקסיקנית ||0.00888||0.0069||0.0533||0.00592
|-
|מזרח תיכונית||0.00562||0.00562||0.0114||0.00749
|}

;תרופות המדכאות את רמת הפעילות של TPMT:
מתן סימולטני של allopurinol, naproxen, ibuprofen, ketoprofen, furosemide, sulfasalazine, mesalamine, olsalazine, mefenamic acid, מעכבי חומצה בנזואית ודיורטיקה מקבוצת התיאזידים.

;Genotyping של TPMT ברוק:
יש למלא ברוק מבחנה בנפח של 2 מ"ל. השיטה הנהוגה לגילוי מוטציות בגן ל-TPMT כאשר החומר המתקבל הוא רוק, ידועה כ-PCR 5'-Nuclease End-point Allelic discrimination analysis.

== הוראות לביצוע הבדיקה ==

אין כל הכנות מיוחדות של הנבדק לפני לקיחת הדם. לקיחת הדם צריכה להתבצע במבחנת ליתיום הפארין (פקק ירוק) או במבחנת ספירת דם (EDTA פקק סגלגל). אין לסרכז, ויש לאחסן את הדם המלא בקירור לפני שליחתו המיידית למעבדה בתנאי קירור. אין להקפיא את הדם. הדגימה יציבה בתנאי קירור (2-8 מעלות) למשך 6 ימים. דגימת דם המוליטית במיוחד יש לפסול. שיטת הבדיקה: Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS).

==ראו גם==
* [[מדריך בדיקות מעבדה|חזרה לדף מדריך בדיקות מעבדה]]
* [[בדיקות ביוכימיות|בדיקות מעבדה - בדיקות ביוכימיות]]

{{ייחוס|[[משתמש:בן עמי סלע|פרופ' בן עמי סלע]]}}

[[קטגוריה:בדיקות מעבדה - בדיקות ביוכימיות]]
[[קטגוריה:בדיקות מעבדה: כימיה בדם]]

נוגדנים ל-Anti DNAse B antibodies - DNAse B

2015-11-23T05:06:42Z

בן עמי סלע:

{{בדיקת מעבדה
|שם עברי= נוגדנים ל-DNAse B
|שם לועזי= Anti DNAse B antibodies
|קיצור=AND-B; ADB; ADNase-B; Antideoxyribonuclease B titer; Streptococcal Antibodies, DNB.
|תמונה=
|כיתוב תמונה=
|מעבדה=מיקרוביולוגיה בדם
|תחום=ברור הדבקה על ידי group A Streptococcus.
|יחידות מדידה=
|טווח ערכים תקין=במבוגרים מתחת ל-85 יחידות/מ"ל; בילדים בגיל בית הספר מתחת ל-171 יחידות/מ"ל; לילדים בגיל נמוך מ-6 שנים-מתחת ל-61 יחידות/מ"ל.
|יוצר הערך=[[משתמש:בן עמי סלע|פרופ' בן-עמי סלע]]
|אחראי הערך=
}}
== משמעות הבדיקה ==

בדיקת anti-DNAse-B יכולה לסייע באבחון הדבקה נוכחית בסטרפטוקוקוס, בבירור הסיבה לגלומרולונפריטיס כמו גם ל[[קדחת השיגרון]] (rheumatic fever). בדרך כלל מתבצעת בדיקה זו במקביל לבדיקת ASO, שנועדה אף היא לגלות הדבקות קודמות בסטרפטוקוקוס. ברוב המקרים, הדבקות סטרפטוקוקאליות של הגרון והעור, מזוהות ומטופלות ב[[אנטיביוטיקה]], וההדבקה נעלמת. במקרים בהם הדבקות אלה אינן גורמות לתסמינים הניתנים לזיהוי, או שהם אינם מאובחנות, סיבוכים כגון אלה של rheumatic fever או glomerulonephritis עלולים להתפתח בחלק מהמטופלים ובעיקר בילדים צעירים.

כאמור אי-אבחון וטיפול ראוי, עלול לגרום לכך שדלקות גרון על ידי group A streptococcus עלולה לגרום ל- rheumatic fever או ל-glomerulonephritis, בעוד שדלקות סטרפטוקוקליות של העור עלולה לגרום ל- glomerulonephritis. מבדק ASO מתבצע אם במטופל מופיעים תסמינים המרמזים על אחד משני הסיבוכים האמורים, או במטופל עם היסטוריה מהזמן הקרוב של דלקת גרון, הדבקות עור טיפוסיות, או עם הדבקה סטרפטוקוקלית מוכחת.

מבדק anti-DNAse-B יכול להיות מוזמן כשלעצמו, או במשולב עם מבחן של נוגדן אנטי-סטרפטוקוקלי אחר, דוגמת anti-hyaluronidase, אם מבדק ASO מתקבל שלילי. ב-10-15% מבין אלה עם סיבוך בתר-סטרפטוקוקלי לא תתקבל תוצאה מוגברת של ASO, אך יכולה להתקבל תוצאה מוגברת של טיטר של anti-DNAse-B או של antihyaluronidase. נתונים אלה נכונים בפרט במקרים של glomerulonephritis שנכרך בהדבקה סטפרטוקוקלית קודמת של העור.

אם לנבדק יש רמה גבוהה או כזו בקו-עלייה של טיטר ASO, אין צורך למעשה לבצע בדיקת anti-DNAse-B. יחד עם זאת, אם רמת ASO שלילית, בדיקת anti-DNAse-B יכולה להיות בעלת ערך בזיהוי הדבקות קודמות של סטרפטוקוקוס, בנבדקים שאינם מייצרים ASO, או כאלה המייצרים כמויות קטנות שלו. הללו מתבצעות במשולב, ניתן לזהות למעלה מ-90% מהמקרים של הדבקות סטרפטוקוקליות שהתרחשו ולא אובחנו בזמן אמת. תוצאות שליליות במבדק נוגדנים כנגד DNAse-B ובמבדק ASO או טיטר נמוך מאוד של נוגדנים בשני מבדקים אלה, פירושן שהנבדק בסבירות גבוהה לא הודבק לאחרונה על ידי Group A streptococci. מסקנה זו נכונה במיוחד אם תוצאות אלה התקבלו בבדיקות חוזרות בהפרש של שבועיים.

הדבקות סטרפטוקוקליות יכולת להיגרם על ידי מספר זנים של streptococcus והם זני A, B, C, D ו-G המזוהים על ידי דרגת אלימותם והמבנה כימי של שטח הפנים. כל אחד מ-5 זנים אלה גורם לסוגי הדבקה שונים ולתסמינים שונים הנגרמים.

Group A streptococcus הוא הזן האלים ביותר באדם, ובין היתר גורם ל-Strep throat, טונסיליטיס, פצעים מהדבקות עור, אלח דם (septicemia), [[שנית]] (scarlet fever), [[שפעת]], [[דלקת פרקים]], מחולית ע"ש Sydenham וגלומרולונפריטיס.

האנזים DNAse B מיוצר על ידי כמעט כל הסרוטיפים של β hemolytic Group A , אך באופן פחות משמעותי ע"י זנים ב- Group C ו-Group G של Streptococcus. אלה הנדבקים עם זנים אלה של סטרפטוקוקוס מייצרים נוגדנים כנגד האנזים DNAse B. מבחנים סרולוגיים לנוכחות נוגדנים ל-DNAse B הם לעזר באישוש האבחון של הדבקה סטרפטוקוקאלית בעיקר בגרון ובעור. מבחן זה הוא למעשה מבחן של נטרול פעילות האנזים, ונמדדת היכולת של נוגדנים ספציפיים לעכב את הדה-פולימריזציה של DNA. במבדק נבחנת יכולת העיכוב של מהולים סריאליים של הנסיוב הנבדק. הערך ההוֹפְכי (רציפרוקלי) של המהול הגבוה ביותר שעדיין מעכב את פעילות האנזים הוא הטיטר הנחשב.

התרחישים של גלומרולונפריטיס ושל rheumatic fever יכולים להופיע במהלך ההדבקה הסטרפטוקוקלית, או לאחר תקופה חביון (latency) לאחר הדבקה כזו במהלכה הנדבק חסר תסמינים. תקופת חביון זו לגבי גלומרולונפריטיס נמשכת בערך 10 ימים, ובמקרה של rheumatic fever תקופת החביון היא בת 20 יום בממוצע.

מספר אנטיגנים בקטריאליים זוהו בתרביות של סטרפטוקוקים Group A. בעיקרם חלבונים אלה הם אנזימים הכוללים את streptolysin O, סטרפטוקינאזה, hyaluronidase ו-4 סוגי דאוקסיריבונוקלאזות
DNAse A, B, C and D)) כמו גם nicotiamide adenine nucleotidase. הדבקות עם סטרפטוקוקוס מ-group A, הן ייחודיות כיוון שהן יכולות להוות תרחישי פתיחה לסיבוכים לא-מוגלתיים כגון rheumatic fever או glomerulonephritis. נתונים עדכניים מצביעים על כך ש-rheumatic fever קשור עם הדבקה עם מספר סרוטיפים ראומטוגנים כמו M19 ,M18 ,M6 ,M5 ,M3 ,M1, ואילו glomerulonephritis כרוך בהדבקה עם הסרוטיפים הנפריטוגנים M60, M59, M57, M49, M12, M2.

סטרפטוקוקוס (Group A) הידוע גם כ-Streptococcus pyogenes, גורם לספקטרום רחב של תחלואה, ומהווה את הגורם החיידקי העיקרי לתרחישים של [[דלקת גרון]] (pharyngitis) או של [[דלקת שקדים תפליטית]] (exudative tonsillitis). מבחינה אפידמיולוגית פרינגיטיס על רקע סטרפטקוקאלי מייצגת 1-2% מכלל הביקורים אצל רופאי משפחה, ונכלל ברשימת 20 התחלואות השכיחות ביותר. לעומת זאת, ההתרחשות של rheumatic fever poststreptococcal pharyngitis היא /100,0001-2. הגיל הרווח יותר לסוג הדבקות זה הוא מתחת ל-20 שנה, והוא נדיר יחסית בילדים מתחת גיל 3 שנים. ההעברה של החיידק הפתוגני היא על ידי מגע ישיר עם הפרשות אף, כאשר מבחינה עונתית השכיחות הגדולה של ההדבקות מתרחשת בחורף או בתחילת האביב. Streptococcus pyogenes הוא חיידק נקד גראם-חיובי.

בעקבות תרחיש של פיודרמה סטרפטוקוקלית שהיא מפגע דלקתי הנוטה להתפשט בשטחי עור נרחבים, העלול לגרום ל-poststreptococcal glomerulonephritis, בפחות מ-30% מהמקרים החולים מפתחים רמות טיטר מוגברות של ASO. לעומת זאת, רוב החולים בתרחיש המתואר מפתחים רמות טיטר מוגברות של anti-DNAse-B הנותרות מוגברות חודשים אחדים. לכן, המבדק הסרולוגי האחרון הוא המועדף. כמו כן, בגלל הנטייה למוגברות ממושכת, מבדק anti-DNAse-B יכול להיות לעזר באבחון של הסיבוכים המאוחרים של מחלה נוירולוגית הידועה כ-"מחולית סידנהם" (‏Sydenham`s chorea‏) או גם כ-St. Vitus dance.

ידוע שנוגדנים שנוצרו נגד אנטיגנים של החיידק Streptococcus ‎pyogenes מגיבים גם ‏עם אנטיגנים ברקמת הלב, במפרקים ובמוח, וגורמים לפיכך לדלקות בלב ‏ובמסתמיו, לדלקת פרקים כרונית ולמחלה הנוירולוגית מחולית ‏סידנהם, שהיא המפגע הנוירולוגי העיקרי שמקורה בדלקת פרקים חריפה. המחולית ‏מאופיינת על-ידי תנועות לא רצוניות (כעין תנועת מחול), וכן על ידי הפרעות נוירו-פסיכיאטריות כמו [[הפרעה טורדנית-‏כפייתית]] (‏OCD‏), היפראקטיביות וחוסר יציבות רגשית. מחלה זו מתפוגגת בדרך כלל תוך 2-3 חודשי ללא תופעות לוואי לא רצויות לטווח זמן ארוך. זו דוגמה לחיקוי מולקולארי בו פעילות ‏חיסונית מצולבת (cross reactivity) בין החיידק לרקמות המאכסן הגורמת ל[[דלקת פרקים]], דלקת ברקמת הלב, בכליות ופגיעה נוירולוגית (Bisno וחב' ב-Principles Prac Infect Dis משנת 2009, ו-Ayoub ו-Harden ב-Manual Clin Lab Immunol משנת 1997).

ערכי הנורמה של בדיקת טיטר הנוגדנים anti-DNAse-B יכולים להשתנות משמעותית עם הגיל והאזור הגיאוגרפי, והם אף עלול להראות סטיות של 15-20% באוכלוסייה בריאה באותו אזור גיאוגרפי בעיקר באסיה ובאפריקה (Karmarker וחב' ב-Indian J Med Res משנת 2004, ו-Mhalu ו-Matre ב-East African Med J משנת 1995). מחקר של Ayoub וחב' ב-Clin Diagn Lab Immunol משנת 2003, הצביע על שינויים ברמת הנוגדנים כנגד סטרפטוקוקוס Group A בדמם של נבדקים עם ובלי rheumatic fever באזורים גיאוגרפיים עם רמות גבוהות ונמוכות של המחלה.

ערכי טיטר מוגברים מוצאים בערך ב-80% מהמקרים של דלקת מפרקים חריפה (acute rheumatic fever). ערכים מוגברים של טיטר נוגדנים כנגד DNAse B, יכולים לסייע באבחון של acute rheumatic fever ב-20% מהנבדקים בהם אין ערכים מוגברים של הטיטר של ASO. יצוין שרמות אנטי-DNAse-B, עולות לאט יותר מאשר אלה של ASO, ומגיעים לשיא רק 4-8 שבועות לאחר ההדבקה. נוגדנים כנגד DNAse גם דועכים הרבה יותר לאט בהשוואה ל-ASO, והם נותרים מוגברים למשך מספר חודשים.

{| class="wikitable"
|-
|+ קריטריונים להתנהלות במקרים של כאבי גרון{{הערה|שם=הערה1|מומלץ על ידי ה-CDC, ע"י ה- American College of Physicians (ACP) ו- American Academy of Family Physicians (AAFP) , אך לא ע"יInfectious Diseases Society of America (IDSA) או על ידי American Heart Association (AHA) .}}
|-
! קריטריונים !! נקודות
|-
| היעדר שיעול || 1
|-
| נפיחות או רגשות של קשריות ה-aneterior cervical || 1
|-
| טמפרטורת גוף מעל 38 מעלות צלזסיוס || 1
|-
| אקסודט טונסילרי או נפיחות השקדים || 1
|-
|colspan="2"| '''גיל'''
|-
| 3-14 שנה || 1
|-
| 15-44 שנה || 0
|-
| מעל גיל 45 || -1
|-
|'''ניקוד מצטבר'''||'''התנהלות מוצעת'''
|-
|≤0|| אין צורך בבדיקה
|-
|1||סיכון נמוך מ-10%, ניתן לבצע את הבדיקה רק אם קיים חשש מובהק או מגע לאחרונה עם חולה
|-
|2-3||יש לבצע משטח ותרבית גרון ואת הבדיקה
|-
|>4||יש לטפל ללא דיחוי בלי ביצוע הבדיקה
|}

==התוויות לבדיקות מעבדה==

התוויות לביצוע בדיקת anti-DNAse-B ו/או בדיקת ASO: כאב גרון, חום ו-lymphadenopathy.

מבדק מהיר לזיהוי סטרפטוקוקוס (RST או rapid strep test, וכן RADT או rapid antigen detection test), הוא מבדק זיהוי מהיר הנמצא בשימוש נרחב בקליניקות לסייע באבחון של דלקת גרון בקטריאלית, שנגרמה על ידי group A streptococci, המכונה לעתים strep throat. מבדק זה מסייע לקבוע האם יש לנקוט בטיפול אנטיביוטי (Mersch ב-MedicineNet.com משנת 2015). קיימים מספר מבדקים מהירים, תוך שימוש בטכנולוגיות שונות הפועלות כולן על בסיס גילוי group A streptococci בגרון על ידי תגובה עם אנטיגנים ספציפיים לחיידק זה על פני מטוש (swab) הגרון.

ברוב המקרים פרינגיטיס נגרמת על ידי הדבקה נגיפית, אם כי ב-20-40% ממקרי פרינגיטיס בילדים, וב-5-15% מהמקרים הללו במבוגרים הדבקה חיידקית היא הגורם למפגע (Matthys וחב' ב-Annals Fam Med משנת 2007). כיוון שהסיבה העיקרית של פרינגיטיס בקטריאלי היא group A streptococci, נוכחות פתוגן זה בגרונו של המטופל היא תנאי נחוץ להתחלת טיפול אנטיביוטי (Danchin וחב' ב- Med J Australia משנת 2002). אמנם פרינגיטיס על רקע group A streptococci, היא הדבקה המתפוגגת מעצמה תוך שבוע ללא תרופות, אך טיפול אנטיביוטי עשוי לקצר את משך המפגע ולהפחית מחומרתו, כמו גם את הסיבוכים הנלווים החמורים. ליישום של RST, יש גם חשיבות בהקשר של בריאות הציבור, שכן שימוש אנטיביוטי לא נאות, בפרט במקרים של פרינגיטיס נגיפי, עלול להגביר את תופעת העמידות לאנטיביוטיקה. בארה"ב יש דגש יותר מובהק על ביצוע RST מאשר באירופה.

תרבית חיידקים על ידי משטח גרון היא שיטה אמינה ולא יקרה שיכולה לשמש חלופה נאותה ל-RST, והיא בעלת רגישות וספציפיות גבוהות. אלא שתשובת המעבדה דורשת 48 שעות לביצוע מבדק תרבית בעוד שתשובת RST יכולה להתקבל תוך דקות אחדות.

==מהלך בדיקת RST==

אוספים בערת מטוש חומר רירי (mucus) מגרונו של הנבדק. ברוב שיטות RST דגימת הריר נחשפת בריאגנט של ערכת הבדיקה לנוגדנים הנקשרים ספציפית לאנטיגנים של Group A Stretococcus. במקרה של תוצאה חיובית מתקבלת ריאקציה נראית לעין. ישנם 3 סוגים עיקריים של RST: ראשית, latex fixation test שפותח בשנות ה-80 וכעת כבר אינו בשימוש. בשיטה זו חרוזי latex המכוסים באנטיגנים של החיידק, עוברים אגלוטינציה בולטת לעין בנוכחות נוגדנים כנגד החיידק אם אלה אמנם נוכחים. שנית, lateral flow test, שהיא כיום שיטת RST בשימוש הנרחב ביותר. הדגימה באה במגע עם פילם של ניטרוצלולוז, ואם אנטיגנים של Group A Stretococcus מצויים, הם ינדדו על פני הפילם ליצירה של "קשת" נראית לעין במקום המפגש של אנטיגנים אלה עם הנוגדן המסומן הרלוונטי. שלישית, השיטה העדכנית ביותר אך גם היקרה יותר של optical immunoassay, בה מערבבים את הדגימה עם נוגדנים מסומנים ובהמשך עם מצע מיוחד על פני פילם המשנה צבעו בהתאם לנוכחות או לחסר של אנטיגן של החיידק (Cohen וחב' ב-Cochrane Database Syst Rev משנת 2013).

==פירוש התוצאות==

הספציפיות של RST לנוכחות group A streptococci היא לפחות 95%, עם מספר מחקרים המצביעים על ספציפיות קרובה יותר ל-100% (על פי Cohen וחב' ב-J Pediatr משנת 2014). יחד עם זאת, 5-20% נושאים group A streptococci בגרונם ללא תסמינים של הדבקה, כך שנוכחות החיידק בנבדקים עם פרינגיטיס אינה מוכיחה שחיידק זה אחראי להדבקה. הרגישות של ה-lateral flow test נמוכה במקצת ועומדת על 65-80%, ולכן תוצאה שלילית במבדק זה אינה יכולה לשמש לשלילת פריגיטיס על רקע group A streptococci, מה שמהווה חסרון בהשוואה למבדק תרבית בו הרגישות היא 90-95%. השיטה העדכנית יותר של optical immunoassay היא בעלת רגישות של 94% (על פי Gerber וחב' ב-J Am Med Assoc משנת 1997). ההנחיות בארה"ב ממליצות על ביצוע תרבית חיידקים במקרה של תוצאת RST שלילית (Gerber וחב' ב-Circulation משנת 2009), בעוד שההנחיות האירופיות ממליצות על הסתמכות מוחלטת על תוצאת RST (על פי Pelucci וחב' ב-Clin Microbiol Infect משנת 2012).

*בדיקת תרבית ל-Group A Streptococcus היא ה-Gold standard לזיהוי הדבקה בסוג זה של סטרפטוקוקוס, וכמקובל היא מבוצעת כאשר RST מתקבל שלילי והחשד לנוכחות של סטרפטוקוקוס בדלקת הגרון הוא גבוה. רגישות שיטה זו 90-95%.

*מדידת anti-DNAse-B בשיטה נפלומטרית כמותית היא השיטה המועדפת ברוב התסריטים הקליניים, ומהווה את המבדק היעיל ביותר במקרים של מחולית (chorea) ראומטית כיוון שהטיטר הנבדק נותר מוגבר לזמן ארוך יותר. אחת ממגבלות השיטה הוא שטיפול אנטיביוטי מפחית את טיטר הנוגדנים, לכן יש סבורים שתרבית גרון צריכה להתבצע בעת ובעונה אחת. בדיקת anti DNAse-B טובה לאישור של הדבקה בזמן אמת או הדבקה שהתרחשה לאחרונה עםgroup A streptococci בנבדקים החשודים לסיבוכים לא מוגלתיים כגון גלומרולונפריטיס חריפה או rheumatic fever חריפה. ההמלצה היא לבדוק נוכחות נוגדנים אלה בדגימות של מטופל בפאזה החריפה של המפגע וכן בשלב ההחלמה ממנו, בהפרש של כ-14 יום בין 2המבדקים. הנוגדנים כנגד DNAse-B יכולים לשרוד בנסיוב למשך תקופה של 2-3 חודשים לאחר ההדבקה. תגובת הנוגדנים כנגד DNAse-B מתחילה בדרך כלל מאוחר יותר מהופעת נוגדנים כנגד ASO, אך היא מתגלה באחוז גבוה יותר של נבדקים, והיא מתגלה לפרק זמן ממושך יותר בהשוואה ל-מבדק ASO.

*מדידת ASO בשיטה נפלומטרית כמותית שיטה המאוששת בהדבקה קודמת על ידי group A streptococcus, הנחשדת במטופלים עם תסמינים של גלומרולונפריטיס או של Rheumatic fever. נהוג לבצע בדיקה זו במשולב עם anti-DNAse-B. שיטה זו מודדת יצירת נוגדנים כנגד האנזים האריתרו-ליטי streptolysin O המופרש ספציפי על ידי חיידק זה. מגבלותיה שאינה יעילה באבחון הפתוגן בהדבקות עור. כמו כן, טיפול אנטיביוטי מפחית את רגישות השיטה. יש המדגישים את הצורך לבצע תרבית גרון במקביל, כמו גם לבצע שתי בדיקות עוקבות של anti ASO בהפרש של שבועיים בשלב החריף של המפגע ובשלב ההחלמה ממנו. נוגדני ASO שורדים בערך 6 שבועות לאחר ההדבקה. מגבלות נוספות של מבדק ASO עלולות להיווצר כאשר יש בנסיוב רמה גבוהה של β lipoproteins שעלולים לגרום לתוצאה false-positive. בנוסף, גם סטרואידים המדכאים את מערכת החיסון יכולים לדכא יצירת ASO. בהערכה של מטופלים עם acute rheumatic fever, ממליץ ה-AHA דווקא על ביצוע בדיקת ASO על פני בדיקת anti-DNAse-B.

מבחן streptozyme משמש כבדיקת סקר של נוגדנים לאנטיגנים הסטרפטןקוקליים NADase, DNAse, סטרפטוקינאז, streptolysin O ו-hyaluronidase. מבדק זה שימושי בהערכה של חשד למחלה בתר-סטרפטוקוקלית כגון rheumatic fever לאחר הדבקה עם Streptococcus pyogenes. יתרון מבדק זה על פני שני המבדקים האחרים, הוא ביכולתו לגלות מספר נוגדנים לאטיגנים שונים, באופן מהיר, ובכך שהתוצאות המתקבלות אינן מושפעות מגורמים שונים המשפיעים על המבדקים האחרים. חולשתו של מבדק streptozyme שהוא אינו רגיש בילדים כמו במבוגרים, וכן בכך שלעתים הוא לא מגלה נוגדנים לאחד האנטיגנים שהוזכרו ללא סיבה ברורה. גם במבדק זה עלייה סריאלית בטיטר הנוגדנים משמעותית יותר קביעה בודדה.

==משמעות של תוצאות הבדיקה==

#ערכים של 183-240 יחידות/מ"ל נחשבים לערכי anti-DNAse-B מוגברים במקצת;
#ערכים של 240-360 יחידות/מ"ל נחשבים לערכי anti-DNAse-B מוגברים;
#ערכים של 360-640 יחידות/מ"ל נחשבים לערכי anti-DNAse-B מוגברים משמעותית;
#ערכים של מעל 640 יחידות/מ"ל נחשבים לערכי anti-DNAse-B מוגברים מאוד.

== הוראות לביצוע הבדיקה ==

אין צורך בהכנות מיוחדות כולל צום. את הדם יש לדגום במבחנה כימית (פקק אדום) או במבחנת ג'ל. יש לסרכז את הדגימה תוך 30 דקות מנטילת הדם, ולקרר או להקפיא מיידית. יש להעביר את דגימת הדם למעבדה מקוררת בתוך קרח כתוש או בכלי עם קרחומים. להעברה למעבדה מרוחקת, מומלץ שמבחנת הנסיוב תוכנס לכלי עם קרח יבש. הדגימה יציבה למשך 48 שעות בטמפרטורת החדר, למשך 8 ימים בקירור,‏ או למשך 90 יום בהקפאה. אין לקבל דגימות המגיעות למעבדה לא מקוררות, וכן יש לפסול דגימות המוליטיות מאוד או ליפמיות מאוד.

==ביבליוגרפיה==

{{הערות שוליים}}

==ראו גם==

* [[מדריך בדיקות מעבדה|חזרה לדף מדריך בדיקות מעבדה]]
* [[מחלות בקטריאליות/ זיהום בקטריאלי-אלח-דם|בדיקות מעבדה - מחלות בקטריאליות/ זיהום בקטריאלי-אלח-דם]]
* [[מחלות ריאומטיות|בדיקות מעבדה - מחלות ריאומטיות]]

{{ייחוס|[[משתמש:בן עמי סלע|פרופ' בן-עמי סלע]]}}

[[קטגוריה:בדיקות מעבדה - זיהום בקטריאלי]]
[[קטגוריה:בדיקות מעבדה: כימיה בדם]]

נוגדנים ל-Anti DNAse B antibodies - DNAse B

2015-11-23T05:05:12Z

בן עמי סלע:

{{בדיקת מעבדה
|שם עברי= נוגדנים ל-DNAse B
|שם לועזי= Anti DNAse B antibodies
|קיצור=AND-B; ADB; ADNase-B; Antideoxyribonuclease B titer; Streptococcal Antibodies, DNB.
|תמונה=
|כיתוב תמונה=
|מעבדה=מיקרוביולוגיה בדם
|תחום=ברור הדבקה על ידי group A Streptococcus.
|יחידות מדידה=
|טווח ערכים תקין=במבוגרים מתחת ל-85 יחידות/מ"ל; בילדים בגיל בית הספר מתחת ל-171 יחידות/מ"ל; לילדים בגיל נמוך מ-6 שנים-מתחת ל-61 יחידות/מ"ל.
|יוצר הערך=[[משתמש:בן עמי סלע|פרופ' בן-עמי סלע]]
|אחראי הערך=
}}
== משמעות הבדיקה ==

בדיקת anti-DNAse-B יכולה לסייע באבחון הדבקה נוכחית בסטרפטוקוקוס, בבירור הסיבה לגלומרולונפריטיס כמו גם ל[[קדחת השיגרון]] (rheumatic fever). בדרך כלל מתבצעת בדיקה זו במקביל לבדיקת ASO, שנועדה אף היא לגלות הדבקות קודמות בסטרפטוקוקוס. ברוב המקרים, הדבקות סטרפטוקוקאליות של הגרון והעור, מזוהות ומטופלות ב[[אנטיביוטיקה]], וההדבקה נעלמת. במקרים בהם הדבקות אלה אינן גורמות לתסמינים הניתנים לזיהוי, או שהם אינם מאובחנות, סיבוכים כגון אלה של rheumatic fever או glomerulonephritis עלולים להתפתח בחלק מהמטופלים ובעיקר בילדים צעירים.

כאמור אי-אבחון וטיפול ראוי, עלול לגרום לכך שדלקות גרון על ידי group A streptococcus עלולה לגרום ל- rheumatic fever או ל-glomerulonephritis, בעוד שדלקות סטרפטוקוקליות של העור עלולה לגרום ל- glomerulonephritis. מבדק ASO מתבצע אם במטופל מופיעים תסמינים המרמזים על אחד משני הסיבוכים האמורים, או במטופל עם היסטוריה מהזמן הקרוב של דלקת גרון, הדבקות עור טיפוסיות, או עם הדבקה סטרפטוקוקלית מוכחת.

מבדק anti-DNAse-B יכול להיות מוזמן כשלעצמו, או במשולב עם מבחן של נוגדן אנטי-סטרפטוקוקלי אחר, דוגמת anti-hyaluronidase, אם מבדק ASO מתקבל שלילי. ב-10-15% מבין אלה עם סיבוך בתר-סטרפטוקוקלי לא תתקבל תוצאה מוגברת של ASO, אך יכולה להתקבל תוצאה מוגברת של טיטר של anti-DNAse-B או של antihyaluronidase. נתונים אלה נכונים בפרט במקרים של glomerulonephritis שנכרך בהדבקה סטפרטוקוקלית קודמת של העור.

אם לנבדק יש רמה גבוהה או כזו בקו-עלייה של טיטר ASO, אין צורך למעשה לבצע בדיקת anti-DNAse-B. יחד עם זאת, אם רמת ASO שלילית, בדיקת anti-DNAse-B יכולה להיות בעלת ערך בזיהוי הדבקות קודמות של סטרפטוקוקוס, בנבדקים שאינם מייצרים ASO, או כאלה המייצרים כמויות קטנות שלו. הללו מתבצעות במשולב, ניתן לזהות למעלה מ-90% מהמקרים של הדבקות סטרפטוקוקליות שהתרחשו ולא אובחנו בזמן אמת. תוצאות שליליות במבדק נוגדנים כנגד DNAse-B ובמבדק ASO או טיטר נמוך מאוד של נוגדנים בשני מבדקים אלה, פירושן שהנבדק בסבירות גבוהה לא הודבק לאחרונה על ידי Group A streptococci. מסקנה זו נכונה במיוחד אם תוצאות אלה התקבלו בבדיקות חוזרות בהפרש של שבועיים.

הדבקות סטרפטוקוקליות יכולת להיגרם על ידי מספר זנים של streptococcus והם זני A, B, C, D ו-G המזוהים על ידי דרגת אלימותם והמבנה כימי של שטח הפנים. כל אחד מ-5 זנים אלה גורם לסוגי הדבקה שונים ולתסמינים שונים הנגרמים.

Group A streptococcus הוא הזן האלים ביותר באדם, ובין היתר גורם ל-Strep throat, טונסיליטיס, פצעים מהדבקות עור, אלח דם (septicemia), [[שנית]] (scarlet fever), [[שפעת]], [[דלקת פרקים]], מחולית ע"ש Sydenham וגלומרולונפריטיס.

האנזים DNAse B מיוצר על ידי כמעט כל הסרוטיפים של β hemolytic Group A , אך באופן פחות משמעותי ע"י זנים ב- Group C ו-Group G של Streptococcus. אלה הנדבקים עם זנים אלה של סטרפטוקוקוס מייצרים נוגדנים כנגד האנזים DNAse B. מבחנים סרולוגיים לנוכחות נוגדנים ל-DNAse B הם לעזר באישוש האבחון של הדבקה סטרפטוקוקאלית בעיקר בגרון ובעור. מבחן זה הוא למעשה מבחן של נטרול פעילות האנזים, ונמדדת היכולת של נוגדנים ספציפיים לעכב את הדה-פולימריזציה של DNA. במבדק נבחנת יכולת העיכוב של מהולים סריאליים של הנסיוב הנבדק. הערך ההוֹפְכי (רציפרוקלי) של המהול הגבוה ביותר שעדיין מעכב את פעילות האנזים הוא הטיטר הנחשב.

התרחישים של גלומרולונפריטיס ושל rheumatic fever יכולים להופיע במהלך ההדבקה הסטרפטוקוקלית, או לאחר תקופה חביון (latency) לאחר הדבקה כזו במהלכה הנדבק חסר תסמינים. תקופת חביון זו לגבי גלומרולונפריטיס נמשכת בערך 10 ימים, ובמקרה של rheumatic fever תקופת החביון היא בת 20 יום בממוצע.

מספר אנטיגנים בקטריאליים זוהו בתרביות של סטרפטוקוקים Group A. בעיקרם חלבונים אלה הם אנזימים הכוללים את streptolysin O, סטרפטוקינאזה, hyaluronidase ו-4 סוגי דאוקסיריבונוקלאזות
DNAse A, B, C and D)) כמו גם nicotiamide adenine nucleotidase. הדבקות עם סטרפטוקוקוס מ-group A, הן ייחודיות כיוון שהן יכולות להוות תרחישי פתיחה לסיבוכים לא-מוגלתיים כגון rheumatic fever או glomerulonephritis. נתונים עדכניים מצביעים על כך ש-rheumatic fever קשור עם הדבקה עם מספר סרוטיפים ראומטוגנים כמו M19 ,M18 ,M6 ,M5 ,M3 ,M1, ואילו glomerulonephritis כרוך בהדבקה עם הסרוטיפים הנפריטוגנים M60, M59, M57, M49, M12, M2.

סטרפטוקוקוס (Group A) הידוע גם כ-Streptococcus pyogenes, גורם לספקטרום רחב של תחלואה, ומהווה את הגורם החיידקי העיקרי לתרחישים של [[דלקת גרון]] (pharyngitis) או של [[דלקת שקדים תפליטית]] (exudative tonsillitis). מבחינה אפידמיולוגית פרינגיטיס על רקע סטרפטקוקאלי מייצגת 1-2% מכלל הביקורים אצל רופאי משפחה, ונכלל ברשימת 20 התחלואות השכיחות ביותר. לעומת זאת, ההתרחשות של rheumatic fever poststreptococcal pharyngitis היא /100,0001-2. הגיל הרווח יותר לסוג הדבקות זה הוא מתחת ל-20 שנה, והוא נדיר יחסית בילדים מתחת גיל 3 שנים. ההעברה של החיידק הפתוגני היא על ידי מגע ישיר עם הפרשות אף, כאשר מבחינה עונתית השכיחות הגדולה של ההדבקות מתרחשת בחורף או בתחילת האביב. Streptococcus pyogenes הוא חיידק נקד גראם-חיובי.

בעקבות תרחיש של פיודרמה סטרפטוקוקלית שהיא מפגע דלקתי הנוטה להתפשט בשטחי עור נרחבים, העלול לגרום ל-poststreptococcal glomerulonephritis, בפחות מ-30% מהמקרים החולים מפתחים רמות טיטר מוגברות של ASO. לעומת זאת, רוב החולים בתרחיש המתואר מפתחים רמות טיטר מוגברות של anti-DNAse-B הנותרות מוגברות חודשים אחדים. לכן, המבדק הסרולוגי האחרון הוא המועדף. כמו כן, בגלל הנטייה למוגברות ממושכת, מבדק anti-DNAse-B יכול להיות לעזר באבחון של הסיבוכים המאוחרים של מחלה נוירולוגית הידועה כ-"מחולית סידנהם" (‏Sydenham`s chorea‏) או גם כ-St. Vitus dance.

ידוע שנוגדנים שנוצרו נגד אנטיגנים של החיידק Streptococcus ‎pyogenes מגיבים גם ‏עם אנטיגנים ברקמת הלב, במפרקים ובמוח, וגורמים לפיכך לדלקות בלב ‏ובמסתמיו, לדלקת פרקים כרונית ולמחלה הנוירולוגית מחולית ‏סידנהם, שהיא המפגע הנוירולוגי העיקרי שמקורה בדלקת פרקים חריפה. המחולית ‏מאופיינת על-ידי תנועות לא רצוניות (כעין תנועת מחול), וכן על ידי הפרעות נוירו-פסיכיאטריות כמו [[הפרעה טורדנית-‏כפייתית]] (‏OCD‏), היפראקטיביות וחוסר יציבות רגשית. מחלה זו מתפוגגת בדרך כלל תוך 2-3 חודשי ללא תופעות לוואי לא רצויות לטווח זמן ארוך. זו דוגמה לחיקוי מולקולארי בו פעילות ‏חיסונית מצולבת (cross reactivity) בין החיידק לרקמות המאכסן הגורמת ל[[דלקת פרקים]], דלקת ברקמת הלב, בכליות ופגיעה נוירולוגית (Bisno וחב' ב-Principles Prac Infect Dis משנת 2009, ו-Ayoub ו-Harden ב-Manual Clin Lab Immunol משנת 1997).

ערכי הנורמה של בדיקת טיטר הנוגדנים anti-DNAse-B יכולים להשתנות משמעותית עם הגיל והאזור הגיאוגרפי, והם אף עלול להראות סטיות של 15-20% באוכלוסייה בריאה באותו אזור גיאוגרפי בעיקר באסיה ובאפריקה (Karmarker וחב' ב-Indian J Med Res משנת 2004, ו-Mhalu ו-Matre ב-East African Med J משנת 1995). מחקר של Ayoub וחב' ב-Clin Diagn Lab Immunol משנת 2003, הצביע על שינויים ברמת הנוגדנים כנגד סטרפטוקוקוס Group A בדמם של נבדקים עם ובלי rheumatic fever באזורים גיאוגרפיים עם רמות גבוהות ונמוכות של המחלה.

ערכי טיטר מוגברים מוצאים בערך ב-80% מהמקרים של דלקת מפרקים חריפה (acute rheumatic fever). ערכים מוגברים של טיטר נוגדנים כנגד DNAse B, יכולים לסייע באבחון של acute rheumatic fever ב-20% מהנבדקים בהם אין ערכים מוגברים של הטיטר של ASO. יצוין שרמות אנטי-DNAse-B, עולות לאט יותר מאשר אלה של ASO, ומגיעים לשיא רק 4-8 שבועות לאחר ההדבקה. נוגדנים כנגד DNAse גם דועכים הרבה יותר לאט בהשוואה ל-ASO, והם נותרים מוגברים למשך מספר חודשים.

{| class="wikitable"
|-
|+ קריטריונים להתנהלות במקרים של כאבי גרון{{הערה|שם=הערה1|מומלץ על ידי ה-CDC, ע"י ה- American College of Physicians (ACP) ו- American Academy of Family Physicians (AAFP) , אך לא ע"יInfectious Diseases Society of America (IDSA) או על ידי American Heart Association (AHA) .}}
|-
! קריטריונים !! נקודות
|-
| היעדר שיעול || 1
|-
| נפיחות או רגשות של קשריות ה-aneterior cervical || 1
|-
| טמפרטורת גוף מעל 38 מעלות צלזסיוס || 1
|-
| אקסודט טונסילרי או נפיחות השקדים || 1
|-
|colspan="2"| '''גיל'''
|-
| 3-14 שנה || 1
|-
| 15-44 שנה || 0
|-
| מעל גיל 45 || -1
|-
|'''ניקוד מצטבר'''||'''התנהלות מוצעת'''
|-
|≤0|| אין צורך בבדיקה
|-
|1||סיכון נמוך מ-10%, ניתן לבצע את הבדיקה רק אם קיים חשש מובהק או מגע לאחרונה עם חולה
|-
|2-3||יש לבצע משטח ותרבית גרון ואת הבדיקה
|-
|>4||יש לטפל ללא דיחוי בלי ביצוע הבדיקה
|}

==התוויות לבדיקות מעבדה==

התוויות לביצוע בדיקת anti-DNAse-B ו/או בדיקת ASO: כאב גרון, חום ו-lymphadenopathy.

מבדק מהיר לזיהוי סטרפטוקוקוס (RST או rapid strep test, וכן RADT או rapid antigen detection test), הוא מבדק זיהוי מהיר הנמצא בשימוש נרחב בקליניקות לסייע באבחון של דלקת גרון בקטריאלית, שנגרמה על ידי group A streptococci, המכונה לעתים strep throat. מבדק זה מסייע לקבוע האם יש לנקוט בטיפול אנטיביוטי (Mersch ב-MedicineNet.com משנת 2015). קיימים מספר מבדקים מהירים, תוך שימוש בטכנולוגיות שונות הפועלות כולן על בסיס גילוי group A streptococci בגרון על ידי תגובה עם אנטיגנים ספציפיים לחיידק זה על פני מטוש (swab) הגרון.

ברוב המקרים פרינגיטיס נגרמת על ידי הדבקה נגיפית, אם כי ב-20-40% ממקרי פרינגיטיס בילדים, וב-5-15% מהמקרים הללו במבוגרים הדבקה חיידקית היא הגורם למפגע (Matthys וחב' ב-Annals Fam Med משנת 2007). כיוון שהסיבה העיקרית של פרינגיטיס בקטריאלי היא group A streptococci, נוכחות פתוגן זה בגרונו של המטופל היא תנאי נחוץ להתחלת טיפול אנטיביוטי (Danchin וחב' ב- Med J Australia משנת 2002). אמנם פרינגיטיס על רקע group A streptococci, היא הדבקה המתפוגגת מעצמה תוך שבוע ללא תרופות, אך טיפול אנטיביוטי עשוי לקצר את משך המפגע ולהפחית מחומרתו, כמו גם את הסיבוכים הנלווים החמורים. ליישום של RST, יש גם חשיבות בהקשר של בריאות הציבור, שכן שימוש אנטיביוטי לא נאות, בפרט במקרים של פרינגיטיס נגיפי, עלול להגביר את תופעת העמידות לאנטיביוטיקה. בארה"ב יש דגש יותר מובהק על ביצוע RST מאשר באירופה.

תרבית חיידקים על ידי משטח גרון היא שיטה אמינה ולא יקרה שיכולה לשמש חלופה נאותה ל-RST, והיא בעלת רגישות וספציפיות גבוהות. אלא שתשובת המעבדה דורשת 48 שעות לביצוע מבדק תרבית בעוד שתשובת RST יכולה להתקבל תוך דקות אחדות.

==מהלך בדיקת RST==

אוספים בערת מטוש חומר רירי (mucus) מגרונו של הנבדק. ברוב שיטות RST דגימת הריר נחשפת בריאגנט של ערכת הבדיקה לנוגדנים הנקשרים ספציפית לאנטיגנים של Group A Stretococcus. במקרה של תוצאה חיובית מתקבלת ריאקציה נראית לעין. ישנם 3 סוגים עיקריים של RST: ראשית, latex fixation test שפותח בשנות ה-80 וכעת כבר אינו בשימוש. בשיטה זו חרוזי latex המכוסים באנטיגנים של החיידק, עוברים אגלוטינציה בולטת לעין בנוכחות נוגדנים כנגד החיידק אם אלה אמנם נוכחים. שנית, lateral flow test, שהיא כיום שיטת RST בשימוש הנרחב ביותר. הדגימה באה במגע עם פילם של ניטרוצלולוז, ואם אנטיגנים של Group A Stretococcus מצויים, הם ינדדו על פני הפילם ליצירה של "קשת" נראית לעין במקום המפגש של אנטיגנים אלה עם הנוגדן המסומן הרלוונטי. שלישית, השיטה העדכנית ביותר אך גם היקרה יותר של optical immunoassay, בה מערבבים את הדגימה עם נוגדנים מסומנים ובהמשך עם מצע מיוחד על פני פילם המשנה צבעו בהתאם לנוכחות או לחסר של אנטיגן של החיידק (Cohen וחב' ב-Cochrane Database Syst Rev משנת 2013).

==פירוש התוצאות==

הספציפיות של RST לנוכחות group A streptococci היא לפחות 95%, עם מספר מחקרים המצביעים על ספציפיות קרובה יותר ל-100% (על פי Cohenוחב' ב-J Pediatr משנת 2014). יחד עם זאת, 5-20% נושאים group A streptococci בגרונם ללא תסמינים של הדבקה, כך שנוכחות החיידק בנבדקים עם פרינגיטיס אינה מוכיחה שחיידק זה אחראי להדבקה. הרגישות של ה-lateral flow test נמוכה במקצת ועומדת על 65-80%, ולכן תוצאה שלילית במבדק זה אינה יכולה לשמש לשלילת פריגיטיס על רקע group A streptococci, מה שמהווה חסרון בהשוואה למבדק תרבית בו הרגישות היא 90-95%. השיטה העדכנית יותר של optical immunoassay היא בעלת רגישות של 94% (על פי Gerber וחב' ב-J Am Med Assoc משנת 1997). ההנחיות בארה"ב ממליצות על ביצוע תרבית חיידקים במקרה של תוצאת RST שלילית (Gerber וחב' ב-Circulation משנת 2009), בעוד שההנחיות האירופיות ממליצות על הסתמכות מוחלטת על תוצאת RST (על פי Pelucci וחב' ב-Clin Microbiol Infect משנת 2012).

*בדיקת תרבית ל-Group A Streptococcus היא ה-Gold standard לזיהוי הדבקה בסוג זה של סטרפטוקוקוס, וכמקובל היא מבוצעת כאשר RST מתקבל שלילי והחשד לנוכחות של סטרפטוקוקוס בדלקת הגרון הוא גבוה. רגישות שיטה זו 90-95%.

*מדידת anti-DNAse-B בשיטה נפלומטרית כמותית היא השיטה המועדפת ברוב התסריטים הקליניים, ומהווה את המבדק היעיל ביותר במקרים של מחולית (chorea) ראומטית כיוון שהטיטר הנבדק נותר מוגבר לזמן ארוך יותר. אחת ממגבלות השיטה הוא שטיפול אנטיביוטי מפחית את טיטר הנוגדנים, לכן יש סבורים שתרבית גרון צריכה להתבצע בעת ובעונה אחת. בדיקת anti DNAse-B טובה לאישור של הדבקה בזמן אמת או הדבקה שהתרחשה לאחרונה עםgroup A streptococci בנבדקים החשודים לסיבוכים לא מוגלתיים כגון גלומרולונפריטיס חריפה או rheumatic fever חריפה. ההמלצה היא לבדוק נוכחות נוגדנים אלה בדגימות של מטופל בפאזה החריפה של המפגע וכן בשלב ההחלמה ממנו, בהפרש של כ-14 יום בין 2המבדקים. הנוגדנים כנגד DNAse-B יכולים לשרוד בנסיוב למשך תקופה של 2-3 חודשים לאחר ההדבקה. תגובת הנוגדנים כנגד DNAse-B מתחילה בדרך כלל מאוחר יותר מהופעת נוגדנים כנגד ASO, אך היא מתגלה באחוז גבוה יותר של נבדקים, והיא מתגלה לפרק זמן ממושך יותר בהשוואה ל-מבדק ASO.

*מדידת ASO בשיטה נפלומטרית כמותית שיטה המאוששת בהדבקה קודמת על ידי group A streptococcus, הנחשדת במטופלים עם תסמינים של גלומרולונפריטיס או של Rheumatic fever. נהוג לבצע בדיקה זו במשולב עם anti-DNAse-B. שיטה זו מודדת יצירת נוגדנים כנגד האנזים האריתרו-ליטי streptolysin O המופרש ספציפי על ידי חיידק זה. מגבלותיה שאינה יעילה באבחון הפתוגן בהדבקות עור. כמו כן, טיפול אנטיביוטי מפחית את רגישות השיטה. יש המדגישים את הצורך לבצע תרבית גרון במקביל, כמו גם לבצע שתי בדיקות עוקבות של anti ASO בהפרש של שבועיים בשלב החריף של המפגע ובשלב ההחלמה ממנו. נוגדני ASO שורדים בערך 6 שבועות לאחר ההדבקה. מגבלות נוספות של מבדק ASO עלולות להיווצר כאשר יש בנסיוב רמה גבוהה של β lipoproteins שעלולים לגרום לתוצאה false-positive. בנוסף, גם סטרואידים המדכאים את מערכת החיסון יכולים לדכא יצירת ASO. בהערכה של מטופלים עם acute rheumatic fever, ממליץ ה-AHA דווקא על ביצוע בדיקת ASO על פני בדיקת anti-DNAse-B.

מבחן streptozyme משמש כבדיקת סקר של נוגדנים לאנטיגנים הסטרפטןקוקליים NADase, DNAse, סטרפטוקינאז, streptolysin O ו-hyaluronidase. מבדק זה שימושי בהערכה של חשד למחלה בתר-סטרפטוקוקלית כגון rheumatic fever לאחר הדבקה עם Streptococcus pyogenes. יתרון מבדק זה על פני שני המבדקים האחרים, הוא ביכולתו לגלות מספר נוגדנים לאטיגנים שונים, באופן מהיר, ובכך שהתוצאות המתקבלות אינן מושפעות מגורמים שונים המשפיעים על המבדקים האחרים. חולשתו של מבדק streptozyme שהוא אינו רגיש בילדים כמו במבוגרים, וכן בכך שלעתים הוא לא מגלה נוגדנים לאחד האנטיגנים שהוזכרו ללא סיבה ברורה. גם במבדק זה עלייה סריאלית בטיטר הנוגדנים משמעותית יותר קביעה בודדה.

==משמעות של תוצאות הבדיקה==

#ערכים של 183-240 יחידות/מ"ל נחשבים לערכי anti-DNAse-B מוגברים במקצת;
#ערכים של 240-360 יחידות/מ"ל נחשבים לערכי anti-DNAse-B מוגברים;
#ערכים של 360-640 יחידות/מ"ל נחשבים לערכי anti-DNAse-B מוגברים משמעותית;
#ערכים של מעל 640 יחידות/מ"ל נחשבים לערכי anti-DNAse-B מוגברים מאוד.

== הוראות לביצוע הבדיקה ==

אין צורך בהכנות מיוחדות כולל צום. את הדם יש לדגום במבחנה כימית (פקק אדום) או במבחנת ג'ל. יש לסרכז את הדגימה תוך 30 דקות מנטילת הדם, ולקרר או להקפיא מיידית. יש להעביר את דגימת הדם למעבדה מקוררת בתוך קרח כתוש או בכלי עם קרחומים. להעברה למעבדה מרוחקת, מומלץ שמבחנת הנסיוב תוכנס לכלי עם קרח יבש. הדגימה יציבה למשך 48 שעות בטמפרטורת החדר, למשך 8 ימים בקירור,‏ או למשך 90 יום בהקפאה. אין לקבל דגימות המגיעות למעבדה לא מקוררות, וכן יש לפסול דגימות המוליטיות מאוד או ליפמיות מאוד.

==ביבליוגרפיה==

{{הערות שוליים}}

==ראו גם==

* [[מדריך בדיקות מעבדה|חזרה לדף מדריך בדיקות מעבדה]]
* [[מחלות בקטריאליות/ זיהום בקטריאלי-אלח-דם|בדיקות מעבדה - מחלות בקטריאליות/ זיהום בקטריאלי-אלח-דם]]
* [[מחלות ריאומטיות|בדיקות מעבדה - מחלות ריאומטיות]]

{{ייחוס|[[משתמש:בן עמי סלע|פרופ' בן-עמי סלע]]}}

[[קטגוריה:בדיקות מעבדה - זיהום בקטריאלי]]
[[קטגוריה:בדיקות מעבדה: כימיה בדם]]

נוגדנים ל-Anti DNAse B antibodies - DNAse B

2015-11-23T05:04:08Z

בן עמי סלע:

{{בדיקת מעבדה
|שם עברי= נוגדנים ל-DNAse B
|שם לועזי= Anti DNAse B antibodies
|קיצור=AND-B; ADB; ADNase-B; Antideoxyribonuclease B titer; Streptococcal Antibodies, DNB.
|תמונה=
|כיתוב תמונה=
|מעבדה=מיקרוביולוגיה בדם
|תחום=ברור הדבקה על ידי group A Streptococcus.
|יחידות מדידה=
|טווח ערכים תקין=במבוגרים מתחת ל-85 יחידות/מ"ל; בילדים בגיל בית הספר מתחת ל-171 יחידות/מ"ל; לילדים בגיל נמוך מ-6 שנים-מתחת ל-61 יחידות/מ"ל.
|יוצר הערך=[[משתמש:בן עמי סלע|פרופ' בן-עמי סלע]]
|אחראי הערך=
}}
== משמעות הבדיקה ==

בדיקת anti-DNAse-B יכולה לסייע באבחון הדבקה נוכחית בסטרפטוקוקוס, בבירור הסיבה לגלומרולונפריטיס כמו גם ל[[קדחת השיגרון]] (rheumatic fever). בדרך כלל מתבצעת בדיקה זו במקביל לבדיקת ASO, שנועדה אף היא לגלות הדבקות קודמות בסטרפטוקוקוס. ברוב המקרים, הדבקות סטרפטוקוקאליות של הגרון והעור, מזוהות ומטופלות ב[[אנטיביוטיקה]], וההדבקה נעלמת. במקרים בהם הדבקות אלה אינן גורמות לתסמינים הניתנים לזיהוי, או שהם אינם מאובחנות, סיבוכים כגון אלה של rheumatic fever או glomerulonephritis עלולים להתפתח בחלק מהמטופלים ובעיקר בילדים צעירים.

כאמור אי-אבחון וטיפול ראוי, עלול לגרום לכך שדלקות גרון על ידי group A streptococcus עלולה לגרום ל- rheumatic fever או ל-glomerulonephritis, בעוד שדלקות סטרפטוקוקליות של העור עלולה לגרום ל- glomerulonephritis. מבדק ASO מתבצע אם במטופל מופיעים תסמינים המרמזים על אחד משני הסיבוכים האמורים, או במטופל עם היסטוריה מהזמן הקרוב של דלקת גרון, הדבקות עור טיפוסיות, או עם הדבקה סטרפטוקוקלית מוכחת.

מבדק anti-DNAse-B יכול להיות מוזמן כשלעצמו, או במשולב עם מבחן של נוגדן אנטי-סטרפטוקוקלי אחר, דוגמת anti-hyaluronidase, אם מבדק ASO מתקבל שלילי. ב-10-15% מבין אלה עם סיבוך בתר-סטרפטוקוקלי לא תתקבל תוצאה מוגברת של ASO, אך יכולה להתקבל תוצאה מוגברת של טיטר של anti-DNAse-B או של antihyaluronidase. נתונים אלה נכונים בפרט במקרים של glomerulonephritis שנכרך בהדבקה סטפרטוקוקלית קודמת של העור.

אם לנבדק יש רמה גבוהה או כזו בקו-עלייה של טיטר ASO, אין צורך למעשה לבצע בדיקת anti-DNAse-B. יחד עם זאת, אם רמת ASO שלילית, בדיקת anti-DNAse-B יכולה להיות בעלת ערך בזיהוי הדבקות קודמות של סטרפטוקוקוס, בנבדקים שאינם מייצרים ASO, או כאלה המייצרים כמויות קטנות שלו. הללו מתבצעות במשולב, ניתן לזהות למעלה מ-90% מהמקרים של הדבקות סטרפטוקוקליות שהתרחשו ולא אובחנו בזמן אמת. תוצאות שליליות במבדק נוגדנים כנגד DNAse-B ובמבדק ASO או טיטר נמוך מאוד של נוגדנים בשני מבדקים אלה, פירושן שהנבדק בסבירות גבוהה לא הודבק לאחרונה על ידי Group A streptococci. מסקנה זו נכונה במיוחד אם תוצאות אלה התקבלו בבדיקות חוזרות בהפרש של שבועיים.

הדבקות סטרפטוקוקליות יכולת להיגרם על ידי מספר זנים של streptococcus והם זני A, B, C, D ו-G המזוהים על ידי דרגת אלימותם והמבנה כימי של שטח הפנים. כל אחד מ-5 זנים אלה גורם לסוגי הדבקה שונים ולתסמינים שונים הנגרמים.

Group A streptococcus הוא הזן האלים ביותר באדם, ובין היתר גורם ל-Strep throat, טונסיליטיס, פצעים מהדבקות עור, אלח דם (septicemia), [[שנית]] (scarlet fever), [[שפעת]], [[דלקת פרקים]], מחולית ע"ש Sydenham וגלומרולונפריטיס.

האנזים DNAse B מיוצר על ידי כמעט כל הסרוטיפים של β hemolytic Group A , אך באופן פחות משמעותי ע"י זנים ב- Group C ו-Group G של Streptococcus. אלה הנדבקים עם זנים אלה של סטרפטוקוקוס מייצרים נוגדנים כנגד האנזים DNAse B. מבחנים סרולוגיים לנוכחות נוגדנים ל-DNAse B הם לעזר באישוש האבחון של הדבקה סטרפטוקוקאלית בעיקר בגרון ובעור. מבחן זה הוא למעשה מבחן של נטרול פעילות האנזים, ונמדדת היכולת של נוגדנים ספציפיים לעכב את הדה-פולימריזציה של DNA. במבדק נבחנת יכולת העיכוב של מהולים סריאליים של הנסיוב הנבדק. הערך ההוֹפְכי (רציפרוקלי) של המהול הגבוה ביותר שעדיין מעכב את פעילות האנזים הוא הטיטר הנחשב.

התרחישים של גלומרולונפריטיס ושל rheumatic fever יכולים להופיע במהלך ההדבקה הסטרפטוקוקלית, או לאחר תקופה חביון (latency) לאחר הדבקה כזו במהלכה הנדבק חסר תסמינים. תקופת חביון זו לגבי גלומרולונפריטיס נמשכת בערך 10 ימים, ובמקרה של rheumatic fever תקופת החביון היא בת 20 יום בממוצע.

מספר אנטיגנים בקטריאליים זוהו בתרביות של סטרפטוקוקים Group A. בעיקרם חלבונים אלה הם אנזימים הכוללים את streptolysin O, סטרפטוקינאזה, hyaluronidase ו-4 סוגי דאוקסיריבונוקלאזות
DNAse A, B, C and D)) כמו גם nicotiamide adenine nucleotidase. הדבקות עם סטרפטוקוקוס מ-group A, הן ייחודיות כיוון שהן יכולות להוות תרחישי פתיחה לסיבוכים לא-מוגלתיים כגון rheumatic fever או glomerulonephritis. נתונים עדכניים מצביעים על כך ש-rheumatic fever קשור עם הדבקה עם מספר סרוטיפים ראומטוגנים כמו M19 ,M18 ,M6 ,M5 ,M3 ,M1, ואילו glomerulonephritis כרוך בהדבקה עם הסרוטיפים הנפריטוגנים M60, M59, M57, M49, M12, M2.

סטרפטוקוקוס (Group A) הידוע גם כ-Streptococcus pyogenes, גורם לספקטרום רחב של תחלואה, ומהווה את הגורם החיידקי העיקרי לתרחישים של [[דלקת גרון]] (pharyngitis) או של [[דלקת שקדים תפליטית]] (exudative tonsillitis). מבחינה אפידמיולוגית פרינגיטיס על רקע סטרפטקוקאלי מייצגת 1-2% מכלל הביקורים אצל רופאי משפחה, ונכלל ברשימת 20 התחלואות השכיחות ביותר. לעומת זאת, ההתרחשות של rheumatic fever poststreptococcal pharyngitis היא /100,0001-2. הגיל הרווח יותר לסוג הדבקות זה הוא מתחת ל-20 שנה, והוא נדיר יחסית בילדים מתחת גיל 3 שנים. ההעברה של החיידק הפתוגני היא על ידי מגע ישיר עם הפרשות אף, כאשר מבחינה עונתית השכיחות הגדולה של ההדבקות מתרחשת בחורף או בתחילת האביב. Streptococcus pyogenes הוא חיידק נקד גראם-חיובי.

בעקבות תרחיש של פיודרמה סטרפטוקוקלית שהיא מפגע דלקתי הנוטה להתפשט בשטחי עור נרחבים, העלול לגרום ל-poststreptococcal glomerulonephritis, בפחות מ-30% מהמקרים החולים מפתחים רמות טיטר מוגברות של ASO. לעומת זאת, רוב החולים בתרחיש המתואר מפתחים רמות טיטר מוגברות של anti-DNAse-B הנותרות מוגברות חודשים אחדים. לכן, המבדק הסרולוגי האחרון הוא המועדף. כמו כן, בגלל הנטייה למוגברות ממושכת, מבדק anti-DNAse-B יכול להיות לעזר באבחון של הסיבוכים המאוחרים של מחלה נוירולוגית הידועה כ-"מחולית סידנהם" (‏Sydenham`s chorea‏) או גם כ-St. Vitus dance.

ידוע שנוגדנים שנוצרו נגד אנטיגנים של החיידק Streptococcus ‎pyogenes מגיבים גם ‏עם אנטיגנים ברקמת הלב, במפרקים ובמוח, וגורמים לפיכך לדלקות בלב ‏ובמסתמיו, לדלקת פרקים כרונית ולמחלה הנוירולוגית מחולית ‏סידנהם, שהיא המפגע הנוירולוגי העיקרי שמקורה בדלקת פרקים חריפה. המחולית ‏מאופיינת על-ידי תנועות לא רצוניות (כעין תנועת מחול), וכן על ידי הפרעות נוירו-פסיכיאטריות כמו [[הפרעה טורדנית-‏כפייתית]] (‏OCD‏), היפראקטיביות וחוסר יציבות רגשית. מחלה זו מתפוגגת בדרך כלל תוך 2-3 חודשי ללא תופעות לוואי לא רצויות לטווח זמן ארוך. זו דוגמה לחיקוי מולקולארי בו פעילות ‏חיסונית מצולבת (cross reactivity) בין החיידק לרקמות המאכסן הגורמת ל[[דלקת פרקים]], דלקת ברקמת הלב, בכליות ופגיעה נוירולוגית (Bisno וחב' ב-Principles Prac Infect Dis משנת 2009, ו-Ayoub ו-Harden ב-Manual Clin Lab Immunol משנת 1997).

ערכי הנורמה של בדיקת טיטר הנוגדנים anti-DNAse-B יכולים להשתנות משמעותית עם הגיל והאזור הגיאוגרפי, והם אף עלול להראות סטיות של 15-20% באוכלוסייה בריאה באותו אזור גיאוגרפי בעיקר באסיה ובאפריקה (Karmarker וחב' ב-Indian J Med Res משנת 2004, ו-Mhalu ו-Matre ב-East African Med J משנת 1995). מחקר של Ayoub וחב' ב-Clin Diagn Lab Immunol משנת 2003, הצביע על שינויים ברמת הנוגדנים כנגד סטרפטוקוקוס Group A בדמם של נבדקים עם ובלי rheumatic fever באזורים גיאוגרפיים עם רמות גבוהות ונמוכות של המחלה.

ערכי טיטר מוגברים מוצאים בערך ב-80% מהמקרים של דלקת מפרקים חריפה (acute rheumatic fever). ערכים מוגברים של טיטר נוגדנים כנגד DNAse B, יכולים לסייע באבחון של acute rheumatic fever ב-20% מהנבדקים בהם אין ערכים מוגברים של הטיטר של ASO. יצוין שרמות אנטי-DNAse-B, עולות לאט יותר מאשר אלה של ASO, ומגיעים לשיא רק 4-8 שבועות לאחר ההדבקה. נוגדנים כנגד DNAse גם דועכים הרבה יותר לאט בהשוואה ל-ASO, והם נותרים מוגברים למשך מספר חודשים.

{| class="wikitable"
|-
|+ קריטריונים להתנהלות במקרים של כאבי גרון{{הערה|שם=הערה1|מומלץ על ידי ה-CDC, ע"י ה- American College of Physicians (ACP) ו- American Academy of Family Physicians (AAFP) , אך לא ע"יInfectious Diseases Society of America (IDSA) או על ידי American Heart Association (AHA) .}}
|-
! קריטריונים !! נקודות
|-
| היעדר שיעול || 1
|-
| נפיחות או רגשות של קשריות ה-aneterior cervical || 1
|-
| טמפרטורת גוף מעל 38 מעלות צלזסיוס || 1
|-
| אקסודט טונסילרי או נפיחות השקדים || 1
|-
|colspan="2"| '''גיל'''
|-
| 3-14 שנה || 1
|-
| 15-44 שנה || 0
|-
| מעל גיל 45 || -1
|-
|'''ניקוד מצטבר'''||'''התנהלות מוצעת'''
|-
|≤0|| אין צורך בבדיקה
|-
|1||סיכון נמוך מ-10%, ניתן לבצע את הבדיקה רק אם קיים חשש מובהק או מגע לאחרונה עם חולה
|-
|2-3||יש לבצע משטח ותרבית גרון ואת הבדיקה
|-
|>4||יש לטפל ללא דיחוי בלי ביצוע הבדיקה
|}

==התוויות לבדיקות מעבדה==

התוויות לביצוע בדיקת anti-DNAse-B ו/או בדיקת ASO: כאב גרון, חום ו-lymphadenopathy.

מבדק מהיר לזיהוי סטרפטוקוקוס (RST או rapid strep test, וכן RADT או rapid antigen detection test), הוא מבדק זיהוי מהיר הנמצא בשימוש נרחב בקליניקות לסייע באבחון של דלקת גרון בקטריאלית, שנגרמה על ידי group A streptococci, המכונה לעתים strep throat. מבדק זה מסייע לקבוע האם יש לנקוט בטיפול אנטיביוטי (Mersch ב-MedicineNet.com משנת 2015). קיימים מספר מבדקים מהירים, תוך שימוש בטכנולוגיות שונות הפועלות כולן על בסיס גילוי group A streptococci בגרון על ידי תגובה עם אנטיגנים ספציפיים לחיידק זה על פני מטוש (swab) הגרון.

ברוב המקרים פרינגיטיס נגרמת על ידי הדבקה נגיפית, אם כי ב-20-40% ממקרי פרינגיטיס בילדים, וב-5-15% מהמקרים הללו במבוגרים הדבקה חיידקית היא הגורם למפגע (Matthys וחב' ב-Annals Fam Med משנת 2007). כיוון שהסיבה העיקרית של פרינגיטיס בקטריאלי היא group A streptococci, נוכחות פתוגן זה בגרונו של המטופל היא תנאי נחוץ להתחלת טיפול אנטיביוטי (Danchin וחב' ב- Med J Australia משנת 2002). אמנם פרינגיטיס על רקע group A streptococci, היא הדבקה המתפוגגת מעצמה תוך שבוע ללא תרופות, אך טיפול אנטיביוטי עשוי לקצר את משך המפגע ולהפחית מחומרתו, כמו גם את הסיבוכים הנלווים החמורים. ליישום של RST, יש גם חשיבות בהקשר של בריאות הציבור, שכן שימוש אנטיביוטי לא נאות, בפרט במקרים של פרינגיטיס נגיפי, עלול להגביר את תופעת העמידות לאנטיביוטיקה. בארה"ב יש דגש יותר מובהק על ביצוע RST מאשר באירופה.

תרבית חיידקים על ידי משטח גרון היא שיטה אמינה ולא יקרה שיכולה לשמש חלופה נאותה ל-RST, והיא בעלת רגישות וספציפיות גבוהות. אלא שתשובת המעבדה דורשת 48 שעות לביצוע מבדק תרבית בעוד שתשובת RST יכולה להתקבל תוך דקות אחדות.

==מהלך בדיקת RST==

אוספים בערת מטוש חומר רירי (mucus) מגרונו של הנבדק. ברוב שיטות RST דגימת הריר נחשפת בריאגנט של ערכת הבדיקה לנוגדנים הנקשרים ספציפית לאנטיגנים של Group A Stretococcus. במקרה של תוצאה חיובית מתקבלת ריאקציה נראית לעין. ישנם 3 סוגים עיקריים של RST: ראשית, latex fixation test שפותח בשנות ה-80 וכעת כבר אינו בשימוש. בשיטה זו חרוזי latex המכוסים באנטיגנים של החיידק, עוברים אגלוטינציה בולטת לעין בנוכחות נוגדנים כנגד החיידק אם אלה אמנם נוכחים. שנית, lateral flow test, שהיא כיום שיטת RST בשימוש הנרחב ביותר. הדגימה באה במגע עם פילם של ניטרוצלולוז, ואם אנטיגנים של Group A Stretococcus מצויים, הם ינדדו על פני הפילם ליצירה של "קשת" נראית לעין במקום המפגש של אנטיגנים אלה עם הנוגדן המסומן הרלוונטי. שלישית, השיטה העדכנית ביותר אך גם היקרה יותר של optical immunoassay, בה מערבבים את הדגימה עם נוגדנים מסומנים ובהמשך עם מצע מיוחד על פני פילם המשנה צבעו בהתאם לנוכחות או לחסר של אנטיגן של החיידק (Cohen וחב' ב-Cochrane Database Syst Rev משנת 2013).

==פירוש התוצאות==

הספציפיות של RST לנוכחות group A streptococci היא לפחות 95%, עם מספר מחקרים המצביעים על ספציפיות קרובה יותר ל-100% (על פי Cohenוחב' ב-J Pediatr משנת 2014). יחד עם זאת, 5-20% נושאים group A streptococci בגרונם ללא תסמינים של הדבקה, כך שנוכחות החיידק בנבדקים עם פרינגיטיס אינה מוכיחה שחיידק זה אחראי להדבקה. הרגישות של ה-lateral flow test נמוכה במקצת ועומדת על 65-80%, ולכן תוצאה שלילית במבדק זה אינה יכולה לשמש לשלילת פריגיטיס על רקע group A streptococci, מה שמהווה חסרון בהשוואה למבדק תרבית בו הרגישות היא 90-95%. השיטה העדכנית יותר של optical immunoassay היא בעלת רגישות של 94% (על פי Gerber וחב' ב-J Am Med Assoc משנת 1997). ההנחיות בארה"ב ממליצות על ביצוע תרבית חיידקים במקרה של תוצאת RST שלילית (Gerber וחב' ב-Circulation משנת 2009), בעוד שההנחיות האירופיות ממליצות על הסתמכות מוחלטת על תוצאת RST (על פי Pelucci וחב' ב-Clin Microbiol Infect משנת 2012).

*בדיקת תרבית ל-Group A Streptococcus היא ה-Gold standard לזיהוי הדבקה בסוג זה של סטרפטוקוקוס, וכמקובל היא מבוצעת כאשר RST מתקבל שלילי והחשד לנוכחות של סטרפטוקוקוס בדלקת הגרון הוא גבוה. רגישות שיטה זו 90-95%.

*מדידת anti-DNAse-B בשיטה נפלומטרית כמותית היא השיטה המועדפת ברוב התסריטים הקליניים, ומהווה את המבדק היעיל ביותר במקרים של מחולית (chorea) ראומטית כיוון שהטיטר הנבדק נותר מוגבר לזמן ארוך יותר. אחת ממגבלות השיטה הוא שטיפול אנטיביוטי מפחית את טיטר הנוגדנים, לכן יש סבורים שתרבית גרון צריכה להתבצע בעת ובעונה אחת. בדיקת anti DNAse-B טובה לאישור של הדבקה בזמן אמת או הדבקה שהתרחשה לאחרונה עםgroup A streptococci בנבדקים החשודים לסיבוכים לא מוגלתיים כגון גלומרולונפריטיס חריפה או rheumatic fever חריפה. ההמלצה היא לבדוק נוכחות נוגדנים אלה בדגימות של מטופל בפאזה החריפה של המפגע וכן בשלב ההחלמה ממנו, בהפרש של כ-14 יום בין 2המבדקים. הנוגדנים כנגד DNAse-B יכולים לשרוד בנסיוב למשך תקופה של 2-3 חודשים לאחר ההדבקה. תגובת הנוגדנים כנגד DNAse-B מתחילה בדרך כלל מאוחר יותר מהופעת נוגדנים כנגד ASO, אך היא מתגלה באחוז גבוה יותר של נבדקים, והיא מתגלה לפרק זמן ממושך יותר בהשוואה ל-מבדק ASO.

*מדידת ASO בשיטה נפלומטרית כמותית שיטה המאוששת בהדבקה קודמת על ידי group A streptococcus, הנחשדת במטופלים עם תסמינים של גלומרולונפריטיס או של Rheumatic fever. נהוג לבצע בדיקה זו במשולב עם anti-DNAse-B. שיטה זו מודדת יצירת נוגדנים כנגד האנזים האריתרו-ליטי streptolysin O המופרש ספציפי על ידי חיידק זה. מגבלותיה שאינה יעילה באבחון הפתוגן בהדבקות עור. כמו כן, טיפול אנטיביוטי מפחית את רגישות השיטה. יש המדגישים את הצורך לבצע תרבית גרון במקביל, כמו גם לבצע שתי בדיקות עוקבות של anti ASO בהפרש של שבועיים בשלב החריף של המפגע ובשלב ההחלמה ממנו. נוגדני ASO שורדים בערך 6 שבועות לאחר ההדבקה. מגבלות נוספות של מבדק ASO עלולות להיווצר כאשר יש בנסיוב רמה גבוהה של β lipoproteins שעלולים לגרום לתוצאה false-positive. בנוסף, גם סטרואידים המדכאים את מערכת החיסון יכולים לדכא יצירת ASO. בהערכה של מטופלים עם acute rheumatic fever, ממליץ ה-AHA דווקא על ביצוע בדיקת ASO על פני בדיקת anti-DNAse-B.

מבחן streptozyme משמש כבדיקת סקר של נוגדנים לאנטיגנים הסטרפטןקוקליים NADase, DNAse, סטרפטוקינאז, streptolysin O ו-hyaluronidase. מבדק זה שימושי בהערכה של חשד למחלה בתר-סטרפטוקוקלית כגון rheumatic fever לאחר הדבקה עם Streptococcus pyogenes. יתרון מבדק זה על פני שני המבדקים האחרים, הוא ביכולתו לגלות מספר נוגדנים לאטיגנים שונים, באופן מהיר, ובכך שהתוצאות המתקבלות אינן מושפעות מגורמים שונים המשפיעים על המבדקים האחרים. חולשתו של מבדק streptozyme שהוא אינו רגיש בילדים כמו במבוגרים, וכן בכך שלעתים הוא לא מגלה נוגדנים לאחד האנטיגנים שהוזכרו ללא סיבה ברורה. גם במבדק זה עלייה סריאלית בטיטר הנוגדנים משמעותית יותר קביעה בודדה.

==משמעות של תוצאות הבדיקה==

#ערכים של 183-240 יחידות/מ"ל נחשבים לערכי anti-DNAse-B מוגברים במקצת;
#ערכים של 240-360 יחידות/מ"ל נחשבים לערכי anti-DNAse-B מוגברים;
#ערכים של 360-640 יחידות/מ"ל נחשבים לערכי anti-DNAse-B מוגברים משמעותית;
#ערכים של מעל 640 יחידות/מ"ל נחשבים לערכי anti-DNAse-B מוגברים מאוד.

== הוראות לביצוע הבדיקה ==

אין צורך בהכנות מיוחדות כולל צום. את הדם יש לדגום במבחנה כימית (פקק אדום) או במבחנת ג'ל. יש לסרכז את הדגימה תוך 30 דקות מנטילת הדם, ולקרר או להקפיא מיידית. יש להעביר את דגימת הדם למעבדה מקוררת בתוך קרח כתוש או בכלי עם קרחומים. להעברה למעבדה מרוחקת, מומלץ שמבחנת הנסיוב תוכנס לכלי עם קרח יבש. הדגימה יציבה למשך 48 שעות בטמפרטורת החדר, למשך 8 ימים בקירור,‏ או למשך 90 יום בהקפאה. אין לקבל דגימות המגיעות למעבדה לא מקוררות, וכן יש לפסול דגימות המוליטיות מאוד או ליפמיות מאוד.

==ביבליוגרפיה==

{{הערות שוליים}}

==ראו גם==

* [[מדריך בדיקות מעבדה|חזרה לדף מדריך בדיקות מעבדה]]
* [[מחלות בקטריאליות/ זיהום בקטריאלי-אלח-דם|בדיקות מעבדה - מחלות בקטריאליות/ זיהום בקטריאלי-אלח-דם]]
* [[מחלות ריאומטיות|בדיקות מעבדה - מחלות ריאומטיות]]

{{ייחוס|[[משתמש:בן עמי סלע|פרופ' בן-עמי סלע]]}}

[[קטגוריה:בדיקות מעבדה - זיהום בקטריאלי]]
[[קטגוריה:בדיקות מעבדה: כימיה בדם]]

נוגדנים ל-Anti DNAse B antibodies - DNAse B

2015-11-23T04:34:24Z

בן עמי סלע:

{{בדיקת מעבדה
|שם עברי= נוגדנים ל-DNAse B
|שם לועזי= Anti DNAse B antibodies
|קיצור=AND-B; ADB; ADNase-B; Antideoxyribonuclease B titer; Streptococcal Antibodies, DNB.
|תמונה=
|כיתוב תמונה=
|מעבדה=מיקרוביולוגיה בדם
|תחום=ברור הדבקה על ידי group A Streptococcus.
|יחידות מדידה=
|טווח ערכים תקין=במבוגרים מתחת ל-85 יחידות/מ"ל; בילדים בגיל בית הספר מתחת ל-171 יחידות/מ"ל; לילדים בגיל נמוך מ-6 שנים-מתחת ל-61 יחידות/מ"ל.
|יוצר הערך=[[משתמש:בן עמי סלע|פרופ' בן-עמי סלע]]
|אחראי הערך=
}}
== משמעות הבדיקה ==

בדיקת anti-DNAse-B יכולה לסייע באבחון הדבקה נוכחית בסטרפטוקוקוס, בבירור הסיבה לגלומרולונפריטיס כמו גם ל[[קדחת השיגרון]] (rheumatic fever). בדרך כלל מתבצעת בדיקה זו במקביל לבדיקת ASO, שנועדה אף היא לגלות הדבקות קודמות בסטרפטוקוקוס. ברוב המקרים, הדבקות סטרפטוקוקאליות של הגרון והעור, מזוהות ומטופלות ב[[אנטיביוטיקה]], וההדבקה נעלמת. במקרים בהם הדבקות אלה אינן גורמות לתסמינים הניתנים לזיהוי, או שהם אינם מאובחנות, סיבוכים כגון אלה של rheumatic fever או glomerulonephritis עלולים להתפתח בחלק מהמטופלים ובעיקר בילדים צעירים.

כאמור אי-אבחון וטיפול ראוי, עלול לגרום לכך שדלקות גרון על ידי group A streptococcus עלולה לגרום ל- rheumatic fever או ל-glomerulonephritis, בעוד שדלקות סטרפטוקוקליות של העור עלולה לגרום ל- glomerulonephritis. מבדק ASO מתבצע אם במטופל מופיעים תסמינים המרמזים על אחד משני הסיבוכים האמורים, או במטופל עם היסטוריה מהזמן הקרוב של דלקת גרון, הדבקות עור טיפוסיות, או עם הדבקה סטרפטוקוקלית מוכחת.

מבדק anti-DNAse-B יכול להיות מוזמן כשלעצמו, או במשולב עם מבחן של נוגדן אנטי-סטרפטוקוקלי אחר, דוגמת anti-hyaluronidase, אם מבדק ASO מתקבל שלילי. ב-10-15% מבין אלה עם סיבוך בתר-סטרפטוקוקלי לא תתקבל תוצאה מוגברת של ASO, אך יכולה להתקבל תוצאה מוגברת של טיטר של anti-DNAse-B או של antihyaluronidase. נתונים אלה נכונים בפרט במקרים של glomerulonephritis שנכרך בהדבקה סטפרטוקוקלית קודמת של העור.

אם לנבדק יש רמה גבוהה או כזו בקו-עלייה של טיטר ASO, אין צורך למעשה לבצע בדיקת anti-DNAse-B. יחד עם זאת, אם רמת ASO שלילית, בדיקת anti-DNAse-B יכולה להיות בעלת ערך בזיהוי הדבקות קודמות של סטרפטוקוקוס, בנבדקים שאינם מייצרים ASO, או כאלה המייצרים כמויות קטנות שלו. הללו מתבצעות במשולב, ניתן לזהות למעלה מ-90% מהמקרים של הדבקות סטרפטוקוקליות שהתרחשו ולא אובחנו בזמן אמת. תוצאות שליליות במבדק נוגדנים כנגד DNAse-B ובמבדק ASO או טיטר נמוך מאוד של נוגדנים בשני מבדקים אלה, פירושן שהנבדק בסבירות גבוהה לא הודבק לאחרונה על ידי Group A streptococci. מסקנה זו נכונה במיוחד אם תוצאות אלה התקבלו בבדיקות חוזרות בהפרש של שבועיים.

הדבקות סטרפטוקוקליות יכולת להיגרם על ידי מספר זנים של streptococcus והם זני A, B, C, D ו-G המזוהים על ידי דרגת אלימותם והמבנה כימי של שטח הפנים. כל אחד מ-5 זנים אלה גורם לסוגי הדבקה שונים ולתסמינים שונים הנגרמים.

Group A streptococcus הוא הזן האלים ביותר באדם, ובין היתר גורם ל-Strep throat, טונסיליטיס, פצעים מהדבקות עור, אלח דם (septicemia), [[שנית]] (scarlet fever), [[שפעת]], [[דלקת פרקים]], מחולית ע"ש Sydenham וגלומרולונפריטיס.

האנזים DNAse B מיוצר על ידי כמעט כל הסרוטיפים של β hemolytic Group A , אך באופן פחות משמעותי ע"י זנים ב- Group C ו-Group G של Streptococcus. אלה הנדבקים עם זנים אלה של סטרפטוקוקוס מייצרים נוגדנים כנגד האנזים DNAse B. מבחנים סרולוגיים לנוכחות נוגדנים ל-DNAse B הם לעזר באישוש האבחון של הדבקה סטרפטוקוקאלית בעיקר בגרון ובעור. מבחן זה הוא למעשה מבחן של נטרול פעילות האנזים, ונמדדת היכולת של נוגדנים ספציפיים לעכב את הדה-פולימריזציה של DNA. במבדק נבחנת יכולת העיכוב של מהולים סריאליים של הנסיוב הנבדק. הערך ההוֹפְכי (רציפרוקלי) של המהול הגבוה ביותר שעדיין מעכב את פעילות האנזים הוא הטיטר הנחשב.

התרחישים של גלומרולונפריטיס ושל rheumatic fever יכולים להופיע במהלך ההדבקה הסטרפטוקוקלית, או לאחר תקופה חביון (latency) לאחר הדבקה כזו במהלכה הנדבק חסר תסמינים. תקופת חביון זו לגבי גלומרולונפריטיס נמשכת בערך 10 ימים, ובמקרה של rheumatic fever תקופת החביון היא בת 20 יום בממוצע.

מספר אנטיגנים בקטריאליים זוהו בתרביות של סטרפטוקוקים Group A. בעיקרם חלבונים אלה הם אנזימים הכוללים את streptolysin O, סטרפטוקינאזה, hyaluronidase ו-4 סוגי דאוקסיריבונוקלאזות
DNAse A, B, C and D)) כמו גם nicotiamide adenine nucleotidase. הדבקות עם סטרפטוקוקוס מ-group A, הן ייחודיות כיוון שהן יכולות להוות תרחישי פתיחה לסיבוכים לא-מוגלתיים כגון rheumatic fever או glomerulonephritis. נתונים עדכניים מצביעים על כך ש-rheumatic fever קשור עם הדבקה עם מספר סרוטיפים ראומטוגנים כמו M19 ,M18 ,M6 ,M5 ,M3 ,M1, ואילו glomerulonephritis כרוך בהדבקה עם הסרוטיפים הנפריטוגנים M60, M59, M57, M49, M12, M2.

סטרפטוקוקוס (Group A) הידוע גם כ-Streptococcus pyogenes, גורם לספקטרום רחב של תחלואה, ומהווה את הגורם החיידקי העיקרי לתרחישים של [[דלקת גרון]] (pharyngitis) או של [[דלקת שקדים תפליטית]] (exudative tonsillitis). מבחינה אפידמיולוגית פרינגיטיס על רקע סטרפטקוקאלי מייצגת 1-2% מכלל הביקורים אצל רופאי משפחה, ונכלל ברשימת 20 התחלואות השכיחות ביותר. לעומת זאת, ההתרחשות של rheumatic fever poststreptococcal pharyngitis היא /100,0001-2. הגיל הרווח יותר לסוג הדבקות זה הוא מתחת ל-20 שנה, והוא נדיר יחסית בילדים מתחת גיל 3 שנים. ההעברה של החיידק הפתוגני היא על ידי מגע ישיר עם הפרשות אף, כאשר מבחינה עונתית השכיחות הגדולה של ההדבקות מתרחשת בחורף או בתחילת האביב. Streptococcus pyogenes הוא חיידק נקד גראם-חיובי.

בעקבות תרחיש של פיודרמה סטרפטוקוקלית שהיא מפגע דלקתי הנוטה להתפשט בשטחי עור נרחבים, העלול לגרום ל-poststreptococcal glomerulonephritis, בפחות מ-30% מהמקרים החולים מפתחים רמות טיטר מוגברות של ASO. לעומת זאת, רוב החולים בתרחיש המתואר מפתחים רמות טיטר מוגברות של anti-DNAse-B הנותרות מוגברות חודשים אחדים. לכן, המבדק הסרולוגי האחרון הוא המועדף. כמו כן, בגלל הנטייה למוגברות ממושכת, מבדק anti-DNAse-B יכול להיות לעזר באבחון של הסיבוכים המאוחרים של מחלה נוירולוגית הידועה כ-"מחולית סידנהם" (‏Sydenham`s chorea‏) או גם כ-St. Vitus dance.

ידוע שנוגדנים שנוצרו נגד אנטיגנים של החיידק Streptococcus ‎pyogenes מגיבים גם ‏עם אנטיגנים ברקמת הלב, במפרקים ובמוח, וגורמים לפיכך לדלקות בלב ‏ובמסתמיו, לדלקת פרקים כרונית ולמחלה הנוירולוגית מחולית ‏סידנהם, שהיא המפגע הנוירולוגי העיקרי שמקורה בדלקת פרקים חריפה. המחולית ‏מאופיינת על-ידי תנועות לא רצוניות (כעין תנועת מחול), וכן על ידי הפרעות נוירו-פסיכיאטריות כמו [[הפרעה טורדנית-‏כפייתית]] (‏OCD‏), היפראקטיביות וחוסר יציבות רגשית. מחלה זו מתפוגגת בדרך כלל תוך 2-3 חודשי ללא תופעות לוואי לא רצויות לטווח זמן ארוך. זו דוגמה לחיקוי מולקולארי בו פעילות ‏חיסונית מצולבת (cross reactivity) בין החיידק לרקמות המאכסן הגורמת ל[[דלקת פרקים]], דלקת ברקמת הלב, בכליות ופגיעה נוירולוגית (Bisno וחב' ב-Principles Prac Infect Dis משנת 2009, ו-Ayoub ו-Harden ב-Manual Clin Lab Immunol משנת 1997).

ערכי הנורמה של בדיקת טיטר הנוגדנים anti-DNAse-B יכולים להשתנות משמעותית עם הגיל והאזור הגיאוגרפי, והם אף עלול להראות סטיות של 15-20% באוכלוסייה בריאה באותו אזור גיאוגרפי בעיקר באסיה ובאפריקה (Karmarker וחב' ב-Indian J Med Res משנת 2004, ו-Mhalu ו-Matre ב-East African Med J משנת 1995). מחקר של Ayoub וחב' ב-Clin Diagn Lab Immunol משנת 2003, הצביע על שינויים ברמת הנוגדנים כנגד סטרפטוקוקוס Group A בדמם של נבדקים עם ובלי rheumatic fever באזורים גיאוגרפיים עם רמות גבוהות ונמוכות של המחלה.

ערכי טיטר מוגברים מוצאים בערך ב-80% מהמקרים של דלקת מפרקים חריפה (acute rheumatic fever). ערכים מוגברים של טיטר נוגדנים כנגד DNAse B, יכולים לסייע באבחון של acute rheumatic fever ב-20% מהנבדקים בהם אין ערכים מוגברים של הטיטר של ASO. יצוין שרמות אנטי-DNAse-B, עולות לאט יותר מאשר אלה של ASO, ומגיעים לשיא רק 4-8 שבועות לאחר ההדבקה. נוגדנים כנגד DNAse גם דועכים הרבה יותר לאט בהשוואה ל-ASO, והם נותרים מוגברים למשך מספר חודשים.

{| class="wikitable"
|-
|+ קריטריונים להתנהלות במקרים של כאבי גרון{{הערה|שם=הערה1|מומלץ על ידי ה-CDC, ע"י ה- American College of Physicians (ACP) ו- American Academy of Family Physicians (AAFP) , אך לא ע"יInfectious Diseases Society of America (IDSA) או על ידי American Heart Association (AHA) .}}
|-
! קריטריונים !! נקודות
|-
| היעדר שיעול || 1
|-
| נפיחות או רגשות של קשריות ה-aneterior cervical || 1
|-
| טמפרטורת גוף מעל 38 מעלות צלזסיוס || 1
|-
| אקסודט טונסילרי או נפיחות השקדים || 1
|-
|colspan="2"| '''גיל'''
|-
| 3-14 שנה || 1
|-
| 15-44 שנה || 0
|-
| מעל גיל 45 || -1
|-
|'''ניקוד מצטבר'''||'''התנהלות מוצעת'''
|-
|≤0|| אין צורך בבדיקה
|-
|1||סיכון נמוך מ-10%, ניתן לבצע את הבדיקה רק אם קיים חשש מובהק או מגע לאחרונה עם חולה
|-
|2-3||יש לבצע משטח ותרבית גרון ואת הבדיקה
|-
|>4||יש לטפל ללא דיחוי בלי ביצוע הבדיקה
|}

==התוויות לבדיקות מעבדה==

התוויות לביצוע בדיקת anti-DNAse-B ו/או בדיקת ASO: כאב גרון, חום ו-lymphadenopathy.

מבדק מהיר לזיהוי סטרפטוקוקוס (RST או rapid strep test, וכן RADT או rapid antigen detection test), הוא מבדק זיהוי מהיר הנמצא בשימוש נרחב בקליניקות לסייע באבחון של דלקת גרון בקטריאלית, שנגרמה על ידי group A streptococci, המכונה לעתים strep throat. מבדק זה מסייע לקבוע האם יש לנקוט בטיפול אנטיביוטי (Mersch ב-MedicineNet.com משנת 2015). קיימים מספר מבדקים מהירים, תוך שימוש בטכנולוגיות שונות הפועלות כולן על בסיס גילוי group A streptococci בגרון על ידי תגובה עם אנטיגנים ספציפיים לחיידק זה על פני מטוש (swab) הגרון.

ברוב המקרים פרינגיטיס נגרמת על ידי הדבקה נגיפית, אם כי ב-20-40% ממקרי פרינגיטיס בילדים, וב-5-15% מהמקרים הללו במבוגרים הדבקה חיידקית היא הגורם למפגע (Matthys וחב' ב-Annals Fam Med משנת 2007). כיוון שהסיבה העיקרית של פרינגיטיס בקטריאלי היא group A streptococci, נוכחות פתוגן זה בגרונו של המטופל היא תנאי נחוץ להתחלת טיפול אנטיביוטי (Danchin וחב' ב- Med J Australia משנת 2002). אמנם פרינגיטיס על רקע group A streptococci, היא הדבקה המתפוגגת מעצמה תוך שבוע ללא תרופות, אך טיפול אנטיביוטי עשוי לקצר את משך המפגע ולהפחית מחומרתו, כמו גם את הסיבוכים הנלווים החמורים. ליישום של RST, יש גם חשיבות בהקשר של בריאות הציבור, שכן שימוש אנטיביוטי לא נאות, בפרט במקרים של פרינגיטיס נגיפי, עלול להגביר את תופעת העמידות לאנטיביוטיקה. בארה"ב יש דגש יותר מובהק על ביצוע RST מאשר באירופה.

תרבית חיידקים על ידי משטח גרון היא שיטה אמינה ולא יקרה שיכולה לשמש חלופה נאותה ל-RST, והיא בעלת רגישות וספציפיות גבוהות. אלא שתשובת המעבדה דורשת 48 שעות לביצוע מבדק תרבית בעוד שתשובת RST יכולה להתקבל תוך דקות אחדות.

==מהלך בדיקת RST==

אוספים בערת מטוש חומר רירי (mucus) מגרונו של הנבדק. ברוב שיטות RST דגימת הריר נחשפת בריאגנט של ערכת הבדיקה לנוגדנים הנקשרים ספציפית לאנטיגנים של Group A Stretococcus. במקרה של תוצאה חיובית מתקבלת ריאקציה נראית לעין. ישנם 3 סוגים עיקריים של RST: ראשית, latex fixation test שפותח בשנות ה-80 וכעת כבר אינו בשימוש. בשיטה זו חרוזי latex המכוסים באנטיגנים של החיידק, עוברים אגלוטינציה בולטת לעין בנוכחות נוגדנים כנגד החיידק אם אלה אמנם נוכחים. שנית, lateral flow test, שהיא כיום שיטת RST בשימוש הנרחב ביותר. הדגימה באה במגע עם פילם של ניטרוצלולוז, ואם אנטיגנים של Group A Stretococcus מצויים, הם ינדדו על פני הפילם ליצירה של "קשת" נראית לעין במקום המפגש של אנטיגנים אלה עם הנוגדן המסומן הרלוונטי. שלישית, השיטה העדכנית ביותר אך גם היקרה יותר של optical immunoassay, בה מערבבים את הדגימה עם נוגדנים מסומנים ובהמשך עם מצע מיוחד על פני פילם המשנה צבעו בהתאם לנוכחות או לחסר של אנטיגן של החיידק (Cohen וחב' ב-Cochrane Database Syst Rev משנת 2013).

==פירוש התוצאות==

הספציפיות של RST לנוכחות group A streptococci היא לפחות 95%, עם מספר מחקרים המצביעים על ספציפיות קרובה יותר ל-100% (על פי Cohenוחב' ב-J Pediatr משנת 2014). יחד עם זאת, 5-20% נושאים group A streptococci בגרונם ללא תסמינים של הדבקה, כך שנוכחות החיידק בנבדקים עם פרינגיטיס אינה מוכיחה שחיידק זה אחראי להדבקה. הרגישות של ה-lateral flow test נמוכה במקצת ועומדת על 65-80%, ולכן תוצאה שלילית במבדק זה אינה יכולה לשמש לשלילת פריגיטיס על רקע group A streptococci, מה שמהווה חסרון בהשוואה למבדק תרבית בו הרגישות היא 90-95%. השיטה העדכנית יותר של optical immunoassay היא בעלת רגישות של 94% (על פי Gerber וחב' ב-J Am Med Assoc משנת 1997). ההנחיות בארה"ב ממליצות על ביצוע תרבית חיידקים במקרה של תוצאת RST שלילית (Gerber וחב' ב-Circulation משנת 2009), בעוד שההנחיות האירופיות ממליצות על הסתמכות מוחלטת על תוצאת RST (על פי Pelucci וחב' ב-Clin Microbiol Infect משנת 2012).

*בדיקת תרבית ל-Group A Streptococcus היא ה-Gold standard לזיהוי הדבקה בסוג זה של סטרפטוקוקוס, וכמקובל היא מבוצעת כאשר RST מתקבל שלילי והחשד לנוכחות של סטרפטוקוקוס בדלקת הגרון הוא גבוה. רגישות שיטה זו 90-95%.

*מדידת anti-DNAse-B בשיטה נפלומטרית כמותית היא השיטה המועדפת ברוב התסריטים הקליניים, ומהווה את המבדק היעיל ביותר במקרים של מחולית (chorea) ראומטית כיוון שהטיטר הנבדק נותר מוגבר לזמן ארוך יותר. אחת ממגבלות השיטה הוא שטיפול אנטיביוטי מפחית את טיטר הנוגדנים, לכן יש סבורים שתרבית גרון צריכה להתבצע בעת ובעונה אחת. בדיקת anti DNAse-B טובה לאישור של הדבקה בזמן אמת או הדבקה שהתרחשה לאחרונה עםgroup A streptococci בנבדקים החשודים לסיבוכים לא מוגלתיים כגון גלומרולונפריטיס חריפה או rheumatic fever חריפה. ההמלצה היא לבדוק נוכחות נוגדנים אלה בדגימות של מטופל בפאזה החריפה של המפגע וכן בשלב ההחלמה ממנו, בהפרש של כ-14 יום בין 2המבדקים. הנוגדנים כנגד DNAse-B יכולים לשרוד בנסיוב למשך תקופה של 2-3 חודשים לאחר ההדבקה. תגובת הנוגדנים כנגד DNAse-B מתחילה בדרך כלל מאוחר יותר מהופעת נוגדנים כנגד ASO, אך היא מתגלה באחוז גבוה יותר של נבדקים, והיא מתגלה לפרק זמן ממושך יותר בהשוואה ל-מבדק ASO.

*מדידת ASO בשיטה נפלומטרית כמותית שיטה המאוששת בהדבקה קודמת על ידי group A streptococcus, הנחשדת במטופלים עם תסמינים של גלומרולונפריטיס או של Rheumatic fever. נהוג לבצע בדיקה זו במשולב עם anti-DNAse-B. שיטה זו מודדת יצירת נוגדנים כנגד האנזים האריתרו-ליטי streptolysin O המופרש ספציפי על ידי חיידק זה. מגבלותיה שאינה יעילה באבחון הפתוגן בהדבקות עור. כמו כן, טיפול אנטיביוטי מפחית את רגישות השיטה. יש המדגישים את הצורך לבצע תרבית גרון במקביל, כמו גם לבצע שתי בדיקות עוקבות של anti ASO בהפרש של שבועיים בשלב החריף של המפגע ובשלב ההחלמה ממנו. נוגדני ASO שורדים בערך 6 שבועות לאחר ההדבקה. מגבלות נוספות של מבדק ASO עלולות להיווצר כאשר יש בנסיוב רמה גבוהה של β lipoproteins שעלולים לגרום לתוצאה false-positive. בנוסף, גם סטרואידים המדכאים את מערכת החיסון יכולים לדכא יצירת ASO. בהערכה של מטופלים עם acute rheumatic fever, ממליץ ה-AHA דווקא על ביצוע בדיקת ASO על פני בדיקת anti-DNAse-B.

מבחן streptozyme משמש כבדיקת סקר של נוגדנים לאנטיגנים הסטרפטןקוקליים NADase, DNAse, סטרפטוקינאז, streptolysin O ו-hyaluronidase. מבדק זה שימושי בהערכה של חשד למחלה בתר-סטרפטוקוקלית כגון rheumatic fever לאחר הדבקה עם Streptococcus pyogenes. יתרון מבדק זה על פני שני המבדקים האחרים, הוא ביכולתו לגלות מספר נוגדנים לאטיגנים שונים, באופן מהיר, ובכך שהתוצאות המתקבלות אינן מושפעות מגורמים שונים המשפיעים על המבדקים האחרים. חולשתו של מבדק streptozyme שהוא אינו רגיש בילדים כמו במבוגרים, וכן בכך שלעתים הוא לא מגלה נוגדנים לאחד האנטיגנים שהוזכרו ללא סיבה ברורה. גם במבדק זה עלייה סריאלית בטיטר הנוגדנים משמעותית יותר קביעה בודדה.

==משמעות של תוצאות הבדיקה==

#ערכים של 183-240 יחידות/מ"ל נחשבים לערכי anti-DNAse-B מוגברים במקצת;
#ערכים של 240-360 יחידות/מ"ל נחשבים לערכי anti-DNAse-B מוגברים;
#ערכים של 360-640 יחידות/מ"ל נחשבים לערכי anti-DNAse-B מוגברים משמעותית;
#ערכים של מעל 640 יחידות/מ"ל נחשבים לערכי anti-DNAse-B מוגברים מאוד.

== הוראות לביצוע הבדיקה ==

אין צורך בהכנות מיוחדות כולל צום. את הדם יש לדגום במבחנה כימית (פקק אדום) או במבחנת ג'ל. יש לסרכז את הדגימה תוך 30 דקות מנטילת הדם, ולקרר או להקפיא מיידית. יש להעביר את דגימת הדם למעבדה מקוררת בתוך קרח כתוש או בכלי עם קרחומים. להעברה למעבדה מרוחקת, מומלץ שמבחנת הנסיוב תוכנס לכלי עם קרח יבש. הדגימה יציבה למשך 48 שעות בטמפרטורת החדר, למשך 8 ימים בקירור,‏ או למשך 90 יום בהקפאה. אין לקבל דגימות המגיעות למעבדה לא מקוררות, וכן יש לפסול דגימות המוליטיות מאוד או ליפמיות מאוד.

==ביבליוגרפיה==

{{הערות שוליים}}

==ראו גם==

* [[מדריך בדיקות מעבדה|חזרה לדף מדריך בדיקות מעבדה]]
* [[מחלות בקטריאליות/ זיהום בקטריאלי-אלח-דם|בדיקות מעבדה - מחלות בקטריאליות/ זיהום בקטריאלי-אלח-דם]]
* [[מחלות ריאומטיות|בדיקות מעבדה - מחלות ריאומטיות]]

{{ייחוס|[[משתמש:בן עמי סלע|פרופ' בן-עמי סלע]]}}

[[קטגוריה:בדיקות מעבדה - זיהום בקטריאלי]]
[[קטגוריה:בדיקות מעבדה: כימיה בדם]]

מוטציה G20210A ב-prothrombin

2015-11-03T06:40:07Z

בן עמי סלע:

== מוטציה G20210A ב- prothrombin==

כינויים נוספים: Factor II 20210 mutation; Prothrombin 20210 mutation; PTNT.
יוצר הערך: פרופ' בן-עמי סלע.

== בסיס פיזיולוגי ==

גורם קרישה II או פרותרומבין, הוא פרו-אנזים התלוי בוויטמין K, שתפקידו חיוני בתחילת רצף הריאקציות (cascade) של קרישת הדם. חסר של פקטור II הוא תרחיש נדיר של מפגע דימום מורש או נרכש. בשנת 1947, היו Quick וחב' הראשונים בתיאור של חסר פקטור II ב-Lancet, ובשנת 1969 היו אלה Shapiro וחב' הראשונים בתיאור של פגם מבני תורשתי בפרותרומבין ב-J Clin Invest. חסר תורשתי בפקטור II הוא הוא מפגע אוטוזומלי-רצסיבי, הבא לביטוי בירידה בסינתזה של פרותרומבין המוגדר כ-hypoprothrombinmia (על פי Lancellotti וחב' ב-Semin Thromb Haemost משנת 2013), או בסינתזה של פרותרומבין פגום ובלתי-פונקציונאלי הידוע כ-dysprothrombinemia (על פי Girolami וחב' ב-Blood Coagul Fibrinolysis משנת 1998). משקלו המולקולארי של פרותרומבין הוא 72,000 דלטון, ותקופת מחצית החיים של פרותרומבין בפלזמה היא כ-60 שעות.

ברוב המקרים, אלה שהם הומוזיגוטים לפגם אינם תסמיניים ואינם מתפתחים VTE במרוצת חייהם, למרות שרמות פרותרומבין בדמם הם בתחום של 2-25% מהרמה הנורמאלית. יחד עם זאת מטופלים תסמיניים נוטים לפתח חבורות מדממות, epistaxis, שטפי דם ברקמות רכות, דימום ממושך לאחר ניתוחים, ו-menorrhagia. אנשים הטרוזיגוטים לפגם אף הם בדרך כלל אינם תסמיניים, ורמת פרותרומבין בדמם היא 50% או למעלה מכך בהשוואה לרמה הנורמאלית. במקרים של dysprothrombinemia רק במבחני תפקוד ניתן לקבל רמות מופחתות של החלבון, בעוד שמבדקים אימונולוגיים נותנים כצפוי ערכי חלבון תקינים. חסר נרכש של פקטור II יכול להיגרם על ידי מחלת כבד חמורה, על ידי חסר ויטמין K, תרופות נוגדות קרישה כגון קומאדין, או נוכחות של נוגדן עצמי המגיב עם החלבון (Bajaj וחב' ב-Blood משנת 1985).

הגן המקודד לפרותרומבין מבוטא בעיקר בתאי כבד (Royle וחב' ב-Somat Cell Mol Genet משנת 1987), והוא ממוקם על כרומוזום 11 באזור הצנטרומר בעמדה 11p11-q12 (על פי Degen ב-Semin Thromb Hemost משנת 1992). גן זה מורכב מ-14 אקסונים ומכיל 24kb של DNA. הגן מקודד לאזור איתות, לאזור של propeptide, למקטע של חומצה גלוטמית, ל-2 אזורי kringle, ולמקטע קטליטי. האנזים γ-glutamyl carboxylase, בנוכחות ויטמין K וסידן, ממיר 10 שיירים של חומצה הגלוטמית ה-N-טרמינאלית לשיירים של γ-קרבוקסי חומצה גלוטמית, החיוניים לקישור של פרותרומבין לפוספוליפידים בממברנה של טסיות-דם. ניסויים עם עכברים טרנסגניים עם חסר מוחלט של פרותרומבין מדגימים מוות בשלב העוברי, או מייד עם הלידה (Sun ןחב' ב-Proc Natl Acad Sci USA משנת 1998, ואותם חוקרים ב-Thromb Haemost משנת 2002). בהתאם, חסר מוחלט של פרותרומבין לא דווח עד כה באדם. חסר בוויטמין K או טיפול בקומדין מעכב את ריאקציית הקרבוקסילציה של החומצה הגלוטמית, מה שמאט או אף מעכב את מסלול הקואגולציה. פרותרומבין שונה מגורמי קרישה אחרים בכך שהוא מושפע רק באופן מזערי על ידי הריון.

מוטציית G20210A בגן המקודד לפרותרומבין:

פרט לחסר בפרותרומבין, פגם נוסף בחלבון זה היא המוטציה G20210A, שהדיווח הראשון עליה נעשה בשנת 1996 על ידי Poort ןחב' ב-Blood, כסיבה תורשתית לפקקת תסחיפית ורידית (VTE), והיא מתבטאת ברמות מוגברות של פרותרומבין בפלזמה והגברה בסיכון להופעת פקקת. מוטציה זו כרוכה בשחלוף של הנוקלאוטיד adenine ב-guanine בעמדה 20210 באזור ה- 3prime untranslated של הגן לפרותרומבין (Pollak ןחב' ב-Blood משנת 2002). מוטציה זו משנה את אתר הפוליאדנילציה בגן, וגורמת לסינתזה מוגברת של mRNA, ובהתאם לביטוי מוגבר של פרותרומבין (Ceelie וחב' ב-J Thromb Haemost משנת 2004).

השכיחות של מוטציה G20210A מוערכת כ-2-3% בלבנים (Rosendaal וחב' ב-Thromb Haemost משנת 1998, ו-Atasay וחב' ב-Pediatr Hematol משנת 2003). המוטציה שכיחה יותר באלה ממוצא דרום-אירופי מאשר באלה ממוצא צפון אירופי, והיא נדירה ביותר בקרב אסייתים ואפריקאים. בטורקיה לדוגמה, שכיחות המוטציה היא 0.7% (על פי Irdem וחב' ב-Saudi Med J משנת 2005). אלה ההטרוזיגוטים למוטציה זו הם בעלי סיכון מוגבר פי 2-3 לפתח פקקת (Margaglione וחב' ב-Ann Intern Med משנת 1998), מה שמביא להגברת הסיכון לאירוע קרדיו-וסקולארי איסכמי בגברים מתחת גיל 60 שנה (Lalouschek וחב' ב-Stroke משנת 2005). נשים הנושאות מוטציה זו אמורות להימנע או לגלות עירנות מוגברת אם הם משתמשות באמצעי-מניעה פומיים, בגלל החשש המוגברת לפקקת. מוטציה זו מופיעה בעיקר באוכלוסייה הלבנה, ומעריכים שתחילת המוטציה הולכת לאחור למעלה מ-20,000 שנה. בארה"ב שכיחות המוטציה באפרו-אמריקנים היא 0.4%, והיא נדירה בקבוצות אתניות אחרות.

פתופיזיולוגיה:

ב-cascade הריאקציות של קרישת דם, פרותרומבין מבוקע על ידי פקטור Xa ב-2 אתרים ליצירת תרומבין, שהוא סרין-פרוטאזה פעיל ביותר (Narayananב-Ann Clin Lab Sci משנת 1999). ריאקציה פרוטאוליטית זו מתרחשת על פני הפוספוליפידים בשטח הפנים של טסיות-דם, ודורשת סידן. תרומבין אחראי להשריית איגור (aggregation) של טסיות , ולשפעול של מספר תווכים נוספים במפל ריאקציות הקרישה, כגון הפיכת פיברינוגן לפיברין, העובר פולימריזציה ליצירת קריש סביב הטסיות המצומתות. כמו כן תרומבין מסב פקטור XIII לפקטור XIIIa, אנזים המצלב ומייצב את הפולימרים של פיברין. ההשפעות יוצרות הפקקת של תרומבין נחלשות או אף נמנעות על ידי קישור תרומבין ל-thrombomodulin על פני תאי אנדותל, ליצירת קומפלקס המשפעל את protein C, אשר מפרק של גורמי הקרישה Va ו-VIIIa ומונע את cascade הקרישה.

תועדו מספר מוטציות missence ספציפיות בגן של פרותרומבין (Akhavan וחב' ב-Thromb Haemost משנת 2000), מוטציה בה Tyr בעמדה 44 משוחלף על ידי Cys (על פי Sun וחב' ב-Brit J Hematol משנת 1999), מוטציה בה Gla בעמדה 29 משוחלף על ידי Gly (על פי Wang וחב' ב-Haemophilia משנת 2004), ומוטציה בקרב אוכלוסייה הודית בה Ala בעמדה 362 משוחלף על ידי Thr (על פי Jayandharan וחב' ב-J Thromb Haemost משנת 2005). שחלופים של חומצות אמינו בודדות יכולים לגרום להיפופרותרומבינמיה או לדיספרותרומבינמיה, ואמנם רוב המוטציות הגורמות לחסר בפרותרומבין הם מסוג missence.

Sun וחב' תיארו ב-Thromb Haemost משנת 2001 שני בני משפחה בוונצואלה עם רמות פרותרומבין שלא עלו על 4% מהנורמה. באלה זוהתה מוטציה שגרמה לשחלוף של טירוזין על ידי ציסטין בעמדה 44 שהוא אזור ארומטי של החלבון, ולכן נגרם כיפוף (folding) שגוי שלו מה שעלול היה לגרום להפרעה בהפרשת פרותרומבין. מוטציות אחרות תוארו כגון זו הידועה כ-Puerto Rico I בה ארגינין בעמדה 457 משוחלף על ידי גליצין (Lefkowitz וחב' ב-J Thromb Haemost משנת 2003, ו-Kling וחב' ב-Am J Hematol משנת 2007). מוטציית Saint-Denis שחלוף של חומצה אספרטית לגלוטמין בעמדה 552 (על פי Rouy וחב' ב-Brit J Hematol משנת 2006(, ובשנת 2013 תיארו Kuijper וחב' ב- Haemophilia 2 מוטציות חדשות בגן לפרותרומבין, הכרוכות בחסר פרותרומבין המוגדר כ-compound heterozygous type ½.

מוטציות נוספות שזוהו בהטרוזיגוטים לדיס-פרותרומבינמיה הן Arg517Gln (על פי Henriksen וחב' ב-Blood משנת 1998, ומה שידוע כפרותרומבין סן-אנטוניו עם שחלוף של חומצת אמינו יחידה (Arg320His) באזור השפעול של פקטור Xa, הגורם אף הוא לדיס-פרותרומבינמיה (Sun וחב' ב-Blood משנת 2000).

חסר נרכש (acquired) של פרותרומבין יכול לנבוע מאטיולוגיות אחדות, וכיוון שחלבון זה מסונתז כמעט באופן בלעדי בכבד, סביר שמפגעי כבד חמורים הם בעלי השפעה דרמטית על רמות פרותרומבין. גם חסר ויטמין K יכול להפחית רמות פרותרומבין. כיוון שוויטמין זה מיוצר במעי על ידי פלורה אנטראלית, ורמתו עלולה להיות מושפעת ממצבי ספיגה לקויים, חסימה של צינורות מרה, או שימוש מסיבי באנטיביוטיקה (Bhat ו-Deshmukh ב-Indian Pediatr משנת 2003(. חסר של ויטמין K עלול להיגרם באופן יאטרוגני על ידי טיפול ב-propyltiouracil או עם אנטגוניסטים של קומדין. חסר של ויטמין K ניתן למצוא גם בתינוקות בחודשי החיים הראשונים. מקרי חסר מולד או נרכש של פרותרומבין נדירים בארה"ב, ואילו בעולם דווחו רק כ-30 מקרים של חסר נרכש של פרותרומבין (Degen ב-Mol Basis Thromb Hemost משנת 1995).

כמו כן, חסר נרכש של פרותרומבין ניתן לגלות לעתים במטופלים עם lupus anticoagulant (על פי Baudo וחב' ב-Thromb Res משנת 1990, ו-Taddio וחב' ב-Clin Rheumatol משנת 2007). מטופלים אלה יכולים לפתח נוגדנים עצמיים ספציפיים לפרותרומבין, היוצרים קומפלקס עם חלבון זה ומפנים אותו באופן משמעותי מהגוף (Cote וחב' ב-Am J Clin Pathol משנת 1997, ו-Vivaldi וחב' ב-Haematologica מאןתה שנה). תרחיש זה שלעתים מתייחסים אליו כאל lupus anticoagulant hypoprothrombinemia syndrome נצפה בעיקר במקרים של SLE, אך יכול להופיע גם באלה ללא SLE, ובכל מקרה כרוך בתמותה גבוהה (Nayer ו-Ortega ב-J Nephropathol משנת 2014). דימומים המיוחסים להיפופרותרומבינמיה נרכשת הנגרמים על ידי נוגדנים עצמיים לפוספוליפידים, יכולים להןפיע לאחר תרחיש שלgastroenteritis חריפה על רקע של נגיף adeno וכן לאחר תרחיש של mycoplasma pneumonia (על פי Shimizu וחב' ב- Nihon Rinsho Meneki Gakkai Kaishi משנת 2014).

פרותרומבין משחק תפקיד בחרלת (urticaria) כרונית כמו גם במפגעי עור וסקולאריים כגון primary cutaneous vasculitis (על פי Cugno ב-Intern Emerg Med משנת 2010, ו-Kawakami ב-J Dermatol משנת 2010). גם המפגע ליבדו וסקולופתי כרוך עם נוגדן IgM כנגד הקומפלקס פוספטידילסרין-פרותרומבין (Tabata ןחב' ב-Acta Derm Venereol משנת 2010).

בין גורמי הסיכון ל-VTE, החסר באנטי-קואגולנטים protein C ו-protein S מגביר את הסיכון לתרחיש זה פי 5-10, ואחריהם בסולם הסיכון מוצאים את פקטור V ליידן, את ההשתייכות לקבוצת דם שאינה O (על פי Reistma וחב' ב- Arterioscler Thromb Vasc Biol משנת 2012), ואת המוטציה G20210A בפרותומבין (Martinelli וחב' ב-Crit Care Med משנת 2010).

למרות שרמות פרותרומבין מוגברות באופן מתון באלה עם המוטציה G20210A, ומדידת רמת פרותרומבין ניתנת לביצוע בשגרת המעבדה, אין צורך קליני במדידת רמת פרותרומבין לזיהוי המוטציה. מדידת PT או "זמן פרותרומבין" היא אחת הבדיקות המקובלות להעריך את מסלול תהליך הקרישה. בדיקה זו מוגדרת כזמן הנדרש ליצירת קריש פיברין בדגימת פלזמה דלה בטסיות-דם שנלקחה במבחנת ציטראט, לאחר שמוסיפים לה tissue factor (ריקומביננטי או כזה שהופק מבעלי חיים). הגדלה משמעותית ב-PT משמשת אינדיקציה למחלת כבד מתקדמת.

מתי נדרשת בדיקה זו?

א. הנבדק סובל מאירוע ראשון של DVT או VTE בגיל שמתחת ל-50 שנה.
ב. הנבדק חווה קריש דם באזור גוף בלתי שגרתי כמו בוורידי הכבד, הכליות, המוח, המעי, העין או בווריד מזנטרי באזור האגן.
ג. לנבדק יש היסטוריה אישית או משפחתית של אירועים נשנים של DVT או VTE.
ד. לנבדקת יש אירוע של DVT סמוך לנטילה פומית של אמצעי מניעה, או בעת הריון, או כתוצאה מטיפול הורמונאלי משלים HRT)).
ה. הנבדקת חוותה מספר הפלות עצמוניות בלתי מוסברות, בייחוד אלו המתרחשות בשליש השני או השלישי של ההיריון.

מבדק למוטציה של A20210G יכול להידרש כאשר בן משפחת מדרגה ראשונה, הוא בעל מוטציה בפקטור V ליידן או מוטציה בגן PT 20210. יחד עם זאת, פאנל מומחים של ה-CDC באטלנטה שנדרש לסוגיה זו בשנת 2011, המליץ שאם המטרה היא להחליט על טיפול אנטי-קואגולנטי, מבוגרים ללא תסמינים של VTE לא חייבים להיבדק למציאות המוטציה האמורה, גם אם אחד מבני המשפחה נמצא כנושא את המוטציה ב-PT 20210 או בפקטור V ליידן. אם בני משפחה א-תסמיניים יודעים שהם נושאים את אחת המוטציות האמורות או אפילו שתי מוטציות כאלה, הדבר חייב להגביר אצלם את המוטיבציה להישמר מפני גורמי סיכון אחרים לפקקת, כגון שימוש בגלולות למניעת הריון, עישון, רמות מוגברות של הומוציסטאין, ולהגביר את הערנות בכל הקשור לאורח חיים רבצני המגביר את הסיכון להופעת פקקת. יחד עם זאת, יש להדגיש שרבים מנשאי מוטציות אלה לא יתנסו בימי חייהם באירוע של DVT או של VTE.

מטופלים עם חסר בפרותרומבין מדווחים לעתים על היסטוריה משפחתית של מפגעי דימומים. התרחישים עליהם מדווחים מופלים אלה יכולים לכלל דימום מסיבי מחבל הטבור בעת הלידה, דימום מסיבי בעת ביצוע המילה, דימומים ממושכים של היולדת לאחר הלידה, נטייה לדימומים בפציעות קלות, נטייה של דימום מהחניכיים, נטייה לדימומים מהאף (epistaxis), דימומים ממושכים לאחר פעולות כירורגיות, צואה בגוון שחור כתוצאה מדימומי מעי (melena), דם בשתן (המאטוריה), דמם תוך גולגולתי, שטפי-דם ברקמות רכות, דימום וסתי מוגבר (menorrhagia) ודימום במפרקים (Hemarthroses).
בדיקה פיזיקאלית של מטופלים עם חסר פרותרומבין, יכולה לגלות בעור פורפורות או פטכיות המשנות צבען ל"פצעים כחולים"-אכימוזות, בעיקר באזור הקרסול, כאשר באלה הנוהגים לשכב שעות ארוכות הפטכיות מופיעות בעיקר באזור הגב. במקרה של חסר נרכש של פרותרומבין, ייתכן שתימצא מחלת כבד או ספיגה לקויה במעי. מצבים תורשתיים של פקקת הכרוכים עם עמידות לחלבון antithrombin III יכולים להיגרם מהמוטציה בגן המקודד לפרותרומבין (Miyawaki וחב' ב-N Eng J Med משנת 2012). מדובר על מוטציה מסוג gain-of-function בגן לפרותרומבין הגורמת לעמידות ל-antithrombin III וממילא לרגישות למצבי פקקת.

שיקולים אבחוניים:

בשיקולים לאבחון מעורבות של פגם בפרותרומבין לצורך של אבחון מבדיל יש לכלול גם את התרחישים הבארים שעלולים להגביר את מצבי הדמם: פורפורה אקטינית, תסמונת Ehlers-Danlos, תסמונת Gardner-Diamond, פורפורה ע"ש Henoch-Schönlen, מחלת von Willebrand, תופעת Schwartzman, תסמונת Waterhouse-Friderichsen ו-Pseudoxanthoma elasticum.

תרחישים אחרים שצריך לתת עליהם את הדעת הם: חסר בפקטורים V, IX, VII, XI, VIII, חסר ויטמין K, תסמונת מיאלודיספלסטית, מחלת Osler-Weber-Rendu, תסמונת Wiskott-Aldrich, מיאלומה נפוצה, תסמונת המוליטית-אורמית, ITP או Immune Thrombocytopenic Purpura, המופיליה, TTP או Thrombotic Thrombocytopenic Purpura, קריוגלובולימיה, DIC או Disseminated Intravascular Coagulation, מאקרוגלובולינמיה ע"ש Waldenstrom ו- Dysfibrinogenemia מחלת כבד ועירוי דם מסיבי.

מצבים נוספים שיכולים לגרום לרמה מופחתת של פרותרומבין:

ספיגה לקויה במעי (שתגרום לרמת ויטמין K נמוכה), טיפול בקומדין, פיברינוליזה פתולוגית, טיפול בהפארין (למרות שתרופה זו אינה מורידה בדרך כלל רמת פרותרומבין, תיתכן ירידה זמנית כזו לאחר מתן בולוס של הפארין, מושבות חיידקים מועטות בפלורת המעי וכתוצאה יצירה מופחת של ויטמין K, חסר תורשתי המועבר בהורשה רצסיבית, ושגיאות טכניות כמו הוספה מעטה מדי של דם למבחנה. בבדיקות מעבדה רלוונטיות נוספות לקואגולציה המתבצעות במקביל במקרים של מטופלים עם חסר בפרותרומבין, מתקבלות התוצאות הבאות: זמן פרותרומבין (PT) מתארך, בדיקת aPTT או activated partial thromboplastin time מתארכת, אך לעומת זאת משך זמן הדימום (bleeding time) הוא בתוך גבולות הנורמה.

הסיכונים הכרוכים במקרי חסר של פקטור V ליידן והמוטציה ב-PT 20210 וכן חסרים בגורמי קרישה נספים, בין עם נרכשים או מגיעים בהורשה, אינם תלויים האחד במשנהו. אדם יכול לשאת יותר מאשר מוטציה אחת, והסיכון של שתיים או יותר מוטציות הוא סיכון מצטבר. לאלה מתוספים גורמי סיכון הנמצאים בשליטתנו, כמו צריכת גלולות למניעת הריון, שעלולה להחמיר את הסיכון למצבי דימום. לדוגמה, אישה שהיא הטרוזיגוטית לפקטור V ליידן, היא בסיכון המוגבר פי 2-4 לפתח VTE. אם אישה זו צורכת גלולות למניעת הריון, הסיכון המצטבר עלול להיות גדול פי-30 בהשוואה להטרוגיגוטיות של פקטור V ליידן בלבד.

הפולימורפיזם ממוקם באזור "הלא מקודד" של הגן לפרותרומבין, הקרוב לנקודה בה מחובר "זנב" של poly-A ל-pre-mRNA (על פי Ye וחב' ב-Lancet משנת 2006). מוטציה זו גורמת לעליה ברמות פרותרומבין בפלזמה, כנראה על ידי הגברת היציבות של ה-pre-mRNA של חלבון זה (Degen ו-Davie ב-Biochemistry משנת 1987). נראה אם כן ש-G20210A תורם להיפרקואגולציה, אך לא במיוחד לפקקת עורקית, ואמנם המטה-אנליזה של Ye וחב' הצביעה על עליה מתונה ביותר של 30% בסיכון למחלת עורקים כליליים.

נשאיות הטרוזיגוטיות למוטציית G20210A הצורכות גלולות למניעת הריון נמצאות בסיכון מוגבר פי-15 לתרחיש של VTE, ואם הן בנוסף הטרוזיגוטיות למוטציה של פקטור V ליידן הסיכון ל-VTE גדל פי-20 (על פי De Stefano וחב' ב-N Eng J Med משנת 1999).

בהמלצות של EGAPP או Evaluation of Genomic Applications in Practice & Prevention משנת 2011 ב-Genet Med, לא מומלץ לבצע בדיקה גנטית של G20210A במבוגרים המפתחים VTE. כפי שלא מומלץ לבצע בדיקה זו בבני-משפחה א-תסמיניים של נשאי מוטציה זו שעברו אירוע של VTE. באלה בהם התפתח VTE, תוצאות של מבדקי תרומבופיליה, משחקים תפקיד שולי באופי ובמשך הטיפול הקליני (Baglin ב- Semin Respir Crit Care Med משנת 2012).

בדיקת מוטציה זו יכולה להתבצע במקביל למבחנים מולקולאריים נוספים של קואגולציה: בדיקה בדם של MTHAC לקביעת המוטציה A1298C באנזים 5,10 Methylenetetrahydrofolate reductase ; בדיקה בדם של FSDNA לקביעת מוטציה R505Q ב-Factor V Leiden; בדיקה בדם של MTHFR לקביעת המוטציה C677T באנזים 5,10Methylenetetrahydrofolate reductase; בדיקה בדם של MTHP לקביעת המוטציהA1298C באנזים 5,10Methylenetetrahydrofolate reductase.

== הוראות לביצוע הבדיקה ==

אין צורך בשום הכנה דוגמת צום או שינוי במתכונת נטילת תרופות. יש לפסול דגימות המוליטיות או ליפמיות מאוד, אך ניתן לקבל דגימות עם המוליזה או ליפמיה קלה. איסוף הדם צריך להתבצע במבחנת ספירת דם (EDTA פקק בצבע סגלגל) או במבחנת ציטראט (פקק תכלת), שיש למלא בדם עד לסימון הקו העליון, תוך שהופכים את המבחנה מספר פעמים לוודא מגע טוב עם נוגדי הקרישה, ואין לסרכז את המבחנה אלא לשלחה ללא שהות למעבדה כדם מלא בקירור. אין לקבל דגימות פלזמה במבחנות הפארין (פקק ירוק). הדגימות יציבות 72 שעות בטמפרטורת החדר, ושבוע בקירור. אין להקפיא את הדגימה. הבדיקה מולקולארית ומתבצעת על ידי PCR ל DNA לויקוציטרי תוך ניטור פלואורסצנטי (Hall וחב' ב-Proc Natl Acad Sci USA משנת 2000).

מספר מבדקים נוספים עשויים לסייע בזיהוי גורמים נוספים שתורמים לתרומבופיליה. מבדקים אלה כוללים את Lupus anticoagulant, אנטיתרומבין III, הומוציסטאין, מוטציה C677T באנזים MTHFR, מוטציה Factor V gene R2 mutation הידועה כ-A4070G, כמו גם מדידת רמות protein C ו-protein S.

מוטציה G20210A ב-prothrombin

2015-11-03T06:38:53Z

בן עמי סלע: יצירת דף עם התוכן "== מוטציה G20210A ב- prothrombin== כינויים נוספים: Factor II 20210 mutation; Prothrombin 20210 mutation; PTNT. == בסיס פיזיולוג..."

== מוטציה G20210A ב- prothrombin==

כינויים נוספים: Factor II 20210 mutation; Prothrombin 20210 mutation; PTNT.

== בסיס פיזיולוגי ==

גורם קרישה II או פרותרומבין, הוא פרו-אנזים התלוי בוויטמין K, שתפקידו חיוני בתחילת רצף הריאקציות (cascade) של קרישת הדם. חסר של פקטור II הוא תרחיש נדיר של מפגע דימום מורש או נרכש. בשנת 1947, היו Quick וחב' הראשונים בתיאור של חסר פקטור II ב-Lancet, ובשנת 1969 היו אלה Shapiro וחב' הראשונים בתיאור של פגם מבני תורשתי בפרותרומבין ב-J Clin Invest. חסר תורשתי בפקטור II הוא הוא מפגע אוטוזומלי-רצסיבי, הבא לביטוי בירידה בסינתזה של פרותרומבין המוגדר כ-hypoprothrombinmia (על פי Lancellotti וחב' ב-Semin Thromb Haemost משנת 2013), או בסינתזה של פרותרומבין פגום ובלתי-פונקציונאלי הידוע כ-dysprothrombinemia (על פי Girolami וחב' ב-Blood Coagul Fibrinolysis משנת 1998). משקלו המולקולארי של פרותרומבין הוא 72,000 דלטון, ותקופת מחצית החיים של פרותרומבין בפלזמה היא כ-60 שעות.

ברוב המקרים, אלה שהם הומוזיגוטים לפגם אינם תסמיניים ואינם מתפתחים VTE במרוצת חייהם, למרות שרמות פרותרומבין בדמם הם בתחום של 2-25% מהרמה הנורמאלית. יחד עם זאת מטופלים תסמיניים נוטים לפתח חבורות מדממות, epistaxis, שטפי דם ברקמות רכות, דימום ממושך לאחר ניתוחים, ו-menorrhagia. אנשים הטרוזיגוטים לפגם אף הם בדרך כלל אינם תסמיניים, ורמת פרותרומבין בדמם היא 50% או למעלה מכך בהשוואה לרמה הנורמאלית. במקרים של dysprothrombinemia רק במבחני תפקוד ניתן לקבל רמות מופחתות של החלבון, בעוד שמבדקים אימונולוגיים נותנים כצפוי ערכי חלבון תקינים. חסר נרכש של פקטור II יכול להיגרם על ידי מחלת כבד חמורה, על ידי חסר ויטמין K, תרופות נוגדות קרישה כגון קומאדין, או נוכחות של נוגדן עצמי המגיב עם החלבון (Bajaj וחב' ב-Blood משנת 1985).

הגן המקודד לפרותרומבין מבוטא בעיקר בתאי כבד (Royle וחב' ב-Somat Cell Mol Genet משנת 1987), והוא ממוקם על כרומוזום 11 באזור הצנטרומר בעמדה 11p11-q12 (על פי Degen ב-Semin Thromb Hemost משנת 1992). גן זה מורכב מ-14 אקסונים ומכיל 24kb של DNA. הגן מקודד לאזור איתות, לאזור של propeptide, למקטע של חומצה גלוטמית, ל-2 אזורי kringle, ולמקטע קטליטי. האנזים γ-glutamyl carboxylase, בנוכחות ויטמין K וסידן, ממיר 10 שיירים של חומצה הגלוטמית ה-N-טרמינאלית לשיירים של γ-קרבוקסי חומצה גלוטמית, החיוניים לקישור של פרותרומבין לפוספוליפידים בממברנה של טסיות-דם. ניסויים עם עכברים טרנסגניים עם חסר מוחלט של פרותרומבין מדגימים מוות בשלב העוברי, או מייד עם הלידה (Sun ןחב' ב-Proc Natl Acad Sci USA משנת 1998, ואותם חוקרים ב-Thromb Haemost משנת 2002). בהתאם, חסר מוחלט של פרותרומבין לא דווח עד כה באדם. חסר בוויטמין K או טיפול בקומדין מעכב את ריאקציית הקרבוקסילציה של החומצה הגלוטמית, מה שמאט או אף מעכב את מסלול הקואגולציה. פרותרומבין שונה מגורמי קרישה אחרים בכך שהוא מושפע רק באופן מזערי על ידי הריון.

מוטציית G20210A בגן המקודד לפרותרומבין:

פרט לחסר בפרותרומבין, פגם נוסף בחלבון זה היא המוטציה G20210A, שהדיווח הראשון עליה נעשה בשנת 1996 על ידי Poort ןחב' ב-Blood, כסיבה תורשתית לפקקת תסחיפית ורידית (VTE), והיא מתבטאת ברמות מוגברות של פרותרומבין בפלזמה והגברה בסיכון להופעת פקקת. מוטציה זו כרוכה בשחלוף של הנוקלאוטיד adenine ב-guanine בעמדה 20210 באזור ה- 3prime untranslated של הגן לפרותרומבין (Pollak ןחב' ב-Blood משנת 2002). מוטציה זו משנה את אתר הפוליאדנילציה בגן, וגורמת לסינתזה מוגברת של mRNA, ובהתאם לביטוי מוגבר של פרותרומבין (Ceelie וחב' ב-J Thromb Haemost משנת 2004).

השכיחות של מוטציה G20210A מוערכת כ-2-3% בלבנים (Rosendaal וחב' ב-Thromb Haemost משנת 1998, ו-Atasay וחב' ב-Pediatr Hematol משנת 2003). המוטציה שכיחה יותר באלה ממוצא דרום-אירופי מאשר באלה ממוצא צפון אירופי, והיא נדירה ביותר בקרב אסייתים ואפריקאים. בטורקיה לדוגמה, שכיחות המוטציה היא 0.7% (על פי Irdem וחב' ב-Saudi Med J משנת 2005). אלה ההטרוזיגוטים למוטציה זו הם בעלי סיכון מוגבר פי 2-3 לפתח פקקת (Margaglione וחב' ב-Ann Intern Med משנת 1998), מה שמביא להגברת הסיכון לאירוע קרדיו-וסקולארי איסכמי בגברים מתחת גיל 60 שנה (Lalouschek וחב' ב-Stroke משנת 2005). נשים הנושאות מוטציה זו אמורות להימנע או לגלות עירנות מוגברת אם הם משתמשות באמצעי-מניעה פומיים, בגלל החשש המוגברת לפקקת. מוטציה זו מופיעה בעיקר באוכלוסייה הלבנה, ומעריכים שתחילת המוטציה הולכת לאחור למעלה מ-20,000 שנה. בארה"ב שכיחות המוטציה באפרו-אמריקנים היא 0.4%, והיא נדירה בקבוצות אתניות אחרות.

פתופיזיולוגיה:

ב-cascade הריאקציות של קרישת דם, פרותרומבין מבוקע על ידי פקטור Xa ב-2 אתרים ליצירת תרומבין, שהוא סרין-פרוטאזה פעיל ביותר (Narayananב-Ann Clin Lab Sci משנת 1999). ריאקציה פרוטאוליטית זו מתרחשת על פני הפוספוליפידים בשטח הפנים של טסיות-דם, ודורשת סידן. תרומבין אחראי להשריית איגור (aggregation) של טסיות , ולשפעול של מספר תווכים נוספים במפל ריאקציות הקרישה, כגון הפיכת פיברינוגן לפיברין, העובר פולימריזציה ליצירת קריש סביב הטסיות המצומתות. כמו כן תרומבין מסב פקטור XIII לפקטור XIIIa, אנזים המצלב ומייצב את הפולימרים של פיברין. ההשפעות יוצרות הפקקת של תרומבין נחלשות או אף נמנעות על ידי קישור תרומבין ל-thrombomodulin על פני תאי אנדותל, ליצירת קומפלקס המשפעל את protein C, אשר מפרק של גורמי הקרישה Va ו-VIIIa ומונע את cascade הקרישה.

תועדו מספר מוטציות missence ספציפיות בגן של פרותרומבין (Akhavan וחב' ב-Thromb Haemost משנת 2000), מוטציה בה Tyr בעמדה 44 משוחלף על ידי Cys (על פי Sun וחב' ב-Brit J Hematol משנת 1999), מוטציה בה Gla בעמדה 29 משוחלף על ידי Gly (על פי Wang וחב' ב-Haemophilia משנת 2004), ומוטציה בקרב אוכלוסייה הודית בה Ala בעמדה 362 משוחלף על ידי Thr (על פי Jayandharan וחב' ב-J Thromb Haemost משנת 2005). שחלופים של חומצות אמינו בודדות יכולים לגרום להיפופרותרומבינמיה או לדיספרותרומבינמיה, ואמנם רוב המוטציות הגורמות לחסר בפרותרומבין הם מסוג missence.

Sun וחב' תיארו ב-Thromb Haemost משנת 2001 שני בני משפחה בוונצואלה עם רמות פרותרומבין שלא עלו על 4% מהנורמה. באלה זוהתה מוטציה שגרמה לשחלוף של טירוזין על ידי ציסטין בעמדה 44 שהוא אזור ארומטי של החלבון, ולכן נגרם כיפוף (folding) שגוי שלו מה שעלול היה לגרום להפרעה בהפרשת פרותרומבין. מוטציות אחרות תוארו כגון זו הידועה כ-Puerto Rico I בה ארגינין בעמדה 457 משוחלף על ידי גליצין (Lefkowitz וחב' ב-J Thromb Haemost משנת 2003, ו-Kling וחב' ב-Am J Hematol משנת 2007). מוטציית Saint-Denis שחלוף של חומצה אספרטית לגלוטמין בעמדה 552 (על פי Rouy וחב' ב-Brit J Hematol משנת 2006(, ובשנת 2013 תיארו Kuijper וחב' ב- Haemophilia 2 מוטציות חדשות בגן לפרותרומבין, הכרוכות בחסר פרותרומבין המוגדר כ-compound heterozygous type ½.

מוטציות נוספות שזוהו בהטרוזיגוטים לדיס-פרותרומבינמיה הן Arg517Gln (על פי Henriksen וחב' ב-Blood משנת 1998, ומה שידוע כפרותרומבין סן-אנטוניו עם שחלוף של חומצת אמינו יחידה (Arg320His) באזור השפעול של פקטור Xa, הגורם אף הוא לדיס-פרותרומבינמיה (Sun וחב' ב-Blood משנת 2000).

חסר נרכש (acquired) של פרותרומבין יכול לנבוע מאטיולוגיות אחדות, וכיוון שחלבון זה מסונתז כמעט באופן בלעדי בכבד, סביר שמפגעי כבד חמורים הם בעלי השפעה דרמטית על רמות פרותרומבין. גם חסר ויטמין K יכול להפחית רמות פרותרומבין. כיוון שוויטמין זה מיוצר במעי על ידי פלורה אנטראלית, ורמתו עלולה להיות מושפעת ממצבי ספיגה לקויים, חסימה של צינורות מרה, או שימוש מסיבי באנטיביוטיקה (Bhat ו-Deshmukh ב-Indian Pediatr משנת 2003(. חסר של ויטמין K עלול להיגרם באופן יאטרוגני על ידי טיפול ב-propyltiouracil או עם אנטגוניסטים של קומדין. חסר של ויטמין K ניתן למצוא גם בתינוקות בחודשי החיים הראשונים. מקרי חסר מולד או נרכש של פרותרומבין נדירים בארה"ב, ואילו בעולם דווחו רק כ-30 מקרים של חסר נרכש של פרותרומבין (Degen ב-Mol Basis Thromb Hemost משנת 1995).

כמו כן, חסר נרכש של פרותרומבין ניתן לגלות לעתים במטופלים עם lupus anticoagulant (על פי Baudo וחב' ב-Thromb Res משנת 1990, ו-Taddio וחב' ב-Clin Rheumatol משנת 2007). מטופלים אלה יכולים לפתח נוגדנים עצמיים ספציפיים לפרותרומבין, היוצרים קומפלקס עם חלבון זה ומפנים אותו באופן משמעותי מהגוף (Cote וחב' ב-Am J Clin Pathol משנת 1997, ו-Vivaldi וחב' ב-Haematologica מאןתה שנה). תרחיש זה שלעתים מתייחסים אליו כאל lupus anticoagulant hypoprothrombinemia syndrome נצפה בעיקר במקרים של SLE, אך יכול להופיע גם באלה ללא SLE, ובכל מקרה כרוך בתמותה גבוהה (Nayer ו-Ortega ב-J Nephropathol משנת 2014). דימומים המיוחסים להיפופרותרומבינמיה נרכשת הנגרמים על ידי נוגדנים עצמיים לפוספוליפידים, יכולים להןפיע לאחר תרחיש שלgastroenteritis חריפה על רקע של נגיף adeno וכן לאחר תרחיש של mycoplasma pneumonia (על פי Shimizu וחב' ב- Nihon Rinsho Meneki Gakkai Kaishi משנת 2014).

פרותרומבין משחק תפקיד בחרלת (urticaria) כרונית כמו גם במפגעי עור וסקולאריים כגון primary cutaneous vasculitis (על פי Cugno ב-Intern Emerg Med משנת 2010, ו-Kawakami ב-J Dermatol משנת 2010). גם המפגע ליבדו וסקולופתי כרוך עם נוגדן IgM כנגד הקומפלקס פוספטידילסרין-פרותרומבין (Tabata ןחב' ב-Acta Derm Venereol משנת 2010).

בין גורמי הסיכון ל-VTE, החסר באנטי-קואגולנטים protein C ו-protein S מגביר את הסיכון לתרחיש זה פי 5-10, ואחריהם בסולם הסיכון מוצאים את פקטור V ליידן, את ההשתייכות לקבוצת דם שאינה O (על פי Reistma וחב' ב- Arterioscler Thromb Vasc Biol משנת 2012), ואת המוטציה G20210A בפרותומבין (Martinelli וחב' ב-Crit Care Med משנת 2010).

למרות שרמות פרותרומבין מוגברות באופן מתון באלה עם המוטציה G20210A, ומדידת רמת פרותרומבין ניתנת לביצוע בשגרת המעבדה, אין צורך קליני במדידת רמת פרותרומבין לזיהוי המוטציה. מדידת PT או "זמן פרותרומבין" היא אחת הבדיקות המקובלות להעריך את מסלול תהליך הקרישה. בדיקה זו מוגדרת כזמן הנדרש ליצירת קריש פיברין בדגימת פלזמה דלה בטסיות-דם שנלקחה במבחנת ציטראט, לאחר שמוסיפים לה tissue factor (ריקומביננטי או כזה שהופק מבעלי חיים). הגדלה משמעותית ב-PT משמשת אינדיקציה למחלת כבד מתקדמת.

מתי נדרשת בדיקה זו?

א. הנבדק סובל מאירוע ראשון של DVT או VTE בגיל שמתחת ל-50 שנה.
ב. הנבדק חווה קריש דם באזור גוף בלתי שגרתי כמו בוורידי הכבד, הכליות, המוח, המעי, העין או בווריד מזנטרי באזור האגן.
ג. לנבדק יש היסטוריה אישית או משפחתית של אירועים נשנים של DVT או VTE.
ד. לנבדקת יש אירוע של DVT סמוך לנטילה פומית של אמצעי מניעה, או בעת הריון, או כתוצאה מטיפול הורמונאלי משלים HRT)).
ה. הנבדקת חוותה מספר הפלות עצמוניות בלתי מוסברות, בייחוד אלו המתרחשות בשליש השני או השלישי של ההיריון.

מבדק למוטציה של A20210G יכול להידרש כאשר בן משפחת מדרגה ראשונה, הוא בעל מוטציה בפקטור V ליידן או מוטציה בגן PT 20210. יחד עם זאת, פאנל מומחים של ה-CDC באטלנטה שנדרש לסוגיה זו בשנת 2011, המליץ שאם המטרה היא להחליט על טיפול אנטי-קואגולנטי, מבוגרים ללא תסמינים של VTE לא חייבים להיבדק למציאות המוטציה האמורה, גם אם אחד מבני המשפחה נמצא כנושא את המוטציה ב-PT 20210 או בפקטור V ליידן. אם בני משפחה א-תסמיניים יודעים שהם נושאים את אחת המוטציות האמורות או אפילו שתי מוטציות כאלה, הדבר חייב להגביר אצלם את המוטיבציה להישמר מפני גורמי סיכון אחרים לפקקת, כגון שימוש בגלולות למניעת הריון, עישון, רמות מוגברות של הומוציסטאין, ולהגביר את הערנות בכל הקשור לאורח חיים רבצני המגביר את הסיכון להופעת פקקת. יחד עם זאת, יש להדגיש שרבים מנשאי מוטציות אלה לא יתנסו בימי חייהם באירוע של DVT או של VTE.

מטופלים עם חסר בפרותרומבין מדווחים לעתים על היסטוריה משפחתית של מפגעי דימומים. התרחישים עליהם מדווחים מופלים אלה יכולים לכלל דימום מסיבי מחבל הטבור בעת הלידה, דימום מסיבי בעת ביצוע המילה, דימומים ממושכים של היולדת לאחר הלידה, נטייה לדימומים בפציעות קלות, נטייה של דימום מהחניכיים, נטייה לדימומים מהאף (epistaxis), דימומים ממושכים לאחר פעולות כירורגיות, צואה בגוון שחור כתוצאה מדימומי מעי (melena), דם בשתן (המאטוריה), דמם תוך גולגולתי, שטפי-דם ברקמות רכות, דימום וסתי מוגבר (menorrhagia) ודימום במפרקים (Hemarthroses).
בדיקה פיזיקאלית של מטופלים עם חסר פרותרומבין, יכולה לגלות בעור פורפורות או פטכיות המשנות צבען ל"פצעים כחולים"-אכימוזות, בעיקר באזור הקרסול, כאשר באלה הנוהגים לשכב שעות ארוכות הפטכיות מופיעות בעיקר באזור הגב. במקרה של חסר נרכש של פרותרומבין, ייתכן שתימצא מחלת כבד או ספיגה לקויה במעי. מצבים תורשתיים של פקקת הכרוכים עם עמידות לחלבון antithrombin III יכולים להיגרם מהמוטציה בגן המקודד לפרותרומבין (Miyawaki וחב' ב-N Eng J Med משנת 2012). מדובר על מוטציה מסוג gain-of-function בגן לפרותרומבין הגורמת לעמידות ל-antithrombin III וממילא לרגישות למצבי פקקת.

שיקולים אבחוניים:

בשיקולים לאבחון מעורבות של פגם בפרותרומבין לצורך של אבחון מבדיל יש לכלול גם את התרחישים הבארים שעלולים להגביר את מצבי הדמם: פורפורה אקטינית, תסמונת Ehlers-Danlos, תסמונת Gardner-Diamond, פורפורה ע"ש Henoch-Schönlen, מחלת von Willebrand, תופעת Schwartzman, תסמונת Waterhouse-Friderichsen ו-Pseudoxanthoma elasticum.

תרחישים אחרים שצריך לתת עליהם את הדעת הם: חסר בפקטורים V, IX, VII, XI, VIII, חסר ויטמין K, תסמונת מיאלודיספלסטית, מחלת Osler-Weber-Rendu, תסמונת Wiskott-Aldrich, מיאלומה נפוצה, תסמונת המוליטית-אורמית, ITP או Immune Thrombocytopenic Purpura, המופיליה, TTP או Thrombotic Thrombocytopenic Purpura, קריוגלובולימיה, DIC או Disseminated Intravascular Coagulation, מאקרוגלובולינמיה ע"ש Waldenstrom ו- Dysfibrinogenemia מחלת כבד ועירוי דם מסיבי.

מצבים נוספים שיכולים לגרום לרמה מופחתת של פרותרומבין:

ספיגה לקויה במעי (שתגרום לרמת ויטמין K נמוכה), טיפול בקומדין, פיברינוליזה פתולוגית, טיפול בהפארין (למרות שתרופה זו אינה מורידה בדרך כלל רמת פרותרומבין, תיתכן ירידה זמנית כזו לאחר מתן בולוס של הפארין, מושבות חיידקים מועטות בפלורת המעי וכתוצאה יצירה מופחת של ויטמין K, חסר תורשתי המועבר בהורשה רצסיבית, ושגיאות טכניות כמו הוספה מעטה מדי של דם למבחנה. בבדיקות מעבדה רלוונטיות נוספות לקואגולציה המתבצעות במקביל במקרים של מטופלים עם חסר בפרותרומבין, מתקבלות התוצאות הבאות: זמן פרותרומבין (PT) מתארך, בדיקת aPTT או activated partial thromboplastin time מתארכת, אך לעומת זאת משך זמן הדימום (bleeding time) הוא בתוך גבולות הנורמה.

הסיכונים הכרוכים במקרי חסר של פקטור V ליידן והמוטציה ב-PT 20210 וכן חסרים בגורמי קרישה נספים, בין עם נרכשים או מגיעים בהורשה, אינם תלויים האחד במשנהו. אדם יכול לשאת יותר מאשר מוטציה אחת, והסיכון של שתיים או יותר מוטציות הוא סיכון מצטבר. לאלה מתוספים גורמי סיכון הנמצאים בשליטתנו, כמו צריכת גלולות למניעת הריון, שעלולה להחמיר את הסיכון למצבי דימום. לדוגמה, אישה שהיא הטרוזיגוטית לפקטור V ליידן, היא בסיכון המוגבר פי 2-4 לפתח VTE. אם אישה זו צורכת גלולות למניעת הריון, הסיכון המצטבר עלול להיות גדול פי-30 בהשוואה להטרוגיגוטיות של פקטור V ליידן בלבד.

הפולימורפיזם ממוקם באזור "הלא מקודד" של הגן לפרותרומבין, הקרוב לנקודה בה מחובר "זנב" של poly-A ל-pre-mRNA (על פי Ye וחב' ב-Lancet משנת 2006). מוטציה זו גורמת לעליה ברמות פרותרומבין בפלזמה, כנראה על ידי הגברת היציבות של ה-pre-mRNA של חלבון זה (Degen ו-Davie ב-Biochemistry משנת 1987). נראה אם כן ש-G20210A תורם להיפרקואגולציה, אך לא במיוחד לפקקת עורקית, ואמנם המטה-אנליזה של Ye וחב' הצביעה על עליה מתונה ביותר של 30% בסיכון למחלת עורקים כליליים.

נשאיות הטרוזיגוטיות למוטציית G20210A הצורכות גלולות למניעת הריון נמצאות בסיכון מוגבר פי-15 לתרחיש של VTE, ואם הן בנוסף הטרוזיגוטיות למוטציה של פקטור V ליידן הסיכון ל-VTE גדל פי-20 (על פי De Stefano וחב' ב-N Eng J Med משנת 1999).

בהמלצות של EGAPP או Evaluation of Genomic Applications in Practice & Prevention משנת 2011 ב-Genet Med, לא מומלץ לבצע בדיקה גנטית של G20210A במבוגרים המפתחים VTE. כפי שלא מומלץ לבצע בדיקה זו בבני-משפחה א-תסמיניים של נשאי מוטציה זו שעברו אירוע של VTE. באלה בהם התפתח VTE, תוצאות של מבדקי תרומבופיליה, משחקים תפקיד שולי באופי ובמשך הטיפול הקליני (Baglin ב- Semin Respir Crit Care Med משנת 2012).

בדיקת מוטציה זו יכולה להתבצע במקביל למבחנים מולקולאריים נוספים של קואגולציה: בדיקה בדם של MTHAC לקביעת המוטציה A1298C באנזים 5,10 Methylenetetrahydrofolate reductase ; בדיקה בדם של FSDNA לקביעת מוטציה R505Q ב-Factor V Leiden; בדיקה בדם של MTHFR לקביעת המוטציה C677T באנזים 5,10Methylenetetrahydrofolate reductase; בדיקה בדם של MTHP לקביעת המוטציהA1298C באנזים 5,10Methylenetetrahydrofolate reductase.

== הוראות לביצוע הבדיקה ==

אין צורך בשום הכנה דוגמת צום או שינוי במתכונת נטילת תרופות. יש לפסול דגימות המוליטיות או ליפמיות מאוד, אך ניתן לקבל דגימות עם המוליזה או ליפמיה קלה. איסוף הדם צריך להתבצע במבחנת ספירת דם (EDTA פקק בצבע סגלגל) או במבחנת ציטראט (פקק תכלת), שיש למלא בדם עד לסימון הקו העליון, תוך שהופכים את המבחנה מספר פעמים לוודא מגע טוב עם נוגדי הקרישה, ואין לסרכז את המבחנה אלא לשלחה ללא שהות למעבדה כדם מלא בקירור. אין לקבל דגימות פלזמה במבחנות הפארין (פקק ירוק). הדגימות יציבות 72 שעות בטמפרטורת החדר, ושבוע בקירור. אין להקפיא את הדגימה. הבדיקה מולקולארית ומתבצעת על ידי PCR ל DNA לויקוציטרי תוך ניטור פלואורסצנטי (Hall וחב' ב-Proc Natl Acad Sci USA משנת 2000).

מספר מבדקים נוספים עשויים לסייע בזיהוי גורמים נוספים שתורמים לתרומבופיליה. מבדקים אלה כוללים את Lupus anticoagulant, אנטיתרומבין III, הומוציסטאין, מוטציה C677T באנזים MTHFR, מוטציה Factor V gene R2 mutation הידועה כ-A4070G, כמו גם מדידת רמות protein C ו-protein S.

מבחני תפקוד טסיות-דם - Platelet Function Tests

2015-10-26T14:16:42Z

בן עמי סלע:

== מבחני תפקוד טסיות-דם -Platelet Function Tests ==

כינויים נוספים: Platelet Aggregation Studies ;PFT ;Platelet Function Test ,Platele Function Assay; PFA
מעבדה: המטולוגיה בדם.
יוצר הערך: פרופ' בן-עמי סלע.

== מטרת הבדיקה ==

סיוע לקביעת הסיבה לדימום-יתר, או לזיהוי של פגם תפקודי של טסיות הדם. כמו כן בדיקות אלו חיוניות בניטור הנוכחות והיעילות של תרופות נוגדות-טסיות. המבדקים הללו רלוונטיים כאשר יש נטייה לדימומים תת-עוריים בכל פציעה קלה, הופעת המאטומות מסיביות, או לאלה הנוטלים תכשירים העלולים להשפיע על פעילות הטסיות. כמו כן ניתן לבצע מבדקים אלה לפני פרוצדורות ניתוחיות, כאמצעי פרופילקטי. כמו כן עשויים מבדקים אלה לגלות עמידות לאספירין. כן יש לשקול מבדקים אלה במקרים של דימומים כרוניים מהאף, דימומים מסיביים בעת המחזור, חניכיים מדממים או דימומים מסיביים בטיפולי שיניים.

== בסיס פיזיולוגי ==

טסיות-דם מיוצרות במח העצם ונעות בצירקולציה. כאשר יש פציעה או נזק לכלי-דם ומתחיל דימום, טסיות הדם מסייעות לעצור את הדימום בשלוש דרכים: הן נספחות לאזור הפגיעה; הן נצמדות לטסיות אחרות בתהליך של איגור (aggregation); הן משחררות חומרים המעודדים את המשך האיגור.
פרט להמוסטאזיס ולפקקת, מספר גדל והולך של מחקרים מצביעים על כך שתרומבוציטים או platelets ולהלן טסיות דם, הן בעלות תפקיד אינטגראלי בקשר בינתאי, הן מתווכות של תהליכי דלקת ויש להן תפקיד במודולציה של תגובות חיסוניות. טסיות-דם, הם תאים נטולי גרעין המצויים בצירקולצית הדם. מקורם של פרגמנטים תאיים אלה הם מגה-קריוציטים במח העצם.

האנדותל הווסקולארי הנורמאלי מייצר מעכבים פוטנטיים של טסיות-דם כגון חד-תחמוצת החנקן (NO), פרוסטציקלין, ו-ADPase. ברגע שמרכיבים תת-אנדותליאליים הכוללים קולאגן, פיברונקטין, למינין, או גורם von Willebrand (להלן vWF) נחשפים כתוצאה מפציעה של דופן כלי הדם, טסיות-דם עוברות סדרה של ריאקציות תפקודיות מבוקרות באופן קפדני, כגון ספיחה, התפשטות, הפרשת מרכיבים פנימיים של טסיות הדם, איגור, פעילות מסייעת לקרישת דם, יצירה של מיקרו-חלקיקים, ולבסוף התכווצות יצירת קריש הדם. ספיחת טסיות (adhesion) מתבצעת בתיווך של אינטראקציה בין קומפלקס הקולטן glycoprotein (GP) Ib/V/IX על פני ממברנת טסיות הדם, לבין הגורם vWF, והאינטראקציה של GP VI ו-GP Ia עם קולגן באזורים של הנזק הוסקולארי (Jennings ב- J Thromb Hemostasis משנת 2008).

הגופיפים הדחוסים מכילים adenine nucleotides מסוג ADP ו-ATP וכן סרוטונין, המשרים את תהליך האיגור והצימות (aggregation), כיווץ כלי הדם, יצירת ציטוקינים וכן modulators של תהליך דלקת. הליזוזומים מכילים אנזימים פרוטאוליטיים וכן אנזימים המבקעים רב סוכרים ואוליגו-סוכרים, ובכך הם יכולים לסייע לפינוי פתוגנים, לפירוק של משתית (matrix) חוץ-תאית, ולתרום לפינוי של חלקיקי פקקת המורכבת מטסיות-דם, כמו גם לסייע בפירוק של הפארין (Jenne וחב' ב- Int J Lab Hematolמשנת 2013).

מספר מסלולים משתתפים בשפעול של הטסיות, תוך השתתפות של קולגן, ADP, סרוטונין, thromboxane A2, אפינפרין ו-thrombin. הפעולה המשותפת של מולקולות משפעלות אלו גורמת לגיוס של טסיות מהצירקולציה, ולמספר התבטאויות ברורות של שפעולן של הטסיות כגון שינויים בצורת הטסיות, התבטאות יתר של פעילות P-selectin, של הליגנד המסיס CD40, ושל קדם-קואגולנט של הטסיות, כמו גם המרה של GP IIb/IIIa לצורתו הפעילה. כידוע, GP IIb/IIIa הוא הקולטן המרכזי של טסיות הדם המתווך באיגור של תאים אלה.

רק הקומפלקס GP IIb/IIIa המשופעל מסוגל לקשור פיברינוגן מסיס בפלזמה ולגרום לאיגור ול-spreading נוסף של הטסיות המשופעלות באזור בפגיעה הוסקולארית. לכן, שלב האיגור תלוי באופן קריטי בקולטנים הקשורים לחלבוני G, והוא מתווך על ידי גשרים בין פיברינוגן וגורם von Willebrandלבין קומפלקסים משופעלים של GP IIb/IIIa על פני תאי טסיות שכנים ומשופעלים אף הם (Clemeston ב-Thrombosis Res משנת 2012, ו-Abbate וחב' באותו כתב עת באותה שנה). החשיפה של פוספוליפידים אניוניים (בעיקר פוספטידיל-סרין) מספקת משטח עליו הטסיות יכולות לסייע לתרומבין. אנזים מפתח זה של מפל (cascade) הקרישה, והאגוניסט הפוטנטי ביותר של טסיות הדם, פועל על ידי ביקוע הקולטנים המשופעלים על ידי פרוטאזות. פרץ פעילות התרומבין מוביל לשפעול מתמשך של קולטנים אלה ולגיוס טסיות לסביבה הקרובה תוך השתתפות של לויקוציטים דרך הקולטנים שלהם ל-P-selectin. לאחר היווצרות הקריש, הטסיות המשופעלות עוברות רה-ארגון על ידי כיווץ של השלד הפנימי שלהן (cytoskeleton) המורכב מ-actin/myosin, מה שגורם להצטמקות הקריש.

במצב של steady state מגה-קריוציטים מספקים בערך 1011 טסיות דם ביום עם תחלופת הטסיות אחת ל- 8-9 ימים. תהליך זה מושפע משינויים סביבתיים אחדים, מה שמביא את רמת טסיות דם בפלזמה ל-150-400 מיליון לסמ"ק. טסיות-דם במצב מנוחה הם תאים דיסקואידיים קטנים (2-4 מיקרומטר באורכם ו-0.5 מיקרומטר ברוחבם), מה שמאפשר תנועתם והיספחותם אל דופן כלי הדם, שם הם מפקחים באופן תמידי על שלמות האנדותל הוסקולארי. טסיות-דם מכילות 3 סוגים של גראנולות: α-granules, גופיפים דחוסים וליזוזומים. ה-α-granules הן השכיחות ביותר בטסיות הדם, והן עוברות במהירות אקסוציטוזה בעת השפעול שלהן על מנת לעודד המוסטאזיס ודלקת.

הגופיפים הדחוסים מכילים adenine nucleotides מסוג ADP ו-ATP וכן סרוטונין, המשרים את תהליך האיגור והצימות (aggregation), כיווץ כלי הדם, יצירת ציטוקינים וכן modulators של תהליך דלקת. הליזוזומים מכילים אנזימים פרוטאוליטיים וכן אנזימים המבקעים רב סוכרים ואוליגו-סוכרים, ובכך הם יכולים לסייע לפינוי פתוגנים, לפירוק של משתית (matrix) חוץ-תאית, ולתרום לפינוי של חלקיקי פקקת המורכבת מטסיות-דם, כמו גם לסייע בפירוק של הפארין (Jenne וחב' ב-Int J Lab Hematol משנת 2013).

בחינת תפקוד טסיות:

רוב המבדקים של תפקוד טסיות הדם, נועדו באופן מסורתי לאבחון והתנהלות במקרי מטופלים עם בעיות של דימום-יתר. בניגוד לפגמים בתהליך הקרישה, בהם בדיקות כגון "זמן פרותרומבין" (PT) או activated partial thromboplastin time) aPTT), שעברו סטנדרטיזציה ואוטומטיזציה מלאה, מבחני תפקוד הטסיות נחשבים עדיין מבדקים עתירי זמן ביצוע, ומייגעים יותר, הדורשים מכשור מיוחד ואנשי מעבדה מיומנים בתחום זה. הזיהוי במעבדה של פגמי hemostasis הכוללים כשלים בתפקוד הטסיות דורשים נכון להיום תהליכי מעבדה רב-שלביים.

כיוון שטסיות דם כרוכות באותה מידה גם במפגעי atherothrombosis, נכנסים לשגרת המעבדה מבדקים חדשים למדידת תפקוד הטסיות, כדי לנטר את יעילותם של תרופות נוגדות-טסיות, במטרה לנבא אירועי תופעות של דימום או קרישת-יתר במחלות פקקתיות בעורקים. ראשית דבר, חיוניים במיוחד פרטים על תולדות המחלה, וזהות תכשירים ותרופות בעבר הקרוב ובהווה. בדיקות המעבדה מתחילות בדרך כלל על ידי ביצוע ספירת דם מלאה (CBC), בדרך כלל ביחד עם בחינה מיקרוסקופית של משטח דם, בעיקר אם מתקבלת תוצאה חריגה לגבי הספירה של טסיות הדם, כגון MPV או mean platelet volume וכן PDW או platelet distribution width. ברוב המעבדות מתבצע פאנל של בדיקות screening כאשר קיים חשד לפגמים ב-hemostsis. אם מבחני סריקה אלה מתקבלים תקינים, אך האינדיקציה הקלינית מחשידה לפגמים בטסיות, יש לבצע מהלך אבחוני כוללני בהוספת בדיקות ייחודיות כגון platelet aggregometry המהווה מדד לשחרור טסיות, וכן flow cytometry, בדיקת platelet microRNAs , בירורים גנטיים וכן אנליזה של מסלולי מעבר איתותים (signal transduction) שהוא בשלב זה בעל אופי מחקרי בדרגת מיומנות גבוהה שאינו נהוג במרבית המעבדות הקליניות.

Platelet Aggregometry : מדידת כושר האיגור (aggregation) של טסיות.

שיטת LTA או light transmission aggregometry נחשבת "מדד זהב" בין שיטות מדידת התפקוד של טסיות-דם, והיא עדיין השיטה שנמצאת בשימוש רווח במעבדה הקלינית. השיטה מבוססת על הנעה (stirring) של PRP או platelet rich plasma בתוך cuvette הממוקמת בין מקור אור לבין גלאי. אחרי הוספה של פאנל של מספר אגוניסטים כמו קולגן, ADP, תרומבין, ristocetin, אפינפרין וחומצה אראכידונית, הטסיות עוברות איגור מה שמגביר את מעבר האור דרך ה-cuvette. כיוון שתרומבין הנחשב אמנם לאגוניסט פוטנטי של טסיות, מבקע גם פיברינוגן ליצירת פיברין ומגביר יצירת קריש, הוא אינו נחשב אגוניסט נוח לשימוש במדידת כושר האיגור של טסיות. לכן, במקום תרומבין ניתן להשתמש ב-TRAP או thrombin receptor activating peptide. המתווה של איגור טסיות נחשב כתגובה ראשונית לאגוניסטים אקסוגניים כאשר התגובה השניונית היא הפרשת התכולה של הגרנולות הדחוסות של הטסיות.

מבדק Platelet Aggregometry בודק באיזה מידה טסיות נצמדות זו לזו ליצירת קריש דם. טווח הייחוס של מבדק זה הוא מתווה נורמאלי דו-פאזי של איגור בתגובה למשפעלים ספציפיים של טסיות דם (ראה תרשים למטה):

יש לציין שהתגובה הדו-פאזית של תהליך האיגור יכולה להיות ממוסכת אם מוסיפים ריכוזים גבוהים מדי של אגוניסטים. הפרמטרים הנמדדים כוללים את קצב האיגור המבוטא ב-%/min, ואת המופע (amplitude) המרבי או את אחוז האיגור לאחר פרק זמן קבוע, בדרך כלל 6-10 דקות (Favaloro וחב' ב-Clin Chem Lab Med משנת 2010, ו-Kehrel ו-Brodde ב- Transfusion Med Hemotherapy משנת 2013).

שיטת LTA נותרת הטכניקה השימושית ביותר לאבחון מגוון רחב של פגמים בטסיות. החיסרון היחיד של טכניקה זו הוא השימוש בפלזמה עתירה בטסיות (PRP) במקום בדם מלא מה שמחייב סרכוז מיוחד, וכן בגין העובדה שבהיעדר תאי דם אדומים ולבנים, שיטת LTA אינה מודדת במדויק את ההמוסטאזיס הראשוני. כמו כן בשיטה זו נזקקים לנפח גדול של דגימת דם, היא ממושכת בביצוע וכן ישנם משתנים קדם-אנליטיים ואנליטיים רבים, המשפיעים על תוצאותיה.

שיטת LTA לא עברה סטנדרטיזציה, למרות העובדה שפורסמו הנחיות לביצועה. ההמלצות האחרונות של ה-SSC או תת-הוועדה של ועדת הסטנדרטיזציות של ה-International Society on Thrombosis and Haemostasis או(ISTH) זמינות לכל (Cattaneo וחב' ב-J Thromb prostasis משנת 2009 וכן באותו כתב עת משנת 2013, ו-Dawood וחב' ב-Blood משנת 2012). שיטות חלופיות כוללות aggregometry של דם מלא, או שיטת lumiaggregometry הוכנסו לשימוש, אך רובן לא אומצו במעבדות ואין בהם הוספה של מידע אבחוני נוסף.

המגבלות של מבדק LTA קונבנציונאלי עודדו פיתוח של שיטות תפקוד טסיות חדשות ופשוטות יותר לביצוע. השיטה הנפוצה כיום ביותר עושה שימוש ב-Platelet function analyzer מסוג PFA-100 או PFA-200 של חברת Siemens ב-Marburg גרמניה, המשמש גם עזר בבדיקות של זמן דימום. המכשיר מנטר את הירידה בקצב הזרימה, והזמן הנדרש לקבל סתימה מלאה של החריר מדווח כ-CT או closure time עד למקסימום של 300 שניות. מבדק זה של תפקוד טסיות קל לביצוע, אוטומטי ומהיר, ומשקף מספר מאפיינים של התפקוד הפיזיולוגי של טסיות, תוך שהוא מתבצע בדם מלא ולא ב-PRP (על פי Hayward וחב' ב-J Thromb Haemostasis משנת 2006, ו-Favloro ב-Sem Thromb Haemostasis משנת 2008).

לאחרונה נסקרו השימושים הקליניים של LTA, והם כוללים סריקה לאבחון מחלת von Willebrand, והניטור של טיפול במחלה זו, וכן זיהוי של פגמים מורשים או נרכשים של טסיות, ניטור של טיפול נוגד טסיות, והאישוש של סיכון הנובע מדימומים בעת פרוצדורה כירורגית. יחד עם זאת, CT מושפע מספירת הטסיות וההמטוקריט, ויש לו ספציפיות נמוכה לכל מפגע ייחודי של טסיות הדם. לכן, תוצאות נורמאליות של CT יכולות לשמש בדרגת ביטחון סבירה לשלול מספר מפגעים תפקודיים חמורים של טסיות כמו vWD חמורה, אך אין בהן לשלול חסר מתון של vWF או מפגעי טסיות מתונים.

אינטרפרטציה של תוצאות מבדק איגור טסיות:

ירידה באיגור טסיות עשויה להיות כרוכה במפגעים הבאים: א. מפגעים אוטו-אימוניים בהם נוצרים נוגדנים עצמיים כנגד טסיות; ב. תסמונת Bernard-Soulier הנדירה בה חסר ב-GpIb המהווה קולטן ל-vWF פוגע ביצירת הקריש; ג. הצטברות של תוצרי פירוק של פיברין; ד. Glanzmann thrombasthenia שהיא פגיעה נדירה ביכולת האיגור של טסיות כתוצאה מחסר או מפגם ב-GpIIb/IIIa המשמש קולטן לפיברינוגן וכך נפגע הקשר בין טסיות לטסיות אחרות ונפגעת היווצרות הקריש; ה. שימוש בתרופות החוסמות יצירת טסיות (thiazide diuretics, אינטרפרון, אלכוהול) ; ו. מפגעים בשגשוג תאים מייאלואידיים; ז. Storage pool disease בה נפגעת יכולת הגרנולות בטסיות להכיל ולהפריש ADP המסייע לאיגורן ; ח. אורמיה כתוצאה מאי-ספיקת כליות; ט. מחלת von Willebrand, בה יצירה מופחתת של vWF מפחיתה את יכולת הספיחה של טסיות לכלי הדם הפגועים מה שמגביר איבוד דם.

(להכניס כאן את הטבלה בשפה העברית)

מבדק flow cytometry:

מבדק זה המתבצע בדם מלא, מהווה טכניקת מעבדה עוצמתית ופופולארית לאשש תפקוד טסיות ואת השפעול שלהן על ידי שימוש בקרינת laser לקבוע את החלבונים הנמצאים על שטח פני הטסיות, וכיצד חלבונים אלה עוברים שינוי בעת שפעול הטסיות. למרות שטכניקה זו דורשת ציוד מתוחכם, כמו גם נוגדנים חד-שבטיים, ולמרות שלא עברה סטנדרטיזציה מלאה, יש לה מספר יתרונות הכוללות צורך בנפח קטן של דם מלא, ואי תלות במספר הטסיות. המבחנים השכיחים ביותר לביצוע שיגרתי של flow cytometry הם הכימות של סטאטוס קולטן GP של הטסיות, כמו גם קביעת ההרכב של הגרנולות בטסיות. מכשיר flow cytometer יכול לכמת חסרים של GP IIb/IIIa בתסמונת Glanzmann’s thrombasthenia, וחסרים ב-GP Ib/IX/V בתסמונת Bernard-Soulier. מכשיר זה תוכנן גם למדוד את הגרנולות הדחוסות על ידי קליטה ושחרור של mepacrine, שהוא חומר פלואורסצנטי ירוק הנקלט על ידי טסיות ונאגר בגרנולות הדחוסות שלהן (על פי Wall וחב' ב-Brit J Hematol משנת 1995).

מדידת flow cytometry מאפשרת את האנליזה של תפקודם של תאי טסיות בודדים, ואת מדידת הביטוי של סמנים של שפעול טסיות אינדיבידואליות כמו גם כימות הקשר בין טסיות ותאי דם אחרים. הסמנים השכיחים ביותר של שפעול טסיות שניתן לבדוק ב-flow cytometry הם ביטוי של P-selectin על פני הטסיות (כסמן של הפרשת α-granules), מדידת בעזרת הנוגדן החד-שבטי PAC-1 של השינוי המבני של GP IIb/IIIa לצורתו הפעילה כתוצאה משפעול הטסיות, יצירת קוניוגציות בין טסיות לתאי-דם לבנים, בחינה של microparticles, חשיפתם של פוספוליפידים טעונים שלילית על פני טסיות כמדד של פעילות קדם-קואגולנטית, והזרחון של VASP-P או vasodilator-stimulated hosphoprotein-phosphorylation, וכן כמדד לקולטן P2Y12 המתבטא לאחר שפעול טסיות, בעזרת המכשיר של BioCytex מ-Marseille, צרפת (Williams וחב' ב-Thromb Haemostasis משנת 2010, וכן Hezardוחב' ב-Cardiovasc Hematol Disorders-Drug Targets משנת 2010 ו-Dahlen וחב' ב-Thrombo Haemostasis משנת 2013).

מבדק Viscoelastometry הידוע גם כ-Thromboelastometry:

קרישי דם צריכים להיות חזקים דיים לעצור שטפי דם ולמנוע דימום נוסף עד לחסימת הפציעה בכלי הדם. מבדק זה מתוכנן לקבוע את החוזק של קריש הדם בעת יצירתו. בדיקה זו מתבצעת בדרך כלל במעבדות של מרכזים רפואיים גדולים.

מבדקים אחרים של POCT או point-of-care testing:

מבחני תפקוד טסיות תופסים חלק הולך וגדל ככלים לניבוי דימומים או לצורך ניטור יעילותם של תכשירים מונעי קרישת דם. מספר הולך וגדל של אנשים מטופלים כיום עם תרופות נוגדות-טסיות, מה שמגביר את הסיכון לתרחישי דמם. מבדק LTA המסורתי עדיין חיוני להערכה של מפגעי טסיות, אך הוא קשה לביצוע במצבים של טיפולים דחופים וחריפים. כיום יש מגמה לתכנון מכשור פשוט וקל יותר לתפעול של POCT המתבצע מחוץ למעבדה הקלינית, "ליד מיטת החולה". נתאר כאן 2 מכשירים יציגים כאלה: א. Impact cone and plate analyzer (המיוצר על ידי DiaMed ב-Cressier, שוויץ); ב. Thromboelastography או TEG (המיוצר על ידי Hemoscope ב-Niles, IL, USA על פי Afshari וחב' ב-Cochrane Database System Rev משנת 2011, ו-Kim וחב' ב-Lab Med משנת 2013.

מכשיר ה-Impact cone תוכנן במקור לניטור של ספיחת טסיות למשטח של polystyrene. המכשיר מכיל מיקרוסקופ, והוא מבצע צביעה ואנליזה של מבנה טסיות הנספחות ועוברות איגור תחת shear rate גבוה של 1800/שנייה. התוצאה מדווחת כאחוז המשטח המכוסה על ידי טסיות, וכן הגודל הממוצע של החלקיקים הנספחים. הספיחה תלויה ב-vWF, בקישור פיברינוגן וב-GP Ib and IIb/IIIa של הטסיות. המבדק אוטומטי במלואו, פשוט ומהיר לביצוע, תוך צורך בנפח קטן של דם. נתונים ניסויים מרמזים לכך שה-Impact cone יכול לגלות מספר פגמים של טסיות או ב-vWF, וניתן להשתמש בו באופן פוטנציאלי לצורך בדיקת סריקה. מבדק TEG ומבדק נוסף הידוע כ-rotational thrombelastometry או ROTEM המתבצע במכשיר של חברת Pentapharm GmbH ממינכן, גרמניה, מודד את התכונות הפיסיקאליות של הקרישים הנוצרים על ידי שימוש ב-oscillating cup שיכול לטפל סימולטאנית במספר דגימות דם. TEG מספק נתונים שונים המתייחסים ליצירת פיברין, התפתחות קריש הדם, כמו גם נתונים על החוזק והיציבות של קריש הפיברין, וכן על תהליך הפיברינוליזה. היתרונות המיוחדים של TEG/POTEM הם ביכולתם לתת תיאור מלא של יצירת הקריש והאינטראקציה בינו לבין אלמנטים שונים בדם המלא בפרט בעת יצירת קריש. מכשור זה מופעל בחדרי ניתוח הרדמה והתאוששות לקביעה של סכנת דימום והצורך בעירויי דם. אנליזה זו נמשכת לפחות 30 דקות. היא מתבצעת בבתי חולי גדולים או בחדר הניתוח או כגבדיקת point-of-care במעבדה הקלינית (Afshari וחב' ב-Cochrane Database Syst Rev משנת 2011).

ניטור טיפולים תרופתיים נוגדי טסיות:

ככל שמתרבה השימוש בתכשירים נוגדי-טסיות גדלה החיוניות באופטימליזציה של היחס סיכון/תועלת במטופלים. הטיפול המודרני בתכשירים נוגדי-טסיות מבוסס על שלושה מסלולים עיקריים של שפעול תאים אלה: א. עיכוב האנזים cyclooxygenase-1 המביא להפחתת thromboxane A-2 ; ב. עיכוב P2Y12) ADP); ג. חסימת הקולטן GP IIb/IIIa (על פי Close ב Fundamental Clin Pharmacol משנת 2012, וכן Tobin וחב' ב-Eur J Neurol משנת 2013 ו-Capodanno וחב' ב-J Thromb Haemostasis משנת 2013). ראוי לציין שגם מקרים בהם התגלתה עמידות לטיפולים נוגדי טסיות, כמו גם בטיפול המשולב של אספירין ו-clopidogrel, נעשה שימוש במבדקים של תפקודי טסיות לנסות ולהבין עמידות זו (Woo וחב' ב-Korean J Lab Med משנת 2010).

בעשור האחרון התקבלה עדות משכנעת ממספר ניסוים תצפיתיים שהדגימה קשר חזק בין פעילות טסיות גבוהה (HPR) ו-ADP, כמו גם עם אירועים איסכמיים לאחר פרוצדורות PCI, ובעיקר פקקת הנגרמת בגין שתילת תומכן. ה-AHA, ה-American College of Cardiology וה-European Society of Cardiology פרסמו המלצה בדרגה IIb לבצע בדיקות תפקוד טסיות לסייע בבחירה של מעכב P2Y12 באלה בסיכון גבוה בין העוברים PCI, אם כי לא מומלץ על ביצוע שגרתי של בדיקות אלו (המלצה class III).

לאחרונה גופים אלה עדכנו מסמך קונצנזוס עם ערכי סף עבור high plateket reactivity או HPR ו-low platelet reactivity או LPR ל-ADP, ערכים שעשויים לשמש מחקרים עתידיים של תרפיה-מותאמת-אישית כנגד טסיות. LPR ל-ADP הכרוכה כנראה בסכנת דימום. לכן, שלושת הגופים האמורים הציעו "חלון תרפויטי" עבור טיפולים במעכבי P2Y12 (על פי Bonello וחב' ב- J Am College of Cardiol משנת 2010, וכן Aradi וחב' ב- Eur Heart J משנת 2014 ו-Tantry וחב' ב- J Am College of Cardiol משנת 2013).

המבדקים השכיחים ביותר במסגרת מבחני תפקוד טסיות ידועים כ-VerifyNow P1Y12 assay של חברת Accumetrics בסן-דיגו, קליפורניה, וכיום גם באנלייזר סורק multiplate של Hoffmann-La-Roche בבאזל, וכן VASP assay, בהם התגברו על רבות מהמגבלות הטכניות של השיטות הקודמות, כולל שיטת LTA הקונבנציונאלית. לכן, בעת הזו נקבע setting לערכי HPR ו-LPR על פי הקריטריונים הבאים, בהתאמה: (א) 208< ו-85> יחידות פעילות של P2Y12 במבדק VerifyNow P2Y12; (ב) 50%< ו-16%> של platelet reactivity index בשיטת VASP-P; (ג) 46< ו-19> יחידות איגור אקראיות בתגובה ל-ADP בסורק multiplate (על פי Zhang וחב' ב-Platelets משנת 2013).

מבדק PMP או Platelet-Derived Microparticles:

מיקרו-חלקיקים הנעים בצירקולציה מוגדרים כ-vesicles קטנים של פוספוליפידים שהקוטר שלהם נע בין 0.1-1.0 מיקרון, ומקורם בסוגי תאים שונים כגון טסיות, אריתרוציטים, לויקוציטים, תאי אנדותל ותאי שריר חלק וסקולאריים (Prokopi וחב' ב-Blood משנת 2009). מיקרו-חלקיקים נבדלים מ-exosomes, שהם וסיקולות קטנות יותר (40-100 ננומטר) שמקורם בממברנות אנדופלזמיות ומגופיפים שנוצרו בעת אפופטוזיס שגודלם מעל 1.5 מיקרון, והמכילים מרכיבים גרעיניים. מיקרו-חלקיקים נושאים חלבוני שטח פנים ומכילים גם חומר ציטופלזמטי של תאי-אם, וכן פוספוליפידים (בעיקר פוספטידיל-סרין) (Mause ו-Weber ב-Circulation Res משנת 2010, ו-Aatonen וחב' ב-Thromb Hemostasis משנת 2012).

במצבים של steady-state מיקרו-חלקיקים שמקורם בטסיות דם ובמגה-קריוציטים, הם המיקרו-חלקיקים הנפוצים ביותר, ומהווים עד 70-90% מכלל המיקרו-חלקיקים בצירקולציה (Italiano Jr וחב' ב-Curr Opin Hematol משנת 2010). רמת PMP מראה הבדלים מגדריים, כאשר הערכים גבוהים יותר בנשים מאשר בגברים, ואכן ישנם גם הבדלים הקשורים למחזור החודשי. ערכי PMP גדלים עם ההזדקנות, אך גם לאחר פעילות גופנית מאומצת, תוך הגברה של הפוטנציאל ההמוסטאטי. בערך 25% מהפעילות התומכת בקרישה של טסיות משופעלות, כרוכה עם מיקרו-חלקיקים המשתחררים בעת שפעול טסיות, כאשר שטח הפנים של הטסיות יכול להיות פי 50-100 יותר פרו-קואגולנטי מאשר זה של טסיות לא משופעלות. כמויות קטנות של PMP משתחררות באופן מתמשך מטסיות במנוחה, אך תהליך זה מואץ ביותר לאחר שפעולן או לאחר פעילות גופנית אינטנסיבית.

התכונות התרומבוגניות של PMP אושרו בניסויים רבים, כאשר רמות גבוהות של PMP כרוכות בחוזקה עם מצביים קרישתיים רבים. PMP היו מוגברים משמעותית במטופלים עם תסחיף פקקתי לריאות (PE), תרחיש בו הם היו המקור העיקרי של MP פרו-קואגולנטים. לדוגמה, בתרחיש של valvular atrial fibrillation, המהווה סיכון גבוה ל- thromboembolism, המספרים של PMP היו מוגברים יותר מאשר פי-3. רמות מוגברות של PMP היו כרוכות גם במצבי מחלות אחרות כולל thrombocytopenia מושרית על ידי הפארין, פקקת עורקית, ITP, תרומבוציטופניה תרומבוטית, מחלת תאים חרמשיים, uremia, ממאירות ודלקת מפרקים שגרונית (RA). כמו כן, PMP נכרכו גם בפתוגניות של טרשת עורקים כמו גם בוויסות של אנגיוגניות (Shantsila וחב' ב-J Thromb Haemostasis משנת 2010, וכן França וחב' ב-Circulation משנת 2012, ו- Biasucci וחב' באותו כתב עת באותה שנה, וכן Lackner וחב' ב-Stroke משנת 2010).

למרות שהמשמעות הפיזיולוגית של PMP הודחקה משך שנים רבות, מחקר עדכני מצביע על כך שחלקיקים זעירים אלה עשויים לשחק תפקיד חשוב בטרנספורט ובהעברה של מולקולות פעילות ביולוגית ואיתותים ברחבי הגוף כולו. MP יכולים להשפיע על תאי היעד שלהם או על ידי גירוי ישיר שלהם דרך ליגנדים המבוטאים על פני תאים אלה, או על ידי העברה של קולטנים של פני תאים מתא אחד למשנהו. כיוון שחלקיקי MP נעטפים בעת יצירתם על ידי מרכיבים ציטופלזמטיים, הם נושאים חלבונים ו-RNA שמקורם בציטוזול של תא האם, אותם הם מעבירים לתא היעד.

מספר שיטות מעבדה לאנליזה של PMP פורסמו, אך השיטה הנפוצה ביותר כיום היא שיטת flow cytometry. למרות מספר הפרסומים הגדול על PMP, חוסר סטנדרטיזציה של השיטה מקשה על ההשוואה בין תוצאות הפרסומים השונים. סקר של תת-ועדה של ISTH Vascular Biology הראה שבערך 75% מהמעבדות משתמשות ב-flow cytometry לבחינת דגימות קליניות. יחד עם זאת, מגוון רחב של משתנים קדם-אנליטייים ואנליטיים, גורמים לתחום רחב של ערכי PMP בפלזמה חופשית מטסיות (PFP) באנשים בריאים (Robert וחב' ב- J Thromb Haemostasis משנת 2009, וכן Mobarrez וחב' ב-Thrombosis Res משנת 2010, ו-Lacroix וחב' ב-J Thromb Haemostsis משנת 2010).

שלוש תת-ועדות של ISTH (המתייחסות לביולוגיה וסקולארית, ל-DIC או Disseminated Intravascular Coagulation ול-Haemostasis and Malignancy) יזמו פרויקט להביא לסטנדרטיזציה של מדידת MP על ידי flow cytometer. איסטרטגיה זו מבוססת על שימוש בכדוריות (beads) תת-מיקרומטריות, הידועות כ-Megamix beads של חברת BioCytex הצרפתית מ-Marseille, המאפשרים אנליזה הדירה של MP.

מבדק MicroRNAs או miRNA של טסיות:

miRNA הוא מקטע קטן של RNA "לא מקודד" המכיל 21-23 נוקלאוטידים, שתפקידו בוויסות של בערך 60% של הגנים המקודדים לחלבונים ביונקים, לפחות באופן חלקי על ידי הדיכוי של תרגום RNA (על פי Dangwal ו-Thum ב-Thromb Haemostasis משנת 2012). טסיות משופעלות מפרישות כאמור MP עשירים במגוון של גורמי גדילה או בחלבונים מפעילים בעלי השפעות חוץ-תאיות (Edelstein וחב' ב-J Thromb Haemostasis משנת 2013). למרות שטסיות חסרות גרעין או DNA גנומי, תאים אלה יכולים לתרגם mRNA מוּרש ליצירת חלבונים. מעניין לציין שטסיות מקבלות בהורשה חלבונים הקשורים לעיבוד של miRNA, בנוסף לעותקים (transcripts) שמקורם בתאי האם של הטסיות, המגה-קריוציטים (Willeit וחב' ב-Circulation Res משנת 2013).
דיווח עדכני על תכולת miRNA ב-MP מראה ש-PMP יכולים לשאת את מטען ה-miRNA של הטסיות, אל אזורי היעד שלהם במערכת הקרדיו-וסקולארית. יתרה מכך, טסיות-מפרישות-miRNA יכולות לתרום למאגר ה-miRNA, הפכו נושא מחקרי של אלה התרים אחר ביו-סמנים הקשורים עם מצבים פתולוגיים שונים (Zampetaki וחב' ב-J Am Coll Cardiol משנת 2012, ו-Grasedieck וחב' ב-Blood משנת 2013).

סריקה בשיטת microarray גלתה ש-miR-24, miR-223, miR-197, miR-126 ו-miR-21, הם בין ה-miRNAs המבוטאים ביותר בטסיות וב-PMP. רמותיהם בצירקולציה למעשה תואמים את רמות PMP כפי שניתן לכימות על ידי flow cytometry. הרמות של miR-340 ו-miR-624 נמצאו מוגברות משמעותית בטסיות ממטופלים הסובלים ממחלת לב כלילית בגיל צעיר. בדומה, ביטוי-יתר של miR-28 נמצא בטסיות שהושגו מחולים עם מחלות סרטניות מיאלו-פרוליפרטיביות.

מעניינת מציאותם בטסיות של למעלה מ-750 מתוך כ-2,000 סוגי miRNAs הידועים באדם. ל-miRNA יש תפקיד מבוסס בהמטופויאזה כמו גם ביצירתם של מגה-קריוציטים; לכן נראה ש-miRNAs בטסיות עשויים לשמש כסמנים וכלים להבנת מנגנונים של ביטוי גנים במגה-קריוציטים ובטסיות. כיוון שהתרגום של miRNA הוא המנגנון היחיד לסינתזה של חלבונים חדשים, יש להניח ש-miRNA ממקור טסיות משחק תפקיד בתפקוד התקין כמו גם במפגעים של המוסטאזיס ושל יצירת פקקת.

(להכניס כאן את הטבלה בשפה האנגלית)

== הוראות לביצוע הבדיקה ==

דגימת הדם: 4 מ"ל של דם מלא הנלקח במבחנת סודיום ציטראט (פקק תכול). ארבע מבחנות נדרשות למדידה של platelet aggregation. שבע מבחנות נדרשות למדידה של איגור והפרשת טסיות. יש לבצע את הבדיקות תוך 4 שעות מנטילת הדם. לתקופת ההמתנה לפני ביצוע הבדיקות הדגימות צריכות להימצא בטמפרטורת החדר שכן קירור הדגימות עלול לגרום לשפעול הטסיות. בדיקות נוספות רלוונטיות לביצוע יחד עם מבדק זה הן ספירת דם מלאה (CBC), ספירת טסיות, PT, PTT, ביופסיה של מח עצם, גורמי קרישה וגורם von Willebrand.

מספר תרופות יכולות להשפיע על תוצאות המבדק, אפילו אם נעשה בהן שימוש עד שבועיים לפני המבדק, לכן יש להימנע מצריכת תרופות אלה במידת האפשר כשבוע-שבועיים לפני הבדיקה. תרופות אלה כוללות: תכשירים אנטיביוטיים דוגמת פניצילינים, צפלוספורינים ו-nitrofurantoin; אנטי-היסטמינים, אספירין, clopidogrel, dipyridamole, נוגדי דיכאון תלת-ציקליים, ticlopidine, תרופות ממשפחת NASID כמו ibuprofen ו-naproxen, וכן theophylline ומעכבי COX-2 כגון celecoxib.

מבחני תפקוד טסיות-דם - Platelet Function Tests

2015-10-26T14:16:10Z

בן עמי סלע:

מבחני תפקוד טסיות-דם - Platelet Function Tests

2015-10-26T14:12:14Z

בן עמי סלע:

== מבחני תפקוד טסיות-דם -Platelet Function Tests ==

כינויים נוספים: Platelet Aggregation Studies ;PFT ;Platelet Function Test ,Platele Function Assay; PFA
מעבדה: המטולוגיה בדם.
יוצר הערך: פרופ' בן-עמי סלע.

== מטרת הבדיקה ==

סיוע לקביעת הסיבה לדימום-יתר, או לזיהוי של פגם תפקודי של טסיות הדם. כמו כן בדיקות אלו חיוניות בניטור הנוכחות והיעילות של תרופות נוגדות-טסיות. המבדקים הללו רלוונטיים כאשר יש נטייה לדימומים תת-עוריים בכל פציעה קלה, הופעת המאטומות מסיביות, או לאלה הנוטלים תכשירים העלולים להשפיע על פעילות הטסיות. כמו כן ניתן לבצע מבדקים אלה לפני פרוצדורות ניתוחיות, כאמצעי פרופילקטי. כמו כן עשויים מבדקים אלה לגלות עמידות לאספירין. כן יש לשקול מבדקים אלה במקרים של דימומים כרוניים מהאף, דימומים מסיביים בעת המחזור, חניכיים מדממים או דימומים מסיביים בטיפולי שיניים.

== בסיס פיזיולוגי ==

טסיות-דם מיוצרות במח העצם ונעות בצירקולציה. כאשר יש פציעה או נזק לכלי-דם ומתחיל דימום, טסיות הדם מסייעות לעצור את הדימום בשלוש דרכים: הן נספחות לאזור הפגיעה; הן נצמדות לטסיות אחרות בתהליך של איגור (aggregation); הן משחררות חומרים המעודדים את המשך האיגור.
פרט להמוסטאזיס ולפקקת, מספר גדל והולך של מחקרים מצביעים על כך שתרומבוציטים או platelets ולהלן טסיות דם, הן בעלות תפקיד אינטגראלי בקשר בינתאי, הן מתווכות של תהליכי דלקת ויש להן תפקיד במודולציה של תגובות חיסוניות. טסיות-דם, הם תאים נטולי גרעין המצויים בצירקולצית הדם. מקורם של פרגמנטים תאיים אלה הם מגה-קריוציטים במח העצם.

האנדותל הווסקולארי הנורמאלי מייצר מעכבים פוטנטיים של טסיות-דם כגון חד-תחמוצת החנקן (NO), פרוסטציקלין, ו-ADPase. ברגע שמרכיבים תת-אנדותליאליים הכוללים קולאגן, פיברונקטין, למינין, או גורם von Willebrand (להלן vWF) נחשפים כתוצאה מפציעה של דופן כלי הדם, טסיות-דם עוברות סדרה של ריאקציות תפקודיות מבוקרות באופן קפדני, כגון ספיחה, התפשטות, הפרשת מרכיבים פנימיים של טסיות הדם, איגור, פעילות מסייעת לקרישת דם, יצירה של מיקרו-חלקיקים, ולבסוף התכווצות יצירת קריש הדם. ספיחת טסיות (adhesion) מתבצעת בתיווך של אינטראקציה בין קומפלקס הקולטן glycoprotein (GP) Ib/V/IX על פני ממברנת טסיות הדם, לבין הגורם vWF, והאינטראקציה של GP VI ו-GP Ia עם קולגן באזורים של הנזק הוסקולארי (Jennings ב- J Thromb Hemostasis משנת 2008).

הגופיפים הדחוסים מכילים adenine nucleotides מסוג ADP ו-ATP וכן סרוטונין, המשרים את תהליך האיגור והצימות (aggregation), כיווץ כלי הדם, יצירת ציטוקינים וכן modulators של תהליך דלקת. הליזוזומים מכילים אנזימים פרוטאוליטיים וכן אנזימים המבקעים רב סוכרים ואוליגו-סוכרים, ובכך הם יכולים לסייע לפינוי פתוגנים, לפירוק של משתית (matrix) חוץ-תאית, ולתרום לפינוי של חלקיקי פקקת המורכבת מטסיות-דם, כמו גם לסייע בפירוק של הפארין (Jenne וחב' ב- Int J Lab Hematolמשנת 2013).

מספר מסלולים משתתפים בשפעול של הטסיות, תוך השתתפות של קולגן, ADP, סרוטונין, thromboxane A2, אפינפרין ו-thrombin. הפעולה המשותפת של מולקולות משפעלות אלו גורמת לגיוס של טסיות מהצירקולציה, ולמספר התבטאויות ברורות של שפעולן של הטסיות כגון שינויים בצורת הטסיות, התבטאות יתר של פעילות P-selectin, של הליגנד המסיס CD40, ושל קדם-קואגולנט של הטסיות, כמו גם המרה של GP IIb/IIIa לצורתו הפעילה. כידוע, GP IIb/IIIa הוא הקולטן המרכזי של טסיות הדם המתווך באיגור של תאים אלה.

רק הקומפלקס GP IIb/IIIa המשופעל מסוגל לקשור פיברינוגן מסיס בפלזמה ולגרום לאיגור ול-spreading נוסף של הטסיות המשופעלות באזור בפגיעה הוסקולארית. לכן, שלב האיגור תלוי באופן קריטי בקולטנים הקשורים לחלבוני G, והוא מתווך על ידי גשרים בין פיברינוגן וגורם von Willebrandלבין קומפלקסים משופעלים של GP IIb/IIIa על פני תאי טסיות שכנים ומשופעלים אף הם (Clemeston ב-Thrombosis Res משנת 2012, ו-Abbate וחב' באותו כתב עת באותה שנה). החשיפה של פוספוליפידים אניוניים (בעיקר פוספטידיל-סרין) מספקת משטח עליו הטסיות יכולות לסייע לתרומבין. אנזים מפתח זה של מפל (cascade) הקרישה, והאגוניסט הפוטנטי ביותר של טסיות הדם, פועל על ידי ביקוע הקולטנים המשופעלים על ידי פרוטאזות. פרץ פעילות התרומבין מוביל לשפעול מתמשך של קולטנים אלה ולגיוס טסיות לסביבה הקרובה תוך השתתפות של לויקוציטים דרך הקולטנים שלהם ל-P-selectin. לאחר היווצרות הקריש, הטסיות המשופעלות עוברות רה-ארגון על ידי כיווץ של השלד הפנימי שלהן (cytoskeleton) המורכב מ-actin/myosin, מה שגורם להצטמקות הקריש.

במצב של steady state מגה-קריוציטים מספקים בערך 1011 טסיות דם ביום עם תחלופת הטסיות אחת ל- 8-9 ימים. תהליך זה מושפע משינויים סביבתיים אחדים, מה שמביא את רמת טסיות דם בפלזמה ל-150-400 מיליון לסמ"ק. טסיות-דם במצב מנוחה הם תאים דיסקואידיים קטנים (2-4 מיקרומטר באורכם ו-0.5 מיקרומטר ברוחבם), מה שמאפשר תנועתם והיספחותם אל דופן כלי הדם, שם הם מפקחים באופן תמידי על שלמות האנדותל הוסקולארי. טסיות-דם מכילות 3 סוגים של גראנולות: α-granules, גופיפים דחוסים וליזוזומים. ה-α-granules הן השכיחות ביותר בטסיות הדם, והן עוברות במהירות אקסוציטוזה בעת השפעול שלהן על מנת לעודד המוסטאזיס ודלקת.

הגופיפים הדחוסים מכילים adenine nucleotides מסוג ADP ו-ATP וכן סרוטונין, המשרים את תהליך האיגור והצימות (aggregation), כיווץ כלי הדם, יצירת ציטוקינים וכן modulators של תהליך דלקת. הליזוזומים מכילים אנזימים פרוטאוליטיים וכן אנזימים המבקעים רב סוכרים ואוליגו-סוכרים, ובכך הם יכולים לסייע לפינוי פתוגנים, לפירוק של משתית (matrix) חוץ-תאית, ולתרום לפינוי של חלקיקי פקקת המורכבת מטסיות-דם, כמו גם לסייע בפירוק של הפארין (Jenne וחב' ב-Int J Lab Hematol משנת 2013).

בחינת תפקוד טסיות:

רוב המבדקים של תפקוד טסיות הדם, נועדו באופן מסורתי לאבחון והתנהלות במקרי מטופלים עם בעיות של דימום-יתר. בניגוד לפגמים בתהליך הקרישה, בהם בדיקות כגון "זמן פרותרומבין" (PT) או activated partial thromboplastin time) aPTT), שעברו סטנדרטיזציה ואוטומטיזציה מלאה, מבחני תפקוד הטסיות נחשבים עדיין מבדקים עתירי זמן ביצוע, ומייגעים יותר, הדורשים מכשור מיוחד ואנשי מעבדה מיומנים בתחום זה. הזיהוי במעבדה של פגמי hemostasis הכוללים כשלים בתפקוד הטסיות דורשים נכון להיום תהליכי מעבדה רב-שלביים.

כיוון שטסיות דם כרוכות באותה מידה גם במפגעי atherothrombosis, נכנסים לשגרת המעבדה מבדקים חדשים למדידת תפקוד הטסיות, כדי לנטר את יעילותם של תרופות נוגדות-טסיות, במטרה לנבא אירועי תופעות של דימום או קרישת-יתר במחלות פקקתיות בעורקים. ראשית דבר, חיוניים במיוחד פרטים על תולדות המחלה, וזהות תכשירים ותרופות בעבר הקרוב ובהווה. בדיקות המעבדה מתחילות בדרך כלל על ידי ביצוע ספירת דם מלאה (CBC), בדרך כלל ביחד עם בחינה מיקרוסקופית של משטח דם, בעיקר אם מתקבלת תוצאה חריגה לגבי הספירה של טסיות הדם, כגון MPV או mean platelet volume וכן PDW או platelet distribution width. ברוב המעבדות מתבצע פאנל של בדיקות screening כאשר קיים חשד לפגמים ב-hemostsis. אם מבחני סריקה אלה מתקבלים תקינים, אך האינדיקציה הקלינית מחשידה לפגמים בטסיות, יש לבצע מהלך אבחוני כוללני בהוספת בדיקות ייחודיות כגון platelet aggregometry המהווה מדד לשחרור טסיות, וכן flow cytometry, בדיקת platelet microRNAs , בירורים גנטיים וכן אנליזה של מסלולי מעבר איתותים (signal transduction) שהוא בשלב זה בעל אופי מחקרי בדרגת מיומנות גבוהה שאינו נהוג במרבית המעבדות הקליניות.

Platelet Aggregometry : מדידת כושר האיגור (aggregation) של טסיות.

שיטת LTA או light transmission aggregometry נחשבת "מדד זהב" בין שיטות מדידת התפקוד של טסיות-דם, והיא עדיין השיטה שנמצאת בשימוש רווח במעבדה הקלינית. השיטה מבוססת על הנעה (stirring) של PRP או platelet rich plasma בתוך cuvette הממוקמת בין מקור אור לבין גלאי. אחרי הוספה של פאנל של מספר אגוניסטים כמו קולגן, ADP, תרומבין, ristocetin, אפינפרין וחומצה אראכידונית, הטסיות עוברות איגור מה שמגביר את מעבר האור דרך ה-cuvette. כיוון שתרומבין הנחשב אמנם לאגוניסט פוטנטי של טסיות, מבקע גם פיברינוגן ליצירת פיברין ומגביר יצירת קריש, הוא אינו נחשב אגוניסט נוח לשימוש במדידת כושר האיגור של טסיות. לכן, במקום תרומבין ניתן להשתמש ב-TRAP או thrombin receptor activating peptide. המתווה של איגור טסיות נחשב כתגובה ראשונית לאגוניסטים אקסוגניים כאשר התגובה השניונית היא הפרשת התכולה של הגרנולות הדחוסות של הטסיות.

מבדק Platelet Aggregometry בודק באיזה מידה טסיות נצמדות זו לזו ליצירת קריש דם. טווח הייחוס של מבדק זה הוא מתווה נורמאלי דו-פאזי של איגור בתגובה למשפעלים ספציפיים של טסיות דם (ראה תרשים למטה):

יש לציין שהתגובה הדו-פאזית של תהליך האיגור יכולה להיות ממוסכת אם מוסיפים ריכוזים גבוהים מדי של אגוניסטים. הפרמטרים הנמדדים כוללים את קצב האיגור המבוטא ב-%/min, ואת המופע (amplitude) המרבי או את אחוז האיגור לאחר פרק זמן קבוע, בדרך כלל 6-10 דקות (Favaloro וחב' ב-Clin Chem Lab Med משנת 2010, ו-Kehrel ו-Brodde ב- Transfusion Med Hemotherapy משנת 2013).

שיטת LTA נותרת הטכניקה השימושית ביותר לאבחון מגוון רחב של פגמים בטסיות. החיסרון היחיד של טכניקה זו הוא השימוש בפלזמה עתירה בטסיות (PRP) במקום בדם מלא מה שמחייב סרכוז מיוחד, וכן בגין העובדה שבהיעדר תאי דם אדומים ולבנים, שיטת LTA אינה מודדת במדויק את ההמוסטאזיס הראשוני. כמו כן בשיטה זו נזקקים לנפח גדול של דגימת דם, היא ממושכת בביצוע וכן ישנם משתנים קדם-אנליטיים ואנליטיים רבים, המשפיעים על תוצאותיה.

שיטת LTA לא עברה סטנדרטיזציה, למרות העובדה שפורסמו הנחיות לביצועה. ההמלצות האחרונות של ה-SSC או תת-הוועדה של ועדת הסטנדרטיזציות של ה-International Society on Thrombosis and Haemostasis או(ISTH) זמינות לכל (Cattaneo וחב' ב-J Thromb prostasis משנת 2009 וכן באותו כתב עת משנת 2013, ו-Dawood וחב' ב-Blood משנת 2012). שיטות חלופיות כוללות aggregometry של דם מלא, או שיטת lumiaggregometry הוכנסו לשימוש, אך רובן לא אומצו במעבדות ואין בהם הוספה של מידע אבחוני נוסף.

המגבלות של מבדק LTA קונבנציונאלי עודדו פיתוח של שיטות תפקוד טסיות חדשות ופשוטות יותר לביצוע. השיטה הנפוצה כיום ביותר עושה שימוש ב-Platelet function analyzer מסוג PFA-100 או PFA-200 של חברת Siemens ב-Marburg גרמניה, המשמש גם עזר בבדיקות של זמן דימום. המכשיר מנטר את הירידה בקצב הזרימה, והזמן הנדרש לקבל סתימה מלאה של החריר מדווח כ-CT או closure time עד למקסימום של 300 שניות. מבדק זה של תפקוד טסיות קל לביצוע, אוטומטי ומהיר, ומשקף מספר מאפיינים של התפקוד הפיזיולוגי של טסיות, תוך שהוא מתבצע בדם מלא ולא ב-PRP (על פי Hayward וחב' ב-J Thromb Haemostasis משנת 2006, ו-Favloro ב-Sem Thromb Haemostasis משנת 2008).

לאחרונה נסקרו השימושים הקליניים של LTA, והם כוללים סריקה לאבחון מחלת von Willebrand, והניטור של טיפול במחלה זו, וכן זיהוי של פגמים מורשים או נרכשים של טסיות, ניטור של טיפול נוגד טסיות, והאישוש של סיכון הנובע מדימומים בעת פרוצדורה כירורגית. יחד עם זאת, CT מושפע מספירת הטסיות וההמטוקריט, ויש לו ספציפיות נמוכה לכל מפגע ייחודי של טסיות הדם. לכן, תוצאות נורמאליות של CT יכולות לשמש בדרגת ביטחון סבירה לשלול מספר מפגעים תפקודיים חמורים של טסיות כמו vWD חמורה, אך אין בהן לשלול חסר מתון של vWF או מפגעי טסיות מתונים.

אינטרפרטציה של תוצאות מבדק איגור טסיות:

ירידה באיגור טסיות עשויה להיות כרוכה במפגעים הבאים: א. מפגעים אוטו-אימוניים בהם נוצרים נוגדנים עצמיים כנגד טסיות; ב. תסמונת Bernard-Soulier הנדירה בה חסר ב-GpIb המהווה קולטן ל-vWF פוגע ביצירת הקריש; ג. הצטברות של תוצרי פירוק של פיברין; ד. Glanzmann thrombasthenia שהיא פגיעה נדירה ביכולת האיגור של טסיות כתוצאה מחסר או מפגם ב-GpIIb/IIIa המשמש קולטן לפיברינוגן וכך נפגע הקשר בין טסיות לטסיות אחרות ונפגעת היווצרות הקריש; ה. שימוש בתרופות החוסמות יצירת טסיות (thiazide diuretics, אינטרפרון, אלכוהול) ; ו. מפגעים בשגשוג תאים מייאלואידיים; ז. Storage pool disease בה נפגעת יכולת הגרנולות בטסיות להכיל ולהפריש ADP המסייע לאיגורן ; ח. אורמיה כתוצאה מאי-ספיקת כליות; ט. מחלת von Willebrand, בה יצירה מופחתת של vWF מפחיתה את יכולת הספיחה של טסיות לכלי הדם הפגועים מה שמגביר איבוד דם.

(להכניס כאן את הטבלה בשפה העברית)

מבדק flow cytometry:

מבדק זה המתבצע בדם מלא, מהווה טכניקת מעבדה עוצמתית ופופולארית לאשש תפקוד טסיות ואת השפעול שלהן על ידי שימוש בקרינת laser לקבוע את החלבונים הנמצאים על שטח פני הטסיות, וכיצד חלבונים אלה עוברים שינוי בעת שפעול הטסיות. למרות שטכניקה זו דורשת ציוד מתוחכם, כמו גם נוגדנים חד-שבטיים, ולמרות שלא עברה סטנדרטיזציה מלאה, יש לה מספר יתרונות הכוללות צורך בנפח קטן של דם מלא, ואי תלות במספר הטסיות. המבחנים השכיחים ביותר לביצוע שיגרתי של flow cytometry הם הכימות של סטאטוס קולטן GP של הטסיות, כמו גם קביעת ההרכב של הגרנולות בטסיות. מכשיר flow cytometer יכול לכמת חסרים של GP IIb/IIIa בתסמונת Glanzmann’s thrombasthenia, וחסרים ב-GP Ib/IX/V בתסמונת Bernard-Soulier. מכשיר זה תוכנן גם למדוד את הגרנולות הדחוסות על ידי קליטה ושחרור של mepacrine, שהוא חומר פלואורסצנטי ירוק הנקלט על ידי טסיות ונאגר בגרנולות הדחוסות שלהן (על פי Wall וחב' ב-Brit J Hematol משנת 1995).

מדידת flow cytometry מאפשרת את האנליזה של תפקודם של תאי טסיות בודדים, ואת מדידת הביטוי של סמנים של שפעול טסיות אינדיבידואליות כמו גם כימות הקשר בין טסיות ותאי דם אחרים. הסמנים השכיחים ביותר של שפעול טסיות שניתן לבדוק ב-flow cytometry הם ביטוי של P-selectin על פני הטסיות (כסמן של הפרשת α-granules), מדידת בעזרת הנוגדן החד-שבטי PAC-1 של השינוי המבני של GP IIb/IIIa לצורתו הפעילה כתוצאה משפעול הטסיות, יצירת קוניוגציות בין טסיות לתאי-דם לבנים, בחינה של microparticles, חשיפתם של פוספוליפידים טעונים שלילית על פני טסיות כמדד של פעילות קדם-קואגולנטית, והזרחון של VASP-P או vasodilator-stimulated hosphoprotein-phosphorylation, וכן כמדד לקולטן P2Y12 המתבטא לאחר שפעול טסיות, בעזרת המכשיר של BioCytex מ-Marseille, צרפת (Williams וחב' ב-Thromb Haemostasis משנת 2010, וכן Hezardוחב' ב-Cardiovasc Hematol Disorders-Drug Targets משנת 2010 ו-Dahlen וחב' ב-Thrombo Haemostasis משנת 2013).

מבדק Viscoelastometry הידוע גם כ-Thromboelastometry:

קרישי דם צריכים להיות חזקים דיים לעצור שטפי דם ולמנוע דימום נוסף עד לחסימת הפציעה בכלי הדם. מבדק זה מתוכנן לקבוע את החוזק של קריש הדם בעת יצירתו. בדיקה זו מתבצעת בדרך כלל במעבדות של מרכזים רפואיים גדולים.

מבדקים אחרים של POCT או point-of-care testing:

מבחני תפקוד טסיות תופסים חלק הולך וגדל ככלים לניבוי דימומים או לצורך ניטור יעילותם של תכשירים מונעי קרישת דם. מספר הולך וגדל של אנשים מטופלים כיום עם תרופות נוגדות-טסיות, מה שמגביר את הסיכון לתרחישי דמם. מבדק LTA המסורתי עדיין חיוני להערכה של מפגעי טסיות, אך הוא קשה לביצוע במצבים של טיפולים דחופים וחריפים. כיום יש מגמה לתכנון מכשור פשוט וקל יותר לתפעול של POCT המתבצע מחוץ למעבדה הקלינית, "ליד מיטת החולה". נתאר כאן 2 מכשירים יציגים כאלה: א. Impact cone and plate analyzer (המיוצר על ידי DiaMed ב-Cressier, שוויץ); ב. Thromboelastography או TEG (המיוצר על ידי Hemoscope ב-Niles, IL, USA על פי Afshari וחב' ב-Cochrane Database System Rev משנת 2011, ו-Kim וחב' ב-Lab Med משנת 2013.

מכשיר ה-Impact cone תוכנן במקור לניטור של ספיחת טסיות למשטח של polystyrene. המכשיר מכיל מיקרוסקופ, והוא מבצע צביעה ואנליזה של מבנה טסיות הנספחות ועוברות איגור תחת shear rate גבוה של 1800/שנייה. התוצאה מדווחת כאחוז המשטח המכוסה על ידי טסיות, וכן הגודל הממוצע של החלקיקים הנספחים. הספיחה תלויה ב-vWF, בקישור פיברינוגן וב-GP Ib and IIb/IIIa של הטסיות. המבדק אוטומטי במלואו, פשוט ומהיר לביצוע, תוך צורך בנפח קטן של דם. נתונים ניסויים מרמזים לכך שה-Impact cone יכול לגלות מספר פגמים של טסיות או ב-vWF, וניתן להשתמש בו באופן פוטנציאלי לצורך בדיקת סריקה. מבדק TEG ומבדק נוסף הידוע כ-rotational thrombelastometry או ROTEM המתבצע במכשיר של חברת Pentapharm GmbH ממינכן, גרמניה, מודד את התכונות הפיסיקאליות של הקרישים הנוצרים על ידי שימוש ב-oscillating cup שיכול לטפל סימולטאנית במספר דגימות דם. TEG מספק נתונים שונים המתייחסים ליצירת פיברין, התפתחות קריש הדם, כמו גם נתונים על החוזק והיציבות של קריש הפיברין, וכן על תהליך הפיברינוליזה. היתרונות המיוחדים של TEG/POTEM הם ביכולתם לתת תיאור מלא של יצירת הקריש והאינטראקציה בינו לבין אלמנטים שונים בדם המלא בפרט בעת יצירת קריש. מכשור זה מופעל בחדרי ניתוח הרדמה והתאוששות לקביעה של סכנת דימום והצורך בעירויי דם. אנליזה זו נמשכת לפחות 30 דקות. היא מתבצעת בבתי חולי גדולים או בחדר הניתוח או כגבדיקת point-of-care במעבדה הקלינית (Afshari וחב' ב-Cochrane Database Syst Rev משנת 2011).

ניטור טיפולים תרופתיים נוגדי טסיות:

ככל שמתרבה השימוש בתכשירים נוגדי-טסיות גדלה החיוניות באופטימליזציה של היחס סיכון/תועלת במטופלים. הטיפול המודרני בתכשירים נוגדי-טסיות מבוסס על שלושה מסלולים עיקריים של שפעול תאים אלה: א. עיכוב האנזים cyclooxygenase-1 המביא להפחתת thromboxane A-2 ; ב. עיכוב P2Y12) ADP); ג. חסימת הקולטן GP IIb/IIIa (על פי Close ב Fundamental Clin Pharmacol משנת 2012, וכן Tobin וחב' ב-Eur J Neurol משנת 2013 ו-Capodanno וחב' ב-J Thromb Haemostasis משנת 2013). ראוי לציין שגם מקרים בהם התגלתה עמידות לטיפולים נוגדי טסיות, כמו גם בטיפול המשולב של אספירין ו-clopidogrel, נעשה שימוש במבדקים של תפקודי טסיות לנסות ולהבין עמידות זו (Woo וחב' ב-Korean J Lab Med משנת 2010).

בעשור האחרון התקבלה עדות משכנעת ממספר ניסוים תצפיתיים שהדגימה קשר חזק בין פעילות טסיות גבוהה (HPR) ו-ADP, כמו גם עם אירועים איסכמיים לאחר פרוצדורות PCI, ובעיקר פקקת הנגרמת בגין שתילת תומכן. ה-AHA, ה-American College of Cardiology וה-European Society of Cardiology פרסמו המלצה בדרגה IIb לבצע בדיקות תפקוד טסיות לסייע בבחירה של מעכב P2Y12 באלה בסיכון גבוה בין העוברים PCI, אם כי לא מומלץ על ביצוע שגרתי של בדיקות אלו (המלצה class III).

לאחרונה גופים אלה עדכנו מסמך קונצנזוס עם ערכי סף עבור high plateket reactivity או HPR ו-low platelet reactivity או LPR ל-ADP, ערכים שעשויים לשמש מחקרים עתידיים של תרפיה-מותאמת-אישית כנגד טסיות. LPR ל-ADP הכרוכה כנראה בסכנת דימום. לכן, שלושת הגופים האמורים הציעו "חלון תרפויטי" עבור טיפולים במעכבי P2Y12 (על פי Bonello וחב' ב- J Am College of Cardiol משנת 2010, וכן Aradi וחב' ב- Eur Heart J משנת 2014 ו-Tantry וחב' ב- J Am College of Cardiol משנת 2013).

המבדקים השכיחים ביותר במסגרת מבחני תפקוד טסיות ידועים כ-VerifyNow P1Y12 assay של חברת Accumetrics בסן-דיגו, קליפורניה, וכיום גם באנלייזר סורק multiplate של Hoffmann-La-Roche בבאזל, וכן VASP assay, בהם התגברו על רבות מהמגבלות הטכניות של השיטות הקודמות, כולל שיטת LTA הקונבנציונאלית. לכן, בעת הזו נקבע setting לערכי HPR ו-LPR על פי הקריטריונים הבאים, בהתאמה: (א) 208< ו-85> יחידות פעילות של P2Y12 במבדק VerifyNow P2Y12; (ב) 50%< ו-16%> של platelet reactivity index בשיטת VASP-P; (ג) 46< ו-19> יחידות איגור אקראיות בתגובה ל-ADP בסורק multiplate (על פי Zhang וחב' ב-Platelets משנת 2013).

מבדק PMP או Platelet-Derived Microparticles:

מיקרו-חלקיקים הנעים בצירקולציה מוגדרים כ-vesicles קטנים של פוספוליפידים שהקוטר שלהם נע בין 0.1-1.0 מיקרון, ומקורם בסוגי תאים שונים כגון טסיות, אריתרוציטים, לויקוציטים, תאי אנדותל ותאי שריר חלק וסקולאריים (Prokopi וחב' ב-Blood משנת 2009). מיקרו-חלקיקים נבדלים מ-exosomes, שהם וסיקולות קטנות יותר (40-100 ננומטר) שמקורם בממברנות אנדופלזמיות ומגופיפים שנוצרו בעת אפופטוזיס שגודלם מעל 1.5 מיקרון, והמכילים מרכיבים גרעיניים. מיקרו-חלקיקים נושאים חלבוני שטח פנים ומכילים גם חומר ציטופלזמטי של תאי-אם, וכן פוספוליפידים (בעיקר פוספטידיל-סרין) (Mause ו-Weber ב-Circulation Res משנת 2010, ו-Aatonen וחב' ב-Thromb Hemostasis משנת 2012).

במצבים של steady-state מיקרו-חלקיקים שמקורם בטסיות דם ובמגה-קריוציטים, הם המיקרו-חלקיקים הנפוצים ביותר, ומהווים עד 70-90% מכלל המיקרו-חלקיקים בצירקולציה (Italiano Jr וחב' ב-Curr Opin Hematol משנת 2010). רמת PMP מראה הבדלים מגדריים, כאשר הערכים גבוהים יותר בנשים מאשר בגברים, ואכן ישנם גם הבדלים הקשורים למחזור החודשי. ערכי PMP גדלים עם ההזדקנות, אך גם לאחר פעילות גופנית מאומצת, תוך הגברה של הפוטנציאל ההמוסטאטי. בערך 25% מהפעילות התומכת בקרישה של טסיות משופעלות, כרוכה עם מיקרו-חלקיקים המשתחררים בעת שפעול טסיות, כאשר שטח הפנים של הטסיות יכול להיות פי 50-100 יותר פרו-קואגולנטי מאשר זה של טסיות לא משופעלות. כמויות קטנות של PMP משתחררות באופן מתמשך מטסיות במנוחה, אך תהליך זה מואץ ביותר לאחר שפעולן או לאחר פעילות גופנית אינטנסיבית.
התכונות התרומבוגניות של PMP אושרו בניסויים רבים, כאשר רמות גבוהות של PMP כרוכות בחוזקה עם מצביים קרישתיים רבים. PMP היו מוגברים משמעותית במטופלים עם תסחיף פקקתי לריאות (PE), תרחיש בו הם היו המקור העיקרי של MP פרו-קואגולנטים. לדוגמה, בתרחיש של valvular atrial fibrillation, המהווה סיכון גבוה ל- thromboembolism, המספרים של PMP היו מוגברים יותר מאשר פי-3. רמות מוגברות של PMP היו כרוכות גם במצבי מחלות אחרות כולל thrombocytopenia מושרית על ידי הפארין, פקקת עורקית, ITP, תרומבוציטופניה תרומבוטית, מחלת תאים חרמשיים, uremia, ממאירות ודלקת מפרקים שגרונית (RA). כמו כן, PMP נכרכו גם בפתוגניות של טרשת עורקים כמו גם בוויסות של אנגיוגניות (Shantsila וחב' ב-J Thromb Haemostasis משנת 2010, וכן França וחב' ב-Circulation משנת 2012, ו- Biasucci וחב' באותו כתב עת באותה שנה, וכן Lackner וחב' ב-Stroke משנת 2010).
למרות שהמשמעות הפיזיולוגית של PMP הודחקה משך שנים רבות, מחקר עדכני מצביע על כך שחלקיקים זעירים אלה עשויים לשחק תפקיד חשוב בטרנספורט ובהעברה של מולקולות פעילות ביולוגית ואיתותים ברחבי הגוף כולו. MP יכולים להשפיע על תאי היעד שלהם או על ידי גירוי ישיר שלהם דרך ליגנדים המבוטאים על פני תאים אלה, או על ידי העברה של קולטנים של פני תאים מתא אחד למשנהו. כיוון שחלקיקי MP נעטפים בעת יצירתם על ידי מרכיבים ציטופלזמטיים, הם נושאים חלבונים ו-RNA שמקורם בציטוזול של תא האם, אותם הם מעבירים לתא היעד.
מספר שיטות מעבדה לאנליזה של PMP פורסמו, אך השיטה הנפוצה ביותר כיום היא שיטת flow cytometry. למרות מספר הפרסומים הגדול על PMP, חוסר סטנדרטיזציה של השיטה מקשה על ההשוואה בין תוצאות הפרסומים השונים. סקר של תת-ועדה של ISTH Vascular Biology הראה שבערך 75% מהמעבדות משתמשות ב-flow cytometry לבחינת דגימות קליניות. יחד עם זאת, מגוון רחב של משתנים קדם-אנליטייים ואנליטיים, גורמים לתחום רחב של ערכי PMP בפלזמה חופשית מטסיות (PFP) באנשים בריאים (Robert וחב' ב- J Thromb Haemostasis משנת 2009, וכן Mobarrez וחב' ב-Thrombosis Res משנת 2010, ו-Lacroix וחב' ב-J Thromb Haemostsis משנת 2010).
שלוש תת-ועדות של ISTH (המתייחסות לביולוגיה וסקולארית, ל-DIC או Disseminated Intravascular Coagulation ול-Haemostasis and Malignancy) יזמו פרויקט להביא
לסטנדרטיזציה של מדידת MP על ידי flow cytometer. איסטרטגיה זו מבוססת על שימוש בכדוריות (beads) תת-מיקרומטריות, הידועות כ-Megamix beads של חברת BioCytex הצרפתית מ-Marseille, המאפשרים אנליזה הדירה של MP.
מבדק MicroRNAs או miRNA של טסיות:
miRNA הוא מקטע קטן של RNA "לא מקודד" המכיל 21-23 נוקלאוטידים, שתפקידו בוויסות של בערך 60% של הגנים המקודדים לחלבונים ביונקים, לפחות באופן חלקי על ידי הדיכוי של תרגום RNA (על פי Dangwal ו-Thum ב-Thromb Haemostasis משנת 2012). טסיות משופעלות מפרישות כאמור MP עשירים במגוון של גורמי גדילה או בחלבונים מפעילים בעלי השפעות חוץ-תאיות (Edelstein וחב' ב-J Thromb Haemostasis משנת 2013). למרות שטסיות חסרות גרעין או DNA גנומי, תאים אלה יכולים לתרגם mRNA מוּרש ליצירת חלבונים. מעניין לציין שטסיות מקבלות בהורשה חלבונים הקשורים לעיבוד של miRNA, בנוסף לעותקים (transcripts) שמקורם בתאי האם של הטסיות, המגה-קריוציטים (Willeit וחב' ב-Circulation Res משנת 2013).
דיווח עדכני על תכולת miRNA ב-MP מראה ש-PMP יכולים לשאת את מטען ה-miRNA של הטסיות, אל אזורי היעד שלהם במערכת הקרדיו-וסקולארית. יתרה מכך, טסיות-מפרישות-miRNA יכולות לתרום למאגר ה-miRNA, הפכו נושא מחקרי של אלה התרים אחר ביו-סמנים הקשורים עם מצבים פתולוגיים שונים (Zampetaki וחב' ב-J Am Coll Cardiol משנת 2012, ו-Grasedieck וחב' ב-Blood משנת 2013).
סריקה בשיטת microarray גלתה ש-miR-24, miR-223, miR-197, miR-126 ו-miR-21, הם בין ה-miRNAs המבוטאים ביותר בטסיות וב-PMP. רמותיהם בצירקולציה למעשה תואמים את רמות PMP כפי שניתן לכימות על ידי flow cytometry. הרמות של miR-340 ו-miR-624 נמצאו מוגברות משמעותית בטסיות ממטופלים הסובלים ממחלת לב כלילית בגיל צעיר. בדומה, ביטוי-יתר של miR-28 נמצא בטסיות שהושגו מחולים עם מחלות סרטניות מיאלו-פרוליפרטיביות.
מעניינת מציאותם בטסיות של למעלה מ-750 מתוך כ-2,000 סוגי miRNAs הידועים באדם. ל-miRNA יש תפקיד מבוסס בהמטופויאזה כמו גם ביצירתם של מגה-קריוציטים; לכן נראה ש-miRNAs בטסיות עשויים לשמש כסמנים וכלים להבנת מנגנונים של ביטוי גנים במגה-קריוציטים ובטסיות. כיוון שהתרגום של miRNA הוא המנגנון היחיד לסינתזה של חלבונים חדשים, יש להניח ש-miRNA ממקור טסיות משחק תפקיד בתפקוד התקין כמו גם במפגעים של המוסטאזיס ושל יצירת פקקת.
(להכניס כאן את הטבלה בשפה האנגלית)
== הוראות לביצוע הבדיקה ==
דגימת הדם: 4 מ"ל של דם מלא הנלקח במבחנת סודיום ציטראט (פקק תכול). ארבע מבחנות נדרשות למדידה של platelet aggregation. שבע מבחנות נדרשות למדידה של איגור והפרשת טסיות. יש לבצע את הבדיקות תוך 4 שעות מנטילת הדם. לתקופת ההמתנה לפני ביצוע הבדיקות הדגימות צריכות להימצא בטמפרטורת החדר שכן קירור הדגימות עלול לגרום לשפעול הטסיות. בדיקות נוספות רלוונטיות לביצוע יחד עם מבדק זה הן ספירת דם מלאה (CBC), ספירת טסיות, PT, PTT, ביופסיה של מח עצם, גורמי קרישה וגורם von Willebrand.
מספר תרופות יכולות להשפיע על תוצאות המבדק, אפילו אם נעשה בהן שימוש עד שבועיים לפני המבדק, לכן יש להימנע מצריכת תרופות אלה במידת האפשר כשבוע-שבועיים לפני הבדיקה. תרופות אלה כוללות: תכשירים אנטיביוטיים דוגמת פניצילינים, צפלוספורינים ו-nitrofurantoin; אנטי-היסטמינים, אספירין, clopidogrel, dipyridamole, נוגדי דיכאון תלת-ציקליים, ticlopidine, תרופות ממשפחת NASID כמו ibuprofen ו-naproxen, וכן theophylline ומעכבי COX-2 כגון celecoxib.

מבחני תפקוד טסיות-דם - Platelet Function Tests

2015-10-26T14:03:26Z

בן עמי סלע: יצירת דף עם התוכן "== מבחני תפקוד טסיות-דם -Platelet Function Tests == כינויים נוספים: Platelet Aggregation Studies ;PFT ;Platelet Function Test ,P..."

== מבחני תפקוד טסיות-דם -Platelet Function Tests ==

כינויים נוספים: Platelet Aggregation Studies ;PFT ;Platelet Function Test ,Platele Function Assay; PFA
מעבדה: המטולוגיה בדם.
יוצר הערך: פרופ' בן-עמי סלע.

== מטרת הבדיקה ==

סיוע לקביעת הסיבה לדימום-יתר, או לזיהוי של פגם תפקודי של טסיות הדם. כמו כן בדיקות אלו חיוניות בניטור הנוכחות והיעילות של תרופות נוגדות-טסיות. המבדקים הללו רלוונטיים כאשר יש נטייה לדימומים תת-עוריים בכל פציעה קלה, הופעת המאטומות מסיביות, או לאלה הנוטלים תכשירים העלולים להשפיע על פעילות הטסיות. כמו כן ניתן לבצע מבדקים אלה לפני פרוצדורות ניתוחיות, כאמצעי פרופילקטי. כמו כן עשויים מבדקים אלה לגלות עמידות לאספירין. כן יש לשקול מבדקים אלה במקרים של דימומים כרוניים מהאף, דימומים מסיביים בעת המחזור, חניכיים מדממים או דימומים מסיביים בטיפולי שיניים.

== בסיס פיזיולוגי ==

טסיות-דם מיוצרות במח העצם ונעות בצירקולציה. כאשר יש פציעה או נזק לכלי-דם ומתחיל דימום, טסיות הדם מסייעות לעצור את הדימום בשלוש דרכים: הן נספחות לאזור הפגיעה; הן נצמדות לטסיות אחרות בתהליך של איגור (aggregation); הן משחררות חומרים המעודדים את המשך האיגור.
פרט להמוסטאזיס ולפקקת, מספר גדל והולך של מחקרים מצביעים על כך שתרומבוציטים או platelets ולהלן טסיות דם, הן בעלות תפקיד אינטגראלי בקשר בינתאי, הן מתווכות של תהליכי דלקת ויש להן תפקיד במודולציה של תגובות חיסוניות. טסיות-דם, הם תאים נטולי גרעין המצויים בצירקולצית הדם. מקורם של פרגמנטים תאיים אלה הם מגה-קריוציטים במח העצם.

האנדותל הווסקולארי הנורמאלי מייצר מעכבים פוטנטיים של טסיות-דם כגון חד-תחמוצת החנקן (NO), פרוסטציקלין, ו-ADPase. ברגע שמרכיבים תת-אנדותליאליים הכוללים קולאגן, פיברונקטין, למינין, או גורם von Willebrand (להלן vWF) נחשפים כתוצאה מפציעה של דופן כלי הדם, טסיות-דם עוברות סדרה של ריאקציות תפקודיות מבוקרות באופן קפדני, כגון ספיחה, התפשטות, הפרשת מרכיבים פנימיים של טסיות הדם, איגור, פעילות מסייעת לקרישת דם, יצירה של מיקרו-חלקיקים, ולבסוף התכווצות יצירת קריש הדם. ספיחת טסיות (adhesion) מתבצעת בתיווך של אינטראקציה בין קומפלקס הקולטן glycoprotein (GP) Ib/V/IX על פני ממברנת טסיות הדם, לבין הגורם vWF, והאינטראקציה של GP VI ו-GP Ia עם קולגן באזורים של הנזק הוסקולארי (Jennings ב- J Thromb Hemostasis משנת 2008).

הגופיפים הדחוסים מכילים adenine nucleotides מסוג ADP ו-ATP וכן סרוטונין, המשרים את תהליך האיגור והצימות (aggregation), כיווץ כלי הדם, יצירת ציטוקינים וכן modulators של תהליך דלקת. הליזוזומים מכילים אנזימים פרוטאוליטיים וכן אנזימים המבקעים רב סוכרים ואוליגו-סוכרים, ובכך הם יכולים לסייע לפינוי פתוגנים, לפירוק של משתית (matrix) חוץ-תאית, ולתרום לפינוי של חלקיקי פקקת המורכבת מטסיות-דם, כמו גם לסייע בפירוק של הפארין (Jenne וחב' ב- Int J Lab Hematolמשנת 2013).

מספר מסלולים משתתפים בשפעול של הטסיות, תוך השתתפות של קולגן, ADP, סרוטונין, thromboxane A2, אפינפרין ו-thrombin. הפעולה המשותפת של מולקולות משפעלות אלו גורמת לגיוס של טסיות מהצירקולציה, ולמספר התבטאויות ברורות של שפעולן של הטסיות כגון שינויים בצורת הטסיות, התבטאות יתר של פעילות P-selectin, של הליגנד המסיס CD40, ושל קדם-קואגולנט של הטסיות, כמו גם המרה של GP IIb/IIIa לצורתו הפעילה. כידוע, GP IIb/IIIa הוא הקולטן המרכזי של טסיות הדם המתווך באיגור של תאים אלה.

רק הקומפלקס GP IIb/IIIa המשופעל מסוגל לקשור פיברינוגן מסיס בפלזמה ולגרום לאיגור ול-spreading נוסף של הטסיות המשופעלות באזור בפגיעה הוסקולארית. לכן, שלב האיגור תלוי באופן קריטי בקולטנים הקשורים לחלבוני G, והוא מתווך על ידי גשרים בין פיברינוגן וגורם von Willebrandלבין קומפלקסים משופעלים של GP IIb/IIIa על פני תאי טסיות שכנים ומשופעלים אף הם (Clemeston ב-Thrombosis Res משנת 2012, ו-Abbate וחב' באותו כתב עת באותה שנה). החשיפה של פוספוליפידים אניוניים (בעיקר פוספטידיל-סרין) מספקת משטח עליו הטסיות יכולות לסייע לתרומבין. אנזים מפתח זה של מפל (cascade) הקרישה, והאגוניסט הפוטנטי ביותר של טסיות הדם, פועל על ידי ביקוע הקולטנים המשופעלים על ידי פרוטאזות. פרץ פעילות התרומבין מוביל לשפעול מתמשך של קולטנים אלה ולגיוס טסיות לסביבה הקרובה תוך השתתפות של לויקוציטים דרך הקולטנים שלהם ל-P-selectin. לאחר היווצרות הקריש, הטסיות המשופעלות עוברות רה-ארגון על ידי כיווץ של השלד הפנימי שלהן (cytoskeleton) המורכב מ-actin/myosin, מה שגורם להצטמקות הקריש.

במצב של steady state מגה-קריוציטים מספקים בערך 1011 טסיות דם ביום עם תחלופת הטסיות אחת ל- 8-9 ימים. תהליך זה מושפע משינויים סביבתיים אחדים, מה שמביא את רמת טסיות דם בפלזמה ל-150-400 מיליון לסמ"ק. טסיות-דם במצב מנוחה הם תאים דיסקואידיים קטנים (2-4 מיקרומטר באורכם ו-0.5 מיקרומטר ברוחבם), מה שמאפשר תנועתם והיספחותם אל דופן כלי הדם, שם הם מפקחים באופן תמידי על שלמות האנדותל הוסקולארי. טסיות-דם מכילות 3 סוגים של גראנולות: α-granules, גופיפים דחוסים וליזוזומים. ה-α-granules הן השכיחות ביותר בטסיות הדם, והן עוברות במהירות אקסוציטוזה בעת השפעול שלהן על מנת לעודד המוסטאזיס ודלקת.

הגופיפים הדחוסים מכילים adenine nucleotides מסוג ADP ו-ATP וכן סרוטונין, המשרים את תהליך האיגור והצימות (aggregation), כיווץ כלי הדם, יצירת ציטוקינים וכן modulators של תהליך דלקת. הליזוזומים מכילים אנזימים פרוטאוליטיים וכן אנזימים המבקעים רב סוכרים ואוליגו-סוכרים, ובכך הם יכולים לסייע לפינוי פתוגנים, לפירוק של משתית (matrix) חוץ-תאית, ולתרום לפינוי של חלקיקי פקקת המורכבת מטסיות-דם, כמו גם לסייע בפירוק של הפארין (Jenne וחב' ב-Int J Lab Hematol משנת 2013).

בחינת תפקוד טסיות:

רוב המבדקים של תפקוד טסיות הדם, נועדו באופן מסורתי לאבחון והתנהלות במקרי מטופלים עם בעיות של דימום-יתר. בניגוד לפגמים בתהליך הקרישה, בהם בדיקות כגון "זמן פרותרומבין" (PT) או activated partial thromboplastin time) aPTT), שעברו סטנדרטיזציה ואוטומטיזציה מלאה, מבחני תפקוד הטסיות נחשבים עדיין מבדקים עתירי זמן ביצוע, ומייגעים יותר, הדורשים מכשור מיוחד ואנשי מעבדה מיומנים בתחום זה. הזיהוי במעבדה של פגמי hemostasis הכוללים כשלים בתפקוד הטסיות דורשים נכון להיום תהליכי מעבדה רב-שלביים.

כיוון שטסיות דם כרוכות באותה מידה גם במפגעי atherothrombosis, נכנסים לשגרת המעבדה מבדקים חדשים למדידת תפקוד הטסיות, כדי לנטר את יעילותם של תרופות נוגדות-טסיות, במטרה לנבא אירועי תופעות של דימום או קרישת-יתר במחלות פקקתיות בעורקים. ראשית דבר, חיוניים במיוחד פרטים על תולדות המחלה, וזהות תכשירים ותרופות בעבר הקרוב ובהווה. בדיקות המעבדה מתחילות בדרך כלל על ידי ביצוע ספירת דם מלאה (CBC), בדרך כלל ביחד עם בחינה מיקרוסקופית של משטח דם, בעיקר אם מתקבלת תוצאה חריגה לגבי הספירה של טסיות הדם, כגון MPV או mean platelet volume וכן PDW או platelet distribution width. ברוב המעבדות מתבצע פאנל של בדיקות screening כאשר קיים חשד לפגמים ב-hemostsis. אם מבחני סריקה אלה מתקבלים תקינים, אך האינדיקציה הקלינית מחשידה לפגמים בטסיות, יש לבצע מהלך אבחוני כוללני בהוספת בדיקות ייחודיות כגון platelet aggregometry המהווה מדד לשחרור טסיות, וכן flow cytometry, בדיקת platelet microRNAs , בירורים גנטיים וכן אנליזה של מסלולי מעבר איתותים (signal transduction) שהוא בשלב זה בעל אופי מחקרי בדרגת מיומנות גבוהה שאינו נהוג במרבית המעבדות הקליניות.

Platelet Aggregometry : מדידת כושר האיגור (aggregation) של טסיות.

שיטת LTA או light transmission aggregometry נחשבת "מדד זהב" בין שיטות מדידת התפקוד של טסיות-דם, והיא עדיין השיטה שנמצאת בשימוש רווח במעבדה הקלינית. השיטה מבוססת על הנעה (stirring) של PRP או platelet rich plasma בתוך cuvette הממוקמת בין מקור אור לבין גלאי. אחרי הוספה של פאנל של מספר אגוניסטים כמו קולגן, ADP, תרומבין, ristocetin, אפינפרין וחומצה אראכידונית, הטסיות עוברות איגור מה שמגביר את מעבר האור דרך ה-cuvette. כיוון שתרומבין הנחשב אמנם לאגוניסט פוטנטי של טסיות, מבקע גם פיברינוגן ליצירת פיברין ומגביר יצירת קריש, הוא אינו נחשב אגוניסט נוח לשימוש במדידת כושר האיגור של טסיות. לכן, במקום תרומבין ניתן להשתמש ב-TRAP או thrombin receptor activating peptide. המתווה של איגור טסיות נחשב כתגובה ראשונית לאגוניסטים אקסוגניים כאשר התגובה השניונית היא הפרשת התכולה של הגרנולות הדחוסות של הטסיות.

מבדק Platelet Aggregometry בודק באיזה מידה טסיות נצמדות זו לזו ליצירת קריש דם. טווח הייחוס של מבדק זה הוא מתווה נורמאלי דו-פאזי של איגור בתגובה למשפעלים ספציפיים של טסיות דם (ראה תרשים למטה):

יש לציין שהתגובה הדו-פאזית של תהליך האיגור יכולה להיות ממוסכת אם מוסיפים ריכוזים גבוהים מדי של אגוניסטים. הפרמטרים הנמדדים כוללים את קצב האיגור המבוטא ב-%/min, ואת המופע (amplitude) המרבי או את אחוז האיגור לאחר פרק זמן קבוע, בדרך כלל 6-10 דקות (Favaloro וחב' ב-Clin Chem Lab Med משנת 2010, ו-Kehrel ו-Brodde ב- Transfusion Med Hemotherapy משנת 2013).

שיטת LTA נותרת הטכניקה השימושית ביותר לאבחון מגוון רחב של פגמים בטסיות. החיסרון היחיד של טכניקה זו הוא השימוש בפלזמה עתירה בטסיות (PRP) במקום בדם מלא מה שמחייב סרכוז מיוחד, וכן בגין העובדה שבהיעדר תאי דם אדומים ולבנים, שיטת LTA אינה מודדת במדויק את ההמוסטאזיס הראשוני. כמו כן בשיטה זו נזקקים לנפח גדול של דגימת דם, היא ממושכת בביצוע וכן ישנם משתנים קדם-אנליטיים ואנליטיים רבים, המשפיעים על תוצאותיה.

שיטת LTA לא עברה סטנדרטיזציה, למרות העובדה שפורסמו הנחיות לביצועה. ההמלצות האחרונות של ה-SSC או תת-הוועדה של ועדת הסטנדרטיזציות של ה-International Society on Thrombosis and Haemostasis או(ISTH) זמינות לכל (Cattaneo וחב' ב-J Thromb prostasis משנת 2009 וכן באותו כתב עת משנת 2013, ו-Dawood וחב' ב-Blood משנת 2012). שיטות חלופיות כוללות aggregometry של דם מלא, או שיטת lumiaggregometry הוכנסו לשימוש, אך רובן לא אומצו במעבדות ואין בהם הוספה של מידע אבחוני נוסף.

המגבלות של מבדק LTA קונבנציונאלי עודדו פיתוח של שיטות תפקוד טסיות חדשות ופשוטות יותר לביצוע. השיטה הנפוצה כיום ביותר עושה שימוש ב-Platelet function analyzer מסוג PFA-100 או PFA-200 של חברת Siemens ב-Marburg גרמניה, המשמש גם עזר בבדיקות של זמן דימום. המכשיר מנטר את הירידה בקצב הזרימה, והזמן הנדרש לקבל סתימה מלאה של החריר מדווח כ-CT או closure time עד למקסימום של 300 שניות. מבדק זה של תפקוד טסיות קל לביצוע, אוטומטי ומהיר, ומשקף מספר מאפיינים של התפקוד הפיזיולוגי של טסיות, תוך שהוא מתבצע בדם מלא ולא ב-PRP (על פי Hayward וחב' ב-J Thromb Haemostasis משנת 2006, ו-Favloro ב-Sem Thromb Haemostasis משנת 2008).
לאחרונה נסקרו השימושים הקליניים של LTA, והם כוללים סריקה לאבחון מחלת von Willebrand, והניטור של טיפול במחלה זו, וכן זיהוי של פגמים מורשים או נרכשים של טסיות, ניטור של טיפול נוגד טסיות, והאישוש של סיכון הנובע מדימומים בעת פרוצדורה כירורגית. יחד עם זאת, CT מושפע מספירת הטסיות וההמטוקריט, ויש לו ספציפיות נמוכה לכל מפגע ייחודי של טסיות הדם. לכן, תוצאות נורמאליות של CT יכולות לשמש בדרגת ביטחון סבירה לשלול מספר מפגעים תפקודיים חמורים של טסיות כמו vWD חמורה, אך אין בהן לשלול חסר מתון של vWF או מפגעי טסיות מתונים.
אינטרפרטציה של תוצאות מבדק איגור טסיות:
ירידה באיגור טסיות עשויה להיות כרוכה במפגעים הבאים: א. מפגעים אוטו-אימוניים בהם נוצרים נוגדנים עצמיים כנגד טסיות; ב. תסמונת Bernard-Soulier הנדירה בה חסר ב-GpIb המהווה קולטן ל-vWF פוגע ביצירת הקריש; ג. הצטברות של תוצרי פירוק של פיברין; ד. Glanzmann thrombasthenia שהיא פגיעה נדירה ביכולת האיגור של טסיות כתוצאה מחסר או מפגם ב-GpIIb/IIIa המשמש קולטן לפיברינוגן וכך נפגע הקשר בין טסיות לטסיות אחרות ונפגעת היווצרות הקריש; ה. שימוש בתרופות החוסמות יצירת טסיות (thiazide diuretics, אינטרפרון, אלכוהול) ; ו. מפגעים בשגשוג תאים מייאלואידיים; ז. Storage pool disease בה נפגעת יכולת הגרנולות בטסיות להכיל ולהפריש ADP המסייע לאיגורן ; ח. אורמיה כתוצאה מאי-ספיקת כליות; ט. מחלת von Willebrand, בה יצירה מופחתת של vWF מפחיתה את יכולת הספיחה של טסיות לכלי הדם הפגועים מה שמגביר איבוד דם.
(להכניס כאן את הטבלה בשפה העברית)
מבדק flow cytometry:
מבדק זה המתבצע בדם מלא, מהווה טכניקת מעבדה עוצמתית ופופולארית לאשש תפקוד טסיות ואת השפעול שלהן על ידי שימוש בקרינת laser לקבוע את החלבונים הנמצאים על שטח פני הטסיות, וכיצד חלבונים אלה עוברים שינוי בעת שפעול הטסיות. למרות שטכניקה זו דורשת ציוד מתוחכם, כמו גם נוגדנים חד-שבטיים, ולמרות שלא עברה סטנדרטיזציה מלאה, יש לה מספר יתרונות הכוללות צורך בנפח קטן של דם מלא , ואי תלות במספר הטסיות. המבחנים השכיחים ביותר לביצוע שיגרתי של flow cytometry הם הכימות של סטאטוס קולטן GP של הטסיות, כמו גם קביעת ההרכב של הגרנולות בטסיות. מכשיר flow cytometer יכול לכמת חסרים של GP IIb/IIIa בתסמונת Glanzmann’s thrombasthenia, וחסרים ב-GP Ib/IX/V בתסמונת Bernard-Soulier. מכשיר זה תוכנן גם למדוד את הגרנולות הדחוסות על ידי קליטה ושחרור של mepacrine, שהוא חומר פלואורסצנטי ירוק הנקלט על ידי טסיות ונאגר בגרנולות הדחוסות שלהן (על פי Wall וחב' ב-Brit J Hematol משנת 1995).
מדידת flow cytometry מאפשרת את האנליזה של תפקודם של תאי טסיות בודדים, ואת מדידת הביטוי של סמנים של שפעול טסיות אינדיבידואליות כמו גם כימות הקשר בין טסיות ותאי דם אחרים. הסמנים השכיחים ביותר של שפעול טסיות שניתן לבדוק ב-flow cytometry הם ביטוי של P-selectin על פני הטסיות (כסמן של הפרשת α-granules), מדידת בעזרת הנוגדן החד-שבטי PAC-1 של השינוי המבני של GP IIb/IIIa לצורתו הפעילה כתוצאה משפעול הטסיות, יצירת קוניוגציות בין טסיות לתאי-דם לבנים, בחינה של microparticles, חשיפתם של פוספוליפידים טעונים שלילית על פני טסיות כמדד של פעילות קדם-קואגולנטית, והזרחון של VASP-P או vasodilator- stimulated hosphoprotein-phosphorylation, וכן כמדד לקולטן P2Y12 המתבטא לאחר שפעול טסיות, בעזרת המכשיר של BioCytex מ-Marseille, צרפת (Williams וחב' ב-Thromb Haemostasis משנת 2010, וכן Hezard וחב' ב-Cardiovasc Hematol Disorders-Drug Targets משנת 2010 ו-Dahlen וחב' ב-Thrombo Haemostasis משנת 2013).
מבדק Viscoelastometry הידוע גם כ-Thromboelastometry:
קרישי דם צריכים להיות חזקים דיים לעצור שטפי דם ולמנוע דימום נוסף עד לחסימת הפציעה בכלי הדם. מבדק זה מתוכנן לקבוע את החוזק של קריש הדם בעת יצירתו. בדיקה זו מתבצעת בדרך כלל במעבדות של מרכזים רפואיים גדולים.
מבדקים אחרים של POCT או point-of-care testing:
מבחני תפקוד טסיות תופסים חלק הולך וגדל ככלים לניבוי דימומים או לצורך ניטור יעילותם של תכשירים מונעי קרישת דם. מספר הולך וגדל של אנשים מטופלים כיום עם תרופות נוגדות-טסיות, מה שמגביר את הסיכון לתרחישי דמם. מבדק LTA המסורתי עדיין חיוני להערכה של מפגעי טסיות, אך הוא קשה לביצוע במצבים של טיפולים דחופים וחריפים. כיום יש מגמה לתכנון מכשור פשוט וקל יותר לתפעול של POCT המתבצע מחוץ למעבדה הקלינית, "ליד מיטת החולה". נתאר כאן 2 מכשירים יציגים כאלה: א. Impact cone and plate analyzer (המיוצר על ידי DiaMed ב-Cressier, שוויץ); ב. Thromboelastography או TEG (המיוצר על ידי Hemoscope ב-Niles, IL, USA על פי Afshari וחב' ב-Cochrane Database System Rev משנת 2011, ו-Kim וחב' ב-Lab Med משנת 2013.
מכשיר ה-Impact cone תוכנן במקור לניטור של ספיחת טסיות למשטח של polystyrene. המכשיר מכיל מיקרוסקופ, והוא מבצע צביעה ואנליזה של מבנה טסיות הנספחות ועוברות איגור תחת shear rate גבוה של 1800/שנייה. התוצאה מדווחת כאחוז המשטח המכוסה על ידי טסיות, וכן הגודל הממוצע של החלקיקים הנספחים. הספיחה תלויה ב-vWF, בקישור פיברינוגן וב-GP Ib and IIb/IIIa של הטסיות. המבדק אוטומטי במלואו, פשוט ומהיר לביצוע, תוך צורך בנפח קטן של דם. נתונים ניסויים מרמזים לכך שה-Impact cone יכול לגלות מספר פגמים של טסיות או ב-vWF, וניתן להשתמש בו באופן פוטנציאלי לצורך בדיקת סריקה. מבדק TEG ומבדק נוסף הידוע כ-rotational thrombelastometry או ROTEM המתבצע במכשיר של חברת Pentapharm GmbH ממינכן, גרמניה, מודד את התכונות הפיסיקאליות של הקרישים הנוצרים על ידי שימוש ב-oscillating cup שיכול לטפל סימולטאנית במספר דגימות דם. TEG מספק נתונים שונים המתייחסים ליצירת פיברין, התפתחות קריש הדם, כמו גם נתונים על החוזק והיציבות של קריש הפיברין, וכן על תהליך הפיברינוליזה. היתרונות המיוחדים של TEG/POTEM הם ביכולתם לתת תיאור מלא של יצירת הקריש והאינטראקציה בינו לבין אלמנטים שונים בדם המלא בפרט העת יצירת קריש. מכשור זה מופעל בחדרי ניתוח הרדמה והתאוששות לקביעה של סכנת דימום והצורך בעירויי דם. אנליזה זו נמשכת לפחות 30 דקות. היא מתבצעת בבתי חולי גדולים או בחדר הניתוח או כגבדיקת point-of-care במעבדה הקלינית (Afshari וחב' ב-Cochrane Database Syst Rev משנת 2011).
ניטור טיפולים תרופתיים נוגדי טסיות:
ככל שמתרבה השימוש בתכשירים נוגדי-טסיות גדלה החיוניות באופטימליזציה של היחס סיכון/תועלת במטופלים. הטיפול המודרני בתכשירים נוגדי-טסיות מבוסס על שלושה מסלולים עיקריים של שפעול תאים אלה: א. עיכוב האנזים cyclooxygenase-1 המביא להפחתת thromboxane A-2 ; ב. עיכוב P2Y12 (ADP); ג. חסימת הקולטן GP IIb/IIIa (על פי Close ב Fundamental Clin Pharmacol משנת 2012, וכן Tobin וחב' ב-Eur J Neurol משנת 2013 ו-Capodanno וחב' ב-J Thromb Haemostasis משנת 2013). ראוי לציין שגם מקרים בהם התגלתה עמידות לטיפולים נוגדי טסיות, כמו גם בטיפול המשולב של אספירין ו-clopidogrel, נעשה שימוש במבדקים של תפקודי טסיות לנסות ולהבין עמידות זו (Woo וחב' ב-Korean J Lab Med משנת 2010).
בעשור האחרון התקבלה עדות משכנעת ממספר ניסוים תצפיתיים שהדגימה קשר חזק בין פעילות טסיות גבוהה (HPR) ו-ADP, כמו גם עם אירועים איסכמיים לאחר פרוצדורות PCI, ובעיקר פקקת הנגרמת בגין שתילת תומכן. ה-AHA, ה-American College of Cardiology וה-European Society of Cardiology פרסמו המלצה בדרגה IIb לבצע בדיקות תפקוד טסיות לסייע בבחירה של מעכב P2Y12 באלה בסיכון גבוה בין העוברים PCI, אם כי לא מומלץ על ביצוע שגרתי של בדיקות אלו (המלצה class III).
לאחרונה גופים אלה עדכנו מסמך קונצנזוס עם ערכי סף עבור high plateket reactivity או HPR ו-low platelet reactivity או LPR ל-ADP, ערכים שעשויים לשמש מחקרים עתידיים של תרפיה-מותאמת-אישית כנגד טסיות. LPR ל-ADP הכרוכה כנראה בסכנת דימום. לכן, שלושת הגופים האמורים הציעו "חלון תרפויטי" עבור טיפולים במעכבי P2Y12 (על פי Bonello וחב' ב- J Am College of Cardiol משנת 2010, וכן Aradi וחב' ב- Eur Heart J משנת 2014 ו-Tantry וחב' ב- J Am College of Cardiol משנת 2013).
המבדקים השכיחים ביותר במסגרת מבחני תפקוד טסיות ידועים כ-VerifyNow P1Y12 assay של חברת Accumetrics בסן-דיגו, קליפורניה, וכיום גם באנלייזר סורק multiplate של Hoffmann-La-Roche בבאזל, וכן VASP assay, בהם התגברו על רבות מהמגבלות הטכניות של השיטות הקודמות., כולל שיטת LTA הקונבנציונאלית. לכן, בעת הזו נקבע setting לערכי HPR ו-LPR על פי הקריטריונים הבאים, בהתאמה: (א) 208< ו-85> יחידות פעילות של P2Y12 במבדק VerifyNow P2Y12; (ב) 50%< ו-16%> של platelet reactivity index בשיטת VASP-P; (ג) 46< ו-19> יחידות איגור אקראיות בתגובה ל-ADP בסורק multiplate (על פי Zhang וחב' ב-Platelets משנת 2013).
מבדק PMP או Platelet-Derived Microparticles:
מיקרו-חלקיקים הנעים בצירקולציה מוגדרים כ-vesicles קטנים של פוספוליפידים שהקוטר שלהם נע בין 0.1-1.0 מיקרון, ומקורם בסוגי תאים שונים כגון טסיות, אריתרוציטים, לויקוציטים, תאי אנדותל ותאי שריר חלק וסקולאריים (Prokopi וחב' ב-Blood משנת 2009). מיקרו-חלקיקים נבדלים מ-exosomes, שהם וסיקולות קטנות יותר (40-100 ננומטר) שמקורם בממברנות אנדופלזמיות ומגופיפים שנוצרו בעת אפופטוזיס שגודלם מעל 1.5 מיקרון, והמכילים מרכיבים גרעיניים. מיקרו-חלקיקים נושאים חלבוני שטח פנים ומכילים גם חומר ציטופלזמטי של תאי-אם, וכן פוספוליפידים (בעיקר פוספטידיל-סרין) (Mause ו-Weber ב-Circulation Res משנת 2010, ו-Aatonen וחב' ב-Thromb Hemostasis משנת 2012).
במצבים של steady-state מיקרו-חלקיקים שמקורם בטסיות דם ובמגה-קריוציטים, הם המיקרו-חלקיקים הנפוצים ביותר, ומהווים עד 70-90% מכלל המיקרו-חלקיקים בצירקולציה (Italiano Jr וחב' ב-Curr Opin Hematol משנת 2010). רמת PMP מראה הבדלים מגדריים, כאשר הערכים גבוהים יותר בנשים מאשר בגברים, ואכן ישנם גם הבדלים הקשורים למחזור החודשי. ערכי PMP גדלים עם ההזדקנות, אך גם לאחר פעילות גופנית מאומצת, תוך הגברה של הפוטנציאל ההמוסטאטי. בערך 25% מהפעילות התומכת בקרישה של טסיות משופעלות, כרוכה עם מיקרו-חלקיקים המשתחררים בעת שפעול טסיות, כאשר שטח הפנים של הטסיות יכול להיות פי 50-100 יותר פרו-קואגולנטי מאשר זה של טסיות לא משופעלות. כמויות קטנות של PMP משתחררות באופן מתמשך מטסיות במנוחה, אך תהליך זה מואץ ביותר לאחר שפעולן או לאחר פעילות גופנית אינטנסיבית.
התכונות התרומבוגניות של PMP אושרו בניסויים רבים, כאשר רמות גבוהות של PMP כרוכות בחוזקה עם מצביים קרישתיים רבים. PMP היו מוגברים משמעותית במטופלים עם תסחיף פקקתי לריאות (PE), תרחיש בו הם היו המקור העיקרי של MP פרו-קואגולנטים. לדוגמה, בתרחיש של valvular atrial fibrillation, המהווה סיכון גבוה ל- thromboembolism, המספרים של PMP היו מוגברים יותר מאשר פי-3. רמות מוגברות של PMP היו כרוכות גם במצבי מחלות אחרות כולל thrombocytopenia מושרית על ידי הפארין, פקקת עורקית, ITP, תרומבוציטופניה תרומבוטית, מחלת תאים חרמשיים, uremia, ממאירות ודלקת מפרקים שגרונית (RA). כמו כן, PMP נכרכו גם בפתוגניות של טרשת עורקים כמו גם בוויסות של אנגיוגניות (Shantsila וחב' ב-J Thromb Haemostasis משנת 2010, וכן França וחב' ב-Circulation משנת 2012, ו- Biasucci וחב' באותו כתב עת באותה שנה, וכן Lackner וחב' ב-Stroke משנת 2010).
למרות שהמשמעות הפיזיולוגית של PMP הודחקה משך שנים רבות, מחקר עדכני מצביע על כך שחלקיקים זעירים אלה עשויים לשחק תפקיד חשוב בטרנספורט ובהעברה של מולקולות פעילות ביולוגית ואיתותים ברחבי הגוף כולו. MP יכולים להשפיע על תאי היעד שלהם או על ידי גירוי ישיר שלהם דרך ליגנדים המבוטאים על פני תאים אלה, או על ידי העברה של קולטנים של פני תאים מתא אחד למשנהו. כיוון שחלקיקי MP נעטפים בעת יצירתם על ידי מרכיבים ציטופלזמטיים, הם נושאים חלבונים ו-RNA שמקורם בציטוזול של תא האם, אותם הם מעבירים לתא היעד.
מספר שיטות מעבדה לאנליזה של PMP פורסמו, אך השיטה הנפוצה ביותר כיום היא שיטת flow cytometry. למרות מספר הפרסומים הגדול על PMP, חוסר סטנדרטיזציה של השיטה מקשה על ההשוואה בין תוצאות הפרסומים השונים. סקר של תת-ועדה של ISTH Vascular Biology הראה שבערך 75% מהמעבדות משתמשות ב-flow cytometry לבחינת דגימות קליניות. יחד עם זאת, מגוון רחב של משתנים קדם-אנליטייים ואנליטיים, גורמים לתחום רחב של ערכי PMP בפלזמה חופשית מטסיות (PFP) באנשים בריאים (Robert וחב' ב- J Thromb Haemostasis משנת 2009, וכן Mobarrez וחב' ב-Thrombosis Res משנת 2010, ו-Lacroix וחב' ב-J Thromb Haemostsis משנת 2010).
שלוש תת-ועדות של ISTH (המתייחסות לביולוגיה וסקולארית, ל-DIC או Disseminated Intravascular Coagulation ול-Haemostasis and Malignancy) יזמו פרויקט להביא
לסטנדרטיזציה של מדידת MP על ידי flow cytometer. איסטרטגיה זו מבוססת על שימוש בכדוריות (beads) תת-מיקרומטריות, הידועות כ-Megamix beads של חברת BioCytex הצרפתית מ-Marseille, המאפשרים אנליזה הדירה של MP.
מבדק MicroRNAs או miRNA של טסיות:
miRNA הוא מקטע קטן של RNA "לא מקודד" המכיל 21-23 נוקלאוטידים, שתפקידו בוויסות של בערך 60% של הגנים המקודדים לחלבונים ביונקים, לפחות באופן חלקי על ידי הדיכוי של תרגום RNA (על פי Dangwal ו-Thum ב-Thromb Haemostasis משנת 2012). טסיות משופעלות מפרישות כאמור MP עשירים במגוון של גורמי גדילה או בחלבונים מפעילים בעלי השפעות חוץ-תאיות (Edelstein וחב' ב-J Thromb Haemostasis משנת 2013). למרות שטסיות חסרות גרעין או DNA גנומי, תאים אלה יכולים לתרגם mRNA מוּרש ליצירת חלבונים. מעניין לציין שטסיות מקבלות בהורשה חלבונים הקשורים לעיבוד של miRNA, בנוסף לעותקים (transcripts) שמקורם בתאי האם של הטסיות, המגה-קריוציטים (Willeit וחב' ב-Circulation Res משנת 2013).
דיווח עדכני על תכולת miRNA ב-MP מראה ש-PMP יכולים לשאת את מטען ה-miRNA של הטסיות, אל אזורי היעד שלהם במערכת הקרדיו-וסקולארית. יתרה מכך, טסיות-מפרישות-miRNA יכולות לתרום למאגר ה-miRNA, הפכו נושא מחקרי של אלה התרים אחר ביו-סמנים הקשורים עם מצבים פתולוגיים שונים (Zampetaki וחב' ב-J Am Coll Cardiol משנת 2012, ו-Grasedieck וחב' ב-Blood משנת 2013).
סריקה בשיטת microarray גלתה ש-miR-24, miR-223, miR-197, miR-126 ו-miR-21, הם בין ה-miRNAs המבוטאים ביותר בטסיות וב-PMP. רמותיהם בצירקולציה למעשה תואמים את רמות PMP כפי שניתן לכימות על ידי flow cytometry. הרמות של miR-340 ו-miR-624 נמצאו מוגברות משמעותית בטסיות ממטופלים הסובלים ממחלת לב כלילית בגיל צעיר. בדומה, ביטוי-יתר של miR-28 נמצא בטסיות שהושגו מחולים עם מחלות סרטניות מיאלו-פרוליפרטיביות.
מעניינת מציאותם בטסיות של למעלה מ-750 מתוך כ-2,000 סוגי miRNAs הידועים באדם. ל-miRNA יש תפקיד מבוסס בהמטופויאזה כמו גם ביצירתם של מגה-קריוציטים; לכן נראה ש-miRNAs בטסיות עשויים לשמש כסמנים וכלים להבנת מנגנונים של ביטוי גנים במגה-קריוציטים ובטסיות. כיוון שהתרגום של miRNA הוא המנגנון היחיד לסינתזה של חלבונים חדשים, יש להניח ש-miRNA ממקור טסיות משחק תפקיד בתפקוד התקין כמו גם במפגעים של המוסטאזיס ושל יצירת פקקת.
(להכניס כאן את הטבלה בשפה האנגלית)
== הוראות לביצוע הבדיקה ==
דגימת הדם: 4 מ"ל של דם מלא הנלקח במבחנת סודיום ציטראט (פקק תכול). ארבע מבחנות נדרשות למדידה של platelet aggregation. שבע מבחנות נדרשות למדידה של איגור והפרשת טסיות. יש לבצע את הבדיקות תוך 4 שעות מנטילת הדם. לתקופת ההמתנה לפני ביצוע הבדיקות הדגימות צריכות להימצא בטמפרטורת החדר שכן קירור הדגימות עלול לגרום לשפעול הטסיות. בדיקות נוספות רלוונטיות לביצוע יחד עם מבדק זה הן ספירת דם מלאה (CBC), ספירת טסיות, PT, PTT, ביופסיה של מח עצם, גורמי קרישה וגורם von Willebrand.
מספר תרופות יכולות להשפיע על תוצאות המבדק, אפילו אם נעשה בהן שימוש עד שבועיים לפני המבדק, לכן יש להימנע מצריכת תרופות אלה במידת האפשר כשבוע-שבועיים לפני הבדיקה. תרופות אלה כוללות: תכשירים אנטיביוטיים דוגמת פניצילינים, צפלוספורינים ו-nitrofurantoin; אנטי-היסטמינים, אספירין, clopidogrel, dipyridamole, נוגדי דיכאון תלת-ציקליים, ticlopidine, תרופות ממשפחת NASID כמו ibuprofen ו-naproxen, וכן theophylline ומעכבי COX-2 כגון celecoxib.

LKM-1

2015-10-19T11:14:30Z

בן עמי סלע:

== LKM-1 ==

כינויים נוספים: נוגדנים ל-anti-LKM1 ; LKM1 (liver/kidney microsomal type 1) antibodies ; LKM-1 Antibodies ;Anti-P450 2D6 .
תחום: מפגעי כבד ובעיקר autoimmune hepatitis.
טווח ערכים תקין: שלילי-לא יותר מ-20.0 יחידות לליטר; גבולי-20.1-24.9 יחידות לליטר; חיובי-מעל 25.0 יחידות לליטר. ערכי ייחוס אלה רלוונטיים לבני כל הגילים.
יוצר הערך: פרופ' בן-עמי סלע.

הפאיטיס אוטו-אימונית:

הפאטיטיס אוטו אימונית (AIH) היא מחלה כרונית מסיבה לא ידועה המאופיינת על ידי תהליך דלקת הפאטו-צלולארית מתמשכת, עם התפתחות נמק ונטייה לעבור לשלב של צמקת. תסמונת זו לעתים קרובות כרוכה עם מחלות אוטו-אימוניות נוספות. לא ניתן להסביר AIH על בסיס של הדבקה נגיפית כרונית, צריכת אלכוהול, או חשיפה לתרופות או כימיקאלים טוקסיים לכבד. ב-13-20% המחלה מתפוגגת באופן ספונטאני ללא כל קשר לפעילות הדלקתית, באופן שלא ניתן לצפות מראש. קרצינומה של תאי כבד (HCC) פחות שכיחה באלה עם AIH בהם התפתחה צמקת, מאשר באלה בהם הצמקת הופיעה מסיבות אחרות. אף על פי כן, HCC אינה אירוע נדיר ב-AIH. לייפת (fibrosis) מופיעה ברוב המטופלים עם AIH, וללא טיפול יעיל הלייפת מתחילה לחבר את אזורי הכבד השעריים (portal) עם האזור המרכזי שלו, מה שבסוף התהליך מוליך לצמקת. בשנת 1999 ה-International AIH Group יצרה מערכת דירוג המחלה שיעילותה ניכרת בעיקר באבחון של AIH במקרים גבוליים-בעייתיים (Alvarez וחב' ב-J Hepatol משנת 1999, ו-Wiegard וחב' ב-Semin Liver Dis משנת 2009).

הממצאים ההיסטו-פתולוגיים באלה עם AIH הם אופייניים אך לא ספציפיים: ל- AIH יש ממצאים המשותפים למקרים של הפאטיטיס נגיפית כרונית, מקרים של הפאטיטיס כרונית על רקע של תרופות, ועוד מפגעי כבד נוספים. ב-10-20% מהמקרים של AIH מוצאים בדגימות ביופסיה הפאטוציטים ענקיים רב-גרעיניים. לממצאים ההיסטופתולוגיים בדגימות ביופסיה של הכבד חשיבות באבחון AIOH ובקביעת חומרת המחלה. ממצאים אלה חיוניים להבדלת AIHמהדבקה ב-HCV, מהפאטיטיס על רקע אלכוהול, ממחלת כבד הנגרמת מטיפול תרופתי טוקסי, מ-PBC ומ-PSC או primary sclerosing cholangitis (על פי Czaja & Carpenter ב-Gastroenterology משנת 1993). כמו כן, AIH מתאפיין על ידי הסננה פורטאלית של תאים מונו-נוקלאריים, לעתים מוצאים גם הסננה של תאי פלזמה.

הרקע ההיסטורי של הפאטיטיס אוטו-אימונית:

החוקר השוודי Waldenström תאר לראשונה בשנת 1950 ב-Acta Endocrinol צורה של הפאטיטיס כרונית בנשים צעירות. התרחיש תואר על ידו כצמקת הכבד, הסננה לכבד של תאי פלזמה והיפר-גאמא-גלובולינמיה ניכרת. באותה שנה דווחו Kunkel וחב' ב-J Clin Invest ו-Bearn וחב' ב-1956 ב-Am J Med, מאפיינים אחרים של התרחיש כולל הגדלה של הטחול והכבד, צהבת. חטטת הפנים (Acne) שעירות-יתר, תווי פנים כבתסמונת Cushing, פיגמנטציה של אזור הבטן, השמנת-יתר, דלקת מפרקים, ואל-ווסת (amenorrhea) בנשים צעירות. בשנת 1955, היו אלה Joske ו-King שדיווחו לראשונה ב-Lancet על הקשר בין זאבת ארגמנית (לופוס) בהפאטיטיס נגיפית כרונית, קשר שהביא לטביעת המושג הפאטיטיס לופואידית על ידי Mackay וחב' ב-Lancet ב-1956. כיום כבר ברור שאין כל קשר בין SLE לבין הפאטיטיס אוטו-אימונית (להלן AIH), וממילא הפאטיטיס לופואידית אינה קשורה ל-SLE.

התיאור ההיסטו-פתולוגי של AIH עבר מספר עדכונים במהלך השנים. בשנת 1992 התכנס פאנל בינלאומי והגדיר מחדש את הקריטריונים האבחוניים (Johnson ו-McFarlane ב-Hepatology משנת 1993), ונקבע סופית שהביטוי המקובל יהיה הפאטיטיס אוטו-אימונית ולא ביטוי שהיה רווח קודם לכן דוגמת הפאטיטיס-אוטו-אימונית כרונית פעילה, שהיה בשימוש באותה עת. אותו פאנל הסיר את הדרישה לפרק זמן מינימאלי של 6 חודשים של פעילות המחלה, כדי שזו תוגדר "כרונית", הרחיב את הספקטרום ההיסטולוגי על מנת שיכלול הפאטיטיס אונתית (lobular), ואישש מחדש את האופי הלא נגיפי של מחלה זו. פאנל זה אישר הכללה של ממצאים היסטולוגיים לכאורה סותרים, כמו כולסטאזיס, פגיעה בצינורות המרה ו-ductopenia.

אפידמיולוגיה של הפאטיטיס אוטו-אימונית:

בארה"ב הנתונים האפידמיולוגיים מוגבלים. בין מבוגרים לבנים שכיחות המפגע מוערכת כ-0.1-1.2 מקרים לכל 100,000. השכיחות של AIH בין מטופלים עם מחלת כבד כרונית היא בתחום של 11-23%. המחלה אחראית לכ-6% מכלל השתלות הכבד בארה"ב. הפאטיטיס אוטו-אימונית type 2 (להלן AIH-2) ו-AIH-3 יחסית פחות שכיחים בארה"ב, ולעומת זאת AIH-2 נפוצה יותר באירופה.

השכיחות של AIH מוערכת בכ-0.1-1.2 מקרים ל-100,000 במערב אירופה, כאשר במזרח אירופה שכיחות מפגע זה גבוהה משמעותית ומגיעה עד כדי 11.6-16.9 מקרים לכל 100,000. זו שכיחות הדומה לזו של צמקת מרתית ראשונית (PBC), וגבוהה פי-2 מזו של מחלת כבד כרונית חסימתית (או primary sclerosing cholangitis). באירופה AIH אחראית לכ-3% מהשתלות הכבד. ביפאן לעומת זאת, השכיחות של AIH נמוכה משמעותית עם 0.015-0.08 מקרים לכל 100,000.

היחס בין AIH-1 ל-AIH-2 הוא :11.5-2.1 באירופה ובקנדה, ו-6-7:1 בארה"ב, בדרום אמריקה, וביפאן. השכיחות של AIH-2 במדינות דרום אירופה גדולה יותר מאשר במדינות צפון אירופה, ארה"ב ויפאן. בניתוח נתונים של 33,379 מטופלים עם צמקת הכבד, מצאו Michitaka וחב' ש-AIH היה הגורם האטיולוגי ב-1.9% מכלל מקרי צמקת אלה ביפאן (J Gastroenterol משנת 2009). רק לשם השואה, הפאטיטיס C היה הגורם האטיולוגי המשמעותי ביותר לצמקת הכבד ביפאן, שם הוא אחראי ל-61% מכלל מקרי הצמקת.

AIH שכיחה ביותר בצפון אירופה באלה עם שכיחות גבוהה של הסמנים הגנטיים HLA-DR3 ו-HLA-DR4 (על פי Boberg ב-Clin Liver Dis משנת 2002, ו-Czaja ב- Semin Liver Dis משנת 2009). ביפאן מצאו Seki וחב' מתאם בין HIH לבין HLA-Bw54 ו-HLA-DR4 (ב-Hepatology משנת 1990).

נשים נפגעות משמעותית יותר מגברים מ-AIH, כאשר McFarlane ו-Heneghan מצאו ב-Hepatol Res משנת 2007, יחס של בערך 3:1 בין שני המינים. ל-AIH יש פיזור גיל דו-מודאלי, כאשר השיא הראשון של הופעת המפגע מתחולל בגילים של 10-20 שנה, והשיא השני של הופעתו מתחולל בין הגילים 45-70 שנה. בערך מחצית מהנפגעים ב-AIH הם מתחת לגיל 20 שנה, והוא גבוה בנערות לפני הופעת המחזור. מאובחנים עם AIH-2 הם בממוצע צעירים יותר, כאשר 80% מבין אלה עם AIH-2 הם ילדים. יחד עם זאת, AIH עלולה להופיע בכל גיל כולל תינוקות וקשישים (Mieli-Vergani ו-Vergani ב-Semin Liver Dis משנת 2009, ו-Czaja ו-Carpenter ב-Hepatology משנת 2006). בקבוצת הגיל הקשישה יש נטייה לגברים להיפגע יותר מ-AIH מאשר נשים.

אטיולוגיה:

האטיולוגיה של AIH אינה ידועה, אם כי מספר גורמים (הדבקה נגיפית, תרופות, וגורמים סביבתיים) עלולים לגרות תגובה אוטו-אימונית ובהתאם תופיע מחלה אוטו-אימונית. בחלק קטן של מאובחנים עם AIH, המפגע מתחולל בעקבות הדבקה חריפה בנגיף הפאטיטיס A, הפאטיטיס B או נגיף Epstein-Barr. נוגדנים עצמיים שכיחים האלה עם הדבקה כרונית ב-HCV, כאשר בנסיוב של אלה ניתן למצוא נוגדנים ל-LKM1. בחלק מהמקרים של מחלת כבד מושרה על ידי תרופות, ניתן למצוא תהליך המתווך על ידי מערכת החיסון. מספר תרופות כדוגמת methyldopa ,nitrofurantoin ,minocycline (על פי Ramakrishna וחב' ב-J Clin Gastroenterol משנת 2009), adalimumab (על פי Adar וחב' ב-J Clin Gastroenterol משנת 2010), ו-infliximab (על פי Fairhurst & Sheehan-Dre ב-Clin Exp Dermatol משנת 2009), יכולות לגרום למחלת כבד עם מאפיינים דומים לאלה של AIH. למרות שברוב המקרים התסמינים מתפוגגים עם הפסקת הטיפול בתרופות אלה, ניתן למצוא מקרים כרוניים של AIH, גם לאחר הפסקת הטיפול התרופתי הזה (Liu ו-Kaplowitz ב-Clin Liver Dis משנת 2002). בשנת 2010 דיווחו Casswall וחב' ב-Scand J Gastroenterol על מציאת DNA של זני הליקובקטר שונים ב-50% של ביופסיות כבד שנלקחו מילדים ומתבגרים עם AIH.
AIH יכולה להיות type 1 או type 2. הפאטיטיס type 1 יכולה להופיע בגילים שונים אך היא שכיחה יותר בנשים צעירות. כמחצית אלה עם AIH type 1, נושאים בקרבם מחלה אוטו-אימונית נוספת כגון סוכרת type 1, או קוליטיס כיבית. באשר ל-AIH type 2, סוג זה יכול להופיע במבוגרים אך הוא שכיח ביותר בילדות-נערות בגיל 2-14 שנה. אלה עם AIH type 2 מכילים נוגדנים עצמיים המגיבים עם מקטע מיקרוזומאלי של הכבד והכליות, השונה מזה כנגדו מכוונים נוגדנים-עצמיים ב-AIH type 1.

מאפיינים קליניים של הפאטיטיס אוטו-אימונית:

AIH הוא בעל מהלך כרוני שהגורם לו עדיין אינו ברור, והוא מתאפיין על ידי תהליך דלקתי הפאטו-צלולארי ונמק, שיש לו נטייה להתדרדר למצב של צמקת. AIH יכול להופיע כהפאטיטיס חריפה או כרונית, או כצמקת מוכחת. במקרים נדירים AIH בא לביטוי ככשל כבדי פולמיננטי. בערך אחד מכל שלושה מאובחנים עם AIH, מראה תסמינים של הפאטיטיס חריפה, המתבטאת בחום גבוה, רגישות של הכבד, וצהבת. חלק המטופלים עם AIH מפתחים סימנים ותסמינים של מחלת כבד כרונית, ואילו אחרים מתדרדרים במהירות לאי-ספיקת כבד חריפה, הבאה לביטוי בצהבת ובקואגולופתיה.

תסמינים שכיחים וממצאים המתקבלים בבדיקה פיזית עלולים לנבוע ממפגעים חוץ-כבדיים הכרוכים ב-AIH. תסמינים שכיחים כוללים עייפות, תחושת אי-נוחות ברום הבטן, גרד מתון, בחילה, הקאות ושלשולים, תווי פנים אופייניים למחלת Cushing, כאבי מפרקים ושרירים (myalgia), פריחה עורית (כולל חטטת), שעירות-יתר, כאבי חזה הנובעים מפלאוריטיס, בצקת ואיבוד משקל. הממצאים השכיחים בבדיקה פיזית הם הפאטומגליה (83%), צהבת (69%), ספלנומגליה (32%), מיימת (20%), אנצפלופתיה (14%) וריבוי לא תקין של כלי דם עוריים (spider angiomas) בפנים, בצוואר ובגפיים (58%). כן יכול להופיע שתן בצבע שחור, אנורקסיה וצואה בהירה ביותר.

תסמינים קליניים באוכלוסייה פדיאטרית עם AIH:

מחקר על ילדים (Caucasian) עם AIH של Oettinger וחב' ב-J Autoimmun משנת 2005, העלה את הנתונים הבאים: ב-58% מתוכם הייתה צהבת, חולשה בלתי ספציפית הופיעה ב-57% מהנבדקים, אנורקסיה ב-47%, כאבי בטן ב-38% וחיוורון (pallor) אובחן ב-26% מהילדים עם AIH. כ-70% מהילדים עם AIH יזדקקו לטיפול עד להיותם בוגרים, כאשר בחלקם צמקת הכבד כבר קיימת למרות גילם הצעיר. בין 20-25% מהילדים המאובחנים עם AIH ימותו בגיל צעיר יחסית או יזדקקו להשתלת כבד. הנחיות שפורסמו בשנת 2011 על ידי האיגוד הגסטרו-אנטרולוגי הבריטי, קובעות שמטופלים צעירים עם AIHצריכים להיות מטופלים עם תכשירים לדיכוי מערכת החיסון, כדי למנוע או לעכב צמקת הכבד (Gleeson ו-Heneghan ב-Gut משנת 2011).

בסדרת מחקרים מדווחים על ידי Gregorio וחב' ב-Hepatology משנת 1997, נמסר ש-70% מהילדים עם AIH-1, ו-40% מהילדים עם AIH-2, פיתחו צמקת הכבד. במדגם של 52 ילדים, 17% סבלו מתמט (collapse) מולטיאצינארי או פנאצינארי עם כשל כבדי חד. המטופלים במחקר זה עם הפרוגנוזה הגרועה ביותר בהיבט של מוות מוקדם או הזדקקות להשתלת כבד, היו הילדים עם אבחון מוקדם של AIH-2, שסבלו מקואגולופתיה, רמות בילירובין גבוהות ותמונה היסטולוגית חמורה כבר בשלב האבחון המוקדם של AIH. בילדים, במצבי מחלה מתקדמת עלולים להופיע תופעות של פרקי בלבול.

הנוגדן LKM-1:

הנוגדן LKM-1 הוא הסמן האבחוני של הצורה החמורה של AIH הידועה כ-autoimmune hepatitis type 2 (להלן AIH2) הפוגעת באופן אופייני בילדים ובמבוגרים צעירים (Homberg וחב' ב-Hepatology משנת 1987). גילוי נוגדן זה בוצע בעבר באופן קונבנציונאלי על ידי אימונו-פלואורסצנטיה, שהיא טכניקה סובייקטיבית שנעשה בה שימוש ברקמות של כבד, כליה וקיבה של חולדות בתור מצע השוואתי (Rizzetto וחב' ב-Clin Exp Immunol משנת 1973). נדירות הממצא של LKM-1 והדמיון בצביעה שלו לזה של הנוגדן האנטי-מיטוכונדריאלי כמו גם לזו של הנוגדן ל-liver cytosol type-1, גרמו לעתים להחמצת LKM-1 (על פי Seelig וחב' ב-Clin Exp Immunol משנת 1993). בהמשך, נחשבה שיטת קישור ליגנד רדיואקטיבי ל"מדד הזהב" לגילוי LKM1, אך זו שיטה ממושכת בביצוע והופכת לא שכיחה במעבדות משיקולים של זיהום סביבתי בחומר רדיו-אקטיבי. למעשה מאז שנת 1999 מקובלת שיטת ELISA שנמצאה ספציפית וגם רגישה (Kerkar וחב' ב-J Immunol Methods משנת 1999, וכן במאמר נוסף של אותם חוקרים ב-J Clin Pathol משנת 2002. גם Miyakawa וחב' פרסמו בשנת 1999 ב-Autoimmunity נתונים על גילוי anti-LKM-1 בשיטת ELISA בנבדקים מבוגרים עם מחלת כבד כרונית, זאת על רקע העובדה שנוגדן עצמי זה מתגלה גם בחלק ממטופלים עם הפאטיטיס C כרונית.

במחקר זה נסקרו 29 מטופלים חיוביים ל-anti-LKM1, כמו גם 301 דגימות נסיוב של אלה עם מחלות כבד שונות, וכן 100 דגימות מאנשים בריאים שליליים ל-anti-LKM1. הספציפיות של מבחן ה-ELISA נבחנה על ידי מבחני ספיחה תוך שימוש בדגימות נסיוב חיוביות ל-anti-LKM1. ב-29 דגימות הנסיוב ממטופלים חיוביים ל-anti-LKM1 בשיטת בדיקה אימונו-פלואורסצנטית IF)) נמצא מתאם טוב בין שיטות ELISA ו-IF. בדיקת נוגדן anti-LKM1 נמצאה חיובית ב-12 מתוך 12 מטופלים מוכחים עם AIH2, וב-16 מתוך 17 הנבדקים עם הפאטיטיס C כרונית שנמצאו חיוביים ל-anti-LKM1 בשיטת IF. ב-401 דגימות אחרות שנמצאו שליליות ל-anti-LKM1 בשיטת IF, נמצא בשיטת ELISA, שפרט לדגימות בודדות כל השאר נמצאו שליליות ל-anti-LKM1 בשיטת ELISA.

הפיתוח של שיטות מדידה סרולוגיות סימל התקדמות אבחונית חשובה, מה שהעניק אפשרות להבדיל בין הפאטיטיס נגיפית כרונית, לבין מחלות כבד כרוניות אחרות, כולל AIH הנחשבת כיום למפגע רב מערכתי, שיכול להתרחש בשני המינים בכל גיל. AIH יכולה להופיע כפועל יוצא של זיהום נגיפי דוגמת הפאטיטיס A, או על ידי חשיפה לכימיקאלים דוגמת minocycline.

נוגדנים עצמיים כנגד LKM1 בזיהום כרוני של הפאטיטיס C: האם דוגמה לחיקוי מולקולארי?

Marceau וחב' פרסמו בשנת 2005 ב-Hepatology את נתוניהם בנושא זה. כידוע נוגדנים עצמיים כנגד LKM1 המכוונים כנגד ציטוכרום P450 2D6 (או CYP2D6), נחשבים סמנים ספציפיים של AIH-2, אך ניתן למצאם גם ב-5% של דגימות נסיוב של מטופלים עם הדבקה כרונית ב-HCV. הוצע שקיים דמיון או חיקוי מולקולארי בין חלבוני הנגיף HCV לבין CYP2D6 על מנת להסביר נוכחות נוגדנים אלה. נוגדנים עצמיים כנגד LKM1 מחולים עם הדבקה ב-HPC, נוקו בשיטת affinity purification על פני עמודה שעליה ספחו את חלבוני .CYP2D6. אפיטופים מבניים של CYP2D6 זוהו על ידי סריקה ואנליזה של phage display, והזיהוי של צמדים משמעותיים סטטיסטית (SSPs). תגובה צולבת בין חלבונים מועמדים של CYP2D6 ו-HCV נבחנה על ידי immunoprecipitation. בודדו 19 שבטים (clones) שונים, והריצוף שלהם הביא למיפוי של אפיטופ מבני באזור של רצף חומצות אמינו 254-288 של CYP2D6, איזור המכיל את האפיטופ הלינארי העיקרי במטופלים עם AIH-2.

בין חלבוני הנגיף HCV מועמדים לחיקוי מולקולארי כללו את E2 ,NS3 ו-NS5a. אכן, נוגדנים עצמיים מטוהרים שבודדו ממטופלים עם הפאטיטיס C המכילים נוגדנים כנגד LKM1, השקיעו בתמיסה את החלבונים NS3 או את NS5a של הנגיף HCV, או אף את שניהם, ותגובתיות זו נוטרלה על ידי CYP2D6.

חלבוני נסיוב ואימונו-גלובולינים:

ממצא שכיח בנסיוב של אלה עם AIH בלתי מטופלת, הוא היפר-γ-גלובולינמיה של IgG רב-שבטי (polyclonal), כאשר רמות γ-גלובולינים נעות בתחום של 3-4 גרם/ד"ל, ויכולות להגיע לעתים קרובות עד 5-6 גרם/ד"ל. יש מדי פעם דיווחים על צמיגות-יתר של הנסיוב שהם משניים לרמות IgG גבוהות. האבחון של AIH אינו סביר בנבדקים עם הפאטיטיס חריפה ללא היפר-γ-גלובולינמיה. רמת γ-גלובטולינים או זו של IgG יכולות לשמש כבסיס סדיר לתגובת המפגע לטיפולים. אלה עם AIH-2 מראים בדרך כלל רמת IgA נמוכה (Mieli-Vergani ו-Vergani ב-World J Gastroenterol משנת 2008).

אמינו-טרנספרזות:

שני אנזימי האמינו-טרנספרזות, ALT ו-AST, נמצאים מוגברים ב-100% של מטופלים בשלב האבחון המוקדם של AIH, עם רמות בתחום של 200-300 יחידות לליטר, אם כי לעתים מדווח על מקרים בהם רמת הטרנס-אמינזות גבוהה פי-50 מרמת הנורמה שלהם. לעומת זאת שני אנזימים אלה הם בעלי מתאם נמוך עם דרגת הנמק הכבדי; יחד עם זאת, ערכי טרנס-אמינזות בתחום של אלפי יחידות לליטר יכולים להצביע על הפאטיטיס חריפה. התמשכות העלייה ברמת טרנס-אמינזות למרות המשך טיפול, הוא מדד אמין להמשך התהליך הדלקתי בכבד. לעומת זאת, נורמליזציה של רמות טרנס-טרנספרזות במרוצת הטיפול מהווה סימן מעודד, אם כי ב-50% מהמטופלים עם רמות נורמאליות של אנזימים אלה תהליך פעיל של דלקת כבד עדיין בתוקפו. ואמנם, נורמליזציה של מדדים ביוכימיים יכולה להקדים ב-3-6 חודשים הפוגה היסטולוגית אמיתית. החמרה ברמות טרנס-אמינזות במי שנמצא בעיצומו של טיפול, או באלה שנמצאים בשלב של הפוגה יכולה להוות איתות להתעוררות מחודשת של פעילות המחלה.

מדדים ביוכימיים והמטולוגיים נוספים של כבד:

רמות בילירובין ופוספטאזה בסיסית מוגברות באופן קל עד מתון ב-80-90% מאלה עם AIH. עלייה חדה ברמת פוספטאזה בסיסית במהלך מחלה אוטו-אימונית, עלולה לבטא התפתחות של (PSC או primary sclerosing cholangitis) או תחילת מהלך של קרצינומה הפאטו-צלולארית כסיבוך של צמקת. ב-50% מהמקרים מוצאים היפו-אלבומינמיה והתארכות משך פרותרומבין PT)), שהם סמנים לאי-תפקוד חמור של המערכת הסינתטית בכבד, שמוצאים לעתים קרובות במחלת כבד פעילה או בצמקת שאינה בשליטה. בין המדדים ההמטולוגיים הבלתי-סדירים שמוצאים ב-AIH ניתן למנות leukopenia מתונה, אנמיה נורמוכרומית, אנמיה המוליטית שהיא Coombs-חיובית, תרומבוציטופניה ושקיעת דם מוחשת. אאוזינופיליה אינה שכיחה, אך ספירות בתחום שבין 9-48%דווחו לעתים. AIH תוארה כממצא היחיד הבא לביטוי בתסמונת היפר-אאוזינופילית אידיופטית.

נוגדנים נוספים ב-AIH:

ממצאי מעבדה ב-AIH כוללים גם רמה מוגברת בנסיוב של נוגדנים כנגד גרעין התא (ANAs), נוגדנים כנגד תאי שריר חלק (SMAs) הכוונים כנגד החלבון actin, נוגדנים כנגד מקטע מיקרוזומאלי של כבד וכליות (LKM-1), או נוגדנים כנגד ציטוזול של תאי כבד (Anti-LC1). נוגדנים מסוג SMAsמוצאים ב-90-100% מאלה עם AIH-1. נוגדנים מסוג ANAs מוצאים ב-10% מאלה עם AIH-1, ובשיתוף עם SMAs נמצאים ב-40-60% מאלה עם AIH-1. כייל נוגדנים עצמיים אלה נע בין 1:100-1:500,000. נוגדנים מסוג SMAs מופיעים בטיטר נמוך בילדים בריאים ובמטופלים עם הפאטיטיס נגיפית וכן במפגעים אחרים, אך אינם פוגעים בכבד.

כמו כן מוצאים ב-AIH נוגדנים כנגד SLA או אנטיגן מסיס של הכבד והם מכוונים כנגד cytokeratins types 8 & 18; נוגדנים כנגד הקולטן הספציפי של הכבד ל-asialoglycoprotein או מה שידוע כלקטין הכבדי; נוגדנים AMA כנגד המיטוכונדריה שהם הנוגדנים ההכרחיים בתרחיש של PBC או primary biliary cirrhosis, אך ניתן למצאם גם ב-AIH; נוגדני APLA כנגד פוספוליפידים (Pathmakanthan וחב' ב- Eur J Gastroenterol Hepatol משנת 1998).

נוגדני LKM-1 נמצאים ב-40-45% מהמטופלים עם AIH-2 והם כרוכים עם מציאות נוגדנים anti-LC1 ב-50% מהמאובחנים עם סוג AIH זה. נוגדנים מסוג anti-LC1 בעצמם ניתן למצוא ב-30% מאלה עם AIH-2, כאשר נוגדנים אחרונים אלה מזהים את האנזים המטבולי הספציפי לכבד הידוע כ-formiminotransferase cyclodeaminase שמשקלו המולקולארי 58,000 דלטון. נוגדנים כנגד הקולטן ל-asialoglycoprotein נמצאים באופן שכיח יותר באלה עם AIH-1 ועשויים לשמש סמנים לפעילות דלקתית. נוגדנים עצמיים נוספים יכולים להימצא גם כן, כגון נוגדנים בלתי-אופייניים מסוג pANCA או perinuclear antineutrophil cytoplasmic antibodies. נמצא שמאובחנים עם AIH בהם נמצאים ממצאים חיוביים לגבי נוגדנים כנגד actin, הם נבדקים צעירים יותר החיוביים לאנטיגן הלויקוציטי האנושי HLA-DR3, ונבדקים אלה נזקקו להשתלת כבד באופן שכיח יותר בהשוואה למטופלים עם ANAs בהם לא נמצאו נוגדנים ל-actin (על פי Czaja וחב' ב-Hepatology משנת 1996).

רקע גנטי ב-AIH:

התרומה של רקע גנטי להופעת תרחיש כגון AIH, מיוחסת למספר haplotypes של HLA, ביניהם DR4, DR3, B14, B8 ו-Dw3. גם שמט (deletion) של הגן C4A נכרך עם הופעת AIH באנשים צעירים יותר (Scully וחב' ב-Gastroenterology משנת 1993). מאובחנים עם AIH נשאי haplotype כדוגמת HLA-DR3, הם בסבירות גבוהה יותר למחלה בדרגת אגרסיביות גדולה יותר, המגיבה פחות לטיפול תרופתי ונזקקת בשכיחות גבוהה יותר להשתלת כבד. בנוסף, המטופלים האחרונים צעירים יותר בעת אבחון המחלה מאשר אלה נשאי haplotypes אחרים. כמו כן, אלה עם AIH נשאי HLA-DR4 haplotype, הם בסבירות גבוהה יותר לפתח תסמינים חוץ-כבדיים (Czaja וחב' ב-Hepatology משנת 1993).

מטופלים עם AIH הם בעלי רמה נמוכה של לימפוציטים T המבטאים את הסמן CD8, ויש להם גם פגם ספציפי בתת-אוכלוסייה של תאי T המפקחים על התגובה החיסונית כנגד אנטיגנים ספציפיים על פני תאי כבד. AIH נכרכה גם עם האלל C4AQO הקשור למשלים (complement), מה שגורם לחסר חלקי של מרכיב המשלים C4. ל-C4 תפקיד ידוע בנטרול נגיפים, והכשל להשמיד נגיפים עלול להביא לתגובה חיסונית כנגד אנטיגנים על פני התאים המודבקים בנגיפים אלה.

גריינים סביבתיים:

בין הנגיפים המוזכרים ככאלה המגרים תרחיש של AIH נמצא את נגיפי rubella, Epstein-Barr והפאטיטיס B ,A, ו-C. מספר מחקרים הצביעו על הומולוגיה ניכרת ברצף חומצות האמינו בין חלבוני הפאטיטיס C לבין CYP2D6 שהוא היעד המולקולארי של הנוגדן העצמי LKM-1, מה שמרמז לכך שחפיפה מולקולארית גורמת להופעת נוגדני LKM-1 בהדבקה של הפאטיטיס C. יש להדגיש יחד עם זאת, שכאשר מופיעים באלה עם הפאטיטיס C כרונית נוגדנים כנגד LKM-1 אלה בדרך כלל אינם מכוונים כנגד אותם אפיטופים איתם מגיבים נוגדנים אלה המופיעים בנסיוב של אלה עם AIH-2. גם תרופות שונות עלולות לגרות תרחיש של AIH, באופן שחלבון של אנזים כגון uridine diphosphat glucuronosyltansferase ומערכת ציטוכרום P-450, מהווים יעדים לאוטו-אימוניות המושרה על ידי נגיף או תרופה, כמו גם להפאטיטיס אוטו-אימונית.

פתוגנזה של AIH:

ראיות עדכניות מצביעות על כך שנזק לכבד באלה עם AIH, הוא תוצאה של התקפה של המערכת החיסונית התאית. תצוגה אנטיגנית משובשת של HLA-class II על פני הפאטוציטים מגבירה את החשיפה של מרכיבים נורמאליים על פני תאים אלה לתאי חיסון הידועים כ-APCs או antigen-presenting cells. ה-APCs מציגים את האנטיגנים של תאי-כבד ללימפוציטים בלתי-מחויבים מסוג Th 0 או helper T-lymphocytes, ואינטראקציה זו מביאה לשפעול של Th 0. שפעול זה מלווה על ידי התמיינות (דיפרנציאציה) של התאים האחרונים ליצירת Th 1 או helper T cell 1, או ליצירת Th 2 או helper T cell 2, בהתאם לציטוקינים השולטים ברקמת הכבד ואופיו של האנטיגן. תאי Th 1 מפרישים בעיקר את האינטרלויקין IL-2 וכן את אינטרפרון-גאמא, אשר משפעלים מקרופאגים ומעודדים את הביטוי של האנטיגנים I HLA class ו-HLA class II, ובכך מכניסים לפעולה את המערכת החיסונית. לעומת זאת, תאי Th 2 מייצרים בעיקר את האינטרלויקינים IL-5, IL-4 ו-IL-10, המעודדים יצירת נוגדנים עצמיים על ידי לימפוציטים מסוג B (על פי Longhi וחב' ב-J Autoimmun משנת 2009).

הסיבות לתצוגה המשובשת של HLA אינן ברורות, אך ייתכן שהן תולדה של גורמים גנטיים, של הדבקה נגיפית חריפה של הפאטיטיס A או B, או של נגיף Epstein-Barr (על פי Vento ו-Cainelli ב-Autoimmun Rev משנת 2004). ייתכן גם שמדובר בהשפעת גורמים כימיים כגון אינטרפרון, מלטונין, α-מתילדופה, nitrofurantoin ,oxyphenisatin או tienilic acid. יש גם המצביעים על הקולטן ל-asialoglycoprotein וכן על cytochrome mono-oxygenase P-450 2D6 כאנטיגנים עצמיים הקשורים לתצוגה המשובשת של HLA.

במצב פיזיולוגי תקין, תאי Th 1 ו-Th 2 מזהים זה את זה, ומנגנונים מווסתים מפקחים באופן מוקפד על תהליכי הזיהוי האנטיגני העצמי. כישלונם של מנגנונים אלה מחיש את המתקפה האוטו-אימונית. הפגיעה בתאי הכבד עלולה להיגרם על ידי פעילות לימפוציטים ציטוטוקסיים המושפעים על ידי IL-2, על ידי שפעול המשלים, על ידי גיוס לימפוציטים מסוג NK על ידי נוגדנים עצמיים הקשורים על פני תאי הכבד, או על ידי תגובה של נוגדנים עצמיים עם אנטיגנים ספציפיים לרקמת הכבד הבאים לביטוי על פני הפאטוציטים. אכן, הפאטוציטים המצופים על ידי נוגדנים עצמיים באלה עם AIH, מומתים כאשר הם מודגרים עם לימפוציטים אוטולוגיים מתרומה עצמית או לימפוציטים אלוגנאיים של תורם זר. התא הממית את ההפאטוציטים בחולי AIH, או תא האפקטור, הנמצא כתא מונונוקלארי שעל פניו יש נוכחות של קולטן למקטע Fc. כבר בשנת 1990 פרסמו Wen וחב' ב-Lancet, שתאי Tשבודדו מדגימות ביופסיית כבד של ילדים עם AIH, ואשר ביטאו על פניהם את הקולטן γ/δ של תאי T הם במיוחד טוקסיים לתאי כבד.

משמעות בדיקות המעבדה:

טיטר גבוה של anti-LKM-1 מצביע כמעט בוודאות שהנבדק נכלל בקבוצת AIH-2, אך התוצאה אינה מוחלטת. ניתן לבצע ביופסיה של הכבד להעריך את מידת הנזק הרקמתי וההצטלקות, על מנת לסייע באישור האבחון. אם תוצאות הבדיקות מצביעות על תוצאה שלילית של anti-LKM-1, ותוצאות חיוביות של נוגדני SMA או ANA, אז יש סבירות גבוהה שמדובר ב-AIH-1. אם תוצאות כל הנוגדנים האמורים מתקבלות שליליות, נראה שהתסמינים הקליניים אינם תוצאה של AIH. יחד עם זאת, אין לשלול לחלוטין אפשרות שעדיין מדובר ב-AIH. לא כל אלה עם AIH מייצרים נוגדנים כנגד LKM-1 או כנגד SMA, כאשר כמה מהם מייצרים נוגדנים עצמיים אחרים שנבחנים רק לעתים נדירות.

הטיטר של הנוגדנים כנגד LKM-1 אינו משקף את חומרת התסמינים או את הפרוגנוזה של המחלה. טיטר הנוגדנים כנגד LKM-1 יכול להשתנות לאורך זמן. אלה המאובחנים עם AIH-2 עלולים לעתים לסבול בעת ובעונה אחת ממפגעים אוטואימוניים אחרים, כגון סוכרת או thyroiditis. מטופלים עם הפאטיטיס C כרונית יכולים לעתים לפתח סוג שונה של נוגדן כנגד LKM-1, שאינו מתגלה בשיטות הבדיקה הרגילות לנוגדן זה, ואין נוהגים בשגרת המעבדה לנסות ולגלותו.

נוגדנים כנגד LKM-1 משמשים כסמן ל-AIH-2, והם מופיעים באופן אופייני בהיעדר נוגדני SMA ו-ANA. הנוגדן כנגד LKM-1 מגיב עם רצף ליניארי קצר של האנטיגן הריקומביננטי cytochrome monooxygenase P450 2D6 (על פי Czaja ו-Homburger ב-Gastroenterology משנת 2001). מאובחנים עם AIH-2 נוטים להיות צעירים יותר, נשים, אשר תסמיני מחלתם חמורים, אך גם כאלה המגיבים טוב לטיפול המדכא את מערכת החיסון.

מתי מתבצעת הבדיקה לנוכחות נוגדנים כנגד LKM-1?

רמת הנוגדנים כנגדLKM-1 נקבעת במסגרת הערכה של מטופלים עם מחלת כבד ללא אטיולוגיה ברורה. בדיקה זו נדרשת בעיקר במקביל לבדיקת נוכחות הנוגדנים מסוג SMA או ANA, על מנת לסייע באבחון של AIH, ולהבדיל בין 2 הסוגים העיקריים של הפאטיטיס אוטו-אימונית, type 1 ו-type 2. מבחנים אלה יכולים להתבצע במסגרת מעקב אחר ממצאי כבד בלתי תקינים, כגון רמות מוגברות באופן עיקש של 2 אנזימי הטרנסאמינאז ALT ו-AST, או של בילירובין. מבחנים אחרים שיש להביא בחשבון ביצועם באותו הקשר, הם מדידת רמת אימונוגלובולינים, שכן האחרונים בדרך כלל מוגברים ב-AIH אך אינם מוגברים בהפאטיטיס נגיפית.

== הוראות לביצוע הבדיקה ==

אין צורך להיות בצום. יש לדגום דם למבחנה כימית (פקק אדום או צהוב) ולאחר סרכוז והפרדת הנסיוב יש להעבירו במבחנה מקוררת למעבדה. ניתן לשמור את הנסיוב עד 4 ימים בטמפרטורת החדר, עד 21 יום בקירור, או 40 יום בהקפאה. אין לקבל דגימות נסיוב בדרגת המוליזה, ליפמיה או איקטֶריה גבוהות, אך ניתן לבדוק דגימות אלה בדרגות המוליזה, ליפמיה ואיקטריה מתונות.

LKM-1

2015-10-19T11:13:23Z

בן עמי סלע:

== LKM-1 ==

כינויים נוספים: נוגדנים ל-anti-LKM1 ; LKM1 (liver/kidney microsomal type 1) antibodies ; LKM-1 Antibodies ;Anti-P450 2D6 .
תחום: מפגעי כבד ובעיקר autoimmune hepatitis.
טווח ערכים תקין: שלילי-לא יותר מ-20.0 יחידות לליטר; גבולי-20.1-24.9 יחידות לליטר; חיובי-מעל 25.0 יחידות לליטר. ערכי ייחוס אלה רלוונטיים לבני כל הגילים.
יוצר הערך: פרופ' בן-עמי סלע.

הפאיטיס אוטו-אימונית:

הפאטיטיס אוטו אימונית (AIH) היא מחלה כרונית מסיבה לא ידועה המאופיינת על ידי תהליך דלקת הפאטו-צלולארית מתמשכת, עם התפתחות נמק ונטייה לעבור לשלב של צמקת. תסמונת זו לעתים קרובות כרוכה עם מחלות אוטו-אימוניות נוספות. לא ניתן להסביר AIH על בסיס של הדבקה נגיפית כרונית, צריכת אלכוהול, או חשיפה לתרופות או כימיקאלים טוקסיים לכבד. ב-13-20% המחלה מתפוגגת באופן ספונטאני ללא כל קשר לפעילות הדלקתית, באופן שלא ניתן לצפות מראש. קרצינומה של תאי כבד (HCC) פחות שכיחה באלה עם AIH בהם התפתחה צמקת, מאשר באלה בהם הצמקת הופיעה מסיבות אחרות. אף על פי כן, HCC אינה אירוע נדיר ב-AIH. לייפת (fibrosis) מופיעה ברוב המטופלים עם AIH, וללא טיפול יעיל הלייפת מתחילה לחבר את אזורי הכבד השעריים (portal) עם האזור המרכזי שלו, מה שבסוף התהליך מוליך לצמקת. בשנת 1999 ה-International AIH Group יצרה מערכת דירוג המחלה שיעילותה ניכרת בעיקר באבחון של AIH במקרים גבוליים-בעייתיים (Alvarez וחב' ב-J Hepatol משנת 1999, ו-Wiegard וחב' ב-Semin Liver Dis משנת 2009).

הממצאים ההיסטו-פתולוגיים באלה עם AIH הם אופייניים אך לא ספציפיים: ל- AIH יש ממצאים המשותפים למקרים של הפאטיטיס נגיפית כרונית, מקרים של הפאטיטיס כרונית על רקע של תרופות, ועוד מפגעי כבד נוספים. ב-10-20% מהמקרים של AIH מוצאים בדגימות ביופסיה הפאטוציטים ענקיים רב-גרעיניים. לממצאים ההיסטופתולוגיים בדגימות ביופסיה של הכבד חשיבות באבחון AIOH ובקביעת חומרת המחלה. ממצאים אלה חיוניים להבדלת AIHמהדבקה ב-HCV, מהפאטיטיס על רקע אלכוהול, ממחלת כבד הנגרמת מטיפול תרופתי טוקסי, מ-PBC ומ-PSC או primary sclerosing cholangitis (על פי Czaja & Carpenter ב-Gastroenterology משנת 1993). כמו כן, AIH מתאפיין על ידי הסננה פורטאלית של תאים מונו-נוקלאריים, לעתים מוצאים גם הסננה של תאי פלזמה.

הרקע ההיסטורי של הפאטיטיס אוטו-אימונית:

החוקר השוודי Waldenström תאר לראשונה בשנת 1950 ב-Acta Endocrinol צורה של הפאטיטיס כרונית בנשים צעירות. התרחיש תואר על ידו כצמקת הכבד, הסננה לכבד של תאי פלזמה והיפר-גאמא-גלובולינמיה ניכרת. באותה שנה דווחו Kunkel וחב' ב-J Clin Invest ו-Bearn וחב' ב-1956 ב-Am J Med, מאפיינים אחרים של התרחיש כולל הגדלה של הטחול והכבד, צהבת. חטטת הפנים (Acne) שעירות-יתר, תווי פנים כבתסמונת Cushing, פיגמנטציה של אזור הבטן, השמנת-יתר, דלקת מפרקים, ואל-ווסת (amenorrhea) בנשים צעירות. בשנת 1955, היו אלה Joske ו-King שדיווחו לראשונה ב-Lancet על הקשר בין זאבת ארגמנית (לופוס) בהפאטיטיס נגיפית כרונית, קשר שהביא לטביעת המושג הפאטיטיס לופואידית על ידי Mackay וחב' ב-Lancet ב-1956. כיום כבר ברור שאין כל קשר בין SLE לבין הפאטיטיס אוטו-אימונית (להלן AIH), וממילא הפאטיטיס לופואידית אינה קשורה ל-SLE.

התיאור ההיסטו-פתולוגי של AIH עבר מספר עדכונים במהלך השנים. בשנת 1992 התכנס פאנל בינלאומי והגדיר מחדש את הקריטריונים האבחוניים (Johnson ו-McFarlane ב-Hepatology משנת 1993), ונקבע סופית שהביטוי המקובל יהיה הפאטיטיס אוטו-אימונית ולא ביטוי שהיה רווח קודם לכן דוגמת הפאטיטיס-אוטו-אימונית כרונית פעילה, שהיה בשימוש באותה עת. אותו פאנל הסיר את הדרישה לפרק זמן מינימאלי של 6 חודשים של פעילות המחלה, כדי שזו תוגדר "כרונית", הרחיב את הספקטרום ההיסטולוגי על מנת שיכלול הפאטיטיס אונתית (lobular), ואישש מחדש את האופי הלא נגיפי של מחלה זו. פאנל זה אישר הכללה של ממצאים היסטולוגיים לכאורה סותרים, כמו כולסטאזיס, פגיעה בצינורות המרה ו-ductopenia.

אפידמיולוגיה של הפאטיטיס אוטו-אימונית:

בארה"ב הנתונים האפידמיולוגיים מוגבלים. בין מבוגרים לבנים שכיחות המפגע מוערכת כ-0.1-1.2 מקרים לכל 100,000. השכיחות של AIH בין מטופלים עם מחלת כבד כרונית היא בתחום של 11-23%. המחלה אחראית לכ-6% מכלל השתלות הכבד בארה"ב. הפאטיטיס אוטו-אימונית type 2 (להלן AIH-2) ו-AIH-3 יחסית פחות שכיחים בארה"ב, ולעומת זאת AIH-2 נפוצה יותר באירופה.

השכיחות של AIH מוערכת בכ-0.1-1.2 מקרים ל-100,000 במערב אירופה, כאשר במזרח אירופה שכיחות מפגע זה גבוהה משמעותית ומגיעה עד כדי 11.6-16.9 מקרים לכל 100,000. זו שכיחות הדומה לזו של צמקת מרתית ראשונית (PBC), וגבוהה פי-2 מזו של מחלת כבד כרונית חסימתית (או primary sclerosing cholangitis). באירופה AIH אחראית לכ-3% מהשתלות הכבד. ביפאן לעומת זאת, השכיחות של AIH נמוכה משמעותית עם 0.015-0.08 מקרים לכל 100,000.

היחס בין AIH-1 ל-AIH-2 הוא :11.5-2.1 באירופה ובקנדה, ו-6-7:1 בארה"ב, בדרום אמריקה, וביפאן. השכיחות של AIH-2 במדינות דרום אירופה גדולה יותר מאשר במדינות צפון אירופה, ארה"ב ויפאן. בניתוח נתונים של 33,379 מטופלים עם צמקת הכבד, מצאו Michitaka וחב' ש-AIH היה הגורם האטיולוגי ב-1.9% מכלל מקרי צמקת אלה ביפאן (J Gastroenterol משנת 2009). רק לשם השואה, הפאטיטיס C היה הגורם האטיולוגי המשמעותי ביותר לצמקת הכבד ביפאן, שם הוא אחראי ל-61% מכלל מקרי הצמקת.

AIH שכיחה ביותר בצפון אירופה באלה עם שכיחות גבוהה של הסמנים הגנטיים HLA-DR3 ו-HLA-DR4 (על פי Boberg ב-Clin Liver Dis משנת 2002, ו-Czaja ב- Semin Liver Dis משנת 2009). ביפאן מצאו Seki וחב' מתאם בין HIH לבין HLA-Bw54 ו-HLA-DR4 (ב-Hepatology משנת 1990).

נשים נפגעות משמעותית יותר מגברים מ-AIH, כאשר McFarlane ו-Heneghan מצאו ב-Hepatol Res משנת 2007, יחס של בערך 3:1 בין שני המינים. ל-AIH יש פיזור גיל דו-מודאלי, כאשר השיא הראשון של הופעת המפגע מתחולל בגילים של 10-20 שנה, והשיא השני של הופעתו מתחולל בין הגילים 45-70 שנה. בערך מחצית מהנפגעים ב-AIH הם מתחת לגיל 20 שנה, והוא גבוה בנערות לפני הופעת המחזור. מאובחנים עם AIH-2 הם בממוצע צעירים יותר, כאשר 80% מבין אלה עם AIH-2 הם ילדים. יחד עם זאת, AIH עלולה להופיע בכל גיל כולל תינוקות וקשישים (Mieli-Vergani ו-Vergani ב-Semin Liver Dis משנת 2009, ו-Czaja ו-Carpenter ב-Hepatology משנת 2006). בקבוצת הגיל הקשישה יש נטייה לגברים להיפגע יותר מ-AIH מאשר נשים.

אטיולוגיה:

האטיולוגיה של AIH אינה ידועה, אם כי מספר גורמים (הדבקה נגיפית, תרופות, וגורמים סביבתיים) עלולים לגרות תגובה אוטו-אימונית ובהתאם תופיע מחלה אוטו-אימונית. בחלק קטן של מאובחנים עם AIH, המפגע מתחולל בעקבות הדבקה חריפה בנגיף הפאטיטיס A, הפאטיטיס B או נגיף Epstein-Barr. נוגדנים עצמיים שכיחים האלה עם הדבקה כרונית ב-HCV, כאשר בנסיוב של אלה ניתן למצוא נוגדנים ל-LKM1. בחלק מהמקרים של מחלת כבד מושרה על ידי תרופות, ניתן למצוא תהליך המתווך על ידי מערכת החיסון. מספר תרופות כדוגמת methyldopa ,nitrofurantoin ,minocycline (על פי Ramakrishna וחב' ב-J Clin Gastroenterol משנת 2009), adalimumab (על פי Adar וחב' ב-J Clin Gastroenterol משנת 2010), ו-infliximab (על פי Fairhurst & Sheehan-Dre ב-Clin Exp Dermatol משנת 2009), יכולות לגרום למחלת כבד עם מאפיינים דומים לאלה של AIH. למרות שברוב המקרים התסמינים מתפוגגים עם הפסקת הטיפול בתרופות אלה, ניתן למצוא מקרים כרוניים של AIH, גם לאחר הפסקת הטיפול התרופתי הזה (Liu ו-Kaplowitz ב-Clin Liver Dis משנת 2002). בשנת 2010 דיווחו Casswall וחב' ב-Scand J Gastroenterol על מציאת DNA של זני הליקובקטר שונים ב-50% של ביופסיות כבד שנלקחו מילדים ומתבגרים עם AIH.
AIH יכולה להיות type 1 או type 2. הפאטיטיס type 1 יכולה להופיע בגילים שונים אך היא שכיחה יותר בנשים צעירות. כמחצית אלה עם AIH type 1, נושאים בקרבם מחלה אוטו-אימונית נוספת כגון סוכרת type 1, או קוליטיס כיבית. באשר ל-AIH type 2, סוג זה יכול להופיע במבוגרים אך הוא שכיח ביותר בילדות-נערות בגיל 2-14 שנה. אלה עם AIH type 2 מכילים נוגדנים עצמיים המגיבים עם מקטע מיקרוזומאלי של הכבד והכליות, השונה מזה כנגדו מכוונים נוגדנים-עצמיים ב-AIH type 1.

מאפיינים קליניים של הפאטיטיס אוטו-אימונית:

AIH הוא בעל מהלך כרוני שהגורם לו עדיין אינו ברור, והוא מתאפיין על ידי תהליך דלקתי הפאטו-צלולארי ונמק, שיש לו נטייה להתדרדר למצב של צמקת. AIH יכול להופיע כהפאטיטיס חריפה או כרונית, או כצמקת מוכחת. במקרים נדירים AIH בא לביטוי ככשל כבדי פולמיננטי. בערך אחד מכל שלושה מאובחנים עם AIH, מראה תסמינים של הפאטיטיס חריפה, המתבטאת בחום גבוה, רגישות של הכבד, וצהבת. חלק המטופלים עם AIH מפתחים סימנים ותסמינים של מחלת כבד כרונית, ואילו אחרים מתדרדרים במהירות לאי-ספיקת כבד חריפה, הבאה לביטוי בצהבת ובקואגולופתיה.

תסמינים שכיחים וממצאים המתקבלים בבדיקה פיזית עלולים לנבוע ממפגעים חוץ-כבדיים הכרוכים ב-AIH. תסמינים שכיחים כוללים עייפות, תחושת אי-נוחות ברום הבטן, גרד מתון, בחילה, הקאות ושלשולים, תווי פנים אופייניים למחלת Cushing, כאבי מפרקים ושרירים (myalgia), פריחה עורית (כולל חטטת), שעירות-יתר, כאבי חזה הנובעים מפלאוריטיס, בצקת ואיבוד משקל. הממצאים השכיחים בבדיקה פיזית הם הפאטומגליה (83%), צהבת (69%), ספלנומגליה (32%), מיימת (20%), אנצפלופתיה (14%) וריבוי לא תקין של כלי דם עוריים (spider angiomas) בפנים, בצוואר ובגפיים (58%). כן יכול להופיע שתן בצבע שחור, אנורקסיה וצואה בהירה ביותר.

תסמינים קליניים באוכלוסייה פדיאטרית עם AIH:

מחקר על ילדים (Caucasian) עם AIH של Oettinger וחב' ב-J Autoimmun משנת 2005, העלה את הנתונים הבאים: ב-58% מתוכם הייתה צהבת, חולשה בלתי ספציפית הופיעה ב-57% מהנבדקים, אנורקסיה ב-47%, כאבי בטן ב-38% וחיוורון (pallor) אובחן ב-26% מהילדים עם AIH. כ-70% מהילדים עם AIH יזדקקו לטיפול עד להיותם בוגרים, כאשר בחלקם צמקת הכבד כבר קיימת למרות גילם הצעיר. בין 20-25% מהילדים המאובחנים עם AIH ימותו בגיל צעיר יחסית או יזדקקו להשתלת כבד. הנחיות שפורסמו בשנת 2011 על ידי האיגוד הגסטרו-אנטרולוגי הבריטי, קובעות שמטופלים צעירים עם AIHצריכים להיות מטופלים עם תכשירים לדיכוי מערכת החיסון, כדי למנוע או לעכב צמקת הכבד (Gleeson ו-Heneghan ב-Gut משנת 2011).

בסדרת מחקרים מדווחים על ידי Gregorio וחב' ב-Hepatology משנת 1997, נמסר ש-70% מהילדים עם AIH-1, ו-40% מהילדים עם AIH-2, פיתחו צמקת הכבד. במדגם של 52 ילדים, 17% סבלו מתמט (collapse) מולטיאצינארי או פנאצינארי עם כשל כבדי חד. המטופלים במחקר זה עם הפרוגנוזה הגרועה ביותר בהיבט של מוות מוקדם או הזדקקות להשתלת כבד, היו הילדים עם אבחון מוקדם של AIH-2, שסבלו מקואגולופתיה, רמות בילירובין גבוהות ותמונה היסטולוגית חמורה כבר בשלב האבחון המוקדם של AIH. בילדים, במצבי מחלה מתקדמת עלולים להופיע תופעות של פרקי בלבול.

הנוגדן LKM-1:

הנוגדן LKM-1 הוא הסמן האבחוני של הצורה החמורה של AIH הידועה כ-autoimmune hepatitis type 2 (להלן AIH2) הפוגעת באופן אופייני בילדים ובמבוגרים צעירים (Homberg וחב' ב-Hepatology משנת 1987). גילוי נוגדן זה בוצע בעבר באופן קונבנציונאלי על ידי אימונו-פלואורסצנטיה, שהיא טכניקה סובייקטיבית שנעשה בה שימוש ברקמות של כבד, כליה וקיבה של חולדות בתור מצע השוואתי (Rizzetto וחב' ב-Clin Exp Immunol משנת 1973). נדירות הממצא של LKM-1 והדמיון בצביעה שלו לזה של הנוגדן האנטי-מיטוכונדריאלי כמו גם לזו של הנוגדן ל-liver cytosol type-1, גרמו לעתים להחמצת LKM-1 (על פי Seelig וחב' ב-Clin Exp Immunol משנת 1993). בהמשך, נחשבה שיטת קישור ליגנד רדיואקטיבי ל"מדד הזהב" לגילוי LKM1, אך זו שיטה ממושכת בביצוע והופכת לא שכיחה במעבדות משיקולים של זיהום סביבתי בחומר רדיו-אקטיבי. למעשה מאז שנת 1999 מקובלת שיטת ELISA שנמצאה ספציפית וגם רגישה (Kerkar וחב' ב-J Immunol Methods משנת 1999, וכן במאמר נוסף של אותם חוקרים ב-J Clin Pathol משנת 2002. גם Miyakawa וחב' פרסמו בשנת 1999 ב-Autoimmunity נתונים על גילוי anti-LKM-1 בשיטת ELISA בנבדקים מבוגרים עם מחלת כבד כרונית, זאת על רקע העובדה שנוגדן עצמי זה מתגלה גם בחלק ממטופלים עם הפאטיטיס C כרונית.

במחקר זה נסקרו 29 מטופלים חיוביים ל-anti-LKM1, כמו גם 301 דגימות נסיוב של אלה עם מחלות כבד שונות, וכן 100 דגימות מאנשים בריאים שליליים ל-anti-LKM1. הספציפיות של מבחן ה-ELISA נבחנה על ידי מבחני ספיחה תוך שימוש בדגימות נסיוב חיוביות ל-anti-LKM1. ב-29 דגימות הנסיוב ממטופלים חיוביים ל-anti-LKM1 בשיטת בדיקה אימונו-פלואורסצנטית IF)) נמצא מתאם טוב בין שיטות ELISA ו-IF. בדיקת נוגדן anti-LKM1 נמצאה חיובית ב-12 מתוך 12 מטופלים מוכחים עם AIH2, וב-16 מתוך 17 הנבדקים עם הפאטיטיס C כרונית שנמצאו חיוביים ל-anti-LKM1 בשיטת IF. ב-401 דגימות אחרות שנמצאו שליליות ל-anti-LKM1 בשיטת IF, נמצא בשיטת ELISA, שפרט לדגימות בודדות כל השאר נמצאו שליליות ל-anti-LKM1 בשיטת ELISA.

הפיתוח של שיטות מדידה סרולוגיות סימל התקדמות אבחונית חשובה, מה שהעניק אפשרות להבדיל בין הפאטיטיס נגיפית כרונית, לבין מחלות כבד כרוניות אחרות, כולל AIH הנחשבת כיום למפגע רב מערכתי, שיכול להתרחש בשני המינים בכל גיל. AIH יכולה להופיע כפועל יוצא של זיהום נגיפי דוגמת הפאטיטיס A, או על ידי חשיפה לכימיקאלים דוגמת minocycline.

נוגדנים עצמיים כנגד LKM1 בזיהום כרוני של הפאטיטיס C: האם דוגמה לחיקוי מולקולארי?

Marceau וחב' פרסמו בשנת 2005 ב-Hepatology את נתוניהם בנושא זה. כידוע נוגדנים עצמיים כנגד LKM1 המכוונים כנגד ציטוכרום P450 2D6 (או CYP2D6), נחשבים סמנים ספציפיים של AIH-2, אך ניתן למצאם גם ב-5% של דגימות נסיוב של מטופלים עם הדבקה כרונית ב-HCV. הוצע שקיים דמיון או חיקוי מולקולארי בין חלבוני הנגיף HCV לבין CYP2D6 על מנת להסביר נוכחות נוגדנים אלה. נוגדנים עצמיים כנגד LKM1 מחולים עם הדבקה ב-HPC, נוקו בשיטת affinity purification על פני עמודה שעליה ספחו את חלבוני .CYP2D6. אפיטופים מבניים של CYP2D6 זוהו על ידי סריקה ואנליזה של phage display, והזיהוי של צמדים משמעותיים סטטיסטית (SSPs). תגובה צולבת בין חלבונים מועמדים של CYP2D6 ו-HCV נבחנה על ידי immunoprecipitation. בודדו 19 שבטים (clones) שונים, והריצוף שלהם הביא למיפוי של אפיטופ מבני באזור של רצף חומצות אמינו 254-288 של CYP2D6, איזור המכיל את האפיטופ הלינארי העיקרי במטופלים עם AIH-2.

בין חלבוני הנגיף HCV מועמדים לחיקוי מולקולארי כללו את E2 ,NS3 ו-NS5a. אכן, נוגדנים עצמיים מטוהרים שבודדו ממטופלים עם הפאטיטיס C המכילים נוגדנים כנגד LKM1, השקיעו בתמיסה את החלבונים NS3 או את NS5a של הנגיף HCV, או אף את שניהם, ותגובתיות זו נוטרלה על ידי CYP2D6.

חלבוני נסיוב ואימונו-גלובולינים:

ממצא שכיח בנסיוב של אלה עם AIH בלתי מטופלת, הוא היפר-γ-גלובולינמיה של IgG רב-שבטי (polyclonal), כאשר רמות γ-גלובולינים נעות בתחום של 3-4 גרם/ד"ל, ויכולות להגיע לעתים קרובות עד 5-6 גרם/ד"ל. יש מדי פעם דיווחים על צמיגות-יתר של הנסיוב שהם משניים לרמות IgG גבוהות. האבחון של AIH אינו סביר בנבדקים עם הפאטיטיס חריפה ללא היפר-γ-גלובולינמיה. רמת γ-גלובטולינים או זו של IgG יכולות לשמש כבסיס סדיר לתגובת המפגע לטיפולים. אלה עם AIH-2 מראים בדרך כלל רמת IgA נמוכה (Mieli-Vergani ו-Vergani ב-World J Gastroenterol משנת 2008).

אמינו-טרנספרזות:

שני אנזימי האמינו-טרנספרזות, ALT ו-AST, נמצאים מוגברים ב-100% של מטופלים בשלב האבחון המוקדם של AIH, עם רמות בתחום של 200-300 יחידות לליטר, אם כי לעתים מדווח על מקרים בהם רמת הטרנס-אמינזות גבוהה פי-50 מרמת הנורמה שלהם. לעומת זאת שני אנזימים אלה הם בעלי מתאם נמוך עם דרגת הנמק הכבדי; יחד עם זאת, ערכי טרנס-אמינזות בתחום של אלפי יחידות לליטר יכולים להצביע על הפאטיטיס חריפה. התמשכות העלייה ברמת טרנס-אמינזות למרות המשך טיפול, הוא מדד אמין להמשך התהליך הדלקתי בכבד. לעומת זאת, נורמליזציה של רמות טרנס-טרנספרזות במרוצת הטיפול מהווה סימן מעודד, אם כי ב-50% מהמטופלים עם רמות נורמאליות של אנזימים אלה תהליך פעיל של דלקת כבד עדיין בתוקפו. ואמנם, נורמליזציה של מדדים ביוכימיים יכולה להקדים ב-3-6 חודשים הפוגה היסטולוגית אמיתית. החמרה ברמות טרנס-אמינזות במי שנמצא בעיצומו של טיפול, או באלה שנמצאים בשלב של הפוגה יכולה להוות איתות להתעוררות מחודשת של פעילות המחלה.

מדדים ביוכימיים והמטולוגיים נוספים של כבד:

רמות בילירובין ופוספטאזה בסיסית מוגברות באופן קל עד מתון ב-80-90% מאלה עם AIH. עלייה חדה ברמת פוספטאזה בסיסית במהלך מחלה אוטו-אימונית, עלולה לבטא התפתחות של (PSC או primary sclerosing cholangitis) או תחילת מהלך של קרצינומה הפאטו-צלולארית כסיבוך של צמקת. ב-50% מהמקרים מוצאים היפו-אלבומינמיה והתארכות משך פרותרומבין PT)), שהם סמנים לאי-תפקוד חמור של המערכת הסינתטית בכבד, שמוצאים לעתים קרובות במחלת כבד פעילה או בצמקת שאינה בשליטה. בין המדדים ההמטולוגיים הבלתי-סדירים שמוצאים ב-AIH ניתן למנות leukopenia מתונה, אנמיה נורמוכרומית, אנמיה המוליטית שהיא Coombs-חיובית, תרומבוציטופניה ושקיעת דם מוחשת. אאוזינופיליה אינה שכיחה, אך ספירות בתחום שבין 9-48%דווחו לעתים. AIH תוארה כממצא היחיד הבא לביטוי בתסמונת היפר-אאוזינופילית אידיופטית.

נוגדנים נוספים ב-AIH:

ממצאי מעבדה ב-AIH כוללים גם רמה מוגברת בנסיוב של נוגדנים כנגד גרעין התא (ANAs), נוגדנים כנגד תאי שריר חלק (SMAs) הכוונים כנגד החלבון actin, נוגדנים כנגד מקטע מיקרוזומאלי של כבד וכליות (LKM-1), או נוגדנים כנגד ציטוזול של תאי כבד (Anti-LC1). נוגדנים מסוג SMAsמוצאים ב-90-100% מאלה עם AIH-1. נוגדנים מסוג ANAs מוצאים ב-10% מאלה עם AIH-1, ובשיתוף עם SMAs נמצאים ב-40-60% מאלה עם AIH-1. כייל נוגדנים עצמיים אלה נע בין 1:100-1:500,000. נוגדנים מסוג SMAs מופיעים בטיטר נמוך בילדים בריאים ובמטופלים עם הפאטיטיס נגיפית וכן במפגעים אחרים, אך אינם פוגעים בכבד.

כמו כן מוצאים ב-AIH נוגדנים כנגד SLA או אנטיגן מסיס של הכבד והם מכוונים כנגד cytokeratins types 8 & 18; נוגדנים כנגד הקולטן הספציפי של הכבד ל-asialoglycoprotein או מה שידוע כלקטין הכבדי; נוגדנים AMA כנגד המיטוכונדריה שהם הנוגדנים ההכרחיים בתרחיש של PBC או primary biliary cirrhosis, אך ניתן למצאם גם ב-AIH; נוגדני APLA כנגד פוספוליפידים (Pathmakanthan וחב' ב- Eur J Gastroenterol Hepatol משנת 1998).

נוגדני LKM-1 נמצאים ב-40-45% מהמטופלים עם AIH-2 והם כרוכים עם מציאות נוגדנים anti-LC1 ב-50% מהמאובחנים עם סוג AIH זה. נוגדנים מסוג anti-LC1 בעצמם ניתן למצוא ב-30% מאלה עם AIH-2, כאשר נוגדנים אחרונים אלה מזהים את האנזים המטבולי הספציפי לכבד הידוע כ-formiminotransferase cyclodeaminase שמשקלו המולקולארי 58,000 דלטון. נוגדנים כנגד הקולטן ל-asialoglycoprotein נמצאים באופן שכיח יותר באלה עם AIH-1 ועשויים לשמש סמנים לפעילות דלקתית. נוגדנים עצמיים נוספים יכולים להימצא גם כן, כגון נוגדנים בלתי-אופייניים מסוג pANCA או perinuclear antineutrophil cytoplasmic antibodies. נמצא שמאובחנים עם AIH בהם נמצאים ממצאים חיוביים לגבי נוגדנים כנגד actin, הם נבדקים צעירים יותר החיוביים לאנטיגן הלויקוציטי האנושי HLA-DR3, ונבדקים אלה נזקקו להשתלת כבד באופן שכיח יותר בהשוואה למטופלים עם ANAs בהם לא נמצאו נוגדנים ל-actin (על פי Czaja וחב' ב-Hepatology משנת 1996).

רקע גנטי ב-AIH:

התרומה של רקע גנטי להופעת תרחיש כגון AIH, מיוחסת למספר haplotypes של HLA, ביניהם DR4, DR3, B14, B8 ו-Dw3. גם שמט (deletion) של הגן C4A נכרך עם הופעת AIH באנשים צעירים יותר (Scully וחב' ב-Gastroenterology משנת 1993). מאובחנים עם AIH נשאי haplotype כדוגמת HLA-DR3, הם בסבירות גבוהה יותר למחלה בדרגת אגרסיביות גדולה יותר, המגיבה פחות לטיפול תרופתי ונזקקת בשכיחות גבוהה יותר להשתלת כבד. בנוסף, המטופלים האחרונים צעירים יותר בעת אבחון המחלה מאשר אלה נשאי haplotypes אחרים. כמו כן, אלה עם AIH נשאי HLA-DR4 haplotype, הם בסבירות גבוהה יותר לפתח תסמינים חוץ-כבדיים (Czaja וחב' ב-Hepatology משנת 1993).

מטופלים עם AIH הם בעלי רמה נמוכה של לימפוציטים T המבטאים את הסמן CD8, ויש להם גם פגם ספציפי בתת-אוכלוסייה של תאי T המפקחים על התגובה החיסונית כנגד אנטיגנים ספציפיים על פני תאי כבד. AIH נכרכה גם עם האלל C4AQO הקשור למשלים (complement), מה שגורם לחסר חלקי של מרכיב המשלים C4. ל-C4 תפקיד ידוע בנטרול נגיפים, והכשל להשמיד נגיפים עלול להביא לתגובה חיסונית כנגד אנטיגנים על פני התאים המודבקים בנגיפים אלה.

גריינים סביבתיים:

בין הנגיפים המוזכרים ככאלה המגרים תרחיש של AIH נמצא את נגיפי rubella, Epstein-Barr והפאטיטיס B ,A, ו-C. מספר מחקרים הצביעו על הומולוגיה ניכרת ברצף חומצות האמינו בין חלבוני הפאטיטיס C לבין CYP2D6 שהוא היעד המולקולארי של הנוגדן העצמי LKM-1, מה שמרמז לכך שחפיפה מולקולארית גורמת להופעת נוגדני LKM-1 בהדבקה של הפאטיטיס C. יש להדגיש יחד עם זאת, שכאשר מופיעים באלה עם הפאטיטיס C כרונית נוגדנים כנגד LKM-1 אלה בדרך כלל אינם מכוונים כנגד אותם אפיטופים איתם מגיבים נוגדנים אלה המופיעים בנסיוב של אלה עם AIH-2. גם תרופות שונות עלולות לגרות תרחיש של AIH, באופן שחלבון של אנזים כגון uridine diphosphat glucuronosyltansferase ומערכת ציטוכרום P-450, מהווים יעדים לאוטו-אימוניות המושרה על ידי נגיף או תרופה, כמו גם להפאטיטיס אוטו-אימונית.

פתוגנזה של AIH:

ראיות עדכניות מצביעות על כך שנזק לכבד באלה עם AIH, הוא תוצאה של התקפה של המערכת החיסונית התאית. תצוגה אנטיגנית משובשת של HLA-class II על פני הפאטוציטים מגבירה את החשיפה של מרכיבים נורמאליים על פני תאים אלה לתאי חיסון הידועים כ-APCs או antigen-presenting cells. ה-APCs מציגים את האנטיגנים של תאי-כבד ללימפוציטים בלתי-מחויבים מסוג Th 0 או helper T-lymphocytes, ואינטראקציה זו מביאה לשפעול של Th 0. שפעול זה מלווה על ידי התמיינות (דיפרנציאציה) של התאים האחרונים ליצירת Th 1 או helper T cell 1, או ליצירת Th 2 או helper T cell 2, בהתאם לציטוקינים השולטים ברקמת הכבד ואופיו של האנטיגן. תאי Th 1 מפרישים בעיקר את האינטרלויקין IL-2 וכן את אינטרפרון-גאמא, אשר משפעלים מקרופאגים ומעודדים את הביטוי של האנטיגנים I HLA class ו-HLA class II, ובכך מכניסים לפעולה את המערכת החיסונית. לעומת זאת, תאי Th 2 מייצרים בעיקר את האינטרלויקינים IL-5, IL-4 ו-IL-10, המעודדים יצירת נוגדנים עצמיים על ידי לימפוציטים מסוג B (על פי Longhi וחב' ב-J Autoimmun משנת 2009).

הסיבות לתצוגה המשובשת של HLA אינן ברורות, אך ייתכן שהן תולדה של גורמים גנטיים, של הדבקה נגיפית חריפה של הפאטיטיס A או B, או של נגיף Epstein-Barr (על פי Vento ו-Cainelli ב-Autoimmun Rev משנת 2004). ייתכן גם שמדובר בהשפעת גורמים כימיים כגון אינטרפרון, מלטונין, α-מתילדופה, nitrofurantoin ,oxyphenisatin או tienilic acid. יש גם המצביעים על הקולטן ל-asialoglycoprotein וכן על cytochrome mono-oxygenase P-450 2D6 כאנטיגנים עצמיים הקשורים לתצוגה המשובשת של HLA.

במצב פיזיולוגי תקין, תאי Th 1 ו-Th 2 מזהים זה את זה, ומנגנונים מווסתים מפקחים באופן מוקפד על תהליכי הזיהוי האנטיגני העצמי. כישלונם של מנגנונים אלה מחיש את המתקפה האוטו-אימונית. הפגיעה בתאי הכבד עלולה להיגרם על ידי פעילות לימפוציטים ציטוטוקסיים המושפעים על ידי IL-2, על ידי שפעול המשלים, על ידי גיוס לימפוציטים מסוג NK על ידי נוגדנים עצמיים הקשורים על פני תאי הכבד, או על ידי תגובה של נוגדנים עצמיים עם אנטיגנים ספציפיים לרקמת הכבד הבאים לביטוי על פני הפאטוציטים. אכן, הפאטוציטים המצופים על ידי נוגדנים עצמיים באלה עם AIH, מומתים כאשר הם מודגרים עם לימפוציטים אוטולוגיים מתרומה עצמית או לימפוציטים אלוגנאיים של תורם זר. התא הממית את ההפאטוציטים בחולי AIH, או תא האפקטור, הנמצא כתא מונונוקלארי שעל פניו יש נוכחות של קולטן למקטע Fc. כבר בשנת 1990 פרסמו Wen וחב' ב-Lancet, שתאי Tשבודדו מדגימות ביופסיית כבד של ילדים עם AIH, ואשר ביטאו על פניהם את הקולטן γ/δ של תאי T הם במיוחד טוקסיים לתאי כבד.

משמעות בדיקות המעבדה:

טיטר גבוה של anti-LKM-1 מצביע כמעט בוודאות שהנבדק נכלל בקבוצת AIH-2, אך התוצאה אינה מוחלטת. ניתן לבצע ביופסיה של הכבד להעריך את מידת הנזק הרקמתי וההצטלקות, על מנת לסייע באישור האבחון. אם תוצאות הבדיקות מצביעות על תוצאה שלילית של anti-LKM-1, ותוצאות חיוביות של נוגדני SMA או ANA, אז יש סבירות גבוהה שמדובר ב-AIH-1. אם תוצאות כל הנוגדנים האמורים מתקבלות שליליות, נראה שהתסמינים הקליניים אינם תוצאה של AIH. יחד עם זאת, אין לשלול לחלוטין אפשרות שעדיין מדובר ב-AIH. לא כל אלה עם AIH מייצרים נוגדנים כנגד LKM-1 או כנגד SMA, כאשר כמה מהם מייצרים נוגדנים עצמיים אחרים שנבחנים רק לעתים נדירות.

הטיטר של הנוגדנים כנגד LKM-1 אינו משקף את חומרת התסמינים או את הפרוגנוזה של המחלה. טיטר הנוגדנים כנגד LKM-1 יכול להשתנות לאורך זמן. אלה המאובחנים עם AIH-2 עלולים לעתים לסבול בעת ובעונה אחת ממפגעים אוטואימוניים אחרים, כגון סוכרת או thyroiditis. מטופלים עם הפאטיטיס C כרונית יכולים לעתים לפתח סוג שונה של נוגדן כנגד LKM-1, שאינו מתגלה בשיטות הבדיקה הרגילות לנוגדן זה, ואין נוהגים בשגרת המעבדה לנסות ולגלותו.

נוגדנים כנגד LKM-1 משמשים כסמן ל-AIH-2, והם מופיעים באופן אופייני בהיעדר נוגדני SMA ו-ANA. הנוגדן כנגד LKM-1 מגיב עם רצף ליניארי קצר של האנטיגן הריקומביננטי cytochrome monooxygenase P450 2D6 (על פי Czaja ו-Homburger ב-Gastroenterology משנת 2001). מאובחנים עם AIH-2 נוטים להיות צעירים יותר, נשים, אשר תסמיני מחלתם חמורים, אך גם כאלה המגיבים טוב לטיפול המדכא את מערכת החיסון.

מתי מתבצעת הבדיקה לנוכחות נוגדנים כנגד LKM-1?

רמת הנוגדנים כנגדLKM-1 נקבעת במסגרת הערכה של מטופלים עם מחלת כבד ללא אטיולוגיה ברורה. בדיקה זו נדרשת בעיקר במקביל לבדיקת נוכחות הנוגדנים מסוג SMA או ANA, על מנת לסייע באבחון של AIH, ולהבדיל בין 2 הסוגים העיקריים של הפאטיטיס אוטו-אימונית, type 1 ו-type 2. מבחנים אלה יכולים להתבצע במסגרת מעקב אחר ממצאי כבד בלתי תקינים, כגון רמות מוגברות באופן עיקש של 2 אנזימי הטרנסאמינאז ALT ו-AST, או של בילירובין. מבחנים אחרים שיש להביא בחשבון ביצועם באותו הקשר, הם מדידת רמת אימונוגלובולינים, שכן האחרונים בדרך כלל מוגברים ב-AIH אך אינם מוגברים בהפאטיטיס נגיפית.
== הוראות לביצוע הבדיקה ==
אין צורך להיות בצום. יש לדגום דם למבחנה כימית (פקק אדום או צהוב) ולאחר סרכוז והפרדת הנסיוב יש להעבירו במבחנה מקוררת למעבדה. ניתן לשמור את הנסיוב עד 4 ימים בטמפרטורת החדר, עד 21 יום בקירור, או 40 יום בהקפאה. אין לקבל דגימות נסיוב בדרגת המוליזה, ליפמיה או איקטֶריה גבוהות, אך ניתן לבדוק דגימות אלה בדרגות המוליזה, ליפמיה ואיקטריה מתונות.

LKM-1

2015-10-19T11:07:35Z

בן עמי סלע:

== LKM-1 ==

כינויים נוספים: נוגדנים ל-anti-LKM1 ; LKM1 (liver/kidney microsomal type 1) antibodies ; LKM-1 Antibodies ;Anti-P450 2D6 .
תחום: מפגעי כבד ובעיקר autoimmune hepatitis.
טווח ערכים תקין: שלילי-לא יותר מ-20.0 יחידות לליטר; גבולי-20.1-24.9 יחידות לליטר; חיובי-מעל 25.0 יחידות לליטר. ערכי ייחוס אלה רלוונטיים לבני כל הגילים.
יוצר הערך: פרופ' בן-עמי סלע.

הפאיטיס אוטו-אימונית:

הפאטיטיס אוטו אימונית (AIH) היא מחלה כרונית מסיבה לא ידועה המאופיינת על ידי תהליך דלקת הפאטו-צלולארית מתמשכת, עם התפתחות נמק ונטייה לעבור לשלב של צמקת. תסמונת זו לעתים קרובות כרוכה עם מחלות אוטו-אימוניות נוספות. לא ניתן להסביר AIH על בסיס של הדבקה נגיפית כרונית, צריכת אלכוהול, או חשיפה לתרופות או כימיקאלים טוקסיים לכבד. ב-13-20% המחלה מתפוגגת באופן ספונטאני ללא כל קשר לפעילות הדלקתית, באופן שלא ניתן לצפות מראש. קרצינומה של תאי כבד (HCC) פחות שכיחה באלה עם AIH בהם התפתחה צמקת, מאשר באלה בהם הצמקת הופיעה מסיבות אחרות. אף על פי כן, HCC אינה אירוע נדיר ב-AIH. לייפת (fibrosis) מופיעה ברוב המטופלים עם AIH, וללא טיפול יעיל הלייפת מתחילה לחבר את אזורי הכבד השעריים (portal) עם האזור המרכזי שלו, מה שבסוף התהליך מוליך לצמקת. בשנת 1999 ה-International AIH Group יצרה מערכת דירוג המחלה שיעילותה ניכרת בעיקר באבחון של AIH במקרים גבוליים-בעייתיים (Alvarez וחב' ב-J Hepatol משנת 1999, ו-Wiegard וחב' ב-Semin Liver Dis משנת 2009).

הממצאים ההיסטו-פתולוגיים באלה עם AIH הם אופייניים אך לא ספציפיים: ל- AIH יש ממצאים המשותפים למקרים של הפאטיטיס נגיפית כרונית, מקרים של הפאטיטיס כרונית על רקע של תרופות, ועוד מפגעי כבד נוספים. ב-10-20% מהמקרים של AIH מוצאים בדגימות ביופסיה הפאטוציטים ענקיים רב-גרעיניים. לממצאים ההיסטופתולוגיים בדגימות ביופסיה של הכבד חשיבות באבחון AIOH ובקביעת חומרת המחלה. ממצאים אלה חיוניים להבדלת AIHמהדבקה ב-HCV, מהפאטיטיס על רקע אלכוהול, ממחלת כבד הנגרמת מטיפול תרופתי טוקסי, מ-PBC ומ-PSC או primary sclerosing cholangitis (על פי Czaja & Carpenter ב-Gastroenterology משנת 1993). כמו כן, AIH מתאפיין על ידי הסננה פורטאלית של תאים מונו-נוקלאריים, לעתים מוצאים גם הסננה של תאי פלזמה.

הרקע ההיסטורי של הפאטיטיס אוטו-אימונית:

החוקר השוודי Waldenström תאר לראשונה בשנת 1950 ב-Acta Endocrinol צורה של הפאטיטיס כרונית בנשים צעירות. התרחיש תואר על ידו כצמקת הכבד, הסננה לכבד של תאי פלזמה והיפר-גאמא-גלובולינמיה ניכרת. באותה שנה דווחו Kunkel וחב' ב-J Clin Invest ו-Bearn וחב' ב-1956 ב-Am J Med, מאפיינים אחרים של התרחיש כולל הגדלה של הטחול והכבד, צהבת. חטטת הפנים (Acne) שעירות-יתר, תווי פנים כבתסמונת Cushing, פיגמנטציה של אזור הבטן, השמנת-יתר, דלקת מפרקים, ואל-ווסת (amenorrhea) בנשים צעירות. בשנת 1955, היו אלה Joske ו-King שדיווחו לראשונה ב-Lancet על הקשר בין זאבת ארגמנית (לופוס) בהפאטיטיס נגיפית כרונית, קשר שהביא לטביעת המושג הפאטיטיס לופואידית על ידי Mackay וחב' ב-Lancet ב-1956. כיום כבר ברור שאין כל קשר בין SLE לבין הפאטיטיס אוטו-אימונית (להלן AIH), וממילא הפאטיטיס לופואידית אינה קשורה ל-SLE.

התיאור ההיסטו-פתולוגי של AIH עבר מספר עדכונים במהלך השנים. בשנת 1992 התכנס פאנל בינלאומי והגדיר מחדש את הקריטריונים האבחוניים (Johnson ו-McFarlane ב-Hepatology משנת 1993), ונקבע סופית שהביטוי המקובל יהיה הפאטיטיס אוטו-אימונית ולא ביטוי שהיה רווח קודם לכן דוגמת הפאטיטיס-אוטו-אימונית כרונית פעילה, שהיה בשימוש באותה עת. אותו פאנל הסיר את הדרישה לפרק זמן מינימאלי של 6 חודשים של פעילות המחלה, כדי שזו תוגדר "כרונית", הרחיב את הספקטרום ההיסטולוגי על מנת שיכלול הפאטיטיס אונתית (lobular), ואישש מחדש את האופי הלא נגיפי של מחלה זו. פאנל זה אישר הכללה של ממצאים היסטולוגיים לכאורה סותרים, כמו כולסטאזיס, פגיעה בצינורות המרה ו-ductopenia.

אפידמיולוגיה של הפאטיטיס אוטו-אימונית:

בארה"ב הנתונים האפידמיולוגיים מוגבלים. בין מבוגרים לבנים שכיחות המפגע מוערכת כ-0.1-1.2 מקרים לכל 100,000. השכיחות של AIH בין מטופלים עם מחלת כבד כרונית היא בתחום של 11-23%. המחלה אחראית לכ-6% מכלל השתלות הכבד בארה"ב. הפאטיטיס אוטו-אימונית type 2 (להלן AIH-2) ו-AIH-3 יחסית פחות שכיחים בארה"ב, ולעומת זאת AIH-2 נפוצה יותר באירופה.

השכיחות של AIH מוערכת בכ-0.1-1.2 מקרים ל-100,000 במערב אירופה, כאשר במזרח אירופה שכיחות מפגע זה גבוהה משמעותית ומגיעה עד כדי 11.6-16.9 מקרים לכל 100,000. זו שכיחות הדומה לזו של צמקת מרתית ראשונית (PBC), וגבוהה פי-2 מזו של מחלת כבד כרונית חסימתית (או primary sclerosing cholangitis). באירופה AIH אחראית לכ-3% מהשתלות הכבד. ביפאן לעומת זאת, השכיחות של AIH נמוכה משמעותית עם 0.015-0.08 מקרים לכל 100,000.

היחס בין AIH-1 ל-AIH-2 הוא :11.5-2.1 באירופה ובקנדה, ו-6-7:1 בארה"ב, בדרום אמריקה, וביפאן. השכיחות של AIH-2 במדינות דרום אירופה גדולה יותר מאשר במדינות צפון אירופה, ארה"ב ויפאן. בניתוח נתונים של 33,379 מטופלים עם צמקת הכבד, מצאו Michitaka וחב' ש-AIH היה הגורם האטיולוגי ב-1.9% מכלל מקרי צמקת אלה ביפאן (J Gastroenterol משנת 2009). רק לשם השואה, הפאטיטיס C היה הגורם האטיולוגי המשמעותי ביותר לצמקת הכבד ביפאן, שם הוא אחראי ל-61% מכלל מקרי הצמקת.

AIH שכיחה ביותר בצפון אירופה באלה עם שכיחות גבוהה של הסמנים הגנטיים HLA-DR3 ו-HLA-DR4 (על פי Boberg ב-Clin Liver Dis משנת 2002, ו-Czaja ב- Semin Liver Dis משנת 2009). ביפאן מצאו Seki וחב' מתאם בין HIH לבין HLA-Bw54 ו-HLA-DR4 (ב-Hepatology משנת 1990).

נשים נפגעות משמעותית יותר מגברים מ-AIH, כאשר McFarlane ו-Heneghan מצאו ב-Hepatol Res משנת 2007, יחס של בערך 3:1 בין שני המינים. ל-AIH יש פיזור גיל דו-מודאלי, כאשר השיא הראשון של הופעת המפגע מתחולל בגילים של 10-20 שנה, והשיא השני של הופעתו מתחולל בין הגילים 45-70 שנה. בערך מחצית מהנפגעים ב-AIH הם מתחת לגיל 20 שנה, והוא גבוה בנערות לפני הופעת המחזור. מאובחנים עם AIH-2 הם בממוצע צעירים יותר, כאשר 80% מבין אלה עם AIH-2 הם ילדים. יחד עם זאת, AIH עלולה להופיע בכל גיל כולל תינוקות וקשישים (Mieli-Vergani ו-Vergani ב-Semin Liver Dis משנת 2009, ו-Czaja ו-Carpenter ב-Hepatology משנת 2006). בקבוצת הגיל הקשישה יש נטייה לגברים להיפגע יותר מ-AIH מאשר נשים.

אטיולוגיה:

האטיולוגיה של AIH אינה ידועה, אם כי מספר גורמים (הדבקה נגיפית, תרופות, וגורמים סביבתיים) עלולים לגרות תגובה אוטו-אימונית ובהתאם תופיע מחלה אוטו-אימונית. בחלק קטן של מאובחנים עם AIH, המפגע מתחולל בעקבות הדבקה חריפה בנגיף הפאטיטיס A, הפאטיטיס B או נגיף Epstein-Barr. נוגדנים עצמיים שכיחים האלה עם הדבקה כרונית ב-HCV, כאשר בנסיוב של אלה ניתן למצוא נוגדנים ל-LKM1. בחלק מהמקרים של מחלת כבד מושרה על ידי תרופות, ניתן למצוא תהליך המתווך על ידי מערכת החיסון. מספר תרופות כדוגמת methyldopa ,nitrofurantoin ,minocycline (על פי Ramakrishna וחב' ב-J Clin Gastroenterol משנת 2009), adalimumab (על פי Adar וחב' ב-J Clin Gastroenterol משנת 2010), ו-infliximab (על פי Fairhurst & Sheehan-Dre ב-Clin Exp Dermatol משנת 2009), יכולות לגרום למחלת כבד עם מאפיינים דומים לאלה של AIH. למרות שברוב המקרים התסמינים מתפוגגים עם הפסקת הטיפול בתרופות אלה, ניתן למצוא מקרים כרוניים של AIH, גם לאחר הפסקת הטיפול התרופתי הזה (Liu ו-Kaplowitz ב-Clin Liver Dis משנת 2002). בשנת 2010 דיווחו Casswall וחב' ב-Scand J Gastroenterol על מציאת DNA של זני הליקובקטר שונים ב-50% של ביופסיות כבד שנלקחו מילדים ומתבגרים עם AIH.
AIH יכולה להיות type 1 או type 2. הפאטיטיס type 1 יכולה להופיע בגילים שונים אך היא שכיחה יותר בנשים צעירות. כמחצית אלה עם AIH type 1, נושאים בקרבם מחלה אוטו-אימונית נוספת כגון סוכרת type 1, או קוליטיס כיבית. באשר ל-AIH type 2, סוג זה יכול להופיע במבוגרים אך הוא שכיח ביותר בילדות-נערות בגיל 2-14 שנה. אלה עם AIH type 2 מכילים נוגדנים עצמיים המגיבים עם מקטע מיקרוזומאלי של הכבד והכליות, השונה מזה כנגדו מכוונים נוגדנים-עצמיים ב-AIH type 1.

מאפיינים קליניים של הפאטיטיס אוטו-אימונית:

AIH הוא בעל מהלך כרוני שהגורם לו עדיין אינו ברור, והוא מתאפיין על ידי תהליך דלקתי הפאטו-צלולארי ונמק, שיש לו נטייה להתדרדר למצב של צמקת. AIH יכול להופיע כהפאטיטיס חריפה או כרונית, או כצמקת מוכחת. במקרים נדירים AIH בא לביטוי ככשל כבדי פולמיננטי. בערך אחד מכל שלושה מאובחנים עם AIH, מראה תסמינים של הפאטיטיס חריפה, המתבטאת בחום גבוה, רגישות של הכבד, וצהבת. חלק המטופלים עם AIH מפתחים סימנים ותסמינים של מחלת כבד כרונית, ואילו אחרים מתדרדרים במהירות לאי-ספיקת כבד חריפה, הבאה לביטוי בצהבת ובקואגולופתיה.

תסמינים שכיחים וממצאים המתקבלים בבדיקה פיזית עלולים לנבוע ממפגעים חוץ-כבדיים הכרוכים ב-AIH. תסמינים שכיחים כוללים עייפות, תחושת אי-נוחות ברום הבטן, גרד מתון, בחילה, הקאות ושלשולים, תווי פנים אופייניים למחלת Cushing, כאבי מפרקים ושרירים (myalgia), פריחה עורית (כולל חטטת), שעירות-יתר, כאבי חזה הנובעים מפלאוריטיס, בצקת ואיבוד משקל. הממצאים השכיחים בבדיקה פיזית הם הפאטומגליה (83%), צהבת (69%), ספלנומגליה (32%), מיימת (20%), אנצפלופתיה (14%) וריבוי לא תקין של כלי דם עוריים (spider angiomas) בפנים, בצוואר ובגפיים (58%). כן יכול להופיע שתן בצבע שחור, אנורקסיה וצואה בהירה ביותר.

תסמינים קליניים באוכלוסייה פדיאטרית עם AIH:

מחקר על ילדים (Caucasian) עם AIH של Oettinger וחב' ב-J Autoimmun משנת 2005, העלה את הנתונים הבאים: ב-58% מתוכם הייתה צהבת, חולשה בלתי ספציפית הופיעה ב-57% מהנבדקים, אנורקסיה ב-47%, כאבי בטן ב-38% וחיוורון (pallor) אובחן ב-26% מהילדים עם AIH. כ-70% מהילדים עם AIH יזדקקו לטיפול עד להיותם בוגרים, כאשר בחלקם צמקת הכבד כבר קיימת למרות גילם הצעיר. בין 20-25% מהילדים המאובחנים עם AIH ימותו בגיל צעיר יחסית או יזדקקו להשתלת כבד. הנחיות שפורסמו בשנת 2011 על ידי האיגוד הגסטרו-אנטרולוגי הבריטי, קובעות שמטופלים צעירים עם AIHצריכים להיות מטופלים עם תכשירים לדיכוי מערכת החיסון, כדי למנוע או לעכב צמקת הכבד (Gleeson ו-Heneghan ב-Gut משנת 2011).

בסדרת מחקרים מדווחים על ידי Gregorio וחב' ב-Hepatology משנת 1997, נמסר ש-70% מהילדים עם AIH-1, ו-40% מהילדים עם AIH-2, פיתחו צמקת הכבד. במדגם של 52 ילדים, 17% סבלו מתמט (collapse) מולטיאצינארי או פנאצינארי עם כשל כבדי חד. המטופלים במחקר זה עם הפרוגנוזה הגרועה ביותר בהיבט של מוות מוקדם או הזדקקות להשתלת כבד, היו הילדים עם אבחון מוקדם של AIH-2, שסבלו מקואגולופתיה, רמות בילירובין גבוהות ותמונה היסטולוגית חמורה כבר בשלב האבחון המוקדם של AIH. בילדים, במצבי מחלה מתקדמת עלולים להופיע תופעות של פרקי בלבול.

הנוגדן LKM-1:

הנוגדן LKM-1 הוא הסמן האבחוני של הצורה החמורה של AIH הידועה כ-autoimmune hepatitis type 2 (להלן AIH2) הפוגעת באופן אופייני בילדים ובמבוגרים צעירים (Homberg וחב' ב-Hepatology משנת 1987). גילוי נוגדן זה בוצע בעבר באופן קונבנציונאלי על ידי אימונו-פלואורסצנטיה, שהיא טכניקה סובייקטיבית שנעשה בה שימוש ברקמות של כבד, כליה וקיבה של חולדות בתור מצע השוואתי (Rizzetto וחב' ב-Clin Exp Immunol משנת 1973). נדירות הממצא של LKM-1 והדמיון בצביעה שלו לזה של הנוגדן האנטי-מיטוכונדריאלי כמו גם לזו של הנוגדן ל-liver cytosol type-1, גרמו לעתים להחמצת LKM-1 (על פי Seelig וחב' ב-Clin Exp Immunol משנת 1993). בהמשך, נחשבה שיטת קישור ליגנד רדיואקטיבי ל"מדד הזהב" לגילוי LKM1, אך זו שיטה ממושכת בביצוע והופכת לא שכיחה במעבדות משיקולים של זיהום סביבתי בחומר רדיו-אקטיבי. למעשה מאז שנת 1999 מקובלת שיטת ELISA שנמצאה ספציפית וגם רגישה (Kerkar וחב' ב-J Immunol Methods משנת 1999, וכן במאמר נוסף של אותם חוקרים ב-J Clin Pathol משנת 2002. גם Miyakawa וחב' פרסמו בשנת 1999 ב-Autoimmunity נתונים על גילוי anti-LKM-1 בשיטת ELISA בנבדקים מבוגרים עם מחלת כבד כרונית, זאת על רקע העובדה שנוגדן עצמי זה מתגלה גם בחלק ממטופלים עם הפאטיטיס C כרונית.

במחקר זה נסקרו 29 מטופלים חיוביים ל-anti-LKM1, כמו גם 301 דגימות נסיוב של אלה עם מחלות כבד שונות, וכן 100 דגימות מאנשים בריאים שליליים ל-anti-LKM1. הספציפיות של מבחן ה-ELISA נבחנה על ידי מבחני ספיחה תוך שימוש בדגימות נסיוב חיוביות ל-anti-LKM1. ב-29 דגימות הנסיוב ממטופלים חיוביים ל-anti-LKM1 בשיטת בדיקה אימונו-פלואורסצנטית IF)) נמצא מתאם טוב בין שיטות ELISA ו-IF. בדיקת נוגדן anti-LKM1 נמצאה חיובית ב-12 מתוך 12 מטופלים מוכחים עם AIH2, וב-16 מתוך 17 הנבדקים עם הפאטיטיס C כרונית שנמצאו חיוביים ל-anti-LKM1 בשיטת IF. ב-401 דגימות אחרות שנמצאו שליליות ל-anti-LKM1 בשיטת IF, נמצא בשיטת ELISA, שפרט לדגימות בודדות כל השאר נמצאו שליליות ל-anti-LKM1 בשיטת ELISA.

הפיתוח של שיטות מדידה סרולוגיות סימל התקדמות אבחונית חשובה, מה שהעניק אפשרות להבדיל בין הפאטיטיס נגיפית כרונית, לבין מחלות כבד כרוניות אחרות, כולל AIH הנחשבת כיום למפגע רב מערכתי, שיכול להתרחש בשני המינים בכל גיל. AIH יכולה להופיע כפועל יוצא של זיהום נגיפי דוגמת הפאטיטיס A, או על ידי חשיפה לכימיקאלים דוגמת minocycline.

נוגדנים עצמיים כנגד LKM1 בזיהום כרוני של הפאטיטיס C: האם דוגמה לחיקוי מולקולארי?

Marceau וחב' פרסמו בשנת 2005 ב-Hepatology את נתוניהם בנושא זה. כידוע נוגדנים עצמיים כנגד LKM1 המכוונים כנגד ציטוכרום P450 2D6 (או CYP2D6), נחשבים סמנים ספציפיים של AIH-2, אך ניתן למצאם גם ב-5% של דגימות נסיוב של מטופלים עם הדבקה כרונית ב-HCV. הוצע שקיים דמיון או חיקוי מולקולארי בין חלבוני הנגיף HCV לבין CYP2D6 על מנת להסביר נוכחות נוגדנים אלה. נוגדנים עצמיים כנגד LKM1 מחולים עם הדבקה ב-HPC, נוקו בשיטת affinity purification על פני עמודה שעליה ספחו את חלבוני .CYP2D6. אפיטופים מבניים של CYP2D6 זוהו על ידי סריקה ואנליזה של phage display, והזיהוי של צמדים משמעותיים סטטיסטית (SSPs). תגובה צולבת בין חלבונים מועמדים של CYP2D6 ו-HCV נבחנה על ידי immunoprecipitation. בודדו 19 שבטים (clones) שונים, והריצוף שלהם הביא למיפוי של אפיטופ מבני באזור של רצף חומצות אמינו 254-288 של CYP2D6, איזור המכיל את האפיטופ הלינארי העיקרי במטופלים עם AIH-2.

בין חלבוני הנגיף HCV מועמדים לחיקוי מולקולארי כללו את E2 ,NS3 ו-NS5a. אכן, נוגדנים עצמיים מטוהרים שבודדו ממטופלים עם הפאטיטיס C המכילים נוגדנים כנגד LKM1, השקיעו בתמיסה את החלבונים NS3 או את NS5a של הנגיף HCV, או אף את שניהם, ותגובתיות זו נוטרלה על ידי CYP2D6.

חלבוני נסיוב ואימונו-גלובולינים:

ממצא שכיח בנסיוב של אלה עם AIH בלתי מטופלת, היפר-γ-גלובולינמיה של IgG רב-שבטי (polyclonal), כאשר רמות γ-גלובולינים נעות בתחום של 3-4 גרם/ד"ל, ויכולות להגיע לעתים קרובות עד 5-6 גרם/ד"ל. יש מדי פעם דיווחים על צמיגות-יתר של הנסיוב שהם משניים לרמות IgG גבוהות. האבחון של AIH אינו סביר בנבדקים עם הפאטיטיס חריפה ללא היפר-γ-גלובולינמיה. רמת γ-גלובטולינים או זו של IgG יכולות לשמש כבסיס סדיר לתגובת המפגע לטיפולים. אלה עם AIH-2 מראים בדרך כלל רמת IgA נמוכה (Mieli-Vergani ו-Vergani ב-World J Gastroenterol משנת 2008).
אמינו-טרנספרזות:
שני אנזימי האמינו-טרנספרזות, ALT ו-AST, נמצאים מוגברים ב-100% של מטופלים בשלב האבחון המוקדם של AIH, עם רמות בתחום של 200-300 יחידות לליטר, אם כי לעתים מדווח על מקרים בהם רמת הטרנס-אמינזות גבוהה פי-50 מרמת הנורמה שלהם. לעומת זאת שני אנזימים אלה הם בעלי מתאם נמוך עם דרגת הנמק הכבדי; יחד עם זאת, ערכי טרנס-אמינזות בתחום של אלפי יחידות לליטר יכולים להצביע על הפאטיטיס חריפה. התמשכות העלייה ברמת טרנס-אמינזות למרות המשך טיפול, הוא מדד אמין להמשך התהליך הדלקתי בכבד. לעומת זאת, נורמליזציה של רמות טרנס-טרנספרזות במרוצת הטיפול מהווה סימן מעודד, אם כי ב-50% מהמטופלים עם רמות נורמאליות של אנזימים אלה תהליך פעיל של דלקת כבד עדיין בתוקפו. ואמנם, נורמליזציה של מדדים ביוכימיים יכולה להקדים ב-3-6 חודשים הפוגה היסטולוגית אמיתית. החמרה ברמות טרנס-אמינזות במי שנמצא בעיצומו של טיפול, או באלה שנמצאים בשלב של הפוגה יכולה להוות איתות להתעוררות מחודשת של פעילות המחלה.
מדדים ביוכימיים והמטולוגיים נוספים של כבד:
רמות בילירובין ופוספטאזה בסיסית מוגברות באופן קל עד מתון ב-80-90% מאלה עם AIH. עלייה חדה ברמת פוספטאזה בסיסית במהלך מחלה אוטו-אימונית, עלולה לבטא התפתחות של (PSC או primary sclerosing cholangitis) או תחילת מהלך של קרצינומה הפאטו-צלולארית כסיבוך של צמקת. ב-50% מהמקרים מוצאים היפו-אלבומינמיה והתארכות משך פרותרומבין PT)), שהם סמנים לאי-תפקוד חמור של המערכת הסינתטית בכבד, שמוצאים לעתים קרובות במחלת כבד פעילה או בצמקת שאינה בשליטה. בין המדדים ההמטולוגיים הבלתי-סדירים שמוצאים ב-AIH ניתן למנות leukopenia מתונה, אנמיה נורמוכרומית, אנמיה המוליטית שהיא Coombs-חיובית, תרומבוציטופניה ושקיעת דם מוחשת. אאוזינופיליה אינה שכיחה, אך ספירות בתחום שבין 9-48% דווחו לעתים. AIH תוארה כממצא היחיד הבא לביטוי בתסמונת היפר-אאוזינופילית אידיופטית.
נוגדנים נוספים ב-AIH:
ממצאי מעבדה ב-AIH כוללים גם רמה מוגברת בנסיוב של נוגדנים כנגד גרעין התא (ANAs), נוגדנים כנגד תאי שריר חלק (SMAs) הכוונים כנגד החלבון actin, נוגדנים כנגד מקטע מיקרוזומאלי של כבד וכליות (LKM-1), או נוגדנים כנגד ציטוזול של תאי כבד (Anti-LC1). נוגדנים מסוג SMAs מוצאים ב-90-100% מאלה עם AIH-1. נוגדנים מסוג ANAs מוצאים ב-10% מאלה עם AIH-1, ובשיתוף עם SMAs נמצאים ב-40-60% מאלה עם AIH-1. כייל נוגדנים עצמיים אלה נע בין 1:100-1:500,000. נוגדנים מסוג SMAs מופיעים בטיטר נמוך בילדים בריאים ובמטופלים עם הפאטיטיס נגיפית וכן במפגעים אחרים, אך אינם פוגעים בכבד.

כמו כן מוצאים ב-AIH נוגדנים כנגד SLA או אנטיגן מסיס של הכבד והם מכוונים כנגד cytokeratins types 8 & 18; נוגדנים כנגד הקולטן הספציפי של הכבד ל-asialoglycoprotein או מה שידוע כלקטין הכבדי; נוגדנים AMA כנגד המיטוכונדריה שהם הנוגדנים ההכרחיים בתרחיש של PBC או primary biliary cirrhosis, אך ניתן למצאם גם ב-AIH; נוגדני APLA כנגד פוספוליפידים (Pathmakanthan וחב' ב- Eur J Gastroenterol Hepatol משנת 1998).

נוגדני LKM-1 נמצאים ב-40-45% מהמטופלים עם AIH-2 והם כרוכים עם מציאות נוגדנים anti-LC1 ב-50% מהמאובחנים עם סוג AIH זה. נוגדנים מסוג anti-LC1 בעצמם ניתן למצוא ב-30% מאלה עם AIH-2, כאשר נוגדנים אחרונים אלה מזהים את האנזים המטבולי הספציפי לכבד הידוע כ-formiminotransferase cyclodeaminase שמשקלו המולקולארי 58,000 דלטון. נוגדנים כנגד הקולטן ל-asialoglycoprotein נמצאים באופן שכיח יותר באלה עם AIH-1 ועשויים לשמש סמנים לפעילות דלקתית. נוגדנים עצמיים נוספים יכולים להימצא גם כן, כגון נוגדנים בלתי-אופייניים מסוג pANCA או perinuclear antineutrophil cytoplasmic antibodies. נמצא שמאובחנים עם AIH בהם נמצאים ממצאים חיוביים לגבי נוגדנים כנגד actin, הם נבדקים צעירים יותר החיוביים לאנטיגן הלויקוציטי האנושי HLA-DR3, ונבדקים אלה נזקקו להשתלת כבד באופן שכיח יותר בהשוואה למטופלים עם ANAs בהם לא נמצאו נוגדנים ל-actin (על פי Czaja וחב' ב-Hepatology משנת 1996).

רקע גנטי ב-AIH:

התרומה של רקע גנטי להופעת תרחיש כגון AIH, מיוחסת למספר haplotypes של HLA, ביניהם DR4, DR3, B14, B8 ו-Dw3. גם שמט (deletion) של הגן C4A נכרך עם הופעת AIH באנשים צעירים יותר (Scully וחב' ב-Gastroenterology משנת 1993). מאובחנים עם AIH נשאי haplotype כדוגמת HLA-DR3, הם בסבירות גבוהה יותר למחלה בדרגת אגרסיביות גדולה יותר, המגיבה פחות לטיפול תרופתי ונזקקת בשכיחות גבוהה יותר להשתלת כבד. בנוסף, המטופלים האחרונים צעירים יותר בעת אבחון המחלה מאשר אלה נשאי haplotypes אחרים. כמו כן, אלה עם AIH נשאי HLA-DR4 haplotype, הם בסבירות גבוהה יותר לפתח תסמינים חוץ-כבדיים (Czaja וחב' ב-Hepatology משנת 1993).

מטופלים עם AIH הם בעלי רמה נמוכה של לימפוציטים T המבטאים את הסמן CD8, ויש להם גם פגם ספציפי בתת-אוכלוסייה של תאי T המפקחים על התגובה החיסונית כנגד אנטיגנים ספציפיים על פני תאי כבד. AIH נכרכה גם עם האלל C4AQO הקשור למשלים (complement), מה שגורם לחסר חלקי של מרכיב המשלים C4. ל-C4 תפקיד ידוע בנטרול נגיפים, והכשל להשמיד נגיפים עלול להביא לתגובה חיסונית כנגד אנטיגנים על פני התאים המודבקים בנגיפים אלה.

גריינים סביבתיים:

בין הנגיפים המוזכרים ככאלה המגרים תרחיש של AIH נמצא את נגיפי rubella, Epstein-Barr והפאטיטיס B ,A, ו-C. מספר מחקרים הצביעו על הומולוגיה ניכרת ברצף חומצות האמינו בין חלבוני הפאטיטיס C לבין CYP2D6 שהוא היעד המולקולארי של הנוגדן העצמי LKM-1, מה שמרמז לכך שחפיפה מולקולארית גורמת להופעת נוגדני LKM-1 בהדבקה של הפאטיטיס C. יש להדגיש יחד עם זאת, שכאשר מופיעים באלה עם הפאטיטיס C כרונית נוגדנים כנגד LKM-1 אלה בדרך כלל אינם מכוונים כנגד אותם אפיטופים איתם מגיבים נוגדנים אלה המופיעים בנסיוב של אלה עם AIH-2. גם תרופות שונות עלולות לגרות תרחיש של AIH, באופן שחלבון של אנזים כגון uridine diphosphat glucuronosyltansferase ומערכת ציטוכרום P-450, מהווים יעדים לאוטו-אימוניות המושרה על ידי נגיף או תרופה, כמו גם להפאטיטיס אוטו-אימונית.

פתוגנזה של AIH:

ראיות עדכניות מצביעות על כך שנזק לכבד באלה עם AIH, הוא תוצאה של התקפה של המערכת החיסונית התאית. תצוגה אנטיגנית משובשת של HLA-class II על פני הפאטוציטים מגבירה את החשיפה של מרכיבים נורמאליים על פני תאים אלה לתאי חיסון הידועים כ-APCs או antigen-presenting cells. ה-APCs מציגים את האנטיגנים של תאי-כבד ללימפוציטים בלתי-מחויבים מסוג Th 0 או helper T-lymphocytes, ואינטראקציה זו מביאה לשפעול של Th 0. שפעול זה מלווה על ידי התמיינות (דיפרנציאציה) של התאים האחרונים ליצירת Th 1 או helper T cell 1, או ליצירת Th 2 או helper T cell 2, בהתאם לציטוקינים השולטים ברקמת הכבד ואופיו של האנטיגן. תאי Th 1 מפרישים בעיקר את האינטרלויקין IL-2 וכן את אינטרפרון-גאמא, אשר משפעלים מקרופאגים ומעודדים את הביטוי של האנטיגנים I HLA class ו-HLA class II, ובכך מכניסים לפעולה את המערכת החיסונית. לעומת זאת, תאי Th 2 מייצרים בעיקר את האינטרלויקינים IL-5, IL-4 ו-IL-10, המעודדים יצירת נוגדנים עצמיים על ידי לימפוציטים מסוג B (על פי Longhi וחב' ב-J Autoimmun משנת 2009).

הסיבות לתצוגה המשובשת של HLA אינן ברורות, אך ייתכן שהן תולדה של גורמים גנטיים, של הדבקה נגיפית חריפה של הפאטיטיס A או B, או של נגיף Epstein-Barr (על פי Vento ו-Cainelli ב-Autoimmun Rev משנת 2004). ייתכן גם שמדובר בהשפעת גורמים כימיים כגון אינטרפרון, מלטונין, α-מתילדופה, nitrofurantoin ,oxyphenisatin או tienilic acid. יש גם המצביעים על הקולטן ל-asialoglycoprotein וכן על cytochrome mono-oxygenase P-450 2D6 כאנטיגנים עצמיים הקשורים לתצוגה המשובשת של HLA.

במצב פיזיולוגי תקין, תאי Th 1 ו-Th 2 מזהים זה את זה, ומנגנונים מווסתים מפקחים באופן מוקפד על תהליכי הזיהוי האנטיגני העצמי. כישלונם של מנגנונים אלה מחיש את המתקפה האוטו-אימונית. הפגיעה בתאי הכבד עלולה להיגרם על ידי פעילות לימפוציטים ציטוטוקסיים המושפעים על ידי IL-2, על ידי שפעול המשלים, על ידי גיוס לימפוציטים מסוג NK על ידי נוגדנים עצמיים הקשורים על פני תאי הכבד, או על ידי תגובה של נוגדנים עצמיים עם אנטיגנים ספציפיים לרקמת הכבד הבאים לביטוי על פני הפאטוציטים. אכן, הפאטוציטים המצופים על ידי נוגדנים עצמיים באלה עם AIH, מומתים כאשר הם מודגרים עם לימפוציטים אוטולוגיים מתרומה עצמית או לימפוציטים אלוגנאיים של תורם זר. התא הממית את ההפאטוציטים בחולי AIH, או תא האפקטור, הנמצא כתא מונונוקלארי שעל פניו יש נוכחות של קולטן למקטע Fc. כבר בשנת 1990 פרסמו Wen וחב' ב-Lancet, שתאי T שבודדו מדגימות ביופסיית כבד של ילדים עם AIH, ואשר ביטאו על פניהם את הקולטן γ/δ של תאי T הם במיוחד טוקסיים לתאי כבד.

משמעות בדיקות המעבדה:

טיטר גבוה של anti-LKM-1 מצביע כמעט בוודאות שהנבדק נכלל בקבוצת AIH-2, אך התוצאה אינה מוחלטת. ניתן לבצע ביופסיה של הכבד להעריך את מידת הנזק הרקמתי וההצטלקות, על מנת לסייע באישור האבחון. אם תוצאות הבדיקות מצביעות על תוצאה שלילית של anti-LKM-1, ותוצאות חיוביות של נוגדני SMA או ANA, אז יש סבירות גבוהה שמדובר ב-AIH-1. אם תוצאות כל הנוגדנים האמורים מתקבלות שליליות, נראה שהתסמינים הקליניים אינם תוצאה של AIH. יחד עם זאת, אין לשלול לחלוטין אפשרות שעדיין מדובר ב-AIH. לא כל אלה עם AIH מייצרים נוגדנים כנגד LKM-1 או כנגד SMA, כאשר כמה מהם מייצרים נוגדנים עצמיים אחרים שנבחנים רק לעתים נדירות.

הטיטר של הנוגדנים כנגד LKM-1 אינו משקף את חומרת התסמינים או את הפרוגנוזה של המחלה. טיטר הנוגדנים כנגד LKM-1 יכול להשתנות לאורך זמן. אלה המאובחנים עם AIH-2 עלולים לעתים לסבול בעת ובעונה אחת ממפגעים אוטואימוניים אחרים, כגון סוכרת או thyroiditis. מטופלים עם הפאטיטיס C כרונית יכולים לעתים לפתח סוג שונה של נוגדן כנגד LKM-1, שאינו מתגלה בשיטות הבדיקה הרגילות לנוגדן זה, ואין נוהגים בשגרת המעבדה לנסות ולגלותו.

נוגדנים כנגד LKM-1 משמשים כסמן ל-AIH-2, והם מופיעים באופן אופייני בהיעדר נוגדני SMA ו-ANA. הנוגדן כנגד LKM-1 מגיב עם רצף ליניארי קצר של האנטיגן הריקומביננטי cytochrome monooxygenase P450 2D6 (על פי Czaja ו-Homburger ב-Gastroenterology משנת 2001). מאובחנים עם AIH-2 נוטים להיות צעירים יותר, נשים, אשר תסמיני מחלתם חמורים, אך גם כאלה המגיבים טוב לטיפול המדכא את מערכת החיסון.

מתי מתבצעת הבדיקה לנוכחות נוגדנים כנגד LKM-1?

רמת הנוגדנים כנגדLKM-1 נקבעת במסגרת הערכה של מטופלים עם מחלת כבד ללא אטיולוגיה ברורה. בדיקה זו נדרשת בעיקר במקביל לבדיקת נוכחות הנוגדנים מסוג SMA או ANA, על מנת לסייע באבחון של AIH, ולהבדיל בין 2 הסוגים העיקריים של הפאטיטיס אוטו-אימונית, type 1 ו-type 2. מבחנים אלה יכולים להתבצע במסגרת מעקב אחר ממצאי כבד בלתי תקינים, כגון רמות מוגברות באופן עיקש של 2 אנזימי הטרנסאמינאז ALT ו-AST, או של בילירובין. מבחנים אחרים שיש להביא בחשבון ביצועם באותו הקשר, הם מדידת רמת אימונוגלובולינים, שכן האחרונים בדרך כלל מוגברים ב-AIH אך אינם מוגברים בהפאטיטיס נגיפית.
== הוראות לביצוע הבדיקה ==
אין צורך להיות בצום. יש לדגום דם למבחנה כימית (פקק אדום או צהוב) ולאחר סרכוז והפרדת הנסיוב יש להעבירו במבחנה מקוררת למעבדה. ניתן לשמור את הנסיוב עד 4 ימים בטמפרטורת החדר, עד 21 יום בקירור, או 40 יום בהקפאה. אין לקבל דגימות נסיוב בדרגת המוליזה, ליפמיה או איקטֶריה גבוהות, אך ניתן לבדוק דגימות אלה בדרגות המוליזה, ליפמיה ואיקטריה מתונות.

LKM-1

2015-10-19T11:04:42Z

בן עמי סלע:

== LKM-1 ==

כינויים נוספים: נוגדנים ל-anti-LKM1 ; LKM1 (liver/kidney microsomal type 1) antibodies ; LKM-1 Antibodies ;Anti-P450 2D6 .
תחום: מפגעי כבד ובעיקר autoimmune hepatitis.
טווח ערכים תקין: שלילי-לא יותר מ-20.0 יחידות לליטר; גבולי-20.1-24.9 יחידות לליטר; חיובי-מעל 25.0 יחידות לליטר. ערכי ייחוס אלה רלוונטיים לבני כל הגילים.
יוצר הערך: פרופ' בן-עמי סלע.

הפאיטיס אוטו-אימונית:

הפאטיטיס אוטו אימונית (AIH) היא מחלה כרונית מסיבה לא ידועה המאופיינת על ידי תהליך דלקת הפאטו-צלולארית מתמשכת, עם התפתחות נמק ונטייה לעבור לשלב של צמקת. תסמונת זו לעתים קרובות כרוכה עם מחלות אוטו-אימוניות נוספות. לא ניתן להסביר AIH על בסיס של הדבקה נגיפית כרונית, צריכת אלכוהול, או חשיפה לתרופות או כימיקאלים טוקסיים לכבד. ב-13-20% המחלה מתפוגגת באופן ספונטאני ללא כל קשר לפעילות הדלקתית, באופן שלא ניתן לצפות מראש. קרצינומה של תאי כבד (HCC) פחות שכיחה באלה עם AIH בהם התפתחה צמקת, מאשר באלה בהם הצמקת הופיעה מסיבות אחרות. אף על פי כן, HCC אינה אירוע נדיר ב-AIH. לייפת (fibrosis) מופיעה ברוב המטופלים עם AIH, וללא טיפול יעיל הלייפת מתחילה לחבר את אזורי הכבד השעריים (portal) עם האזור המרכזי שלו, מה שבסוף התהליך מוליך לצמקת. בשנת 1999 ה-International AIH Group יצרה מערכת דירוג המחלה שיעילותה ניכרת בעיקר באבחון של AIH במקרים גבוליים-בעייתיים (Alvarez וחב' ב-J Hepatol משנת 1999, ו-Wiegard וחב' ב-Semin Liver Dis משנת 2009).

הממצאים ההיסטו-פתולוגיים באלה עם AIH הם אופייניים אך לא ספציפיים: ל- AIH יש ממצאים המשותפים למקרים של הפאטיטיס נגיפית כרונית, מקרים של הפאטיטיס כרונית על רקע של תרופות, ועוד מפגעי כבד נוספים. ב-10-20% מהמקרים של AIH מוצאים בדגימות ביופסיה הפאטוציטים ענקיים רב-גרעיניים. לממצאים ההיסטופתולוגיים בדגימות ביופסיה של הכבד חשיבות באבחון AIOH ובקביעת חומרת המחלה. ממצאים אלה חיוניים להבדלת AIHמהדבקה ב-HCV, מהפאטיטיס על רקע אלכוהול, ממחלת כבד הנגרמת מטיפול תרופתי טוקסי, מ-PBC ומ-PSC או primary sclerosing cholangitis (על פי Czaja & Carpenter ב-Gastroenterology משנת 1993). כמו כן, AIH מתאפיין על ידי הסננה פורטאלית של תאים מונו-נוקלאריים, לעתים מוצאים גם הסננה של תאי פלזמה.

הרקע ההיסטורי של הפאטיטיס אוטו-אימונית:

החוקר השוודי Waldenström תאר לראשונה בשנת 1950 ב-Acta Endocrinol צורה של הפאטיטיס כרונית בנשים צעירות. התרחיש תואר על ידו כצמקת הכבד, הסננה לכבד של תאי פלזמה והיפר-גאמא-גלובולינמיה ניכרת. באותה שנה דווחו Kunkel וחב' ב-J Clin Invest ו-Bearn וחב' ב-1956 ב-Am J Med, מאפיינים אחרים של התרחיש כולל הגדלה של הטחול והכבד, צהבת. חטטת הפנים (Acne) שעירות-יתר, תווי פנים כבתסמונת Cushing, פיגמנטציה של אזור הבטן, השמנת-יתר, דלקת מפרקים, ואל-ווסת (amenorrhea) בנשים צעירות. בשנת 1955, היו אלה Joske ו-King שדיווחו לראשונה ב-Lancet על הקשר בין זאבת ארגמנית (לופוס) בהפאטיטיס נגיפית כרונית, קשר שהביא לטביעת המושג הפאטיטיס לופואידית על ידי Mackay וחב' ב-Lancet ב-1956. כיום כבר ברור שאין כל קשר בין SLE לבין הפאטיטיס אוטו-אימונית (להלן AIH), וממילא הפאטיטיס לופואידית אינה קשורה ל-SLE.

התיאור ההיסטו-פתולוגי של AIH עבר מספר עדכונים במהלך השנים. בשנת 1992 התכנס פאנל בינלאומי והגדיר מחדש את הקריטריונים האבחוניים (Johnson ו-McFarlane ב-Hepatology משנת 1993), ונקבע סופית שהביטוי המקובל יהיה הפאטיטיס אוטו-אימונית ולא ביטוי שהיה רווח קודם לכן דוגמת הפאטיטיס-אוטו-אימונית כרונית פעילה, שהיה בשימוש באותה עת. אותו פאנל הסיר את הדרישה לפרק זמן מינימאלי של 6 חודשים של פעילות המחלה, כדי שזו תוגדר "כרונית", הרחיב את הספקטרום ההיסטולוגי על מנת שיכלול הפאטיטיס אונתית (lobular), ואישש מחדש את האופי הלא נגיפי של מחלה זו. פאנל זה אישר הכללה של ממצאים היסטולוגיים לכאורה סותרים, כמו כולסטאזיס, פגיעה בצינורות המרה ו-ductopenia.

אפידמיולוגיה של הפאטיטיס אוטו-אימונית:

בארה"ב הנתונים האפידמיולוגיים מוגבלים. בין מבוגרים לבנים שכיחות המפגע מוערכת כ-0.1-1.2 מקרים לכל 100,000. השכיחות של AIH בין מטופלים עם מחלת כבד כרונית היא בתחום של 11-23%. המחלה אחראית לכ-6% מכלל השתלות הכבד בארה"ב. הפאטיטיס אוטו-אימונית type 2 (להלן AIH-2) ו-AIH-3 יחסית פחות שכיחים בארה"ב, ולעומת זאת AIH-2 נפוצה יותר באירופה.

השכיחות של AIH מוערכת בכ-0.1-1.2 מקרים ל-100,000 במערב אירופה, כאשר במזרח אירופה שכיחות מפגע זה גבוהה משמעותית ומגיעה עד כדי 11.6-16.9 מקרים לכל 100,000. זו שכיחות הדומה לזו של צמקת מרתית ראשונית (PBC), וגבוהה פי-2 מזו של מחלת כבד כרונית חסימתית (או primary sclerosing cholangitis). באירופה AIH אחראית לכ-3% מהשתלות הכבד. ביפאן לעומת זאת, השכיחות של AIH נמוכה משמעותית עם 0.015-0.08 מקרים לכל 100,000.

היחס בין AIH-1 ל-AIH-2 הוא :11.5-2.1 באירופה ובקנדה, ו-6-7:1 בארה"ב, בדרום אמריקה, וביפאן. השכיחות של AIH-2 במדינות דרום אירופה גדולה יותר מאשר במדינות צפון אירופה, ארה"ב ויפאן. בניתוח נתונים של 33,379 מטופלים עם צמקת הכבד, מצאו Michitaka וחב' ש-AIH היה הגורם האטיולוגי ב-1.9% מכלל מקרי צמקת אלה ביפאן (J Gastroenterol משנת 2009). רק לשם השואה, הפאטיטיס C היה הגורם האטיולוגי המשמעותי ביותר לצמקת הכבד ביפאן, שם הוא אחראי ל-61% מכלל מקרי הצמקת.

AIH שכיחה ביותר בצפון אירופה באלה עם שכיחות גבוהה של הסמנים הגנטיים HLA-DR3 ו-HLA-DR4 (על פי Boberg ב-Clin Liver Dis משנת 2002, ו-Czaja ב- Semin Liver Dis משנת 2009). ביפאן מצאו Seki וחב' מתאם בין HIH לבין HLA-Bw54 ו-HLA-DR4 (ב-Hepatology משנת 1990).

נשים נפגעות משמעותית יותר מגברים מ-AIH, כאשר McFarlane ו-Heneghan מצאו ב-Hepatol Res משנת 2007, יחס של בערך 3:1 בין שני המינים. ל-AIH יש פיזור גיל דו-מודאלי, כאשר השיא הראשון של הופעת המפגע מתחולל בגילים של 10-20 שנה, והשיא השני של הופעתו מתחולל בין הגילים 45-70 שנה. בערך מחצית מהנפגעים ב-AIH הם מתחת לגיל 20 שנה, והוא גבוה בנערות לפני הופעת המחזור. מאובחנים עם AIH-2 הם בממוצע צעירים יותר, כאשר 80% מבין אלה עם AIH-2 הם ילדים. יחד עם זאת, AIH עלולה להופיע בכל גיל כולל תינוקות וקשישים (Mieli-Vergani ו-Vergani ב-Semin Liver Dis משנת 2009, ו-Czaja ו-Carpenter ב-Hepatology משנת 2006). בקבוצת הגיל הקשישה יש נטייה לגברים להיפגע יותר מ-AIH מאשר נשים.

אטיולוגיה:

האטיולוגיה של AIH אינה ידועה, אם כי מספר גורמים (הדבקה נגיפית, תרופות, וגורמים סביבתיים) עלולים לגרות תגובה אוטו-אימונית ובהתאם תופיע מחלה אוטו-אימונית. בחלק קטן של מאובחנים עם AIH, המפגע מתחולל בעקבות הדבקה חריפה בנגיף הפאטיטיס A, הפאטיטיס B או נגיף Epstein-Barr. נוגדנים עצמיים שכיחים האלה עם הדבקה כרונית ב-HCV, כאשר בנסיוב של אלה ניתן למצוא נוגדנים ל-LKM1. בחלק מהמקרים של מחלת כבד מושרה על ידי תרופות, ניתן למצוא תהליך המתווך על ידי מערכת החיסון. מספר תרופות כדוגמת methyldopa ,nitrofurantoin ,minocycline (על פי Ramakrishna וחב' ב-J Clin Gastroenterol משנת 2009), adalimumab (על פי Adar וחב' ב-J Clin Gastroenterol משנת 2010), ו-infliximab (על פי Fairhurst & Sheehan-Dre ב-Clin Exp Dermatol משנת 2009), יכולות לגרום למחלת כבד עם מאפיינים דומים לאלה של AIH. למרות שברוב המקרים התסמינים מתפוגגים עם הפסקת הטיפול בתרופות אלה, ניתן למצוא מקרים כרוניים של AIH, גם לאחר הפסקת הטיפול התרופתי הזה (Liu ו-Kaplowitz ב-Clin Liver Dis משנת 2002). בשנת 2010 דיווחו Casswall וחב' ב-Scand J Gastroenterol על מציאת DNA של זני הליקובקטר שונים ב-50% של ביופסיות כבד שנלקחו מילדים ומתבגרים עם AIH.
AIH יכולה להיות type 1 או type 2. הפאטיטיס type 1 יכולה להופיע בגילים שונים אך היא שכיחה יותר בנשים צעירות. כמחצית אלה עם AIH type 1, נושאים בקרבם מחלה אוטו-אימונית נוספת כגון סוכרת type 1, או קוליטיס כיבית. באשר ל-AIH type 2, סוג זה יכול להופיע במבוגרים אך הוא שכיח ביותר בילדות-נערות בגיל 2-14 שנה. אלה עם AIH type 2 מכילים נוגדנים עצמיים המגיבים עם מקטע מיקרוזומאלי של הכבד והכליות, השונה מזה כנגדו מכוונים נוגדנים-עצמיים ב-AIH type 1.

מאפיינים קליניים של הפאטיטיס אוטו-אימונית:

AIH הוא בעל מהלך כרוני שהגורם לו עדיין אינו ברור, והוא מתאפיין על ידי תהליך דלקתי הפאטו-צלולארי ונמק, שיש לו נטייה להתדרדר למצב של צמקת. AIH יכול להופיע כהפאטיטיס חריפה או כרונית, או כצמקת מוכחת. במקרים נדירים AIH בא לביטוי ככשל כבדי פולמיננטי. בערך אחד מכל שלושה מאובחנים עם AIH, מראה תסמינים של הפאטיטיס חריפה, המתבטאת בחום גבוה, רגישות של הכבד, וצהבת. חלק המטופלים עם AIH מפתחים סימנים ותסמינים של מחלת כבד כרונית, ואילו אחרים מתדרדרים במהירות לאי-ספיקת כבד חריפה, הבאה לביטוי בצהבת ובקואגולופתיה.

תסמינים שכיחים וממצאים המתקבלים בבדיקה פיזית עלולים לנבוע ממפגעים חוץ-כבדיים הכרוכים ב-AIH. תסמינים שכיחים כוללים עייפות, תחושת אי-נוחות ברום הבטן, גרד מתון, בחילה, הקאות ושלשולים, תווי פנים אופייניים למחלת Cushing, כאבי מפרקים ושרירים (myalgia), פריחה עורית (כולל חטטת), שעירות-יתר, כאבי חזה הנובעים מפלאוריטיס, בצקת ואיבוד משקל. הממצאים השכיחים בבדיקה פיזית הם הפאטומגליה (83%), צהבת (69%), ספלנומגליה (32%), מיימת (20%), אנצפלופתיה (14%) וריבוי לא תקין של כלי דם עוריים (spider angiomas) בפנים, בצוואר ובגפיים (58%). כן יכול להופיע שתן בצבע שחור, אנורקסיה וצואה בהירה ביותר.

תסמינים קליניים באוכלוסייה פדיאטרית עם AIH:

מחקר על ילדים (Caucasian) עם AIH של Oettinger וחב' ב-J Autoimmun משנת 2005, העלה את הנתונים הבאים: ב-58% מתוכם הייתה צהבת, חולשה בלתי ספציפית הופיעה ב-57% מהנבדקים, אנורקסיה ב-47%, כאבי בטן ב-38% וחיוורון (pallor) אובחן ב-26% מהילדים עם AIH. כ-70% מהילדים עם AIH יזדקקו לטיפול עד להיותם בוגרים, כאשר בחלקם צמקת הכבד כבר קיימת למרות גילם הצעיר. בין 20-25% מהילדים המאובחנים עם AIH ימותו בגיל צעיר יחסית או יזדקקו להשתלת כבד. הנחיות שפורסמו בשנת 2011 על ידי האיגוד הגסטרו-אנטרולוגי הבריטי, קובעות שמטופלים צעירים עם AIHצריכים להיות מטופלים עם תכשירים לדיכוי מערכת החיסון, כדי למנוע או לעכב צמקת הכבד (Gleeson ו-Heneghan ב-Gut משנת 2011).

בסדרת מחקרים מדווחים על ידי Gregorio וחב' ב-Hepatology משנת 1997, נמסר ש-70% מהילדים עם AIH-1, ו-40% מהילדים עם AIH-2, פיתחו צמקת הכבד. במדגם של 52 ילדים, 17% סבלו מתמט (collapse) מולטיאצינארי או פנאצינארי עם כשל כבדי חד. המטופלים במחקר זה עם הפרוגנוזה הגרועה ביותר בהיבט של מוות מוקדם או הזדקקות להשתלת כבד, היו הילדים עם אבחון מוקדם של AIH-2, שסבלו מקואגולופתיה, רמות בילירובין גבוהות ותמונה היסטולוגית חמורה כבר בשלב האבחון המוקדם של AIH. בילדים, במצבי מחלה מתקדמת עלולים להופיע תופעות של פרקי בלבול.

הנוגדן LKM-1:

הנוגדן LKM-1 הוא הסמן האבחוני של הצורה החמורה של AIH הידועה כ-autoimmune hepatitis type 2 (להלן AIH2) הפוגעת באופן אופייני בילדים ובמבוגרים צעירים (Homberg וחב' ב-Hepatology משנת 1987). גילוי נוגדן זה בוצע בעבר באופן קונבנציונאלי על ידי אימונו-פלואורסצנטיה, שהיא טכניקה סובייקטיבית שנעשה בה שימוש ברקמות של כבד, כליה וקיבה של חולדות בתור מצע השוואתי (Rizzetto וחב' ב-Clin Exp Immunol משנת 1973). נדירות הממצא של LKM-1 והדמיון בצביעה שלו לזה של הנוגדן האנטי-מיטוכונדריאלי כמו גם לזו של הנוגדן ל-liver cytosol type-1, גרמו לעתים להחמצת LKM-1 (על פי Seelig וחב' ב-Clin Exp Immunol משנת 1993). בהמשך, נחשבה שיטת קישור ליגנד רדיואקטיבי ל"מדד הזהב" לגילוי LKM1, אך זו שיטה ממושכת בביצוע והופכת לא שכיחה במעבדות משיקולים של זיהום סביבתי בחומר רדיו-אקטיבי. למעשה מאז שנת 1999 מקובלת שיטת ELISA שנמצאה ספציפית וגם רגישה (Kerkar וחב' ב-J Immunol Methods משנת 1999, וכן במאמר נוסף של אותם חוקרים ב-J Clin Pathol משנת 2002. גם Miyakawa וחב' פרסמו בשנת 1999 ב-Autoimmunity נתונים על גילוי anti-LKM-1 בשיטת ELISA בנבדקים מבוגרים עם מחלת כבד כרונית, זאת על רקע העובדה שנוגדן עצמי זה מתגלה גם בחלק ממטופלים עם הפאטיטיס C כרונית.

במחקר זה נסקרו 29 מטופלים חיוביים ל-anti-LKM1, כמו גם 301 דגימות נסיוב של אלה עם מחלות כבד שונות, וכן 100 דגימות מאנשים בריאים שליליים ל-anti-LKM1. הספציפיות של מבחן ה-ELISA נבחנה על ידי מבחני ספיחה תוך שימוש בדגימות נסיוב חיוביות ל-anti-LKM1. ב-29 דגימות הנסיוב ממטופלים חיוביים ל-anti-LKM1 בשיטת בדיקה אימונו-פלואורסצנטית IF)) נמצא מתאם טוב בין שיטותELISA ו-IF. בדיקת נוגדן anti-LKM1 נמצאה חיובית ב-12 מתוך 12 מטופלים מוכחים עם AIH2, וב-16 מתוך 17 הנבדקים עם הפאטיטיס C כרונית שנמצאו חיוביים ל-anti-LKM1 בשיטת IF. ב-401 דגימות אחרות שנמצאו שליליות ל-anti-LKM1 בשיטת IF, נמצא בשיטתELISA , שפרט לדגימות בודדות כל השאר נמצאו שליליות ל-anti-LKM1 בשיטת ELISA.

הפיתוח של שיטות מדידה סרולוגיות סימל התקדמות אבחונית חשובה, מה שהעניק אפשרות להבדיל בין הפאטיטיס נגיפית כרונית, לבין מחלות כבד כרוניות אחרות, כולל AIH הנחשבת כיום למפגע רב מערכתי, שיכול להתרחש בשני המינים בכל גיל. AIH יכולה להופיע כפועל יוצא של זיהום נגיפי דוגמת הפאטיטיס A, או על ידי חשיפה לכימיקאלים דוגמת minocycline.

נוגדנים עצמיים כנגד LKM1 בזיהום כרוני של הפאטיטיס C: האם דוגמה לחיקוי מולקולארי?

Marceau וחב' פרסמו בשנת 2005 ב-Hepatology את נתוניהם בנושא זה. כידוע נוגדנים עצמיים כנגד LKM1 המכוונים כנגד ציטוכרום P450 2D6 (או CYP2D6), נחשבים סמנים ספציפיים של AIH-2, אך ניתן למצאם גם ב-5% של דגימות נסיוב של מטופלים עם הדבקה כרונית ב-HCV. הוצע שקיים דמיון או חיקוי מולקולארי בין חלבוני הנגיף HCV לבין CYP2D6 על מנת להסביר נוכחות נוגדנים אלה. נוגדנים עצמיים כנגד LKM1 מחולים עם הדבקה ב-HPC, נוקו בשיטת affinity purification על פני עמודה שעליה ספחו את חלבוני .CYP2D6. אפיטופים מבניים של CYP2D6 זוהו על ידי סריקה ואנליזה של phage display, והזיהוי של צמדים משמעותיים סטטיסטית (SSPs). תגובה צולבת בין חלבונים מועמדים של CYP2D6 ו-HCV נבחנה על ידי immunoprecipitation. בודדו 19 שבטים (clones) שונים, והריצוף שלהם הביא למיפוי של אפיטופ מבני באזור של רצף חומצות אמינו 254-288 של CYP2D6, איזור המכיל את האפיטופ הלינארי העיקרי במטופלים עם AIH-2.

בין חלבוני הנגיף HCV מועמדים לחיקוי מולקולארי כללו את E2, NS3 ו-NS5a. אכן, נוגדנים עצמיים מטוהרים שבודדו ממטופלים עם הפאטיטיס C המכילים נוגדנים כנגד LKM1, השקיעו בתמיסה את החלבונים NS3 או את NS5a של הנגיף HCV, או אף את שניהם, ותגובתיות זו נוטרלה על ידי CYP2D6.
חלבוני נסיוב ואימונו-גלובולינים:
ממצא שכיח בנסיוב של אלה עם AIH בלתי מטופלת, היפר-γ-גלובולינמיה של IgG רב-שבטי (polyclonal), כאשר רמות γ-גלובולינים נעות בתחום של 3-4 גרם/ד"ל, ויכולות להגיע לעתים קרובות עד 5-6 גרם/ד"ל. יש מדי פעם דיווחים על צמיגות-יתר של הנסיוב שהם משניים לרמות IgG גבוהות. האבחון של AIH אינו סביר בנבדקים עם הפאטיטיס חריפה ללא היפר-γ-גלובולינמיה. רמת γ-גלובטולינים או זו של IgG יכולות לשמש כבסיס סדיר לתגובת המפגע לטיפולים. אלה עם AIH-2 מראים בדרך כלל רמת IgA נמוכה (Mieli-Vergani ו-Vergani ב-World J Gastroenterol משנת 2008).
אמינו-טרנספרזות:
שני אנזימי האמינו-טרנספרזות, ALT ו-AST, נמצאים מוגברים ב-100% של מטופלים בשלב האבחון המוקדם של AIH, עם רמות בתחום של 200-300 יחידות לליטר, אם כי לעתים מדווח על מקרים בהם רמת הטרנס-אמינזות גבוהה פי-50 מרמת הנורמה שלהם. לעומת זאת שני אנזימים אלה הם בעלי מתאם נמוך עם דרגת הנמק הכבדי; יחד עם זאת, ערכי טרנס-אמינזות בתחום של אלפי יחידות לליטר יכולים להצביע על הפאטיטיס חריפה. התמשכות העלייה ברמת טרנס-אמינזות למרות המשך טיפול, הוא מדד אמין להמשך התהליך הדלקתי בכבד. לעומת זאת, נורמליזציה של רמות טרנס-טרנספרזות במרוצת הטיפול מהווה סימן מעודד, אם כי ב-50% מהמטופלים עם רמות נורמאליות של אנזימים אלה תהליך פעיל של דלקת כבד עדיין בתוקפו. ואמנם, נורמליזציה של מדדים ביוכימיים יכולה להקדים ב-3-6 חודשים הפוגה היסטולוגית אמיתית. החמרה ברמות טרנס-אמינזות במי שנמצא בעיצומו של טיפול, או באלה שנמצאים בשלב של הפוגה יכולה להוות איתות להתעוררות מחודשת של פעילות המחלה.
מדדים ביוכימיים והמטולוגיים נוספים של כבד:
רמות בילירובין ופוספטאזה בסיסית מוגברות באופן קל עד מתון ב-80-90% מאלה עם AIH. עלייה חדה ברמת פוספטאזה בסיסית במהלך מחלה אוטו-אימונית, עלולה לבטא התפתחות של (PSC או primary sclerosing cholangitis) או תחילת מהלך של קרצינומה הפאטו-צלולארית כסיבוך של צמקת. ב-50% מהמקרים מוצאים היפו-אלבומינמיה והתארכות משך פרותרומבין PT)), שהם סמנים לאי-תפקוד חמור של המערכת הסינתטית בכבד, שמוצאים לעתים קרובות במחלת כבד פעילה או בצמקת שאינה בשליטה. בין המדדים ההמטולוגיים הבלתי-סדירים שמוצאים ב-AIH ניתן למנות leukopenia מתונה, אנמיה נורמוכרומית, אנמיה המוליטית שהיא Coombs-חיובית, תרומבוציטופניה ושקיעת דם מוחשת. אאוזינופיליה אינה שכיחה, אך ספירות בתחום שבין 9-48% דווחו לעתים. AIH תוארה כממצא היחיד הבא לביטוי בתסמונת היפר-אאוזינופילית אידיופטית.
נוגדנים נוספים ב-AIH:
ממצאי מעבדה ב-AIH כוללים גם רמה מוגברת בנסיוב של נוגדנים כנגד גרעין התא (ANAs), נוגדנים כנגד תאי שריר חלק (SMAs) הכוונים כנגד החלבון actin, נוגדנים כנגד מקטע מיקרוזומאלי של כבד וכליות (LKM-1), או נוגדנים כנגד ציטוזול של תאי כבד (Anti-LC1). נוגדנים מסוג SMAs מוצאים ב-90-100% מאלה עם AIH-1. נוגדנים מסוג ANAs מוצאים ב-10% מאלה עם AIH-1, ובשיתוף עם SMAs נמצאים ב-40-60% מאלה עם AIH-1. כייל נוגדנים עצמיים אלה נע בין 1:100-1:500,000. נוגדנים מסוג SMAs מופיעים בטיטר נמוך בילדים בריאים ובמטופלים עם הפאטיטיס נגיפית וכן במפגעים אחרים, אך אינם פוגעים בכבד.

כמו כן מוצאים ב-AIH נוגדנים כנגד SLA או אנטיגן מסיס של הכבד והם מכוונים כנגד cytokeratins types 8 & 18; נוגדנים כנגד הקולטן הספציפי של הכבד ל-asialoglycoprotein או מה שידוע כלקטין הכבדי; נוגדנים AMA כנגד המיטוכונדריה שהם הנוגדנים ההכרחיים בתרחיש של PBC או primary biliary cirrhosis, אך ניתן למצאם גם ב-AIH; נוגדני APLA כנגד פוספוליפידים (Pathmakanthan וחב' ב- Eur J Gastroenterol Hepatol משנת 1998).

נוגדני LKM-1 נמצאים ב-40-45% מהמטופלים עם AIH-2 והם כרוכים עם מציאות נוגדנים anti-LC1 ב-50% מהמאובחנים עם סוג AIH זה. נוגדנים מסוג anti-LC1 בעצמם ניתן למצוא ב-30% מאלה עם AIH-2, כאשר נוגדנים אחרונים אלה מזהים את האנזים המטבולי הספציפי לכבד הידוע כ-formiminotransferase cyclodeaminase שמשקלו המולקולארי 58,000 דלטון. נוגדנים כנגד הקולטן ל-asialoglycoprotein נמצאים באופן שכיח יותר באלה עם AIH-1 ועשויים לשמש סמנים לפעילות דלקתית. נוגדנים עצמיים נוספים יכולים להימצא גם כן, כגון נוגדנים בלתי-אופייניים מסוג pANCA או perinuclear antineutrophil cytoplasmic antibodies. נמצא שמאובחנים עם AIH בהם נמצאים ממצאים חיוביים לגבי נוגדנים כנגד actin, הם נבדקים צעירים יותר החיוביים לאנטיגן הלויקוציטי האנושי HLA-DR3, ונבדקים אלה נזקקו להשתלת כבד באופן שכיח יותר בהשוואה למטופלים עם ANAs בהם לא נמצאו נוגדנים ל-actin (על פי Czaja וחב' ב-Hepatology משנת 1996).

רקע גנטי ב-AIH:

התרומה של רקע גנטי להופעת תרחיש כגון AIH, מיוחסת למספר haplotypes של HLA, ביניהם DR4, DR3, B14, B8 ו-Dw3. גם שמט (deletion) של הגן C4A נכרך עם הופעת AIH באנשים צעירים יותר (Scully וחב' ב-Gastroenterology משנת 1993). מאובחנים עם AIH נשאי haplotype כדוגמת HLA-DR3, הם בסבירות גבוהה יותר למחלה בדרגת אגרסיביות גדולה יותר, המגיבה פחות לטיפול תרופתי ונזקקת בשכיחות גבוהה יותר להשתלת כבד. בנוסף, המטופלים האחרונים צעירים יותר בעת אבחון המחלה מאשר אלה נשאי haplotypes אחרים. כמו כן, אלה עם AIH נשאי HLA-DR4 haplotype, הם בסבירות גבוהה יותר לפתח תסמינים חוץ-כבדיים (Czaja וחב' ב-Hepatology משנת 1993).

מטופלים עם AIH הם בעלי רמה נמוכה של לימפוציטים T המבטאים את הסמן CD8, ויש להם גם פגם ספציפי בתת-אוכלוסייה של תאי T המפקחים על התגובה החיסונית כנגד אנטיגנים ספציפיים על פני תאי כבד. AIH נכרכה גם עם האלל C4AQO הקשור למשלים (complement), מה שגורם לחסר חלקי של מרכיב המשלים C4. ל-C4 תפקיד ידוע בנטרול נגיפים, והכשל להשמיד נגיפים עלול להביא לתגובה חיסונית כנגד אנטיגנים על פני התאים המודבקים בנגיפים אלה.

גריינים סביבתיים:

בין הנגיפים המוזכרים ככאלה המגרים תרחיש של AIH נמצא את נגיפי rubella, Epstein-Barr והפאטיטיס B ,A, ו-C. מספר מחקרים הצביעו על הומולוגיה ניכרת ברצף חומצות האמינו בין חלבוני הפאטיטיס C לבין CYP2D6 שהוא היעד המולקולארי של הנוגדן העצמי LKM-1, מה שמרמז לכך שחפיפה מולקולארית גורמת להופעת נוגדני LKM-1 בהדבקה של הפאטיטיס C. יש להדגיש יחד עם זאת, שכאשר מופיעים באלה עם הפאטיטיס C כרונית נוגדנים כנגד LKM-1 אלה בדרך כלל אינם מכוונים כנגד אותם אפיטופים איתם מגיבים נוגדנים אלה המופיעים בנסיוב של אלה עם AIH-2. גם תרופות שונות עלולות לגרות תרחיש של AIH, באופן שחלבון של אנזים כגון uridine diphosphat glucuronosyltansferase ומערכת ציטוכרום P-450, מהווים יעדים לאוטו-אימוניות המושרה על ידי נגיף או תרופה, כמו גם להפאטיטיס אוטו-אימונית.

פתוגנזה של AIH:

ראיות עדכניות מצביעות על כך שנזק לכבד באלה עם AIH, הוא תוצאה של התקפה של המערכת החיסונית התאית. תצוגה אנטיגנית משובשת של HLA-class II על פני הפאטוציטים מגבירה את החשיפה של מרכיבים נורמאליים על פני תאים אלה לתאי חיסון הידועים כ-APCs או antigen-presenting cells. ה-APCs מציגים את האנטיגנים של תאי-כבד ללימפוציטים בלתי-מחויבים מסוג Th 0 או helper T-lymphocytes, ואינטראקציה זו מביאה לשפעול של Th 0. שפעול זה מלווה על ידי התמיינות (דיפרנציאציה) של התאים האחרונים ליצירת Th 1 או helper T cell 1, או ליצירת Th 2 או helper T cell 2, בהתאם לציטוקינים השולטים ברקמת הכבד ואופיו של האנטיגן. תאי Th 1 מפרישים בעיקר את האינטרלויקין IL-2 וכן את אינטרפרון-גאמא, אשר משפעלים מקרופאגים ומעודדים את הביטוי של האנטיגנים I HLA class ו-HLA class II, ובכך מכניסים לפעולה את המערכת החיסונית. לעומת זאת, תאי Th 2 מייצרים בעיקר את האינטרלויקינים IL-5, IL-4 ו-IL-10, המעודדים יצירת נוגדנים עצמיים על ידי לימפוציטים מסוג B (על פי Longhi וחב' ב-J Autoimmun משנת 2009).

הסיבות לתצוגה המשובשת של HLA אינן ברורות, אך ייתכן שהן תולדה של גורמים גנטיים, של הדבקה נגיפית חריפה של הפאטיטיס A או B, או של נגיף Epstein-Barr (על פי Vento ו-Cainelli ב-Autoimmun Rev משנת 2004). ייתכן גם שמדובר בהשפעת גורמים כימיים כגון אינטרפרון, מלטונין, α-מתילדופה, nitrofurantoin ,oxyphenisatin או tienilic acid. יש גם המצביעים על הקולטן ל-asialoglycoprotein וכן על cytochrome mono-oxygenase P-450 2D6 כאנטיגנים עצמיים הקשורים לתצוגה המשובשת של HLA.

במצב פיזיולוגי תקין, תאי Th 1 ו-Th 2 מזהים זה את זה, ומנגנונים מווסתים מפקחים באופן מוקפד על תהליכי הזיהוי האנטיגני העצמי. כישלונם של מנגנונים אלה מחיש את המתקפה האוטו-אימונית. הפגיעה בתאי הכבד עלולה להיגרם על ידי פעילות לימפוציטים ציטוטוקסיים המושפעים על ידי IL-2, על ידי שפעול המשלים, על ידי גיוס לימפוציטים מסוג NK על ידי נוגדנים עצמיים הקשורים על פני תאי הכבד, או על ידי תגובה של נוגדנים עצמיים עם אנטיגנים ספציפיים לרקמת הכבד הבאים לביטוי על פני הפאטוציטים. אכן, הפאטוציטים המצופים על ידי נוגדנים עצמיים באלה עם AIH, מומתים כאשר הם מודגרים עם לימפוציטים אוטולוגיים מתרומה עצמית או לימפוציטים אלוגנאיים של תורם זר. התא הממית את ההפאטוציטים בחולי AIH, או תא האפקטור, הנמצא כתא מונונוקלארי שעל פניו יש נוכחות של קולטן למקטע Fc. כבר בשנת 1990 פרסמו Wen וחב' ב-Lancet, שתאי T שבודדו מדגימות ביופסיית כבד של ילדים עם AIH, ואשר ביטאו על פניהם את הקולטן γ/δ של תאי T הם במיוחד טוקסיים לתאי כבד.

משמעות בדיקות המעבדה:

טיטר גבוה של anti-LKM-1 מצביע כמעט בוודאות שהנבדק נכלל בקבוצת AIH-2, אך התוצאה אינה מוחלטת. ניתן לבצע ביופסיה של הכבד להעריך את מידת הנזק הרקמתי וההצטלקות, על מנת לסייע באישור האבחון. אם תוצאות הבדיקות מצביעות על תוצאה שלילית של anti-LKM-1, ותוצאות חיוביות של נוגדני SMA או ANA, אז יש סבירות גבוהה שמדובר ב-AIH-1. אם תוצאות כל הנוגדנים האמורים מתקבלות שליליות, נראה שהתסמינים הקליניים אינם תוצאה של AIH. יחד עם זאת, אין לשלול לחלוטין אפשרות שעדיין מדובר ב-AIH. לא כל אלה עם AIH מייצרים נוגדנים כנגד LKM-1 או כנגד SMA, כאשר כמה מהם מייצרים נוגדנים עצמיים אחרים שנבחנים רק לעתים נדירות.

הטיטר של הנוגדנים כנגד LKM-1 אינו משקף את חומרת התסמינים או את הפרוגנוזה של המחלה. טיטר הנוגדנים כנגד LKM-1 יכול להשתנות לאורך זמן. אלה המאובחנים עם AIH-2 עלולים לעתים לסבול בעת ובעונה אחת ממפגעים אוטואימוניים אחרים, כגון סוכרת או thyroiditis. מטופלים עם הפאטיטיס C כרונית יכולים לעתים לפתח סוג שונה של נוגדן כנגד LKM-1, שאינו מתגלה בשיטות הבדיקה הרגילות לנוגדן זה, ואין נוהגים בשגרת המעבדה לנסות ולגלותו.

נוגדנים כנגד LKM-1 משמשים כסמן ל-AIH-2, והם מופיעים באופן אופייני בהיעדר נוגדני SMA ו-ANA. הנוגדן כנגד LKM-1 מגיב עם רצף ליניארי קצר של האנטיגן הריקומביננטי cytochrome monooxygenase P450 2D6 (על פי Czaja ו-Homburger ב-Gastroenterology משנת 2001). מאובחנים עם AIH-2 נוטים להיות צעירים יותר, נשים, אשר תסמיני מחלתם חמורים, אך גם כאלה המגיבים טוב לטיפול המדכא את מערכת החיסון.

מתי מתבצעת הבדיקה לנוכחות נוגדנים כנגד LKM-1?

רמת הנוגדנים כנגדLKM-1 נקבעת במסגרת הערכה של מטופלים עם מחלת כבד ללא אטיולוגיה ברורה. בדיקה זו נדרשת בעיקר במקביל לבדיקת נוכחות הנוגדנים מסוג SMA או ANA, על מנת לסייע באבחון של AIH, ולהבדיל בין 2 הסוגים העיקריים של הפאטיטיס אוטו-אימונית, type 1 ו-type 2. מבחנים אלה יכולים להתבצע במסגרת מעקב אחר ממצאי כבד בלתי תקינים, כגון רמות מוגברות באופן עיקש של 2 אנזימי הטרנסאמינאז ALT ו-AST, או של בילירובין. מבחנים אחרים שיש להביא בחשבון ביצועם באותו הקשר, הם מדידת רמת אימונוגלובולינים, שכן האחרונים בדרך כלל מוגברים ב-AIH אך אינם מוגברים בהפאטיטיס נגיפית.
== הוראות לביצוע הבדיקה ==
אין צורך להיות בצום. יש לדגום דם למבחנה כימית (פקק אדום או צהוב) ולאחר סרכוז והפרדת הנסיוב יש להעבירו במבחנה מקוררת למעבדה. ניתן לשמור את הנסיוב עד 4 ימים בטמפרטורת החדר, עד 21 יום בקירור, או 40 יום בהקפאה. אין לקבל דגימות נסיוב בדרגת המוליזה, ליפמיה או איקטֶריה גבוהות, אך ניתן לבדוק דגימות אלה בדרגות המוליזה, ליפמיה ואיקטריה מתונות.

LKM-1

2015-10-19T10:59:55Z

בן עמי סלע: יצירת דף עם התוכן "== LKM-1 == כינויים נוספים: נוגדנים ל-anti-LKM1 ; LKM1 (liver/kidney microsomal type 1) antibodies ; LKM-1 Antibodies ;Anti-P450 2D6 . ת..."

== LKM-1 ==

כינויים נוספים: נוגדנים ל-anti-LKM1 ; LKM1 (liver/kidney microsomal type 1) antibodies ; LKM-1 Antibodies ;Anti-P450 2D6 .
תחום: מפגעי כבד ובעיקר autoimmune hepatitis.
טווח ערכים תקין: שלילי-לא יותר מ-20.0 יחידות לליטר; גבולי-20.1-24.9 יחידות לליטר; חיובי-מעל 25.0 יחידות לליטר. ערכי ייחוס אלה רלוונטיים לבני כל הגילים.
יוצר הערך: פרופ' בן-עמי סלע.

הפאיטיס אוטו-אימונית:

הפאטיטיס אוטו אימונית (AIH) היא מחלה כרונית מסיבה לא ידועה המאופיינת על ידי תהליך דלקת הפאטו-צלולארית מתמשכת, עם התפתחות נמק ונטייה לעבור לשלב של צמקת. תסמונת זו לעתים קרובות כרוכה עם מחלות אוטו-אימוניות נוספות. לא ניתן להסביר AIH על בסיס של הדבקה נגיפית כרונית, צריכת אלכוהול, או חשיפה לתרופות או כימיקאלים טוקסיים לכבד. ב-13-20% המחלה מתפוגגת באופן ספונטאני ללא כל קשר לפעילות הדלקתית, באופן שלא ניתן לצפות מראש. קרצינומה של תאי כבד (HCC) פחות שכיחה באלה עם AIH בהם התפתחה צמקת, מאשר באלה בהם הצמקת הופיעה מסיבות אחרות. אף על פי כן, HCC אינה אירוע נדיר ב-AIH. לייפת (fibrosis) מופיעה ברוב המטופלים עם AIH, וללא טיפול יעיל הלייפת מתחילה לחבר את אזורי הכבד השעריים (portal) עם האזור המרכזי שלו, מה שבסוף התהליך מוליך לצמקת. בשנת 1999 ה-International AIH Group יצרה מערכת דירוג המחלה שיעילותה ניכרת בעיקר באבחון של AIH במקרים גבוליים-בעייתיים (Alvarez וחב' ב-J Hepatol משנת 1999, ו-Wiegard וחב' ב-Semin Liver Dis משנת 2009).

הממצאים ההיסטו-פתולוגיים באלה עם AIH הם אופייניים אך לא ספציפיים: ל- AIH יש ממצאים המשותפים למקרים של הפאטיטיס נגיפית כרונית, מקרים של הפאטיטיס כרונית על רקע של תרופות, ועוד מפגעי כבד נוספים. ב-10-20% מהמקרים של AIH מוצאים בדגימות ביופסיה הפאטוציטים ענקיים רב-גרעיניים. לממצאים ההיסטופתולוגיים בדגימות ביופסיה של הכבד חשיבות באבחון AIOH ובקביעת חומרת המחלה. ממצאים אלה חיוניים להבדלת AIHמהדבקה ב-HCV, מהפאטיטיס על רקע אלכוהול, ממחלת כבד הנגרמת מטיפול תרופתי טוקסי, מ-PBC ומ-PSC או primary sclerosing cholangitis (על פי Czaja & Carpenter ב-Gastroenterology משנת 1993). כמו כן, AIH מתאפיין על ידי הסננה פורטאלית של תאים מונו-נוקלאריים, לעתים מוצאים גם הסננה של תאי פלזמה.

הרקע ההיסטורי של הפאטיטיס אוטו-אימונית:

החוקר השוודי Waldenström תאר לראשונה בשנת 1950 ב-Acta Endocrinol צורה של הפאטיטיס כרונית בנשים צעירות. התרחיש תואר על ידו כצמקת הכבד, הסננה לכבד של תאי פלזמה והיפר-גאמא-גלובולינמיה ניכרת. באותה שנה דווחו Kunkel וחב' ב-J Clin Invest ו-Bearn וחב' ב-1956 ב-Am J Med, מאפיינים אחרים של התרחיש כולל הגדלה של הטחול והכבד, צהבת. חטטת הפנים (Acne) שעירות-יתר, תווי פנים כבתסמונת Cushing, פיגמנטציה של אזור הבטן, השמנת-יתר, דלקת מפרקים, ואל-ווסת (amenorrhea) בנשים צעירות. בשנת 1955, היו אלה Joske ו-King שדיווחו לראשונה ב-Lancet על הקשר בין זאבת ארגמנית (לופוס) בהפאטיטיס נגיפית כרונית, קשר שהביא לטביעת המושג הפאטיטיס לופואידית על ידי Mackay וחב' ב-Lancet ב-1956. כיום כבר ברור שאין כל קשר בין SLE לבין הפאטיטיס אוטו-אימונית (להלן AIH), וממילא הפאטיטיס לופואידית אינה קשורה ל-SLE.

התיאור ההיסטו-פתולוגי של AIH עבר מספר עדכונים במהלך השנים. בשנת 1992 התכנס פאנל בינלאומי והגדיר מחדש את הקריטריונים האבחוניים (Johnson ו-McFarlane ב-Hepatology משנת 1993), ונקבע סופית שהביטוי המקובל יהיה הפאטיטיס אוטו-אימונית ולא ביטוי שהיה רווח קודם לכן דוגמת הפאטיטיס-אוטו-אימונית כרונית פעילה, שהיה בשימוש באותה עת. אותו פאנל הסיר את הדרישה לפרק זמן מינימאלי של 6 חודשים של פעילות המחלה, כדי שזו תוגדר "כרונית", הרחיב את הספקטרום ההיסטולוגי על מנת שיכלול הפאטיטיס אונתית (lobular), ואישש מחדש את האופי הלא נגיפי של מחלה זו. פאנל זה אישר הכללה של ממצאים היסטולוגיים לכאורה סותרים, כמו כולסטאזיס, פגיעה בצינורות המרה ו-ductopenia.

אפידמיולוגיה של הפאטיטיס אוטו-אימונית:

בארה"ב הנתונים האפידמיולוגיים מוגבלים. בין מבוגרים לבנים שכיחות המפגע מוערכת כ-0.1-1.2 מקרים לכל 100,000. השכיחות של AIH בין מטופלים עם מחלת כבד כרונית היא בתחום של 11-23%. המחלה אחראית לכ-6% מכלל השתלות הכבד בארה"ב. הפאטיטיס אוטו-אימונית type 2 (להלן AIH-2) ו-AIH-3 יחסית פחות שכיחים בארה"ב, ולעומת זאת AIH-2 נפוצה יותר באירופה.

השכיחות של AIH מוערכת בכ-0.1-1.2 מקרים ל-100,000 במערב אירופה, כאשר במזרח אירופה שכיחות מפגע זה גבוהה משמעותית ומגיעה עד כדי 11.6-16.9 מקרים לכל 100,000. זו שכיחות הדומה לזו של צמקת מרתית ראשונית (PBC), וגבוהה פי-2 מזו של מחלת כבד כרונית חסימתית (או primary sclerosing cholangitis). באירופה AIH אחראית לכ-3% מהשתלות הכבד. ביפאן לעומת זאת, השכיחות של AIH נמוכה משמעותית עם 0.015-0.08 מקרים לכל 100,000.

היחס בין AIH-1 ל-AIH-2 הוא :11.5-2.1 באירופה ובקנדה, ו-6-7:1 בארה"ב, בדרום אמריקה, וביפאן. השכיחות של AIH-2 במדינות דרום אירופה גדולה יותר מאשר במדינות צפון אירופה, ארה"ב ויפאן. בניתוח נתונים של 33,379 מטופלים עם צמקת הכבד, מצאו Michitaka וחב' ש-AIH היה הגורם האטיולוגי ב-1.9% מכלל מקרי צמקת אלה ביפאן (J Gastroenterol משנת 2009). רק לשם השואה, הפאטיטיס C היה הגורם האטיולוגי המשמעותי ביותר לצמקת הכבד ביפאן, שם הוא אחראי ל-61% מכלל מקרי הצמקת.

AIH שכיחה ביותר בצפון אירופה באלה עם שכיחות גבוהה של הסמנים הגנטיים HLA-DR3 ו-HLA-DR4 (על פי Boberg ב-Clin Liver Dis משנת 2002, ו-Czaja ב- Semin Liver Dis משנת 2009). ביפאן מצאו Seki וחב' מתאם בין HIH לבין HLA-Bw54 ו-HLA-DR4 (ב-Hepatology משנת 1990).

נשים נפגעות משמעותית יותר מגברים מ-AIH, כאשר McFarlane ו-Heneghan מצאו ב-Hepatol Res משנת 2007, יחס של בערך 3:1 בין שני המינים. ל-AIH יש פיזור גיל דו-מודאלי, כאשר השיא הראשון של הופעת המפגע מתחולל בגילים של 10-20 שנה, והשיא השני של הופעתו מתחולל בין הגילים 45-70 שנה. בערך מחצית מהנפגעים ב-AIH הם מתחת לגיל 20 שנה, והוא גבוה בנערות לפני הופעת המחזור. מאובחנים עם AIH-2 הם בממוצע צעירים יותר, כאשר 80% מבין אלה עם AIH-2 הם ילדים. יחד עם זאת, AIH עלולה להופיע בכל גיל כולל תינוקות וקשישים (Mieli-Vergani ו-Vergani ב-Semin Liver Dis משנת 2009, ו-Czaja ו-Carpenter ב-Hepatology משנת 2006). בקבוצת הגיל הקשישה יש נטייה לגברים להיפגע יותר מ-AIH מאשר נשים.
אטיולוגיה:
האטיולוגיה של AIH אינה ידועה, אם כי מספר גורמים (הדבקה נגיפית, תרופות, וגורמים סביבתיים) עלולים לגרות תגובה אוטו-אימונית ובהתאם מחלה אוטו-אימונית. בחלק קטן של מאובחנים עם AIH, המפגע מתחולל בעקבות הדבקה חריפה בנגיף הפאטיטיס A, הפאטיטיס B או נגיף Epstein-Barr. נוגדנים עצמיים שכיחים האלה עם הדבקה כרונית ב-HCV, כאשר בנסיוב של אלה ניתן למצוא נוגדנים ל-LKM1.
בחלק מהמקרים של מחלת כבד מושרה על ידי תרופות, ניתן למצוא תהליך המתווך על ידי מערכת החיסון. מספר תרופות כדוגמת methyldopa, nitrofurantoin, minocycline (על פי Ramakrishna וחב' ב-J Clin Gastroenterol משנת 2009), adalimumab (על פי Adar וחב' ב-J Clin Gastroenterol משנת 2010), ו-infliximab (על פי Fairhurst & Sheehan-Dre ב-Clin Exp Dermatol משנת 2009), יכולות לגרום למחלת כבד עם מאפיינים דומים לאלה של AIH. למרות שברוב במקרים התסמינים מתפוגגים עם הפסקת הטיפול בתרופות אלה, ניתן למצוא מקרים כרוניים של AIH, גם לאחר הפסקת הטיפול התרופתי הזה (Liu ו-Kaplowitz ב-Clin Liver Dis משנת 2002). בשנת 2010 דיווחו Casswall וחב' ב-Scand J Gastroenterol על מציאת DNA של זני הליקובקטר שונים ב-50% של ביופסיות כבד שנלקחו מילדים ומתבגרים עם AIH.
AIH יכולה להיות type 1 או type 2. הפאטיטיס type 1 יכולה להופיע בגילים שונים אך היא שכיחה יותר בנשים צעירות. כמחצית אלה עם AIH type 1, נושאים בקרבם מחלה אוטו-אימונית נוספת כגון סוכרת type 1, או קוליטיס כיבית. באשר ל-AIH type 2, סוג זה יכול להופיע במבוגרים אך הוא שכיח ביותר בילדות-נערות בגיל 2-14 שנה. אלה עם AIH type 2 מכילים נוגדנים עצמיים המגיבים עם מקטע מיקרוזומאלי של הכבד והכליות, השונה מזה כנגדו מכוונים נוגדנים-עצמיים ב-AIH type 1.

מאפיינים קליניים של הפאטיטיס אוטו-אימונית:

AIH הוא בעל מהלך כרוני שהגורם לו עדיין אינו ברור, והוא מתאפיין על ידי תהליך דלקתי הפאטו-צלולארי ונמק, שיש לו נטייה להתדרדר למצב של צמקת. AIH יכול להופיע כהפאטיטיס חריפה או כרונית, או כצמקת מוכחת. במקרים נדירים AIH בא לביטוי ככשל כבדי פולמיננטי. בערך אחד מכל שלושה מאובחנים עם AIH, מראה תסמינים של הפאטיטיס חריפה, המתבטאת בחום גבוה, רגישות של הכבד, וצהבת. חלק המטופלים עם AIH מפתחים סימנים ותסמינים של מחלת כבד כרונית, ואילו אחרים מתדרדרים במהירות לאי-ספיקת כבד חריפה, הבאה לביטוי בצהבת ובקואגולופתיה.

תסמינים שכיחים וממצאים המתקבלים בבדיקה פיזית עלולים לנבוע ממפגעים חוץ-כבדיים הכרוכים ב-AIH. תסמינים שכיחים כוללים עייפות, תחושת אי-נוחות ברום הבטן, גרד מתון, בחילה, הקאות ושלשולים, תווי פנים אופייניים למחלת Cushing, כאבי מפרקים ושרירים (myalgia), פריחה עורית (כולל חטטת), שעירות-יתר, כאבי חזה הנובעים מפלאוריטיס, בצקת ואיבוד משקל. הממצאים השכיחים בבדיקה פיזית הם הפאטומגליה (83%), צהבת (69%), ספלנומגליה (32%), מיימת (20%), אנצפלופתיה (14%) וריבוי לא תקין של כלי דם עוריים (spider angiomas) בפנים, בצוואר ובגפיים (58%). כן יכול להופיע שתן בצבע שחור, אנורקסיה וצואה בהירה ביותר.

תסמינים קליניים באוכלוסייה פדיאטרית עם AIH:

מחקר על ילדים (Caucasian) עם AIH של Oettinger וחב' ב-J Autoimmun משנת 2005, העלה את הנתונים הבאים: ב-58% מתוכם הייתה צהבת, חולשה בלתי ספציפית הופיעה ב-57% מהנבדקים, אנורקסיה ב-47%, כאבי בטן ב-38% וחיוורון (pallor) אובחן ב-26% מהילדים עם AIH. כ-70% מהילדים עם AIH יזדקקו לטיפול עד להיותם בוגרים, כאשר בחלקם צמקת הכבד כבר קיימת למרות גילם הצעיר. בין 20-25% מהילדים המאובחנים עם AIH ימותו בגל צעיר יחסית או יזדקקו להשתלת כבד. הנחיות שפורסמו בשנת 2011 על ידי האיגוד הגסטרו-אנטרולוגי הבריטי, קובעות שמטופלים צעירים עם AIH צריכים להיות מטופלים עם תכשירים לדיכוי מערכת החיסון, למנוע או לעכב צמקת הכבד (Gleeson ו-Heneghan ב-Gut משנת 2011).

בסדרת מחקרים מדווחים על ידי Gregorio וחב' ב-Hepatology משנת 1997, נמסר ש-70% מהילדים עם AIH-1, ו-40% מהילדים עם AIH-2, פיתחו צמקת הכבד. במדגם של 52 ילדים, 17% סבלו מתמט (collapse) מולטיאצינארי או פנאצינארי עם כשל כבדי חד. המטופלים במחקר זה עם הפרוגנוזה הגרועה ביותר בהיבט של מוות מוקדם או הזדקקות להשתלת כבד, היו הילדים עם אבחון מוקדם של AIH-2, שסבלו מקואגולופתיה, רמות בילירובין גבוהות ותמונה היסטולוגית חמורה כבר בשלב האבחון המוקדם של AIH. בילדים, במצבי מחלה מתקדמת עלולים להופיע תופעות של פרקי בלבול.

הנוגדן LKM-1:

הנוגדן LKM-1 הוא הסמן האבחוני של הצורה החמורה של AIH הידועה כ-autoimmune hepatitis type 2 (להלן AIH2) הפוגעת באופן אופייני בילדים ובמבוגרים צעירים (Homberg וחב' ב-Hepatology משנת 1987). גילוי נוגדן זה בוצע בעבר באופן קונבנציונאלי על ידי אימונו-פלואורסצנטיה, שהיא טכניקה סובייקטיבית שנעשה בה שימוש ברקמות של כבד, כליה וקיבה של חולדות בתור מצע השוואתי (Rizzetto וחב' ב-Clin Exp Immunol משנת 1973). נדירות הממצא של LKM-1 והדמיון בצביעה שלו לזה של הנוגדן האנטי-מיטוכונדריאלי כמו גם לזו של הנוגדן ל-liver cytosol type-1, גרמו לעתים להחמצת LKM-1 (על פי Seelig וחב' ב-Clin Exp Immunol משנת 1993). בהמשך, נחשבה שיטת קישור ליגנד רדיואקטיבי ל"מדד הזהב" לגילוי LKM1, אך זו שיטה ממושכת בביצוע והופכת לא שכיחה במעבדות משיקולים של זיהום סביבתי בחומר רדיו-אקטיבי. למעשה מאז שנת 1999 מקובלת שיטת ELISA שנמצאה ספציפית וגם רגישה (Kerkar וחב' ב-J Immunol Methods משנת 1999, וכן במאמר נוסף של אותם חוקרים ב-J Clin Pathol משנת 2002. גם Miyakawa וחב' פרסמו בשנת 1999 ב-Autoimmunity נתונים על גילוי anti-LKM-1 בשיטת ELISA בנבדקים מבוגרים עם מחלת כבד כרונית, זאת על רקע העובדה שנוגדן עצמי זה מתגלה גם בחלק ממטופלים עם הפאטיטיס C כרונית.

במחקר זה נסקרו 29 מטופלים חיוביים ל-anti-LKM1, כמו גם 301 דגימות נסיוב של אלה עם מחלות כבד שונות, וכן 100 דגימות מאנשים בריאים שליליים ל-anti-LKM1. הספציפיות של מבחן ה-ELISA נבחנה על ידי מבחני ספיחה תוך שימוש בדגימות נסיוב חיוביות ל-anti-LKM1. ב-29 דגימות הנסיוב ממטופלים חיוביים ל-anti-LKM1 בשיטת בדיקה אימונו-פלואורסצנטית IF)) נמצא מתאם טוב בין שיטותELISA ו-IF. בדיקת נוגדן anti-LKM1 נמצאה חיובית ב-12 מתוך 12 מטופלים מוכחים עם AIH2, וב-16 מתוך 17 הנבדקים עם הפאטיטיס C כרונית שנמצאו חיוביים ל-anti-LKM1 בשיטת IF. ב-401 דגימות אחרות שנמצאו שליליות ל-anti-LKM1 בשיטת IF, נמצא בשיטתELISA , שפרט לדגימות בודדות כל השאר נמצאו שליליות ל-anti-LKM1 בשיטת ELISA.

הפיתוח של שיטות מדידה סרולוגיות סימל התקדמות אבחונית חשובה, מה שהעניק אפשרות להבדיל בין הפאטיטיס נגיפית כרונית, לבין מחלות כבד כרוניות אחרות, כולל AIH הנחשבת כיום למפגע רב מערכתי, שיכול להתרחש בשני המינים בכל גיל. AIH יכולה להופיע כפועל יוצא של זיהום נגיפי דוגמת הפאטיטיס A, או על ידי חשיפה לכימיקאלים דוגמת minocycline.

נוגדנים עצמיים כנגד LKM1 בזיהום כרוני של הפאטיטיס C: האם דוגמה לחיקוי מולקולארי?

Marceau וחב' פרסמו בשנת 2005 ב-Hepatology את נתוניהם בנושא זה. כידוע נוגדנים עצמיים כנגד LKM1 המכוונים כנגד ציטוכרום P450 2D6 (או CYP2D6), נחשבים סמנים ספציפיים של AIH-2, אך ניתן למצאם גם ב-5% של דגימות נסיוב של מטופלים עם הדבקה כרונית ב-HCV. הוצע שקיים דמיון או חיקוי מולקולארי בין חלבוני הנגיף HCV לבין CYP2D6 על מנת להסביר נוכחות נוגדנים אלה. נוגדנים עצמיים כנגד LKM1 מחולים עם הדבקה ב-HPC, נוקו בשיטת affinity purification על פני עמודה שעליה ספחו את חלבוני .CYP2D6. אפיטופים מבניים של CYP2D6 זוהו על ידי סריקה ואנליזה של phage display, והזיהוי של צמדים משמעותיים סטטיסטית (SSPs). תגובה צולבת בין חלבונים מועמדים של CYP2D6 ו-HCV נבחנה על ידי immunoprecipitation. בודדו 19 שבטים (clones) שונים, והריצוף שלהם הביא למיפוי של אפיטופ מבני באזור של רצף חומצות אמינו 254-288 של CYP2D6, איזור המכיל את האפיטופ הלינארי העיקרי במטופלים עם AIH-2.

בין חלבוני הנגיף HCV מועמדים לחיקוי מולקולארי כללו את E2, NS3 ו-NS5a. אכן, נוגדנים עצמיים מטוהרים שבודדו ממטופלים עם הפאטיטיס C המכילים נוגדנים כנגד LKM1, השקיעו בתמיסה את החלבונים NS3 או את NS5a של הנגיף HCV, או אף את שניהם, ותגובתיות זו נוטרלה על ידי CYP2D6.
חלבוני נסיוב ואימונו-גלובולינים:
ממצא שכיח בנסיוב של אלה עם AIH בלתי מטופלת, היפר-γ-גלובולינמיה של IgG רב-שבטי (polyclonal), כאשר רמות γ-גלובולינים נעות בתחום של 3-4 גרם/ד"ל, ויכולות להגיע לעתים קרובות עד 5-6 גרם/ד"ל. יש מדי פעם דיווחים על צמיגות-יתר של הנסיוב שהם משניים לרמות IgG גבוהות. האבחון של AIH אינו סביר בנבדקים עם הפאטיטיס חריפה ללא היפר-γ-גלובולינמיה. רמת γ-גלובטולינים או זו של IgG יכולות לשמש כבסיס סדיר לתגובת המפגע לטיפולים. אלה עם AIH-2 מראים בדרך כלל רמת IgA נמוכה (Mieli-Vergani ו-Vergani ב-World J Gastroenterol משנת 2008).
אמינו-טרנספרזות:
שני אנזימי האמינו-טרנספרזות, ALT ו-AST, נמצאים מוגברים ב-100% של מטופלים בשלב האבחון המוקדם של AIH, עם רמות בתחום של 200-300 יחידות לליטר, אם כי לעתים מדווח על מקרים בהם רמת הטרנס-אמינזות גבוהה פי-50 מרמת הנורמה שלהם. לעומת זאת שני אנזימים אלה הם בעלי מתאם נמוך עם דרגת הנמק הכבדי; יחד עם זאת, ערכי טרנס-אמינזות בתחום של אלפי יחידות לליטר יכולים להצביע על הפאטיטיס חריפה. התמשכות העלייה ברמת טרנס-אמינזות למרות המשך טיפול, הוא מדד אמין להמשך התהליך הדלקתי בכבד. לעומת זאת, נורמליזציה של רמות טרנס-טרנספרזות במרוצת הטיפול מהווה סימן מעודד, אם כי ב-50% מהמטופלים עם רמות נורמאליות של אנזימים אלה תהליך פעיל של דלקת כבד עדיין בתוקפו. ואמנם, נורמליזציה של מדדים ביוכימיים יכולה להקדים ב-3-6 חודשים הפוגה היסטולוגית אמיתית. החמרה ברמות טרנס-אמינזות במי שנמצא בעיצומו של טיפול, או באלה שנמצאים בשלב של הפוגה יכולה להוות איתות להתעוררות מחודשת של פעילות המחלה.
מדדים ביוכימיים והמטולוגיים נוספים של כבד:
רמות בילירובין ופוספטאזה בסיסית מוגברות באופן קל עד מתון ב-80-90% מאלה עם AIH. עלייה חדה ברמת פוספטאזה בסיסית במהלך מחלה אוטו-אימונית, עלולה לבטא התפתחות של (PSC או primary sclerosing cholangitis) או תחילת מהלך של קרצינומה הפאטו-צלולארית כסיבוך של צמקת. ב-50% מהמקרים מוצאים היפו-אלבומינמיה והתארכות משך פרותרומבין PT)), שהם סמנים לאי-תפקוד חמור של המערכת הסינתטית בכבד, שמוצאים לעתים קרובות במחלת כבד פעילה או בצמקת שאינה בשליטה. בין המדדים ההמטולוגיים הבלתי-סדירים שמוצאים ב-AIH ניתן למנות leukopenia מתונה, אנמיה נורמוכרומית, אנמיה המוליטית שהיא Coombs-חיובית, תרומבוציטופניה ושקיעת דם מוחשת. אאוזינופיליה אינה שכיחה, אך ספירות בתחום שבין 9-48% דווחו לעתים. AIH תוארה כממצא היחיד הבא לביטוי בתסמונת היפר-אאוזינופילית אידיופטית.
נוגדנים נוספים ב-AIH:
ממצאי מעבדה ב-AIH כוללים גם רמה מוגברת בנסיוב של נוגדנים כנגד גרעין התא (ANAs), נוגדנים כנגד תאי שריר חלק (SMAs) הכוונים כנגד החלבון actin, נוגדנים כנגד מקטע מיקרוזומאלי של כבד וכליות (LKM-1), או נוגדנים כנגד ציטוזול של תאי כבד (Anti-LC1). נוגדנים מסוג SMAs מוצאים ב-90-100% מאלה עם AIH-1. נוגדנים מסוג ANAs מוצאים ב-10% מאלה עם AIH-1, ובשיתוף עם SMAs נמצאים ב-40-60% מאלה עם AIH-1. כייל נוגדנים עצמיים אלה נע בין 1:100-1:500,000. נוגדנים מסוג SMAs מופיעים בטיטר נמוך בילדים בריאים ובמטופלים עם הפאטיטיס נגיפית וכן במפגעים אחרים, אך אינם פוגעים בכבד.

כמו כן מוצאים ב-AIH נוגדנים כנגד SLA או אנטיגן מסיס של הכבד והם מכוונים כנגד cytokeratins types 8 & 18; נוגדנים כנגד הקולטן הספציפי של הכבד ל-asialoglycoprotein או מה שידוע כלקטין הכבדי; נוגדנים AMA כנגד המיטוכונדריה שהם הנוגדנים ההכרחיים בתרחיש של PBC או primary biliary cirrhosis, אך ניתן למצאם גם ב-AIH; נוגדני APLA כנגד פוספוליפידים (Pathmakanthan וחב' ב- Eur J Gastroenterol Hepatol משנת 1998).

נוגדני LKM-1 נמצאים ב-40-45% מהמטופלים עם AIH-2 והם כרוכים עם מציאות נוגדנים anti-LC1 ב-50% מהמאובחנים עם סוג AIH זה. נוגדנים מסוג anti-LC1 בעצמם ניתן למצוא ב-30% מאלה עם AIH-2, כאשר נוגדנים אחרונים אלה מזהים את האנזים המטבולי הספציפי לכבד הידוע כ-formiminotransferase cyclodeaminase שמשקלו המולקולארי 58,000 דלטון. נוגדנים כנגד הקולטן ל-asialoglycoprotein נמצאים באופן שכיח יותר באלה עם AIH-1 ועשויים לשמש סמנים לפעילות דלקתית. נוגדנים עצמיים נוספים יכולים להימצא גם כן, כגון נוגדנים בלתי-אופייניים מסוג pANCA או perinuclear antineutrophil cytoplasmic antibodies. נמצא שמאובחנים עם AIH בהם נמצאים ממצאים חיוביים לגבי נוגדנים כנגד actin, הם נבדקים צעירים יותר החיוביים לאנטיגן הלויקוציטי האנושי HLA-DR3, ונבדקים אלה נזקקו להשתלת כבד באופן שכיח יותר בהשוואה למטופלים עם ANAs בהם לא נמצאו נוגדנים ל-actin (על פי Czaja וחב' ב-Hepatology משנת 1996).

רקע גנטי ב-AIH:

התרומה של רקע גנטי להופעת תרחיש כגון AIH, מיוחסת למספר haplotypes של HLA, ביניהם DR4, DR3, B14, B8 ו-Dw3. גם שמט (deletion) של הגן C4A נכרך עם הופעת AIH באנשים צעירים יותר (Scully וחב' ב-Gastroenterology משנת 1993). מאובחנים עם AIH נשאי haplotype כדוגמת HLA-DR3, הם בסבירות גבוהה יותר למחלה בדרגת אגרסיביות גדולה יותר, המגיבה פחות לטיפול תרופתי ונזקקת בשכיחות גבוהה יותר להשתלת כבד. בנוסף, המטופלים האחרונים צעירים יותר בעת אבחון המחלה מאשר אלה נשאי haplotypes אחרים. כמו כן, אלה עם AIH נשאי HLA-DR4 haplotype, הם בסבירות גבוהה יותר לפתח תסמינים חוץ-כבדיים (Czaja וחב' ב-Hepatology משנת 1993).

מטופלים עם AIH הם בעלי רמה נמוכה של לימפוציטים T המבטאים את הסמן CD8, ויש להם גם פגם ספציפי בתת-אוכלוסייה של תאי T המפקחים על התגובה החיסונית כנגד אנטיגנים ספציפיים על פני תאי כבד. AIH נכרכה גם עם האלל C4AQO הקשור למשלים (complement), מה שגורם לחסר חלקי של מרכיב המשלים C4. ל-C4 תפקיד ידוע בנטרול נגיפים, והכשל להשמיד נגיפים עלול להביא לתגובה חיסונית כנגד אנטיגנים על פני התאים המודבקים בנגיפים אלה.

גריינים סביבתיים:

בין הנגיפים המוזכרים ככאלה המגרים תרחיש של AIH נמצא את נגיפי rubella, Epstein-Barr והפאטיטיס B ,A, ו-C. מספר מחקרים הצביעו על הומולוגיה ניכרת ברצף חומצות האמינו בין חלבוני הפאטיטיס C לבין CYP2D6 שהוא היעד המולקולארי של הנוגדן העצמי LKM-1, מה שמרמז לכך שחפיפה מולקולארית גורמת להופעת נוגדני LKM-1 בהדבקה של הפאטיטיס C. יש להדגיש יחד עם זאת, שכאשר מופיעים באלה עם הפאטיטיס C כרונית נוגדנים כנגד LKM-1 אלה בדרך כלל אינם מכוונים כנגד אותם אפיטופים איתם מגיבים נוגדנים אלה המופיעים בנסיוב של אלה עם AIH-2. גם תרופות שונות עלולות לגרות תרחיש של AIH, באופן שחלבון של אנזים כגון uridine diphosphat glucuronosyltansferase ומערכת ציטוכרום P-450, מהווים יעדים לאוטו-אימוניות המושרה על ידי נגיף או תרופה, כמו גם להפאטיטיס אוטו-אימונית.

פתוגנזה של AIH:

ראיות עדכניות מצביעות על כך שנזק לכבד באלה עם AIH, הוא תוצאה של התקפה של המערכת החיסונית התאית. תצוגה אנטיגנית משובשת של HLA-class II על פני הפאטוציטים מגבירה את החשיפה של מרכיבים נורמאליים על פני תאים אלה לתאי חיסון הידועים כ-APCs או antigen-presenting cells. ה-APCs מציגים את האנטיגנים של תאי-כבד ללימפוציטים בלתי-מחויבים מסוג Th 0 או helper T-lymphocytes, ואינטראקציה זו מביאה לשפעול של Th 0. שפעול זה מלווה על ידי התמיינות (דיפרנציאציה) של התאים האחרונים ליצירת Th 1 או helper T cell 1, או ליצירת Th 2 או helper T cell 2, בהתאם לציטוקינים השולטים ברקמת הכבד ואופיו של האנטיגן. תאי Th 1 מפרישים בעיקר את האינטרלויקין IL-2 וכן את אינטרפרון-גאמא, אשר משפעלים מקרופאגים ומעודדים את הביטוי של האנטיגנים I HLA class ו-HLA class II, ובכך מכניסים לפעולה את המערכת החיסונית. לעומת זאת, תאי Th 2 מייצרים בעיקר את האינטרלויקינים IL-5, IL-4 ו-IL-10, המעודדים יצירת נוגדנים עצמיים על ידי לימפוציטים מסוג B (על פי Longhi וחב' ב-J Autoimmun משנת 2009).

הסיבות לתצוגה המשובשת של HLA אינן ברורות, אך ייתכן שהן תולדה של גורמים גנטיים, של הדבקה נגיפית חריפה של הפאטיטיס A או B, או של נגיף Epstein-Barr (על פי Vento ו-Cainelli ב-Autoimmun Rev משנת 2004). ייתכן גם שמדובר בהשפעת גורמים כימיים כגון אינטרפרון, מלטונין, α-מתילדופה, nitrofurantoin ,oxyphenisatin או tienilic acid. יש גם המצביעים על הקולטן ל-asialoglycoprotein וכן על cytochrome mono-oxygenase P-450 2D6 כאנטיגנים עצמיים הקשורים לתצוגה המשובשת של HLA.

במצב פיזיולוגי תקין, תאי Th 1 ו-Th 2 מזהים זה את זה, ומנגנונים מווסתים מפקחים באופן מוקפד על תהליכי הזיהוי האנטיגני העצמי. כישלונם של מנגנונים אלה מחיש את המתקפה האוטו-אימונית. הפגיעה בתאי הכבד עלולה להיגרם על ידי פעילות לימפוציטים ציטוטוקסיים המושפעים על ידי IL-2, על ידי שפעול המשלים, על ידי גיוס לימפוציטים מסוג NK על ידי נוגדנים עצמיים הקשורים על פני תאי הכבד, או על ידי תגובה של נוגדנים עצמיים עם אנטיגנים ספציפיים לרקמת הכבד הבאים לביטוי על פני הפאטוציטים. אכן, הפאטוציטים המצופים על ידי נוגדנים עצמיים באלה עם AIH, מומתים כאשר הם מודגרים עם לימפוציטים אוטולוגיים מתרומה עצמית או לימפוציטים אלוגנאיים של תורם זר. התא הממית את ההפאטוציטים בחולי AIH, או תא האפקטור, הנמצא כתא מונונוקלארי שעל פניו יש נוכחות של קולטן למקטע Fc. כבר בשנת 1990 פרסמו Wen וחב' ב-Lancet, שתאי T שבודדו מדגימות ביופסיית כבד של ילדים עם AIH, ואשר ביטאו על פניהם את הקולטן γ/δ של תאי T הם במיוחד טוקסיים לתאי כבד.

משמעות בדיקות המעבדה:

טיטר גבוה של anti-LKM-1 מצביע כמעט בוודאות שהנבדק נכלל בקבוצת AIH-2, אך התוצאה אינה מוחלטת. ניתן לבצע ביופסיה של הכבד להעריך את מידת הנזק הרקמתי וההצטלקות, על מנת לסייע באישור האבחון. אם תוצאות הבדיקות מצביעות על תוצאה שלילית של anti-LKM-1, ותוצאות חיוביות של נוגדני SMA או ANA, אז יש סבירות גבוהה שמדובר ב-AIH-1. אם תוצאות כל הנוגדנים האמורים מתקבלות שליליות, נראה שהתסמינים הקליניים אינם תוצאה של AIH. יחד עם זאת, אין לשלול לחלוטין אפשרות שעדיין מדובר ב-AIH. לא כל אלה עם AIH מייצרים נוגדנים כנגד LKM-1 או כנגד SMA, כאשר כמה מהם מייצרים נוגדנים עצמיים אחרים שנבחנים רק לעתים נדירות.

הטיטר של הנוגדנים כנגד LKM-1 אינו משקף את חומרת התסמינים או את הפרוגנוזה של המחלה. טיטר הנוגדנים כנגד LKM-1 יכול להשתנות לאורך זמן. אלה המאובחנים עם AIH-2 עלולים לעתים לסבול בעת ובעונה אחת ממפגעים אוטואימוניים אחרים, כגון סוכרת או thyroiditis. מטופלים עם הפאטיטיס C כרונית יכולים לעתים לפתח סוג שונה של נוגדן כנגד LKM-1, שאינו מתגלה בשיטות הבדיקה הרגילות לנוגדן זה, ואין נוהגים בשגרת המעבדה לנסות ולגלותו.

נוגדנים כנגד LKM-1 משמשים כסמן ל-AIH-2, והם מופיעים באופן אופייני בהיעדר נוגדני SMA ו-ANA. הנוגדן כנגד LKM-1 מגיב עם רצף ליניארי קצר של האנטיגן הריקומביננטי cytochrome monooxygenase P450 2D6 (על פי Czaja ו-Homburger ב-Gastroenterology משנת 2001). מאובחנים עם AIH-2 נוטים להיות צעירים יותר, נשים, אשר תסמיני מחלתם חמורים, אך גם כאלה המגיבים טוב לטיפול המדכא את מערכת החיסון.

מתי מתבצעת הבדיקה לנוכחות נוגדנים כנגד LKM-1?

רמת הנוגדנים כנגדLKM-1 נקבעת במסגרת הערכה של מטופלים עם מחלת כבד ללא אטיולוגיה ברורה. בדיקה זו נדרשת בעיקר במקביל לבדיקת נוכחות הנוגדנים מסוג SMA או ANA, על מנת לסייע באבחון של AIH, ולהבדיל בין 2 הסוגים העיקריים של הפאטיטיס אוטו-אימונית, type 1 ו-type 2. מבחנים אלה יכולים להתבצע במסגרת מעקב אחר ממצאי כבד בלתי תקינים, כגון רמות מוגברות באופן עיקש של 2 אנזימי הטרנסאמינאז ALT ו-AST, או של בילירובין. מבחנים אחרים שיש להביא בחשבון ביצועם באותו הקשר, הם מדידת רמת אימונוגלובולינים, שכן האחרונים בדרך כלל מוגברים ב-AIH אך אינם מוגברים בהפאטיטיס נגיפית.
== הוראות לביצוע הבדיקה ==
אין צורך להיות בצום. יש לדגום דם למבחנה כימית (פקק אדום או צהוב) ולאחר סרכוז והפרדת הנסיוב יש להעבירו במבחנה מקוררת למעבדה. ניתן לשמור את הנסיוב עד 4 ימים בטמפרטורת החדר, עד 21 יום בקירור, או 40 יום בהקפאה. אין לקבל דגימות נסיוב בדרגת המוליזה, ליפמיה או איקטֶריה גבוהות, אך ניתן לבדוק דגימות אלה בדרגות המוליזה, ליפמיה ואיקטריה מתונות.

נוגדנים עצמיים כנגד tyrosine phosphatase IA-2

2015-10-01T04:19:40Z

בן עמי סלע:

== נוגדנים עצמיים כנגד tyrosine phosphatase IA-2 ==
כינויים נוספים:anti-IA2 antibodies ;IA-2 ; IA-2A ;Islet Antigen 2 (IA-2) ;Islet Cell autoantibody ;Islet Cell Antigen (ICA) 512 ; Tyrosine Phosphatase-Like autoantibodies ;tyrosine phosphatase-related islet antigen 2S ;Insulinoma-Associated-2 autoantibodies.
טווח ערכים תקין: 0.0-0.8 יחי'/מ"ל. ערך שמעל 0.8 יחי'/מ"ל נחשבים חיוביים לנוגדנים עצמיים כנגד IA-2. בערכים מולאריים תחום הנורמה שווה או קטן מ-0.02 ננומול'/ליטר. יוצר הערך: פרופ' בן-עמי סלע.

מטרת הבדיקה:

תגובה סרולוגית חיובית של נוכחות נוגדנים כנגד IA-2 (מעל 0.02 ננומול' לליטר), משמשת להבדלה קלינית בין 2 סוגי סוכרת, type 1 ו-type 2. זיהוי נבדקים הנמצאים בסיכון לסוכרת type 1 (כולל קרובי משפחה בסיכון גבוה של חולי סוכרת). ניבוי של צורך עתידי בטיפול באינסולין במבוגרים בתחילת שלב התסמינים הקליניים של סוכרת.

הגילוי של IA-2, יעד מרכזי לנוגדנים עצמיים בסוכרת:

IA-2 או islet antigen-2, בודד בעת ובעונה אחת אם כי באופן בלתי תלוי על ידי מספר קבוצות: לראשונה על ידי סריקה של ספריה של ביטוי אנטיגנים של איי הלבלב (ואז ניתן לו הכינוי ICA512) על ידי Rabin וחב' ב-J Immunol משנת 1994, ולאחר מכן על ידי שיבוט וסריקה של ספריית אנטיגנים של אינסולינומה באדם, שאז הוא הוגדר כ-Insulinoma-aasociated protein-2 או IA-2 , חלבון בעל 979 חומצות אמינו עם משקל מולקולארי של 105,847 דלטון, שעל פי Lan וחב' ב-DNA Cell Biol משנת 1994 הוא בעל דמיון רב ל-ICA 512, כאשר שני חלבונים אלה נבדלים רק בחסר של 388 חומצות אמינו בקצה ה-N טרמינאלי, ובחסר של 65 חומצות אמינו בקצה ה-N-טרמינאלי.

אנטיגן זה התברר כמולקולה הדומה לאנזים PTP או protein tyrosine phosphatase שהיה חסר פעילות אנזימטית, כתוצאה ממספר שחלופים של חומצות אמינו באתרים משומרים של החלבון, וחלבון זה מבוטא בעיקר בתאים נוירו-אנדוקריניים הן במערכת העצבים המרכזית והן באיי לנגרהנס בבלוטת הלבלב. הגן המקודד ל-IA-2 מופה לכרומוזום 2q35. זבשני סוגי התאים, אנטיגן זה מעוגן בממברנה של גרנולות מפרישות אינסולין, והנוגדנים מכוונים בעיקר כנגד המקטע התוך-תאי של IA-2, המורכב מרצף חומצות אמינו 601-979 החודר לציטופלזמת התאים, ונחשף רק התרחיש של נזק בתא הנוירו-אנדוקריני.

תפקידו של IA-2 נותר עדיין בלתי ברור, אך מחקרים in vitro במודלים של עכברים סיפקו ראיות לתפקיד אפשרי של IA-2 בהאצת הפרשת אינסולין. תאים באיי לנגרהנס מבטאים גם באופן דיפרנציאלי צורת ICA512 החסרה את המקטעים הטרנס –ממברנאלי והג'וֹקסְטָה-ממברנאלי (רצף חומצות אמינו 557-629). אנטיגן פגום זה המכונה ICA512bdc, שימש את Verge וחב' בפיתוח מבחן נוגדנים , בעזרתו ניתן היה לנבא תרחיש של סוכרת type 1 בבני משפחה מדרגה ראשונה (ב-Diabetes משנת 1996). מייד לאחר מכן, Lu וחב' פרסמו ב-Proc Natl Acad Sci USA ב-1996 על גילוי מולקולה נוספת דמוית-PTP שכונתה phogrin או IA-2β, שהייתה דומה בהיבטים רבים ל-IA-2 בעיקר במיקומה הממברנאלי ובמבנה התוך-תאי שהראה זהות של 74% עם זה של IA-2. גם IA-2β אינו פעיל אנזימטית.

נוגדנים עצמיים כנגד IA-2 נמצאים ב-80% מהילדים והנערים בשעת אבחונים כלוקים בסוכרת type 1. בלמעלה מ-90% מהילדים עם סוכרת נמצאים נוגדנים עצמיים לפחות לאחד משני האנטיגנים IA-2 או GAD בהופעת המחלה. האנטיגן IA-2A בדרך כלל מתפתח מאוחר יותר בתהליך המוביל לסוכרת type 1, ולכן שני אנטיגנים אלה (IA-2 ו-IA-2a, שכיחים פחות בנבדקים עם סיכרת type 1 מעל גיל 30 שנה, והם פחות שימושיים מאשר GAD לאפיון סוכרת בחולי סוכרת מבוגרים יותר.

פיתוח המבדק של נוגדנים כנגד IA-2:

החשיבות של נוגדנים עצמיים למשפחת המולקולות מסוג IA-2 לניבוי של התפתחות סוכרת הודגמה עוד לפני שנלמדו הרצפים של IA-2 ו-IA-2β. כבר ב-1982 פרסם Baekkeskov ב-Nature שימוש בטכניקה של immuno-precipitation של תמציות איי לבלב על ידי נוגדנים עצמיים לקוחים מנסיוב של ילדים חולי סוכרת. מחקרים בראשית שנות ה-90 הראו בשיטת immuno-precipitation של lysate מתאי אינסולינומה עם דגימות נסיוב של חולי סוכרת type 1, שניתן היה להשקיע חלבון במשקל מולקולארי של 64 אלף דלטון, שלאחר טיפול בטריפסין הופיעו שני מקטעים במשקלים מולקולאריים של 37 אלף ו-40 אלף דלטון (Christie וחב' ב-Diabetes משנת 1992). למרות שהזהות של 2 מקטעים אלה הייתה מעורפלת בהתחלה, מחקרים נוספים גילו ש-IA-2 הוא קודמן (precursor) של המקטע בגודל 40 אלף דלטון, ואילו IA-2β הוא הקודמן של המקטע במשל מולקולארי של 37 אלף דלטון.

נוגדנים עצמיים ל-IA-2 ו-IA-2β נמצאו ברוב המטופלים שאובחנים זה עתה עם סוכרת type 1, בהשוואה לגילוי נוגדנים אלה בפחות מ-2% של האנשים הבריאים. המבדק הנותן את התוצאות הטובות ביותר בהיבט של ספציפיות, רגישות והדירוּת הואimmuno-precipitation תוך שימוש ב-Protein A Sepharose של IA-2ic רקומביננטי מסומן רדיואקטיבית עם 35-S, שהוכן במערכת in vitro של תרגום ושעתוק. מספר פאנלים בינלאומיים, כגון DASP או Diabetes Autoantibody Standardization Program, עסקו בהערכה וסטנדרטיזציה של שיטות מדידה שונות ברחבי העולם. בסקירה זו נמצא שמדידות IA-2A ו-IA-2β היו בעלי רגישות גבוהה (66% ו-53%) וספציפיות גבוהה, בהתאמה (Bingley ב-Diabetes משנת 2003). בין השיטות השונות דווקא שיטת ELISA פחות טובה, וההשערה היא שבמהלך ביצוע ELISA חלים שינויי מבנה שלישוני באפיטופים החיוניים לקישור הנוגדן, וזאת בשל פגיעה בקשרים הדו-סולפידיים בחלבון.

כבר בשלב מחקרים מוקדם נמצא שהנוגדנים העצמיים בנסיוב של חולי סוכרת type 1, הגיבו באופן בררני עם המקטעים התוך תאיים של IA-2 ו-IA-2β, ושלא כצפוי הגיבו עם המקטעים החוץ-תאיים של אנטיגנים אלה. בחלבונים IA-2ic ו-IA-2β1c, האפיטופים האנטיגניים ממוקמים בקצה ה-C טרמינאלי, כאשר רק 40% מהנסיוב מגיבים עם הקצה ה-N-טרמינאלי במקרה של IA-2. בשילוב עם נוגדנים עצמיים נוספים כנגד איי לנגרהנס, הגילוי של IA-2 נמצא בשימוש נרחב לסייע בקביעת סוג הסוכרת, ולזהות נבדקים ברמת סיכון לחלות בסוכרת.

תפקידו של IA-2 בפתוגנזה ובסיווג המחלה:

IA-2 יכול להוות יעד ראשוני של תהליך חיסוני שעלול להרוס תאי-איים מייצרי אינסולין. לחילופין, IA-2 יכול להתפתח כפועל יוצא של הרס תאים אלה, תוך שחרור וחשיפת האנטיגן IA-2 תוך השריית תגובה חיסונית. IA-2A מופיעים תמיד במקבים לנוגדנים עצמיים אחרים בסוכרת אוטו-אימונית. השכיחות של הופעת נוגדנים עצמיים כנגד IA-2 דומה בארה" ובאירופה, והיא נעה בין 60-80% מהמקרים המאובחנים החדשים של סוכרת type 1, ובדומה לנוגדנים כנגד ICA, שכיחותם פוחתת בערך ל- 45% מאלה המאובחנים עם סוכרת זו מעל גיל 20 שנה. שכיחותם של הנוגדנים מסוג IA-2A משתנה לא רק עם הגיל, אלא גם עם ה-HLA, והיא גבוהה ביותר במטופלים הנושאים את הגנוטיפים HLA-DR4 ו- (HLA DQA10301-DQB10302 (DQ8, (על פי Hawa וחב' ב-Diabetes משנת 1997, ו-Gorus וחב' ב-Diabetologia מאותה שנה).

יש גם ראיות לכך שהופעת נוגדנים עצמיים ל-IA-2 מתרחשת עד מספר שנים לאחר אבחון סוכרת, אך רמת נוגדנים אלה דועכת במהירות לאחר מכן, שלא בדומה לנוגדנים כנגד GAD, שרמתם עולה עם הגיל. גורמים הכרוכים משמעותית עם משך תקופת הפוגה קלינית הם גיל, מגדר, חיוביות של ICA ורמה גבוהה התחלתית של HbA1C, בעוד שנוכחות של נוגדנים עצמיים ל-IA-2 היא חסרת השפעה. במקרה של IA-2β, בערך ב- 35-50% מנבדקים מאובחנים זה-עתה עם סוכרת מופיעים נוגדנים כנגד IA-2β, בהשוואה לפחות מ-1% מנבדקי ביקורת בריאים. מעל 95% של נסיובים סוכרתיים המגיבים עם IA-2β, מגיבים גם עם IA-2, אך רק 50-80% מהנסיובים המגיבים עם IA-2, מגיבים גם עם IA-2β, מה שמרמז לכך ששתי המולקולות מכילות אפיטופים ייחודיים.

IA-2 בניבוי של סוכרת type 1:

המאמץ לנבא סוכרת type 1, כדי לנסות ולשנות את מהלך המחלה, התמקד בנוגדנים עצמיים, שכן למידת השינויים בתאי T קשה יותר ופחות ספציפית. מספר מחקרים הדגימו את הערך המנבא של ICA, אך זה כרוך ונטילת חומר רקמתי מבלוטת הלבלב, ויש לו מגבלות טכניות משמעעותיות. מדידת IA-2A משלימה את מדידת GADA, כאשר למעלה מ-90% מהילדים מכילים נוגדנים לפחות לאחד מחלבונים אלה בהופעת סוכרת. גילוי נוגדנים ל-IA-2 ול-GAD תורם משמעותית להופעת ICA (על פי Kulmala וחב' ב-J Clin Invest משנת 1998). כיוון ש-2 נוגדנים עצמיים כנגד IA-2 ו-GAD מאוד שכיחים באנשים טרם הופעת המחלה (pre-diabetics), וניתנים לגילוי בשיטות ריקומבינציה רגישות, הם נמצאים היום בשימוש נרחב בבדיקות סריקה של אוכלוסיות, ביחד עם IAA, IA-2βA וכן עם הנוגדן החדש יחסית כנגד ZnT8.

(להכניס כאן את התרשים)

מספר מחקרים על פוטנציאל הניבוי של IA-2A מצאו ספציפיות ורגישות גבוהות, כמו גם ערך ניבוי חיובי (ppv), להתפתחות סוכרת בתאומים זהים (בכול אחת משלושת הקטגוריות מעל 90%), ובקרובי משפחת מדרגה ראשונה נמצא ppv של 5 שנים בתחום שבין 65-85%. למרות ש-IA-2A הוא בעל ערך ניבוי חיובי גבוה, הסכנה בהתפתחות סוכרת עולה כאשר מספר נוגדנים עצמיים כנגדי איי הבלוטה מתגלים, לכן שילוב נוכחותם של מספר נוגדנים נחשב לסמן המנבא הטוב ביותר. יחד עם זאת קיימת הסכמה שנוכחות IA-2A לבדו או בשילוב עם נוכחות נוגדנים עצמיים נוספים, מצביעה על עלייה בסיכון של התקדמות השלב הקדם-קליני לשלב הקליני (Decochez וחב' ב-Diabetologia משנת 2002). מוצע שיצירת IA-2A תואמת את השלב הקריטי בהתקדמות התהליך הפתולוגי, כאשר המקטע התוך תאי β נחשף למערכת החיסון, על פני התאים כאשר תאי β ניזוקים. זו גם הסיבה ש-IA-2A מופיעים בנסיוב יחסית מאוחר בשלב הקדם-קליני לפני הופעת סוכרת type 1, והם קשורים בהופעתם לשלב קצר ומהיר יחסית לקראת התפרצות המחלה (Achenbach וחב' ב-diabetes משנת 2004).

יתרה מכך, בשלב זה יש ל-IA-2A נטייה ליצור צבר (cluster) עם הנוגדנים IA-2βA ו- ZnT8A, ולאשר על ידי כך ביתר שאת ובגישות אבחונית גבוהה יותר את ההתפתחות המהירה לקראת סוכרת. מחקר מפורט יותר של התגובה החיסונית ההוּמוֹראלית, הראה שנוגדנים בשלב המקדים של המחלה היו מכוונים כנגד מקטע הג'וּקסטָה-ממברנאלי של IA-2ic, בעוד שבעת אבחון המחלה שולטים הנוגדנים כנגד אפיטופים רבים של אזורי ה-PTP של IA-2 ו-IA-2β, בעיקר בילדים ובנערים.

ארבעת המבדקים השכיחים ביותר המשמשים להבדיל בין סוכרת type 1, לבין סוכרת הנגרמת מסיבות שונות, מסוכמים בטבלה למטה:

נוגדנים כנגד תאי בטא, כנגד אינסולין או כנגד glutamic acid decarboxylase מסייעים לזהות את אלה עם סוכרת type 1 אוטואימונית. נוגדנים כנגד GAD65 נחשבים על ידי רוב הדיאבטולוגים כסמן הספציפי ביותר, כאשר ב- 70-80% מאלה עם סוכרת type 1 מופיע סוג נוגדנים זה עוד לפני הופעת התסמינים הקליניים או ממש עם הופעתם. באנשים בריאים נוגדנים ל-GAD, מופיעים בפחות מ-3% (על פי Bonifacio וחב' ב-Acta Diabetol משנת 1997). כאשר מודדים במשולב רמת נוגדנים ל-GAD ול-ICA, ניתן לגלות למעלה מ-90% מהחולים בסוג סוכרת זה. הנוגדנים ל-IA2, הם למעשה בין האחרונים שהתגלו ברשימת נוגדנים זו, כאשר הנוגדן האחרון בסדרה הוא הנוגדן כנגד ZnT8A.

זיהוי של protein tyrosine phosphatase-like IA2 או islet cell antigen 512 כאוטו-אנטיגן התלוי באינסולין המופיע בסוכרת כ-2 מקטעים בני 37 ו-40 אלף דלטון, המשמש יעד לנוגדנים בתאי איי לנגרהנס (Bonifacio וחב' ב-J Immunol משנת 1995):

ממצא מוקדם מאוד היה שהתגובה החיסונית ביצירת נוגדנים עצמיים מתחילה זמן רב מאוד לפני התפתחות סוכרת ממש. ממצא זה מוכיח שגם בנוכחות נוגדנים עצמיים אלה, קיים "חלון הזדמנויות" גדול, בו ניתן לעכב הופעת סוכרת type 1, אם וכאשר יהיה טיפול יעיל להאט את התפתחות המחלה או את הפגיעה האפשרית של נוגדנים אלה בתאי β.

נוגדנים עצמיים שמוצאים בילדים, שונים לרוב מאלה שמוצאים במבוגרים. IAA הוא בדרך כלל הסמן המוקדם שמופיעים בילדים, ועם התפתחות המחלה סמן זה עשוי להיעלם, כאשר ICA, GADA ו-IA-2A הופכים משמעותיים יותר. IA-2A חיובי באופן פחות שכיח בהופעה של סוכרת type 1, בהשוואה ל-GADA ול-ICA. בעוד שבערך 50% מהילדים עם הופעת סוכרת type 1 חיוביים ל-IAA, במבוגרים לא שכיחה חיוביות של IAA. מבדקים של נוגדנים עצמיים אלה יכולים לסייע כאשר האבחנה אינה ברורה באלה שאובחנו עם סוכרת type 2, אך חווים קשיים בשליטה על רמות גלוקוזה בטיפולים המקובלים.

מהי משמעות תוצאת בדיקות אלה? אם ICA, GADA ו-IA-2A נמצאים בנסיוב של מבוגר עם תסמיני סוכרת, יש אישור לקיומה של סוכרת type 1. באותה מידה, אם IAA נמצא בילד עם סוכרת שאינו מטופל באינסולין, הסוכרת במקרה זה אף היא type 1. אם לא מתגלים נוגדנים עצמיים, אין כל סבירות שמדובר בסוכרת type 1. אחדים מהמאובחנים עם סוכרת type 1 אינם מפתחים נוגדנים עצמיים הניתנים לגילוי כנגד איי הלבלב, אך זהו מצב נדיר. נוגדנים עצמיים כנגד איי הבלוטה יכולים להתגלות גם באלה עם מפגעים אוטו-אימוניים אנדוקריניים נוספים, כגון Hashimoto thyroiditis או autoimmune Addison disease.

מדידת נוכחות בנסיוב של נוגדנים עצמיים בנבדקים לא-סוכרתיים מומלצת רק למטרות מחקר, או בשימוש לנסות ולנבא התפתחות סוכרת type 1 בבני משפחה של חולים ידועים במחלה. באופן ספציפי יותר, בני משפחה מדרגה ראשונה של חולים בסוכרת type 1, בהם מוצאים ICA ותגובה חלשה של הפרשת אינסולין בתגובה להזרקה תוך-ורידית של גלוקוזה, סיכוייהם לפתח, סוכרת type 1 בפרק זמן של 5 שנים מאז הבדיקה, גדול מ-50%. כיוון שנכון להיום, אין טיפולים יעילים למנוע הופעת סוכרת type 1, אין המלצה לבצע בדיקות סריקה באוכלוסייה לאתר את אלה עם נוגדנים עצמיים, ואף אין המלצה לבצע בדיקות אלה בבני משפחה של חולי סוכרת type 1, אלא אם כן מדובר במחקר קליני בלבד.

מטופלים בהזרקות אינסולין, יכולים להתחיל לפתח נוגדנים כנגד האינסולין האקסוגני. כיוון שבדיקת IAA אינה מבחינה בין סוג זה של נוגדנים לבין נוגדנים כנגד האינסולין האנדוגני, אין להשתמש בבדיקה זו במי שכבר הוזרק עם אינסולין. לדוגמה, נבדקים שהיו חשודים כסוכרתיים type 2, והיו מטופלים בהזרקות אינסולין, אינם יכולים להיעזר במדידת נוגדנים העצמיים כנגד תאי β, על מנת לקבוע אם הם סוכרתיים type 1.

הערה: תוצאות שליליות של נוגדנים כנגד IA-2 אינם שוללות אבחון עתידי של סוכרת type 1 או סיכון עתידי להתפתחות סוכרת זו. הסיכון להופעת סוכרת type 1, יכול להיות מוערך על ידי מדידת רמת נוגדנים כנגד אינסולין, כנגדGAD או כנגד zinc transporter 8 הידוע כ-ZnT8, וכן על ידי בחינת סמנים גנטיים כגון HLA. ניטור רמות היפר-גליקמיה נחשב נתון מרכזי בקביעת הצורך לטיפול באינסולין.

ממצאים שונים לגבי IA-2 ביחס לסמנים האחרים בסוכרת:

בשנת 2003 פרסמו Plodkowski ו-Shane ב-Diabetes & Endocrinology את התייחסותם לאבחנה בין סוכרת type 1 ו-type 2. בעבר היה מקובל להעריך שילדים ובני נוער בהם מאובחת קטואצידוזיס סוכרתית, זו נגרמת מהרס של תאי בטא הפנקראטיים מייצרי אינסולין, וצעירים אלה הוגדרו כלוקים בסוכרת type 1. לעומת זאת, מבוגרים באמצע שנותיהם נחשבו לכאלה המפתחים עמידות לאינסולין הגורמת לאי-סבילות (intolerance) לגלוקוזה, ולכן הוגדרו כלוקים בסוכרת type 2. ברבים מהלוקים בסוכרת type 1 עלול להופיע תרחיש של ketoacidosis, אם כי גם באחוז קטן יותר של אלה עם סוכרת type 2 עלול להופיע תרחיש זה.

נוגדנים לשני הפרגמנטים (37kD ו-40kD) שהם תוצרי פירוק טריפטי של חלבון ממברנאלי בלתי מזוהה של תאים של איי הלבלב, השונה מ-GAD. לאחרונה, דווח על נוגדנים עצמיים כנגד ICA512, הזהה לחלבון tyrosine phosphatase-like protein IA-2, ומחקרם של Bonifacio וחב' נועד לבחון האם IA2/ICA512 הוא בעל הספציפיות האנטיגנית כנגדה פועלים הנוגדנים ל-2 המקטעים 37K ו-40k, כמו גם אחת הדטרמיננטות כנגדה פועלים נוגדנים כנגד תאי איי הלבלב. בניסוי זה, השתתפו 100 חולי סוכרת IDDM שאובחנו לאחרונה, והנסיובים של 51 מתוכם השקיעו ב-assay של אימונו-פרציפיטציה את הפפטידים 37K ו/או 40K, בעוד שנסיובים של 53 מתוכם השקיעו IA2 ריקומביננטי שתורגם in vitro, ונסיובים של 49 מתוכם הכילו נוגדנים הן לפפטידים 37K/40K, כמו גם ל-IA2 הריקומביננטי. נמצא מתאם חזק בין רמות הנוגדנים ל-IA2 הריקומביננטי, לבין רמות הנוגדנים כנגד הפפטיד 40 אלף דלטון (r=0.85 ו-p<0,0001), לבין רמת הנוגדנים כנגד 37 אלף דלטון (r=0.70 ו-p<0.0001).

טיפול בטריפסין של IA2 ריקומביננטי שהושקע, הביא לקבלת מקטעי 37K ו-40K,ואילו אינקובציה מוקדמת של הנסיובים עם IA2 ריקומביננטי, עיכבה לחלוטין את קישור הנוגדנים למקטעי 37K ו-40K. מסקנות מחקר זה מזהות את IA2/ICA512 כקודמנים (precursors) של האוטו-אנטיגנים 37K ו-40K של איי הלבלב. גילוי משולב של נוגדנים ל-IA2 ול-GAD65 בנסיוב זיהה 88 מתוך 100 חולי סוכרת מסוג IDDM.

נוגדנים עצמיים ומגדר:

ילדות וילדים הם בעלי סיכון דומה לפתח סוכרת type 1, אך גברים נמצאים בסיכון מוגבר לפתח תרחיש זה מאשר נשים. כדי להבין מה הסיבה לשוני מגדרי זה בסיכון למחלה, נבחנו נוגדנים עצמיים על בסיס מגדר במדגם ENDIT בו נכללו קרובי משפחה של חולי סוכרת type 1. נמצא שבילדים ובנערים הסיכוי למצוא ICA גדול יותר מאשר בילדות ובנערות.
עיקרון שיטת המבדק:

המבדק משתמש ביכולת של נוגדנים ל-IA-2 הפועלים באופן דו-ולנטי ויוצרים גשר בין החלבון IA-2 הספוח לבארות של microplate לבין הפאזה הנוזלית של הקומפלקסIA-2-biotin . בשלב הראשון הנוגדנים כנגד IA-2 המופיעים בנסיוב הנבדק, נקשרים לחלבון זה הספוח על הפלטה. בשלב השני, IA-2-biotin נקשר לקומפלקס זה. כמות ה-IA-2-biotin נמצאת במתאם עם כמות הנוגדנים כנגד IA-2 שנמצאים בנסיוב של הנבדק. בשטיפות של ה-microplate מורחק ה-IA-2-biotin שלא נקשר, כאשר יתרת IA-2-biotin הקשור ניתנת לכימות על ידי הוספה של Streptavidin-peroxidase וסובסטרט כרומוגני כגון TMB או trimethylbenzidine, כאשר ה-OD של הצבע הצהוב המתפתח נמדד באורך גל של 450 ננומטר.

== הוראות לביצוע הבדיקה ==
יש ליטול דם במבחנה כימית (פקק אדום או צהוב) ולשלוח למעבדה בהקדם בקירור. אין לבצע את הבדיקה בדימות נסיוב המוליטיות או ליפמיות או איקטריות באופן בולט, אם כי ניתן לקבל דגימות בהם שלושת הפרמטרים הללו מתונים. לאחר הפרדת הנסיוב מהתאים בסרכוז, הדגימה יציבה בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות, בקירור למשך 28 יום, ובהקפאה למשך 2 חודשים.

נוגדנים עצמיים כנגד tyrosine phosphatase IA-2

2015-10-01T04:18:44Z

בן עמי סלע:

== נוגדנים עצמיים כנגד tyrosine phosphatase IA-2 ==
כינויים נוספים:anti-IA2 antibodies ;IA-2 ; IA-2A ;Islet Antigen 2 (IA-2) ;Islet Cell autoantibody ;Islet Cell Antigen (ICA) 512 ; Tyrosine Phosphatase-Like autoantibodies ;tyrosine phosphatase-related islet antigen 2S ;Insulinoma-Associated-2 autoantibodies.
טווח ערכים תקין: 0.0-0.8 יחי'/מ"ל. ערך שמעל 0.8 יחי'/מ"ל נחשבים חיוביים לנוגדנים עצמיים כנגד IA-2. בערכים מולאריים תחום הנורמה שווה או קטן מ-0.02 ננומול'/ליטר. יוצר הערך: פרופ' בן-עמי סלע.

מטרת הבדיקה:

תגובה סרולוגית חיובית של נוכחות נוגדנים כנגד IA-2 (מעל 0.02 ננומול' לליטר), משמשת להבדלה קלינית בין 2 סוגי סוכרת, type 1 ו-type 2. זיהוי נבדקים הנמצאים בסיכון לסוכרת type 1 (כולל קרובי משפחה בסיכון גבוה של חולי סוכרת). ניבוי של צורך עתידי בטיפול באינסולין במבוגרים בתחילת שלב התסמינים הקליניים של סוכרת.

הגילוי של IA-2: יעד מרכזי לנוגדנים עצמיים בסוכרת:

IA-2 או islet antigen-2, בודד בעת ובעונה אחת אם כי באופן בלתי תלוי על ידי מספר קבוצות: לראשונה על ידי סריקה של ספריה של ביטוי אנטיגנים של איי הלבלב (ואז ניתן לו הכינוי ICA512) על ידי Rabin וחב' ב-J Immunol משנת 1994, ולאחר מכן על ידי שיבוט וסריקה של ספריית אנטיגנים של אינסולינומה באדם, שאז הוא הוגדר כ-Insulinoma-aasociated protein-2 או IA-2 , חלבון בעל 979 חומצות אמינו עם משקל מולקולארי של 105,847 דלטון, שעל פי Lan וחב' ב-DNA Cell Biol משנת 1994 הוא בעל דמיון רב ל-ICA 512, כאשר שני חלבונים אלה נבדלים רק בחסר של 388 חומצות אמינו בקצה ה-N טרמינאלי, ובחסר של 65 חומצות אמינו בקצה ה-N-טרמינאלי.

אנטיגן זה התברר כמולקולה הדומה לאנזים PTP או protein tyrosine phosphatase שהיה חסר פעילות אנזימטית, כתוצאה ממספר שחלופים של חומצות אמינו באתרים משומרים של החלבון, וחלבון זה מבוטא בעיקר בתאים נוירו-אנדוקריניים הן במערכת העצבים המרכזית והן באיי לנגרהנס בבלוטת הלבלב. הגן המקודד ל-IA-2 מופה לכרומוזום 2q35. זבשני סוגי התאים, אנטיגן זה מעוגן בממברנה של גרנולות מפרישות אינסולין, והנוגדנים מכוונים בעיקר כנגד המקטע התוך-תאי של IA-2, המורכב מרצף חומצות אמינו 601-979 החודר לציטופלזמת התאים, ונחשף רק התרחיש של נזק בתא הנוירו-אנדוקריני.

תפקידו של IA-2 נותר עדיין בלתי ברור, אך מחקרים in vitro במודלים של עכברים סיפקו ראיות לתפקיד אפשרי של IA-2 בהאצת הפרשת אינסולין. תאים באיי לנגרהנס מבטאים גם באופן דיפרנציאלי צורת ICA512 החסרה את המקטעים הטרנס –ממברנאלי והג'וֹקסְטָה-ממברנאלי (רצף חומצות אמינו 557-629). אנטיגן פגום זה המכונה ICA512bdc, שימש את Verge וחב' בפיתוח מבחן נוגדנים , בעזרתו ניתן היה לנבא תרחיש של סוכרת type 1 בבני משפחה מדרגה ראשונה (ב-Diabetes משנת 1996). מייד לאחר מכן, Lu וחב' פרסמו ב-Proc Natl Acad Sci USA ב-1996 על גילוי מולקולה נוספת דמוית-PTP שכונתה phogrin או IA-2β, שהייתה דומה בהיבטים רבים ל-IA-2 בעיקר במיקומה הממברנאלי ובמבנה התוך-תאי שהראה זהות של 74% עם זה של IA-2. גם IA-2β אינו פעיל אנזימטית.

נוגדנים עצמיים כנגד IA-2 נמצאים ב-80% מהילדים והנערים בשעת אבחונים כלוקים בסוכרת type 1. בלמעלה מ-90% מהילדים עם סוכרת נמצאים נוגדנים עצמיים לפחות לאחד משני האנטיגנים IA-2 או GAD בהופעת המחלה. האנטיגן IA-2A בדרך כלל מתפתח מאוחר יותר בתהליך המוביל לסוכרת type 1, ולכן שני אנטיגנים אלה (IA-2 ו-IA-2a, שכיחים פחות בנבדקים עם סיכרת type 1 מעל גיל 30 שנה, והם פחות שימושיים מאשר GAD לאפיון סוכרת בחולי סוכרת מבוגרים יותר.

פיתוח המבדק של נוגדנים כנגד IA-2:

החשיבות של נוגדנים עצמיים למשפחת המולקולות מסוג IA-2 לניבוי של התפתחות סוכרת הודגמה עוד לפני שנלמדו הרצפים של IA-2 ו-IA-2β. כבר ב-1982 פרסם Baekkeskov ב-Nature שימוש בטכניקה של immuno-precipitation של תמציות איי לבלב על ידי נוגדנים עצמיים לקוחים מנסיוב של ילדים חולי סוכרת. מחקרים בראשית שנות ה-90 הראו בשיטת immuno-precipitation של lysate מתאי אינסולינומה עם דגימות נסיוב של חולי סוכרת type 1, שניתן היה להשקיע חלבון במשקל מולקולארי של 64 אלף דלטון, שלאחר טיפול בטריפסין הופיעו שני מקטעים במשקלים מולקולאריים של 37 אלף ו-40 אלף דלטון (Christie וחב' ב-Diabetes משנת 1992). למרות שהזהות של 2 מקטעים אלה הייתה מעורפלת בהתחלה, מחקרים נוספים גילו ש-IA-2 הוא קודמן (precursor) של המקטע בגודל 40 אלף דלטון, ואילו IA-2β הוא הקודמן של המקטע במשל מולקולארי של 37 אלף דלטון.

נוגדנים עצמיים ל-IA-2 ו-IA-2β נמצאו ברוב המטופלים שאובחנים זה עתה עם סוכרת type 1, בהשוואה לגילוי נוגדנים אלה בפחות מ-2% של האנשים הבריאים. המבדק הנותן את התוצאות הטובות ביותר בהיבט של ספציפיות, רגישות והדירוּת הואimmuno-precipitation תוך שימוש ב-Protein A Sepharose של IA-2ic רקומביננטי מסומן רדיואקטיבית עם 35-S, שהוכן במערכת in vitro של תרגום ושעתוק. מספר פאנלים בינלאומיים, כגון DASP או Diabetes Autoantibody Standardization Program, עסקו בהערכה וסטנדרטיזציה של שיטות מדידה שונות ברחבי העולם. בסקירה זו נמצא שמדידות IA-2A ו-IA-2β היו בעלי רגישות גבוהה (66% ו-53%) וספציפיות גבוהה, בהתאמה (Bingley ב-Diabetes משנת 2003). בין השיטות השונות דווקא שיטת ELISA פחות טובה, וההשערה היא שבמהלך ביצוע ELISA חלים שינויי מבנה שלישוני באפיטופים החיוניים לקישור הנוגדן, וזאת בשל פגיעה בקשרים הדו-סולפידיים בחלבון.

כבר בשלב מחקרים מוקדם נמצא שהנוגדנים העצמיים בנסיוב של חולי סוכרת type 1, הגיבו באופן בררני עם המקטעים התוך תאיים של IA-2 ו-IA-2β, ושלא כצפוי הגיבו עם המקטעים החוץ-תאיים של אנטיגנים אלה. בחלבונים IA-2ic ו-IA-2β1c, האפיטופים האנטיגניים ממוקמים בקצה ה-C טרמינאלי, כאשר רק 40% מהנסיוב מגיבים עם הקצה ה-N-טרמינאלי במקרה של IA-2. בשילוב עם נוגדנים עצמיים נוספים כנגד איי לנגרהנס, הגילוי של IA-2 נמצא בשימוש נרחב לסייע בקביעת סוג הסוכרת, ולזהות נבדקים ברמת סיכון לחלות בסוכרת.

תפקידו של IA-2 בפתוגנזה ובסיווג המחלה:

IA-2 יכול להוות יעד ראשוני של תהליך חיסוני שעלול להרוס תאי-איים מייצרי אינסולין. לחילופין, IA-2 יכול להתפתח כפועל יוצא של הרס תאים אלה, תוך שחרור וחשיפת האנטיגן IA-2 תוך השריית תגובה חיסונית. IA-2A מופיעים תמיד במקבים לנוגדנים עצמיים אחרים בסוכרת אוטו-אימונית. השכיחות של הופעת נוגדנים עצמיים כנגד IA-2 דומה בארה" ובאירופה, והיא נעה בין 60-80% מהמקרים המאובחנים החדשים של סוכרת type 1, ובדומה לנוגדנים כנגד ICA, שכיחותם פוחתת בערך ל- 45% מאלה המאובחנים עם סוכרת זו מעל גיל 20 שנה. שכיחותם של הנוגדנים מסוג IA-2A משתנה לא רק עם הגיל, אלא גם עם ה-HLA, והיא גבוהה ביותר במטופלים הנושאים את הגנוטיפים HLA-DR4 ו- (HLA DQA10301-DQB10302 (DQ8, (על פי Hawa וחב' ב-Diabetes משנת 1997, ו-Gorus וחב' ב-Diabetologia מאותה שנה).

יש גם ראיות לכך שהופעת נוגדנים עצמיים ל-IA-2 מתרחשת עד מספר שנים לאחר אבחון סוכרת, אך רמת נוגדנים אלה דועכת במהירות לאחר מכן, שלא בדומה לנוגדנים כנגד GAD, שרמתם עולה עם הגיל. גורמים הכרוכים משמעותית עם משך תקופת הפוגה קלינית הם גיל, מגדר, חיוביות של ICA ורמה גבוהה התחלתית של HbA1C, בעוד שנוכחות של נוגדנים עצמיים ל-IA-2 היא חסרת השפעה. במקרה של IA-2β, בערך ב- 35-50% מנבדקים מאובחנים זה-עתה עם סוכרת מופיעים נוגדנים כנגד IA-2β, בהשוואה לפחות מ-1% מנבדקי ביקורת בריאים. מעל 95% של נסיובים סוכרתיים המגיבים עם IA-2β, מגיבים גם עם IA-2, אך רק 50-80% מהנסיובים המגיבים עם IA-2, מגיבים גם עם IA-2β, מה שמרמז לכך ששתי המולקולות מכילות אפיטופים ייחודיים.

IA-2 בניבוי של סוכרת type 1:

המאמץ לנבא סוכרת type 1, כדי לנסות ולשנות את מהלך המחלה, התמקד בנוגדנים עצמיים, שכן למידת השינויים בתאי T קשה יותר ופחות ספציפית. מספר מחקרים הדגימו את הערך המנבא של ICA, אך זה כרוך ונטילת חומר רקמתי מבלוטת הלבלב, ויש לו מגבלות טכניות משמעעותיות. מדידת IA-2A משלימה את מדידת GADA, כאשר למעלה מ-90% מהילדים מכילים נוגדנים לפחות לאחד מחלבונים אלה בהופעת סוכרת. גילוי נוגדנים ל-IA-2 ול-GAD תורם משמעותית להופעת ICA (על פי Kulmala וחב' ב-J Clin Invest משנת 1998). כיוון ש-2 נוגדנים עצמיים כנגד IA-2 ו-GAD מאוד שכיחים באנשים טרם הופעת המחלה (pre-diabetics), וניתנים לגילוי בשיטות ריקומבינציה רגישות, הם נמצאים היום בשימוש נרחב בבדיקות סריקה של אוכלוסיות, ביחד עם IAA, IA-2βA וכן עם הנוגדן החדש יחסית כנגד ZnT8.

(להכניס כאן את התרשים)

מספר מחקרים על פוטנציאל הניבוי של IA-2A מצאו ספציפיות ורגישות גבוהות, כמו גם ערך ניבוי חיובי (ppv), להתפתחות סוכרת בתאומים זהים (בכול אחת משלושת הקטגוריות מעל 90%), ובקרובי משפחת מדרגה ראשונה נמצא ppv של 5 שנים בתחום שבין 65-85%. למרות ש-IA-2A הוא בעל ערך ניבוי חיובי גבוה, הסכנה בהתפתחות סוכרת עולה כאשר מספר נוגדנים עצמיים כנגדי איי הבלוטה מתגלים, לכן שילוב נוכחותם של מספר נוגדנים נחשב לסמן המנבא הטוב ביותר. יחד עם זאת קיימת הסכמה שנוכחות IA-2A לבדו או בשילוב עם נוכחות נוגדנים עצמיים נוספים, מצביעה על עלייה בסיכון של התקדמות השלב הקדם-קליני לשלב הקליני (Decochez וחב' ב-Diabetologia משנת 2002). מוצע שיצירת IA-2A תואמת את השלב הקריטי בהתקדמות התהליך הפתולוגי, כאשר המקטע התוך תאי β נחשף למערכת החיסון, על פני התאים כאשר תאי β ניזוקים. זו גם הסיבה ש-IA-2A מופיעים בנסיוב יחסית מאוחר בשלב הקדם-קליני לפני הופעת סוכרת type 1, והם קשורים בהופעתם לשלב קצר ומהיר יחסית לקראת התפרצות המחלה (Achenbach וחב' ב-diabetes משנת 2004).

יתרה מכך, בשלב זה יש ל-IA-2A נטייה ליצור צבר (cluster) עם הנוגדנים IA-2βA ו- ZnT8A, ולאשר על ידי כך ביתר שאת ובגישות אבחונית גבוהה יותר את ההתפתחות המהירה לקראת סוכרת. מחקר מפורט יותר של התגובה החיסונית ההוּמוֹראלית, הראה שנוגדנים בשלב המקדים של המחלה היו מכוונים כנגד מקטע הג'וּקסטָה-ממברנאלי של IA-2ic, בעוד שבעת אבחון המחלה שולטים הנוגדנים כנגד אפיטופים רבים של אזורי ה-PTP של IA-2 ו-IA-2β, בעיקר בילדים ובנערים.

ארבעת המבדקים השכיחים ביותר המשמשים להבדיל בין סוכרת type 1, לבין סוכרת הנגרמת מסיבות שונות, מסוכמים בטבלה למטה:

נוגדנים כנגד תאי בטא, כנגד אינסולין או כנגד glutamic acid decarboxylase מסייעים לזהות את אלה עם סוכרת type 1 אוטואימונית. נוגדנים כנגד GAD65 נחשבים על ידי רוב הדיאבטולוגים כסמן הספציפי ביותר, כאשר ב- 70-80% מאלה עם סוכרת type 1 מופיע סוג נוגדנים זה עוד לפני הופעת התסמינים הקליניים או ממש עם הופעתם. באנשים בריאים נוגדנים ל-GAD, מופיעים בפחות מ-3% (על פי Bonifacio וחב' ב-Acta Diabetol משנת 1997). כאשר מודדים במשולב רמת נוגדנים ל-GAD ול-ICA, ניתן לגלות למעלה מ-90% מהחולים בסוג סוכרת זה. הנוגדנים ל-IA2, הם למעשה בין האחרונים שהתגלו ברשימת נוגדנים זו, כאשר הנוגדן האחרון בסדרה הוא הנוגדן כנגד ZnT8A.

זיהוי של protein tyrosine phosphatase-like IA2 או islet cell antigen 512 כאוטו-אנטיגן התלוי באינסולין המופיע בסוכרת כ-2 מקטעים בני 37 ו-40 אלף דלטון, המשמש יעד לנוגדנים בתאי איי לנגרהנס (Bonifacio וחב' ב-J Immunol משנת 1995):

ממצא מוקדם מאוד היה שהתגובה החיסונית ביצירת נוגדנים עצמיים מתחילה זמן רב מאוד לפני התפתחות סוכרת ממש. ממצא זה מוכיח שגם בנוכחות נוגדנים עצמיים אלה, קיים "חלון הזדמנויות" גדול, בו ניתן לעכב הופעת סוכרת type 1, אם וכאשר יהיה טיפול יעיל להאט את התפתחות המחלה או את הפגיעה האפשרית של נוגדנים אלה בתאי β.

נוגדנים עצמיים שמוצאים בילדים, שונים לרוב מאלה שמוצאים במבוגרים. IAA הוא בדרך כלל הסמן המוקדם שמופיעים בילדים, ועם התפתחות המחלה סמן זה עשוי להיעלם, כאשר ICA, GADA ו-IA-2A הופכים משמעותיים יותר. IA-2A חיובי באופן פחות שכיח בהופעה של סוכרת type 1, בהשוואה ל-GADA ול-ICA. בעוד שבערך 50% מהילדים עם הופעת סוכרת type 1 חיוביים ל-IAA, במבוגרים לא שכיחה חיוביות של IAA. מבדקים של נוגדנים עצמיים אלה יכולים לסייע כאשר האבחנה אינה ברורה באלה שאובחנו עם סוכרת type 2, אך חווים קשיים בשליטה על רמות גלוקוזה בטיפולים המקובלים.

מהי משמעות תוצאת בדיקות אלה? אם ICA, GADA ו-IA-2A נמצאים בנסיוב של מבוגר עם תסמיני סוכרת, יש אישור לקיומה של סוכרת type 1. באותה מידה, אם IAA נמצא בילד עם סוכרת שאינו מטופל באינסולין, הסוכרת במקרה זה אף היא type 1. אם לא מתגלים נוגדנים עצמיים, אין כל סבירות שמדובר בסוכרת type 1. אחדים מהמאובחנים עם סוכרת type 1 אינם מפתחים נוגדנים עצמיים הניתנים לגילוי כנגד איי הלבלב, אך זהו מצב נדיר. נוגדנים עצמיים כנגד איי הבלוטה יכולים להתגלות גם באלה עם מפגעים אוטו-אימוניים אנדוקריניים נוספים, כגון Hashimoto thyroiditis או autoimmune Addison disease.

מדידת נוכחות בנסיוב של נוגדנים עצמיים בנבדקים לא-סוכרתיים מומלצת רק למטרות מחקר, או בשימוש לנסות ולנבא התפתחות סוכרת type 1 בבני משפחה של חולים ידועים במחלה. באופן ספציפי יותר, בני משפחה מדרגה ראשונה של חולים בסוכרת type 1, בהם מוצאים ICA ותגובה חלשה של הפרשת אינסולין בתגובה להזרקה תוך-ורידית של גלוקוזה, סיכוייהם לפתח, סוכרת type 1 בפרק זמן של 5 שנים מאז הבדיקה, גדול מ-50%. כיוון שנכון להיום, אין טיפולים יעילים למנוע הופעת סוכרת type 1, אין המלצה לבצע בדיקות סריקה באוכלוסייה לאתר את אלה עם נוגדנים עצמיים, ואף אין המלצה לבצע בדיקות אלה בבני משפחה של חולי סוכרת type 1, אלא אם כן מדובר במחקר קליני בלבד.

מטופלים בהזרקות אינסולין, יכולים להתחיל לפתח נוגדנים כנגד האינסולין האקסוגני. כיוון שבדיקת IAA אינה מבחינה בין סוג זה של נוגדנים לבין נוגדנים כנגד האינסולין האנדוגני, אין להשתמש בבדיקה זו במי שכבר הוזרק עם אינסולין. לדוגמה, נבדקים שהיו חשודים כסוכרתיים type 2, והיו מטופלים בהזרקות אינסולין, אינם יכולים להיעזר במדידת נוגדנים העצמיים כנגד תאי β, על מנת לקבוע אם הם סוכרתיים type 1.

הערה: תוצאות שליליות של נוגדנים כנגד IA-2 אינם שוללות אבחון עתידי של סוכרת type 1 או סיכון עתידי להתפתחות סוכרת זו. הסיכון להופעת סוכרת type 1, יכול להיות מוערך על ידי מדידת רמת נוגדנים כנגד אינסולין, כנגדGAD או כנגד zinc transporter 8 הידוע כ-ZnT8, וכן על ידי בחינת סמנים גנטיים כגון HLA. ניטור רמות היפר-גליקמיה נחשב נתון מרכזי בקביעת הצורך לטיפול באינסולין.

ממצאים שונים לגבי IA-2 ביחס לסמנים האחרים בסוכרת:

בשנת 2003 פרסמו Plodkowski ו-Shane ב-Diabetes & Endocrinology את התייחסותם לאבחנה בין סוכרת type 1 ו-type 2. בעבר היה מקובל להעריך שילדים ובני נוער בהם מאובחת קטואצידוזיס סוכרתית, זו נגרמת מהרס של תאי בטא הפנקראטיים מייצרי אינסולין, וצעירים אלה הוגדרו כלוקים בסוכרת type 1. לעומת זאת, מבוגרים באמצע שנותיהם נחשבו לכאלה המפתחים עמידות לאינסולין הגורמת לאי-סבילות (intolerance) לגלוקוזה, ולכן הוגדרו כלוקים בסוכרת type 2. ברבים מהלוקים בסוכרת type 1 עלול להופיע תרחיש של ketoacidosis, אם כי גם באחוז קטן יותר של אלה עם סוכרת type 2 עלול להופיע תרחיש זה.

נוגדנים לשני הפרגמנטים (37kD ו-40kD) שהם תוצרי פירוק טריפטי של חלבון ממברנאלי בלתי מזוהה של תאים של איי הלבלב, השונה מ-GAD. לאחרונה, דווח על נוגדנים עצמיים כנגד ICA512, הזהה לחלבון tyrosine phosphatase-like protein IA-2, ומחקרם של Bonifacio וחב' נועד לבחון האם IA2/ICA512 הוא בעל הספציפיות האנטיגנית כנגדה פועלים הנוגדנים ל-2 המקטעים 37K ו-40k, כמו גם אחת הדטרמיננטות כנגדה פועלים נוגדנים כנגד תאי איי הלבלב. בניסוי זה, השתתפו 100 חולי סוכרת IDDM שאובחנו לאחרונה, והנסיובים של 51 מתוכם השקיעו ב-assay של אימונו-פרציפיטציה את הפפטידים 37K ו/או 40K, בעוד שנסיובים של 53 מתוכם השקיעו IA2 ריקומביננטי שתורגם in vitro, ונסיובים של 49 מתוכם הכילו נוגדנים הן לפפטידים 37K/40K, כמו גם ל-IA2 הריקומביננטי. נמצא מתאם חזק בין רמות הנוגדנים ל-IA2 הריקומביננטי, לבין רמות הנוגדנים כנגד הפפטיד 40 אלף דלטון (r=0.85 ו-p<0,0001), לבין רמת הנוגדנים כנגד 37 אלף דלטון (r=0.70 ו-p<0.0001).

טיפול בטריפסין של IA2 ריקומביננטי שהושקע, הביא לקבלת מקטעי 37K ו-40K,ואילו אינקובציה מוקדמת של הנסיובים עם IA2 ריקומביננטי, עיכבה לחלוטין את קישור הנוגדנים למקטעי 37K ו-40K. מסקנות מחקר זה מזהות את IA2/ICA512 כקודמנים (precursors) של האוטו-אנטיגנים 37K ו-40K של איי הלבלב. גילוי משולב של נוגדנים ל-IA2 ול-GAD65 בנסיוב זיהה 88 מתוך 100 חולי סוכרת מסוג IDDM.

נוגדנים עצמיים ומגדר:

ילדות וילדים הם בעלי סיכון דומה לפתח סוכרת type 1, אך גברים נמצאים בסיכון מוגבר לפתח תרחיש זה מאשר נשים. כדי להבין מה הסיבה לשוני מגדרי זה בסיכון למחלה, נבחנו נוגדנים עצמיים על בסיס מגדר במדגם ENDIT בו נכללו קרובי משפחה של חולי סוכרת type 1. נמצא שבילדים ובנערים הסיכוי למצוא ICA גדול יותר מאשר בילדות ובנערות.
עיקרון שיטת המבדק:

המבדק משתמש ביכולת של נוגדנים ל-IA-2 הפועלים באופן דו-ולנטי ויוצרים גשר בין החלבון IA-2 הספוח לבארות של microplate לבין הפאזה הנוזלית של הקומפלקסIA-2-biotin . בשלב הראשון הנוגדנים כנגד IA-2 המופיעים בנסיוב הנבדק, נקשרים לחלבון זה הספוח על הפלטה. בשלב השני, IA-2-biotin נקשר לקומפלקס זה. כמות ה-IA-2-biotin נמצאת במתאם עם כמות הנוגדנים כנגד IA-2 שנמצאים בנסיוב של הנבדק. בשטיפות של ה-microplate מורחק ה-IA-2-biotin שלא נקשר, כאשר יתרת IA-2-biotin הקשור ניתנת לכימות על ידי הוספה של Streptavidin-peroxidase וסובסטרט כרומוגני כגון TMB או trimethylbenzidine, כאשר ה-OD של הצבע הצהוב המתפתח נמדד באורך גל של 450 ננומטר.

== הוראות לביצוע הבדיקה ==
יש ליטול דם במבחנה כימית (פקק אדום או צהוב) ולשלוח למעבדה בהקדם בקירור. אין לבצע את הבדיקה בדימות נסיוב המוליטיות או ליפמיות או איקטריות באופן בולט, אם כי ניתן לקבל דגימות בהם שלושת הפרמטרים הללו מתונים. לאחר הפרדת הנסיוב מהתאים בסרכוז, הדגימה יציבה בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות, בקירור למשך 28 יום, ובהקפאה למשך 2 חודשים.

נוגדנים עצמיים כנגד tyrosine phosphatase IA-2

2015-09-30T08:40:50Z

בן עמי סלע:

== נוגדנים עצמיים כנגד tyrosine phosphatase IA-2 ==
כינויים נוספים:anti-IA2 antibodies ;IA-2 ; IA-2A ;Islet Antigen 2 (IA-2) ;Islet Cell autoantibody ;Islet Cell Antigen (ICA) 512 ; Tyrosine Phosphatase-Like autoantibodies ;tyrosine phosphatase-related islet antigen 2S ;Insulinoma-Associated-2 autoantibodies.
טווח ערכים תקין: 0.0-0.8 יחי'/מ"ל. ערך שמעל 0.8 יחי'/מ"ל נחשבים חיוביים לנוגדנים עצמיים כנגד IA-2. בערכים מולאריים תחום הנורמה שווה או קטן מ-0.02 ננומול'/ליטר.

מטרת הבדיקה:

תגובה סרולוגית חיובית של נוכחות נוגדנים כנגד IA-2 (מעל 0.02 ננומול' לליטר), משמשת להבדלה קלינית בין 2 סוגי סוכרת, type 1 ו-type 2. זיהוי נבדקים הנמצאים בסיכון לסוכרת type 1 (כולל קרובי משפחה בסיכון גבוה של חולי סוכרת). ניבוי של צורך עתידי בטיפול באינסולין במבוגרים בתחילת שלב התסמינים הקליניים של סוכרת.

הגילוי של IA-2: יעד מרכזי לנוגדנים עצמיים בסוכרת:

IA-2 או islet antigen-2, בודד בעת ובעונה אחת אם כי באופן בלתי תלוי על ידי מספר קבוצות: לראשונה על ידי סריקה של ספריה של ביטוי אנטיגנים של איי הלבלב (ואז ניתן לו הכינוי ICA512) על ידי Rabin וחב' ב-J Immunol משנת 1994, ולאחר מכן על ידי שיבוט וסריקה של ספריית אנטיגנים של אינסולינומה באדם, שאז הוא הוגדר כ-Insulinoma-aasociated protein-2 או IA-2 , חלבון בעל 979 חומצות אמינו עם משקל מולקולארי של 105,847 דלטון, שעל פי Lan וחב' ב-DNA Cell Biol משנת 1994 הוא בעל דמיון רב ל-ICA 512, כאשר שני חלבונים אלה נבדלים רק בחסר של 388 חומצות אמינו בקצה ה-N טרמינאלי, ובחסר של 65 חומצות אמינו בקצה ה-N-טרמינאלי.

אנטיגן זה התברר כמולקולה הדומה לאנזים PTP או protein tyrosine phosphatase שהיה חסר פעילות אנזימטית, כתוצאה ממספר שחלופים של חומצות אמינו באתרים משומרים של החלבון, וחלבון זה מבוטא בעיקר בתאים נוירו-אנדוקריניים הן במערכת העצבים המרכזית והן באיי לנגרהנס בבלוטת הלבלב. הגן המקודד ל-IA-2 מופה לכרומוזום 2q35. זבשני סוגי התאים, אנטיגן זה מעוגן בממברנה של גרנולות מפרישות אינסולין, והנוגדנים מכוונים בעיקר כנגד המקטע התוך-תאי של IA-2, המורכב מרצף חומצות אמינו 601-979 החודר לציטופלזמת התאים, ונחשף רק התרחיש של נזק בתא הנוירו-אנדוקריני.

תפקידו של IA-2 נותר עדיין בלתי ברור, אך מחקרים in vitro במודלים של עכברים סיפקו ראיות לתפקיד אפשרי של IA-2 בהאצת הפרשת אינסולין. תאים באיי לנגרהנס מבטאים גם באופן דיפרנציאלי צורת ICA512 החסרה את המקטעים הטרנס –ממברנאלי והג'וֹקסְטָה-ממברנאלי (רצף חומצות אמינו 557-629). אנטיגן פגום זה המכונה ICA512bdc, שימש את Verge וחב' בפיתוח מבחן נוגדנים , בעזרתו ניתן היה לנבא תרחיש של סוכרת type 1 בבני משפחה מדרגה ראשונה (ב-Diabetes משנת 1996). מייד לאחר מכן, Lu וחב' פרסמו ב-Proc Natl Acad Sci USA ב-1996 על גילוי מולקולה נוספת דמוית-PTP שכונתה phogrin או IA-2β, שהייתה דומה בהיבטים רבים ל-IA-2 בעיקר במיקומה הממברנאלי ובמבנה התוך-תאי שהראה זהות של 74% עם זה של IA-2. גם IA-2β אינו פעיל אנזימטית.

נוגדנים עצמיים כנגד IA-2 נמצאים ב-80% מהילדים והנערים בשעת אבחונים כלוקים בסוכרת type 1. בלמעלה מ-90% מהילדים עם סוכרת נמצאים נוגדנים עצמיים לפחות לאחד משני האנטיגנים IA-2 או GAD בהופעת המחלה. האנטיגן IA-2A בדרך כלל מתפתח מאוחר יותר בתהליך המוביל לסוכרת type 1, ולכן שני אנטיגנים אלה (IA-2 ו-IA-2a, שכיחים פחות בנבדקים עם סיכרת type 1 מעל גיל 30 שנה, והם פחות שימושיים מאשר GAD לאפיון סוכרת בחולי סוכרת מבוגרים יותר.

פיתוח המבדק של נוגדנים כנגד IA-2:

החשיבות של נוגדנים עצמיים למשפחת המולקולות מסוג IA-2 לניבוי של התפתחות סוכרת הודגמה עוד לפני שנלמדו הרצפים של IA-2 ו-IA-2β. כבר ב-1982 פרסם Baekkeskov ב-Nature שימוש בטכניקה של immuno-precipitation של תמציות איי לבלב על ידי נוגדנים עצמיים לקוחים מנסיוב של ילדים חולי סוכרת. מחקרים בראשית שנות ה-90 הראו בשיטת immuno-precipitation של lysate מתאי אינסולינומה עם דגימות נסיוב של חולי סוכרת type 1, שניתן היה להשקיע חלבון במשקל מולקולארי של 64 אלף דלטון, שלאחר טיפול בטריפסין הופיעו שני מקטעים במשקלים מולקולאריים של 37 אלף ו-40 אלף דלטון (Christie וחב' ב-Diabetes משנת 1992). למרות שהזהות של 2 מקטעים אלה הייתה מעורפלת בהתחלה, מחקרים נוספים גילו ש-IA-2 הוא קודמן (precursor) של המקטע בגודל 40 אלף דלטון, ואילו IA-2β הוא הקודמן של המקטע במשל מולקולארי של 37 אלף דלטון.

נוגדנים עצמיים ל-IA-2 ו-IA-2β נמצאו ברוב המטופלים שאובחנים זה עתה עם סוכרת type 1, בהשוואה לגילוי נוגדנים אלה בפחות מ-2% של האנשים הבריאים. המבדק הנותן את התוצאות הטובות ביותר בהיבט של ספציפיות, רגישות והדירוּת הואimmuno-precipitation תוך שימוש ב-Protein A Sepharose של IA-2ic רקומביננטי מסומן רדיואקטיבית עם 35-S, שהוכן במערכת in vitro של תרגום ושעתוק. מספר פאנלים בינלאומיים, כגון DASP או Diabetes Autoantibody Standardization Program, עסקו בהערכה וסטנדרטיזציה של שיטות מדידה שונות ברחבי העולם. בסקירה זו נמצא שמדידות IA-2A ו-IA-2β היו בעלי רגישות גבוהה (66% ו-53%) וספציפיות גבוהה, בהתאמה (Bingley ב-Diabetes משנת 2003). בין השיטות השונות דווקא שיטת ELISA פחות טובה, וההשערה היא שבמהלך ביצוע ELISA חלים שינויי מבנה שלישוני באפיטופים החיוניים לקישור הנוגדן, וזאת בשל פגיעה בקשרים הדו-סולפידיים בחלבון.

כבר בשלב מחקרים מוקדם נמצא שהנוגדנים העצמיים בנסיוב של חולי סוכרת type 1, הגיבו באופן בררני עם המקטעים התוך תאיים של IA-2 ו-IA-2β, ושלא כצפוי הגיבו עם המקטעים החוץ-תאיים של אנטיגנים אלה. בחלבונים IA-2ic ו-IA-2β1c, האפיטופים האנטיגניים ממוקמים בקצה ה-C טרמינאלי, כאשר רק 40% מהנסיוב מגיבים עם הקצה ה-N-טרמינאלי במקרה של IA-2. בשילוב עם נוגדנים עצמיים נוספים כנגד איי לנגרהנס, הגילוי של IA-2 נמצא בשימוש נרחב לסייע בקביעת סוג הסוכרת, ולזהות נבדקים ברמת סיכון לחלות בסוכרת.

תפקידו של IA-2 בפתוגנזה ובסיווג המחלה:

IA-2 יכול להוות יעד ראשוני של תהליך חיסוני שעלול להרוס תאי-איים מייצרי אינסולין. לחילופין, IA-2 יכול להתפתח כפועל יוצא של הרס תאים אלה, תוך שחרור וחשיפת האנטיגן IA-2 תוך השריית תגובה חיסונית. IA-2A מופיעים תמיד במקבים לנוגדנים עצמיים אחרים בסוכרת אוטו-אימונית. השכיחות של הופעת נוגדנים עצמיים כנגד IA-2 דומה בארה" ובאירופה, והיא נעה בין 60-80% מהמקרים המאובחנים החדשים של סוכרת type 1, ובדומה לנוגדנים כנגד ICA, שכיחותם פוחתת בערך ל- 45% מאלה המאובחנים עם סוכרת זו מעל גיל 20 שנה. שכיחותם של הנוגדנים מסוג IA-2A משתנה לא רק עם הגיל, אלא גם עם ה-HLA, והיא גבוהה ביותר במטופלים הנושאים את הגנוטיפים HLA-DR4 ו- (HLA DQA10301-DQB10302 (DQ8, (על פי Hawa וחב' ב-Diabetes משנת 1997, ו-Gorus וחב' ב-Diabetologia מאותה שנה).

יש גם ראיות לכך שהופעת נוגדנים עצמיים ל-IA-2 מתרחשת עד מספר שנים לאחר אבחון סוכרת, אך רמת נוגדנים אלה דועכת במהירות לאחר מכן, שלא בדומה לנוגדנים כנגד GAD, שרמתם עולה עם הגיל. גורמים הכרוכים משמעותית עם משך תקופת הפוגה קלינית הם גיל, מגדר, חיוביות של ICA ורמה גבוהה התחלתית של HbA1C, בעוד שנוכחות של נוגדנים עצמיים ל-IA-2 היא חסרת השפעה. במקרה של IA-2β, בערך ב- 35-50% מנבדקים מאובחנים זה-עתה עם סוכרת מופיעים נוגדנים כנגד IA-2β, בהשוואה לפחות מ-1% מנבדקי ביקורת בריאים. מעל 95% של נסיובים סוכרתיים המגיבים עם IA-2β, מגיבים גם עם IA-2, אך רק 50-80% מהנסיובים המגיבים עם IA-2, מגיבים גם עם IA-2β, מה שמרמז לכך ששתי המולקולות מכילות אפיטופים ייחודיים.

IA-2 בניבוי של סוכרת type 1:

המאמץ לנבא סוכרת type 1, כדי לנסות ולשנות את מהלך המחלה, התמקד בנוגדנים עצמיים, שכן למידת השינויים בתאי T קשה יותר ופחות ספציפית. מספר מחקרים הדגימו את הערך המנבא של ICA, אך זה כרוך ונטילת חומר רקמתי מבלוטת הלבלב, ויש לו מגבלות טכניות משמעעותיות. מדידת IA-2A משלימה את מדידת GADA, כאשר למעלה מ-90% מהילדים מכילים נוגדנים לפחות לאחד מחלבונים אלה בהופעת סוכרת. גילוי נוגדנים ל-IA-2 ול-GAD תורם משמעותית להופעת ICA (על פי Kulmala וחב' ב-J Clin Invest משנת 1998). כיוון ש-2 נוגדנים עצמיים כנגד IA-2 ו-GAD מאוד שכיחים באנשים טרם הופעת המחלה (pre-diabetics), וניתנים לגילוי בשיטות ריקומבינציה רגישות, הם נמצאים היום בשימוש נרחב בבדיקות סריקה של אוכלוסיות, ביחד עם IAA, IA-2βA וכן עם הנוגדן החדש יחסית כנגד ZnT8.

(להכניס כאן את התרשים)

מספר מחקרים על פוטנציאל הניבוי של IA-2A מצאו ספציפיות ורגישות גבוהות, כמו גם ערך ניבוי חיובי (ppv), להתפתחות סוכרת בתאומים זהים (בכול אחת משלושת הקטגוריות מעל 90%), ובקרובי משפחת מדרגה ראשונה נמצא ppv של 5 שנים בתחום שבין 65-85%. למרות ש-IA-2A הוא בעל ערך ניבוי חיובי גבוה, הסכנה בהתפתחות סוכרת עולה כאשר מספר נוגדנים עצמיים כנגדי איי הבלוטה מתגלים, לכן שילוב נוכחותם של מספר נוגדנים נחשב לסמן המנבא הטוב ביותר. יחד עם זאת קיימת הסכמה שנוכחות IA-2A לבדו או בשילוב עם נוכחות נוגדנים עצמיים נוספים, מצביעה על עלייה בסיכון של התקדמות השלב הקדם-קליני לשלב הקליני (Decochez וחב' ב-Diabetologia משנת 2002). מוצע שיצירת IA-2A תואמת את השלב הקריטי בהתקדמות התהליך הפתולוגי, כאשר המקטע התוך תאי β נחשף למערכת החיסון, על פני התאים כאשר תאי β ניזוקים. זו גם הסיבה ש-IA-2A מופיעים בנסיוב יחסית מאוחר בשלב הקדם-קליני לפני הופעת סוכרת type 1, והם קשורים בהופעתם לשלב קצר ומהיר יחסית לקראת התפרצות המחלה (Achenbach וחב' ב-diabetes משנת 2004).

יתרה מכך, בשלב זה יש ל-IA-2A נטייה ליצור צבר (cluster) עם הנוגדנים IA-2βA ו- ZnT8A, ולאשר על ידי כך ביתר שאת ובגישות אבחונית גבוהה יותר את ההתפתחות המהירה לקראת סוכרת. מחקר מפורט יותר של התגובה החיסונית ההוּמוֹראלית, הראה שנוגדנים בשלב המקדים של המחלה היו מכוונים כנגד מקטע הג'וּקסטָה-ממברנאלי של IA-2ic, בעוד שבעת אבחון המחלה שולטים הנוגדנים כנגד אפיטופים רבים של אזורי ה-PTP של IA-2 ו-IA-2β, בעיקר בילדים ובנערים.

ארבעת המבדקים השכיחים ביותר המשמשים להבדיל בין סוכרת type 1, לבין סוכרת הנגרמת מסיבות שונות, מסוכמים בטבלה למטה:

נוגדנים כנגד תאי בטא, כנגד אינסולין או כנגד glutamic acid decarboxylase מסייעים לזהות את אלה עם סוכרת type 1 אוטואימונית. נוגדנים כנגד GAD65 נחשבים על ידי רוב הדיאבטולוגים כסמן הספציפי ביותר, כאשר ב- 70-80% מאלה עם סוכרת type 1 מופיע סוג נוגדנים זה עוד לפני הופעת התסמינים הקליניים או ממש עם הופעתם. באנשים בריאים נוגדנים ל-GAD, מופיעים בפחות מ-3% (על פי Bonifacio וחב' ב-Acta Diabetol משנת 1997). כאשר מודדים במשולב רמת נוגדנים ל-GAD ול-ICA, ניתן לגלות למעלה מ-90% מהחולים בסוג סוכרת זה. הנוגדנים ל-IA2, הם למעשה בין האחרונים שהתגלו ברשימת נוגדנים זו, כאשר הנוגדן האחרון בסדרה הוא הנוגדן כנגד ZnT8A.

זיהוי של protein tyrosine phosphatase-like IA2 או islet cell antigen 512 כאוטו-אנטיגן התלוי באינסולין המופיע בסוכרת כ-2 מקטעים בני 37 ו-40 אלף דלטון, המשמש יעד לנוגדנים בתאי איי לנגרהנס (Bonifacio וחב' ב-J Immunol משנת 1995):

ממצא מוקדם מאוד היה שהתגובה החיסונית ביצירת נוגדנים עצמיים מתחילה זמן רב מאוד לפני התפתחות סוכרת ממש. ממצא זה מוכיח שגם בנוכחות נוגדנים עצמיים אלה, קיים "חלון הזדמנויות" גדול, בו ניתן לעכב הופעת סוכרת type 1, אם וכאשר יהיה טיפול יעיל להאט את התפתחות המחלה או את הפגיעה האפשרית של נוגדנים אלה בתאי β.

נוגדנים עצמיים שמוצאים בילדים, שונים לרוב מאלה שמוצאים במבוגרים. IAA הוא בדרך כלל הסמן המוקדם שמופיעים בילדים, ועם התפתחות המחלה סמן זה עשוי להיעלם, כאשר ICA, GADA ו-IA-2A הופכים משמעותיים יותר. IA-2A חיובי באופן פחות שכיח בהופעה של סוכרת type 1, בהשוואה ל-GADA ול-ICA. בעוד שבערך 50% מהילדים עם הופעת סוכרת type 1 חיוביים ל-IAA, במבוגרים לא שכיחה חיוביות של IAA. מבדקים של נוגדנים עצמיים אלה יכולים לסייע כאשר האבחנה אינה ברורה באלה שאובחנו עם סוכרת type 2, אך חווים קשיים בשליטה על רמות גלוקוזה בטיפולים המקובלים.

מהי משמעות תוצאת בדיקות אלה? אם ICA, GADA ו-IA-2A נמצאים בנסיוב של מבוגר עם תסמיני סוכרת, יש אישור לקיומה של סוכרת type 1. באותה מידה, אם IAA נמצא בילד עם סוכרת שאינו מטופל באינסולין, הסוכרת במקרה זה אף היא type 1. אם לא מתגלים נוגדנים עצמיים, אין כל סבירות שמדובר בסוכרת type 1. אחדים מהמאובחנים עם סוכרת type 1 אינם מפתחים נוגדנים עצמיים הניתנים לגילוי כנגד איי הלבלב, אך זהו מצב נדיר. נוגדנים עצמיים כנגד איי הבלוטה יכולים להתגלות גם באלה עם מפגעים אוטו-אימוניים אנדוקריניים נוספים, כגון Hashimoto thyroiditis או autoimmune Addison disease.

מדידת נוכחות בנסיוב של נוגדנים עצמיים בנבדקים לא-סוכרתיים מומלצת רק למטרות מחקר, או בשימוש לנסות ולנבא התפתחות סוכרת type 1 בבני משפחה של חולים ידועים במחלה. באופן ספציפי יותר, בני משפחה מדרגה ראשונה של חולים בסוכרת type 1, בהם מוצאים ICA ותגובה חלשה של הפרשת אינסולין בתגובה להזרקה תוך-ורידית של גלוקוזה, סיכוייהם לפתח, סוכרת type 1 בפרק זמן של 5 שנים מאז הבדיקה, גדול מ-50%. כיוון שנכון להיום, אין טיפולים יעילים למנוע הופעת סוכרת type 1, אין המלצה לבצע בדיקות סריקה באוכלוסייה לאתר את אלה עם נוגדנים עצמיים, ואף אין המלצה לבצע בדיקות אלה בבני משפחה של חולי סוכרת type 1, אלא אם כן מדובר במחקר קליני בלבד.

מטופלים בהזרקות אינסולין, יכולים להתחיל לפתח נוגדנים כנגד האינסולין האקסוגני. כיוון שבדיקת IAA אינה מבחינה בין סוג זה של נוגדנים לבין נוגדנים כנגד האינסולין האנדוגני, אין להשתמש בבדיקה זו במי שכבר הוזרק עם אינסולין. לדוגמה, נבדקים שהיו חשודים כסוכרתיים type 2, והיו מטופלים בהזרקות אינסולין, אינם יכולים להיעזר במדידת נוגדנים העצמיים כנגד תאי β, על מנת לקבוע אם הם סוכרתיים type 1.

הערה: תוצאות שליליות של נוגדנים כנגד IA-2 אינם שוללות אבחון עתידי של סוכרת type 1 או סיכון עתידי להתפתחות סוכרת זו. הסיכון להופעת סוכרת type 1, יכול להיות מוערך על ידי מדידת רמת נוגדנים כנגד אינסולין, כנגדGAD או כנגד zinc transporter 8 הידוע כ-ZnT8, וכן על ידי בחינת סמנים גנטיים כגון HLA. ניטור רמות היפר-גליקמיה נחשב נתון מרכזי בקביעת הצורך לטיפול באינסולין.

ממצאים שונים לגבי IA-2 ביחס לסמנים האחרים בסוכרת:

בשנת 2003 פרסמו Plodkowski ו-Shane ב-Diabetes & Endocrinology את התייחסותם לאבחנה בין סוכרת type 1 ו-type 2. בעבר היה מקובל להעריך שילדים ובני נוער בהם מאובחת קטואצידוזיס סוכרתית, זו נגרמת מהרס של תאי בטא הפנקראטיים מייצרי אינסולין, וצעירים אלה הוגדרו כלוקים בסוכרת type 1. לעומת זאת, מבוגרים באמצע שנותיהם נחשבו לכאלה המפתחים עמידות לאינסולין הגורמת לאי-סבילות (intolerance) לגלוקוזה, ולכן הוגדרו כלוקים בסוכרת type 2. ברבים מהלוקים בסוכרת type 1 עלול להופיע תרחיש של ketoacidosis, אם כי גם באחוז קטן יותר של אלה עם סוכרת type 2 עלול להופיע תרחיש זה.

נוגדנים לשני הפרגמנטים (37kD ו-40kD) שהם תוצרי פירוק טריפטי של חלבון ממברנאלי בלתי מזוהה של תאים של איי הלבלב, השונה מ-GAD. לאחרונה, דווח על נוגדנים עצמיים כנגד ICA512, הזהה לחלבון tyrosine phosphatase-like protein IA-2, ומחקרם של Bonifacio וחב' נועד לבחון האם IA2/ICA512 הוא בעל הספציפיות האנטיגנית כנגדה פועלים הנוגדנים ל-2 המקטעים 37K ו-40k, כמו גם אחת הדטרמיננטות כנגדה פועלים נוגדנים כנגד תאי איי הלבלב. בניסוי זה, השתתפו 100 חולי סוכרת IDDM שאובחנו לאחרונה, והנסיובים של 51 מתוכם השקיעו ב-assay של אימונו-פרציפיטציה את הפפטידים 37K ו/או 40K, בעוד שנסיובים של 53 מתוכם השקיעו IA2 ריקומביננטי שתורגם in vitro, ונסיובים של 49 מתוכם הכילו נוגדנים הן לפפטידים 37K/40K, כמו גם ל-IA2 הריקומביננטי. נמצא מתאם חזק בין רמות הנוגדנים ל-IA2 הריקומביננטי, לבין רמות הנוגדנים כנגד הפפטיד 40 אלף דלטון (r=0.85 ו-p<0,0001), לבין רמת הנוגדנים כנגד 37 אלף דלטון (r=0.70 ו-p<0.0001).

טיפול בטריפסין של IA2 ריקומביננטי שהושקע, הביא לקבלת מקטעי 37K ו-40K,ואילו אינקובציה מוקדמת של הנסיובים עם IA2 ריקומביננטי, עיכבה לחלוטין את קישור הנוגדנים למקטעי 37K ו-40K. מסקנות מחקר זה מזהות את IA2/ICA512 כקודמנים (precursors) של האוטו-אנטיגנים 37K ו-40K של איי הלבלב. גילוי משולב של נוגדנים ל-IA2 ול-GAD65 בנסיוב זיהה 88 מתוך 100 חולי סוכרת מסוג IDDM.

נוגדנים עצמיים ומגדר:

ילדות וילדים הם בעלי סיכון דומה לפתח סוכרת type 1, אך גברים נמצאים בסיכון מוגבר לפתח תרחיש זה מאשר נשים. כדי להבין מה הסיבה לשוני מגדרי זה בסיכון למחלה, נבחנו נוגדנים עצמיים על בסיס מגדר במדגם ENDIT בו נכללו קרובי משפחה של חולי סוכרת type 1. נמצא שבילדים ובנערים הסיכוי למצוא ICA גדול יותר מאשר בילדות ובנערות.
עיקרון שיטת המבדק:

המבדק משתמש ביכולת של נוגדנים ל-IA-2 הפועלים באופן דו-ולנטי ויוצרים גשר בין החלבון IA-2 הספוח לבארות של microplate לבין הפאזה הנוזלית של הקומפלקסIA-2-biotin . בשלב הראשון הנוגדנים כנגד IA-2 המופיעים בנסיוב הנבדק, נקשרים לחלבון זה הספוח על הפלטה. בשלב השני, IA-2-biotin נקשר לקומפלקס זה. כמות ה-IA-2-biotin נמצאת במתאם עם כמות הנוגדנים כנגד IA-2 שנמצאים בנסיוב של הנבדק. בשטיפות של ה-microplate מורחק ה-IA-2-biotin שלא נקשר, כאשר יתרת IA-2-biotin הקשור ניתנת לכימות על ידי הוספה של Streptavidin-peroxidase וסובסטרט כרומוגני כגון TMB או trimethylbenzidine, כאשר ה-OD של הצבע הצהוב המתפתח נמדד באורך גל של 450 ננומטר.

== הוראות לביצוע הבדיקה ==
יש ליטול דם במבחנה כימית (פקק אדום או צהוב) ולשלוח למעבדה בהקדם בקירור. אין לבצע את הבדיקה בדימות נסיוב המוליטיות או ליפמיות או איקטריות באופן בולט, אם כי ניתן לקבל דגימות בהם שלושת הפרמטרים הללו מתונים. לאחר הפרדת הנסיוב מהתאים בסרכוז, הדגימה יציבה בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות, בקירור למשך 28 יום, ובהקפאה למשך 2 חודשים.

נוגדנים עצמיים כנגד tyrosine phosphatase IA-2

2015-09-30T08:32:34Z

בן עמי סלע: יצירת דף עם התוכן "== נוגדנים עצמיים כנגד tyrosine phosphatase IA-2 == כינויים נוספים:anti-IA2 antibodies ;IA-2 ; IA-2A ;Islet Antigen 2 (IA-2) ;Isl..."

== נוגדנים עצמיים כנגד tyrosine phosphatase IA-2 ==
כינויים נוספים:anti-IA2 antibodies ;IA-2 ; IA-2A ;Islet Antigen 2 (IA-2) ;Islet Cell autoantibody ;Islet Cell Antigen (ICA) 512 ; Tyrosine Phosphatase-Like autoantibodies ;tyrosine phosphatase-related islet antigen 2S ;Insulinoma-Associated-2 autoantibodies.
טווח ערכים תקין: 0.0-0.8 יחי'/מ"ל. ערך שמעל 0.8 יחי'/מ"ל נחשבים חיוביים לנוגדנים עצמיים כנגד IA-2. בערכים מולאריים תחום הנורמה שווה או קטן מ-0.02 ננומול'/ליטר.

מטרת הבדיקה:

תגובה סרולוגית חיובית של נוכחות נוגדנים כנגד IA-2 (מעל 0.02 ננומול' לליטר), משמשת להבדלה קלינית בין 2 סוגי סוכרת, type 1 ו-type 2. זיהוי נבדקים הנמצאים בסיכון לסוכרת type 1 (כולל קרובי משפחה בסיכון גבוה של חולי סוכרת). ניבוי של צורך עתידי בטיפול באינסולין במבוגרים בתחילת שלב התסמינים הקליניים של סוכרת.

הגילוי של IA-2: יעד מרכזי לנוגדנים עצמיים בסוכרת:

IA-2 או islet antigen-2, בודד בעת ובעונה אחת אם כי באופן בלתי תלוי על ידי מספר קבוצות: לראשונה על ידי סריקה של ספריה של ביטוי אנטיגנים של איי הלבלב (ואז ניתן לו הכינוי ICA512) על ידי Rabin וחב' ב-J Immunol משנת 1994, ולאחר מכן על ידי שיבוט וסריקה של ספריית אנטיגנים של אינסולינומה באדם, שאז הוא הוגדר כ-Insulinoma-aasociated protein-2 או IA-2 , חלבון בעל 979 חומצות אמינו עם משקל מולקולארי של 105,847 דלטון, שעל פי Lan וחב' ב-DNA Cell Biol משנת 1994 הוא בעל דמיון רב ל-ICA 512, כאשר שני חלבונים אלה נבדלים רק בחסר של 388 חומצות אמינו בקצה ה-N טרמינאלי, ובחסר של 65 חומצות אמינו בקצה ה-N-טרמינאלי.

אנטיגן זה התברר כמולקולה הדומה לאנזים PTP או protein tyrosine phosphatase שהיה חסר פעילות אנזימטית, כתוצאה ממספר שחלופים של חומצות אמינו באתרים משומרים של החלבון, וחלבון זה מבוטא בעיקר בתאים נוירו-אנדוקריניים הן במערכת העצבים המרכזית והן באיי לנגרהנס בבלוטת הלבלב. הגן המקודד ל-IA-2 מופה לכרומוזום 2q35. זבשני סוגי התאים, אנטיגן זה מעוגן בממברנה של גרנולות מפרישות אינסולין, והנוגדנים מכוונים בעיקר כנגד המקטע התוך-תאי של IA-2, המורכב מרצף חומצות אמינו 601-979 החודר לציטופלזמת התאים, ונחשף רק התרחיש של נזק בתא הנוירו-אנדוקריני.

תפקידו של IA-2 נותר עדיין בלתי ברור, אך מחקרים in vitro במודלים של עכברים סיפקו ראיות לתפקיד אפשרי של IA-2 בהאצת הפרשת אינסולין. תאים באיי לנגרהנס מבטאים גם באופן דיפרנציאלי צורת ICA512 החסרה את המקטעים הטרנס –ממברנאלי והג'וֹקסְטָה-ממברנאלי (רצף חומצות אמינו 557-629). אנטיגן פגום זה המכונה ICA512bdc, שימש את Verge וחב' בפיתוח מבחן נוגדנים , בעזרתו ניתן היה לנבא תרחיש של סוכרת type 1 בבני משפחה מדרגה ראשונה (ב-Diabetes משנת 1996). מייד לאחר מכן, Lu וחב' פרסמו ב-Proc Natl Acad Sci USA ב-1996 על גילוי מולקולה נוספת דמוית-PTP שכונתה phogrin או IA-2β, שהייתה דומה בהיבטים רבים ל-IA-2 בעיקר במיקומה הממברנאלי ובמבנה התוך-תאי שהראה זהות של 74% עם זה של IA-2. גם IA-2β אינו פעיל אנזימטית.

נוגדנים עצמיים כנגד IA-2 נמצאים ב-80% מהילדים והנערים בשעת אבחונים כלוקים בסוכרת type 1. בלמעלה מ-90% מהילדים עם סוכרת נמצאים נוגדנים עצמיים לפחות לאחד משני האנטיגנים IA-2 או GAD בהופעת המחלה. האנטיגן IA-2A בדרך כלל מתפתח מאוחר יותר בתהליך המוביל לסוכרת type 1, ולכן שני אנטיגנים אלה (IA-2 ו-IA-2a, שכיחים פחות בנבדקים עם סיכרת type 1 מעל גיל 30 שנה, והם פחות שימושיים מאשר GAD לאפיון סוכרת בחולי סוכרת מבוגרים יותר.

פיתוח המבדק של נוגדנים כנגד IA-2:

החשיבות של נוגדנים עצמיים למשפחת המולקולות מסוג IA-2 לניבוי של התפתחות סוכרת הודגמה עוד לפני שנלמדו הרצפים של IA-2 ו-IA-2β. כבר ב-1982 פרסם Baekkeskov ב-Nature שימוש בטכניקה של immuno-precipitation של תמציות איי לבלב על ידי נוגדנים עצמיים לקוחים מנסיוב של ילדים חולי סוכרת. מחקרים בראשית שנות ה-90 הראו בשיטת immuno-precipitation של lysate מתאי אינסולינומה עם דגימות נסיוב של חולי סוכרת type 1, שניתן היה להשקיע חלבון במשקל מולקולארי של 64 אלף דלטון, שלאחר טיפול בטריפסין הופיעו שני מקטעים במשקלים מולקולאריים של 37 אלף ו-40 אלף דלטון (Christie וחב' ב-Diabetes משנת 1992). למרות שהזהות של 2 מקטעים אלה הייתה מעורפלת בהתחלה, מחקרים נוספים גילו ש-IA-2 הוא קודמן (precursor) של המקטע בגודל 40 אלף דלטון, ואילו IA-2β הוא הקודמן של המקטע במשל מולקולארי של 37 אלף דלטון.

נוגדנים עצמיים ל-IA-2 ו-IA-2β נמצאו ברוב המטופלים שאובחנים זה עתה עם סוכרת type 1, בהשוואה לגילוי נוגדנים אלה בפחות מ-2% של האנשים הבריאים. המבדק הנותן את התוצאות הטובות ביותר בהיבט של ספציפיות, רגישות והדירוּת הואimmuno-precipitation תוך שימוש ב-Protein A Sepharose של IA-2ic רקומביננטי מסומן רדיואקטיבית עם 35-S, שהוכן במערכת in vitro של תרגום ושעתוק. מספר פאנלים בינלאומיים, כגון DASP או Diabetes Autoantibody Standardization Program, עסקו בהערכה וסטנדרטיזציה של שיטות מדידה שונות ברחבי העולם. בסקירה זו נמצא שמדידות IA-2A ו-IA-2β היו בעלי רגישות גבוהה (66% ו-53%) וספציפיות גבוהה, בהתאמה (Bingley ב-Diabetes משנת 2003). בין השיטות השונות דווקא שיטת ELISA פחות טובה, וההשערה היא שבמהלך ביצוע ELISA חלים שינויי מבנה שלישוני באפיטופים החיוניים לקישור הנוגדן, וזאת בשל פגיעה בקשרים הדו-סולפידיים בחלבון.

כבר בשלב מחקרים מוקדם נמצא שהנוגדנים העצמיים בנסיוב של חולי סוכרת type 1, הגיבו באופן בררני עם המקטעים התוך תאיים של IA-2 ו-IA-2β, ושלא כצפוי הגיבו עם המקטעים החוץ-תאיים של אנטיגנים אלה. בחלבונים IA-2ic ו-IA-2β1c, האפיטופים האנטיגניים ממוקמים בקצה ה-C טרמינאלי, כאשר רק 40% מהנסיוב מגיבים עם הקצה ה-N-טרמינאלי במקרה של IA-2. בשילוב עם נוגדנים עצמיים נוספים כנגד איי לנגרהנס, הגילוי של IA-2 נמצא בשימוש נרחב לסייע בקביעת סוג הסוכרת, ולזהות נבדקים ברמת סיכון לחלות בסוכרת.

תפקידו של IA-2 בפתוגנזה ובסיווג המחלה:

IA-2 יכול להוות יעד ראשוני של תהליך חיסוני שעלול להרוס תאי-איים מייצרי אינסולין. לחילופין, IA-2 יכול להתפתח כפועל יוצא של הרס תאים אלה, תוך שחרור וחשיפת האנטיגן IA-2 תוך השריית תגובה חיסונית. IA-2A מופיעים תמיד במקבים לנוגדנים עצמיים אחרים בסוכרת אוטו-אימונית. השכיחות של הופעת נוגדנים עצמיים כנגד IA-2 דומה בארה" ובאירופה, והיא נעה בין 60-80% מהמקרים המאובחנים החדשים של סוכרת type 1, ובדומה לנוגדנים כנגד ICA, שכיחותם פוחתת בערך ל- 45% מאלה המאובחנים עם סוכרת זו מעל גיל 20 שנה. שכיחותם של הנוגדנים מסוג IA-2A משתנה לא רק עם הגיל, אלא גם עם ה-HLA, והיא גבוהה ביותר במטופלים הנושאים את הגנוטיפים HLA-DR4 ו- (HLA DQA10301-DQB10302 (DQ8, (על פי Hawa וחב' ב-Diabetes משנת 1997, ו-Gorus וחב' ב-Diabetologia מאותה שנה).

יש גם ראיות לכך שהופעת נוגדנים עצמיים ל-IA-2 מתרחשת עד מספר שנים לאחר אבחון סוכרת, אך רמת נוגדנים אלה דועכת במהירות לאחר מכן, שלא בדומה לנוגדנים כנגד GAD, שרמתם עולה עם הגיל. גורמים הכרוכים משמעותית עם משך תקופת הפוגה קלינית הם גיל, מגדר, חיוביות של ICA ורמה גבוהה התחלתית של HbA1C, בעוד שנוכחות של נוגדנים עצמיים ל-IA-2 היא חסרת השפעה. במקרה של IA-2β, בערך ב- 35-50% מנבדקים מאובחנים זה-עתה עם סוכרת מופיעים נוגדנים כנגד IA-2β, בהשוואה לפחות מ-1% מנבדקי ביקורת בריאים. מעל 95% של נסיובים סוכרתיים המגיבים עם IA-2β, מגיבים גם עם IA-2, אך רק 50-80% מהנסיובים המגיבים עם IA-2, מגיבים גם עם IA-2β, מה שמרמז לכך ששתי המולקולות מכילות אפיטופים ייחודיים.

IA-2 בניבוי של סוכרת type 1:

המאמץ לנבא סוכרת type 1, כדי לנסות ולשנות את מהלך המחלה, התמקד בנוגדנים עצמיים, שכן למידת השינויים בתאי T קשה יותר ופחות ספציפית. מספר מחקרים הדגימו את הערך המנבא של ICA, אך זה כרוך ונטילת חומר רקמתי מבלוטת הלבלב, ויש לו מגבלות טכניות משמעעותיות. מדידת IA-2A משלימה את מדידת GADA, כאשר למעלה מ-90% מהילדים מכילים נוגדנים לפחות לאחד מחלבונים אלה בהופעת סוכרת. גילוי נוגדנים ל-IA-2 ול-GAD תורם משמעותית להופעת ICA (על פי Kulmala וחב' ב-J Clin Invest משנת 1998). כיוון ש-2 נוגדנים עצמיים כנגד IA-2 ו-GAD מאוד שכיחים באנשים טרם הופעת המחלה (pre-diabetics), וניתנים לגילוי בשיטות ריקומבינציה רגישות, הם נמצאים היום בשימוש נרחב בבדיקות סריקה של אוכלוסיות, ביחד עם IAA, IA-2βA וכן עם הנוגדן החדש יחסית כנגד ZnT8.
(להכניס כאן את התרשים)
מספר מחקרים על פוטנציאל הניבוי של IA-2A מצאו ספציפיות ורגישות גבוהות, כמו גם ערך ניבוי חיובי (ppv), להתפתחות סוכרת בתאומים זהים (בכול אחת משלושת הקטגוריות מעל 90%), ובקרובי משפחת מדרגה ראשונה נמצא ppv של 5 שנים בתחום שבין 65-85%. למרות ש-IA-2A הוא בעל ערך ניבוי חיובי גבוה, הסכנה בהתפתחות סוכרת עולה כאשר מספר נוגדנים עצמיים כנגדי איי הבלוטה מתגלים, לכן שילוב נוכחותם של מספר נוגדנים נחשב לסמן המנבא הטוב ביותר. יחד עם זאת קיימת הסכמה שנוכחות IA-2A לבדו או בשילוב עם נוכחות נוגדנים עצמיים נוספים, מצביעה על עלייה בסיכון של התקדמות השלב הקדם-קליני לשלב הקליני (Decochez וחב' ב-Diabetologia משנת 2002). מוצע שיצירת IA-2A תואמת את השלב הקריטי בהתקדמות התהליך הפתולוגי, כאשר המקטע התוך תאי β נחשף למערכת החיסון, על פני התאים כאשר תאי β ניזוקים. זו גם הסיבה ש-IA-2A מופיעים בנסיוב יחסית מאוחר בשלב הקדם-קליני לפני הופעת סוכרת type 1, והם קשורים בהופעתם לשלב קצר ומהיר יחסית לקראת התפרצות המחלה (Achenbach וחב' ב-diabetes משנת 2004).
יתרה מכך, בשלב זה יש ל-IA-2A נטייה ליצור צבר (cluster) עם הנוגדנים IA-2βA ו- ZnT8A , ולאשר על ידי כך ביתר שאת ובגישות אבחונית גבוהה יותר את ההתפתחות המהירה לקראת סוכרת. מחקר מפורט יותר של התגובה החיסונית ההוּמוֹראלית, הראה שנוגדנים בשלב המקדים של המחלה היו מכוונים כנגד מקטע הג'וּקסטָה-ממברנאלי של IA-2ic, בעוד שבעת אבחון המחלה שולטים הנוגדנים כנגד אפיטופים רבים של אזורי ה-PTP של IA-2 ו-IA-2β, בעיקר בילדים ובנערים.
ארבעת המבדקים השכיחים ביותר המשמשים להבדיל בין סוכרת type 1, לבין סוכרת הנגרמת מסיבות שונות, מסוכמים בטבלה למטה:
נוגדנים כנגד תאי בטא, כנגד אינסולין או כנגד glutamic acid decarboxylase מסייעים לזהות את אלה עם סוכרת type 1 אוטואימונית. נוגדנים כנגד GAD65 נחשבים על ידי רוב הדיאבטולוגים כסמן הספציפי ביותר, כאשר ב- 70-80% מאלה עם סוכרת type 1 מופיע סוג נוגדנים זה עוד לפני הופעת התסמינים הקליניים או ממש עם הופעתם. באנשים בריאים נוגדנים ל-GAD, מופיעים בפחות מ-3% (על פי Bonifacio וחב' ב-Acta Diabetol משנת 1997). כאשר מודדים במשולב רמת נוגדנים ל-GAD ול-ICA, ניתן לגלות למעלה מ-90% מהחולים בסוג סוכרת זה. הנוגדנים ל-IA2, הם למעשה בין האחרונים שהתגלו ברשימת נוגדנים זו, כאשר הנוגדן האחרון בסדרה הוא הנוגדן כנגד ZnT8A.
זיהוי של protein tyrosine phosphatase-like IA2 (islet cell antigen 512) כאוטו-אנטיגן התלוי באינסולין המופיע בסוכרת כ-2 מקטעים בני 37 ו-40 אלף דלטון, המשמש יעד לנוגדנים בתאי איי לנגרהנס (Bonifacio וחב' ב-J Immunol משנת 1995):
ממצא מוקדם מאוד היה שהתגובה החיסונית ביצירת נוגדנים עצמיים מתחילה זמן רב מאוד לפני התפתחות סוכרת ממש. ממצא זה מוכיח שגם בנוכחות נוגדנים עצמיים אלה, קיים "חלון הזדמנויות" גדול, בו ניתן לעכב הופעת סוכרת type 1, אם וכאשר יהיה טיפול יעיל להאט את התפתחות המחלה או את הפגיעה האפשרית של נוגדנים אלה בתאי β.
נוגדנים עצמיים שמוצאים בילדים, שונים לרוב מאלה שמוצאים במבוגרים. IAA הוא בדרך כלל הסמן המוקדם שמופיעים בילדים, ועם התפתחות המחלה סמן זה עשוי להיעלם, כאשר ICA, GADA ו-IA-2A הופכים משמעותיים יותר. IA-2A חיובי באופן פחות שכיח בהופעה של סוכרת type 1, בהשוואה ל-GADA ול-ICA. בעוד שבערך 50% מהילדים עם הופעת סוכרת type 1 חיוביים ל-IAA, במבוגרים לא שכיחה חיוביות של IAA. מבדקים של נוגדנים עצמיים אלה יכולים לסייע כאשר האבחנה אינה ברורה באלה שאובחנו עם סוכרת type 2, אך חווים קשיים בשליטה על רמות גלוקוזה בטיפולים המקובלים. מהי משמעות תוצאת בדיקות אלה? אם ICA, GADA ו-IA-2A נמצאים בנסיוב של מבוגר עם תסמיני סוכרת, יש אישור לקיומה של סוכרת type 1. באותה מידה, אם IAA נמצא בילד עם סוכרת שאינו מטופל באינסולין, הסוכרת במקרה זה אף היא type 1. אם לא מתגלים נוגדנים עצמיים, אין כל סבירות שמדובר בסוכרת type 1. אחדים מהמאובחנים עם סוכרת type 1 אינם מפתחים נוגדנים עצמיים הניתנים לגילוי כנגד איי הלבלב, אך זהו מצב נדיר. נוגדנים עצמיים כנגד איי הבלוטה יכולים להתגלות גם באלה עם מפגעים אוטו-אימוניים אנדוקריניים נוספים, כגון Hashimoto thyroiditis או autoimmune Addison disease.
מדידת נוכחות בנסיוב של נוגדנים עצמיים בנבדקים לא-סוכרתיים מומלצת רק למטרות מחקר, או בשימוש לנסות ולנבא התפתחות סוכרת type 1 בבני משפחה של חולים ידועים במחלה. באופן ספציפי יותר, בני משפחה מדרגה ראשונה של חולים בסוכרת type 1, בהם מוצאים ICA ותגובה חלשה של הפרשת אינסולין בתגובה להזרקה תוך-ורידית של גלוקוזה, סיכוייהם לפתח, סוכרת type 1 בפרק זמן של 5 שנים מאז הבדיקה, גדול מ-50%. כיוון שנכון להיום, אין טיפולים יעילים למנוע הופעת סוכרת type 1, אין המלצה לבצע בדיקות סריקה באוכלוסייה לאתר את אלה עם נוגדנים עצמיים, ואף אין המלצה לבצע בדיקות אלה בבני משפחה של חולי סוכרת type 1, אלא אם כן מדובר במחקר קליני בלבד.
מטופלים בהזרקות אינסולין, יכולים להתחיל לפתח נוגדנים כנגד האינסולין האקסוגני. כיוון שבדיקת IAA אינה מבחינה בין סוג זה של נוגדנים לבין נוגדנים כנגד האינסולין האנדוגני, אין להשתמש בבדיקה זו במי שכבר הוזרק עם אינסולין. לדוגמה, נבדקים שהיו חשודים כסוכרתיים type 2, והיו מטופלים בהזרקות אינסולין, אינם יכולים להיעזר במדידת נוגדנים העצמיים כנגד תאי β, על מנת לקבוע אם הם סוכרתיים type 1.
הערות: תוצאות שליליות של נוגדנים כנגד IA-2 אינם שוללות אבחון עתידי של סוכרת type 1 או סיכון עתידי להתפתחות סוכרת זו. הסיכון להופעת סוכרת type 1, יכול להיות מוערך על ידי מדידת רמת נוגדנים כנגד אינסולין, כנגדGAD או כנגד zinc transporter 8 הידוע כ-ZnT8, וכן על ידי בחינת סמנים גנטיים כגון HLA. ניטור רמות היפר-גליקמיה נחשב נתון מרכזי בקביעת הצורך לטיפול באינסולין.
ממצאים שונים לגבי IA-2 ביחס לסמנים האחרים בסוכרת:
בשנת 2003 פרסמו Plodkowski ו-Shane ב-Diabetes & Endocrinology את התייחסותם לאבחנה בין סוכרת type 1 ו-type 2. בעבר היה מקובל להעריך שילדים ובני נוער בהם מאובחת קטואצידוזיס סוכרתית, זו נגרמת מהרס של תאי בטא הפנקראטיים מייצרי אינסולין, וצעירים אלה הוגדרו כלוקים בסוכרת type 1. לעומת זאת, מבוגרים באמצע שנותיהם נחשבו לכאלה המפתחים עמידות לאינסולין הגורמת לאי-סבילות (intolerance) לגלוקוזה, ולכן הוגדרו כלוקים בסוכרת type 2. ברבים מהלוקים בסוכרת type 1 עלול להופיע תרחיש של ketoacidosis, אם כי גם באחוז קטן יותר של אלה עם סוכרת type 2 עלול להופיע תרחיש זה.

נוגדנים לשני הפרגמנטים (37kD ו-40kD) שהם תוצרי פירוק טריפטי של חלבון ממברנאלי בלתי מזוהה של תאים של איי הלבלב, השונה מ-GAD. לאחרונה, דווח על נוגדנים עצמיים כנגד ICA512, הזהה לחלבון tyrosine phosphatase-like protein IA-2, ומחקרם של Bonifacio וחב' נועד לבחון האם IA2/ICA512 הוא בעל הספציפיות האנטיגנית כנגדה פועלים הנוגדנים ל-2 המקטעים 37K ו-40k, כמו גם אחת הדטרמיננטות כנגדה פועלים נוגדנים כנגד תאי איי הלבלב. בניסוי זה, השתתפו 100 חולי סוכרת IDDM שאובחנו לאחרונה, והנסיובים של 51 מתוכם השקיעו ב-assay של אימונו-פרציפיטציה את הפפטידים 37K ו/או 40K, בעוד שנסיובים של 53 מתוכם השקיעו IA2 ריקומביננטי שתורגם in vitro, ונסיובים של 49 מתוכם הכילו נוגדנים הן לפפטידים 37K/40K, כמו גם ל-IA2 הריקומביננטי. נמצא מתאם חזק בין רמות הנוגדנים ל-IA2 הריקומביננטי, לבין רמות הנוגדנים כנגד הפפטיד 40 אלף דלטון (r=0.85 ו-p<0,0001), לבין רמת הנוגדנים כנגד 37 אלף דלטון (r=0.70 ו-p<0.0001).

טיפול בטריפסין של IA2 ריקומביננטי שהושקע, הביא לקבלת מקטעי 37K ו-40K,ואילו אינקובציה מוקדמת של הנסיובים עם IA2 ריקומביננטי, עיכבה לחלוטין את קישור הנוגדנים למקטעי 37K ו-40K. מסקנות מחקר זה מזהות את IA2/ICA512 כקודמנים (precursors) של האוטו-אנטיגנים 37K ו-40K של איי הלבלב. גילוי משולב של נוגדנים ל-IA2 ול-GAD65 בנסיוב זיהה 88 מתוך 100 חולי סוכרת מסוג IDDM .
נוגדנים עצמיים ומגדר:
ילדות וילדים הם בעלי סיכון דומה לפתח סוכרת type 1, אך גברים נמצאים בסיכון מוגבר לפתח תרחיש זה מאשר נשים. כדי להבין מה הסיבה לשוני מגדרי זה בסיכון למחלה, נבחנו נוגדנים עצמיים על בסיס מגדר במדגם ENDIT בו נכללו קרובי משפחה של חולי סוכרת type 1. נמצא שבילדים ובנערים הסיכוי למצוא ICA גדול יותר מאשר בילדות ובנערות.
עיקרון שיטת המבדק:

המבדק משתמש ביכולת של נוגדנים ל-IA-2 הפועלים באופן דו-ולנטי ויוצרים גשר בין החלבון IA-2 הספוח לבארות של microplate לבין הפאזה הנוזלית של הקומפלקסIA-2-biotin . בשלב הראשון הנוגדנים כנגד IA-2 המופיעים בנסיוב הנבדק, נקשרים לחלבון זה הספוח על הפלטה. בשלב השני, IA-2-biotin נקשר לקומפלקס זה. כמות ה-IA-2-biotin נמצאת במתאם עם כמות הנוגדנים כנגד IA-2 שנמצאים בנסיוב של הנבדק. בשטיפות של ה-microplate מורחק ה-IA-2-biotin שלא נקשר, כאשר יתרת IA-2-biotin הקשור ניתנת לכימות על ידי הוספה של Streptavidin-peroxidase וסובסטרט כרומוגני כגון TMB או trimethylbenzidine, כאשר ה-OD של הצבע הצהוב המתפתח נמדד באורך גל של 450 ננומטר.

== הוראות לביצוע הבדיקה ==
יש ליטול דם במבחנה כימית (פקק אדום או צהוב) ולשלוח למעבדה בהקדם בקירור. אין לבצע את הבדיקה בדימות נסיוב המוליטיות או ליפמיות או איקטריות באופן בולט, אם כי ניתן לקבל דגימות בהם שלושת הפרמטרים הללו מתונים. לאחר הפרדת הנסיוב מהתאים בסרכוז, הדגימה יציבה בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות, בקירור למשך 28 יום, ובהקפאה למשך 2 חודשים.

HE4 - Human epididymal protein 4

2015-09-07T08:54:42Z

בן עמי סלע:

{{בדיקת מעבדה
|שם עברי={{רווח קשיח|2}}
|שם לועזי=HE4 - Human epididymal protein 4
|קיצור=WFDC2 או WAP four-disulfide core domain protein 2
|תמונה=
|כיתוב תמונה=
|מעבדה=[[כימיה בדם]]
|תחום=הערכת [[סרטן השחלות]], וניטור מהלך המחלה
|יחידות מדידה=
|טווח ערכים תקין=בנסיוב של נשים בגיל הפוריות - פחות מ-70 פיקומול'/ליטר; בנסיוב של נשים בגיל חידלון הווסת - פחות מ-140 פיקומול'/ליטר
|יוצר הערך=[[משתמש:בן עמי סלע|פרופ' בן-עמי סלע]]
|אחראי הערך=
}}
{{הרחבה|סרטן השחלות}}
==מטרת הבדיקה==

עזר בניטור נשים מטופלות עם סרטן אפיתליאלי של השחלות להתפתחות המחלה או לחזרתה לאחר טיפול תרופתי או ניתוח.

==בסיס פיזיולוגי==

סרטן השחלות היא הסיבה החמישית במעלה לתמותה מממאירות בקרב נשים בארה"ב, וששית בשכיחותה בקרב נשים בעולם כולו, כאשר שכיחות המחלה עולה עם הגיל ועם הסטאטוס של חידלון הווסת. על פי נתוני ה-ACS התגלו בארה"ב 22,280 מקרים חדשים בשנת 2012, ובאותה שנה 15,500 נשים נפטרו מסרטן השחלות. על פי נתוני ה-IARC בליון משנת 2012 שסוכמו על ידי Ferlay וחב', שכיחות ממאירות זו עולה מ-4.7 לכל מאה אלף נשים מתחת גיל 50 שנה, ל-29.6 מקרים לכל מאה אלף נשים בגיל 50-64 שנה. נכון להיום סרט השחלות היא הסיבה הראשונה במעלה לתמותה ממאירויות גינקולוגיות, שכן כ-75% מהמקרים מתגלים בשלבים מתקדמים ומפושטים שלה, זאת כיוון שבשלבים המוקדמים סרטן השחלות חסר תסמינים, ואין שיטה סריקה יעילה לגילוי מוקדם של ממאירות זו (עפ"י Fountain וחב' ב-Gynecol Oncol משנת 2006). אכן, הפער הגדול בין שיעורי ההישרדות כאשר אבחון המחלה נעשה מוקדם (80-90% הישרדות) או כאשר היא מאובחנת בשלב מאוחר (15-20% הישרדות), מבליט את הנחיצות לסמנים אמינים לאבחון מבדיל בין סרטן שחלות ממאיר לבין מסה שפירה באזור האגן.

===גילוי HE4===

הסמן HE4 זוהה לראשונה ואופיין על ידי Kirchhoff וחב' במהלך סריקה דיפרנציאלית של ספריות cDNA של רקמה אפידידימאלית (יותרת האשך) בגבר, ופרסמו זאת ב-Biol Reprod בשנת 1991. מכאן נגזר שמו של החלבון Human Epididymis Protein 4 או HE4. מחקרי המשך גילו את הביטוי של HE4 במספר רקמות מחוץ למערכת הרבייה הגברית, כאשר בין השאר גילו Bingle וחב' בשיטת northern hybridization mRNA של HE4 בריאות, בכליות ובבלוטות הרוק נורמאליות (Oncogene משנת 2002). אנליזה של ביטוי HE4 ברמות נורמאליות וסרטניות באדם על ידי mRNA microarray על ידי Galgano וחב' (Mod Pathol משנת 2006), וכן נמצא ש-HE4 מתבטא ברמות גבוהות באופן יחסי בבלוטות הרוק ובטרכיאה (Clauss וחב' ב-Biochem Biophys Res Commun משנת 2005). על ידי שימוש בשיטת PCR כמותית, גילו Jiang וחב' רמות גבוהות של HE4 באפידידימיס, בטרכיאה ובריאות, וכמויות ממוצעות בבלוטת הערמונית, ברירית הרחם (אנדומטריום) ובשד. כמויות זעירות או חוסר ביטוי של HE4 יוחסו למעי הגס, לשחלה, לכבד, לשליה, לתאי דם לבנים ולרקמת שריר השלד.

===תכונות ביוכימיות של HE4===

HE4 מקודד כפפטיד בעל משקל מולקולארי של 13,000 דלטון, אך בצורתו הבשלה כגליקו-פרוטאין משקלו המולקולארי הוא 20-25 אלף דלטון, והוא חלבון חד שרשרתי. האנליזה של חומצות אמינו של HE4 העלתה מספר ניכר של שיירי ציסטאין במספר לא זוגי, מה שמאפשר לחלבון זה ליצור אינטראקציות עם חלבונים או פפטידים אחרים בקשר די-סולפידי. כן נמצא שחלבון HE4 מכיל 2 מקטעים של WAP או whey acidic protein שהוא חלבון "מי הגבינה" העיקרי בחלב, והוא חיוני בוויסות שגשוגם של תאי אפיתל ברמת השד. בנוסף, תפקיד WAP הוא כנראה דומה לזה של מעכב סרין-פרוטאזות כגון elastase. מבחינה מבנית, מקטע WAP מורכב מ-50 חומצות אמינו ובתוכן 8 שיירי ציסטאין מה שמאפשר 4 קשרי -S-S- תוך מולקולאריים. מחקרים in vitro תוך שימוש ב-mRNA של WAP הצביעו על כך שחלבון זה משפיע על התמיינותם ושגשוגם של תאים (Clauss וחב' ב-Biochem J משנת 2002).

WFDC2, הגן המקודד ל-HE4, ממוקם באדם על כרומוזום 20q12-13.1 על פי Iwabuchi וחב' ב-Cancer Res משנת 1995, והוא אחד מ-14 גנים הומולוגיים על כרומוזום זה המקודדים לחלבונים עם מקטעי WAP (על פי Drapkin וחב' ב-Cancer Res משנת 2005). מעניין לציין שה-locus הכרומוזומאלי q13.20 לעתים קרובות מייצג יתרונות שגשוגיים למספר סוגי סרטן, כגון ממאירויות של חלל הפה, השד, השחלה, המעי הגס, בלוטת הלבלב, הקיבה והרחם (Sonoda וחב' ב-Genes Chromosomes Cancer משנת 1997).אמנם, locus כרומוזומאלי זה מקודד למספר חלבוני WAP כולל
elafin ו-SLPI או Secreory Leukocyte Proteinase Inhibitor, שזוהו כסמנים פוטנציאליים למספר סוגי סרטן (Wiedow וחב' ב-J Biol Chem משנת 1990). למרות שאחדים מחלבונים אלה המכילים מקטעי WAP הם בעלי תפקיד כמעכבי פרוטאזות, דווקא HE4 משולל יכולת עיכוב זו.

למרות שהריכוז הגבוה של HE4 ביותרת האשך מרמז על מעורבות של חלבון זה בפוריות הגבר, התפקיד הפיזיולוגי של HE4 עדיין לא פוענח (Schummer וחב' ב-Gene משנת 1999). היו שייחסו ל-HE4 תפקיד בתהליך ההבשלה של תאי זרע (Kirchhoff וחב' ב-Biol Reprod משנת 1991).

===החלבון HE4 כסמן לסרטן השחלות===

תקופה ארוכה עסקו חוקרים בחיפוש אחר סמן אמין לסייע באבחון מוקדם של סרטן השחלות, כמו גם לסייע בניטור יעילות הטיפול בממאירות זו. HE4 הוא אחד החלבונים שביטויים עולה בממאירות של תא אפיתל שחלתיים, וקבוצות אחדות פרסמו נתון זה בראשית העשור הקודם (Ono וחב' וכן Hough וחב' ב-Cancer Res משנת 2000, כמו גם Shridhar וחב' ב-Cancer Res משנת 2001, וכן Welsh וחב' ב-Proc Natl Acad Sci USA משנת 2001, ו-Schaner וחב' ב-Mol Biol Cell וכן Drapkin ב-Cancer Res משנת 2005). בנוסף, הדגימו Hellström וחב' ב-Adv Exp Med Biol משנת 2008, את המשמעות של HE4 ושל SMRP או Soluble Mesothelin-Related Peptides כסמנים לסרטן השחלות בנפרד או כתוספת למדידת CA125.

על מנת למדוד את הריכוז של HE4 בנסיוב ולהחליט האם ריכוז מתאים לשמש סמן לסרטן השחלות, נדרשה שיטת כימות טובה. Hellström וחב' איחו את הגן המקודד ל-HE4 עם מקטעי Ig Fc מעכבר או מאדם, וחיסנו עכברים עם תוצר האיחוי לקבלה של היברידומות מהן הפיקו 2 נוגדנים חד-שבטיים (2H5 ו-3D8) שזיהו אפיטופים שונים של HE4. נוגדנים אלה שימשו לבניית sandwich-ELISA למדידה אמינה של HE4 בנסיוב (Lowe וחב' ב-Cancer Epidemiol Biomarkers Prev משנת 2008 ו-Schller וחב' ב-Clin Cancer Res משנת 2008).

[[קובץ:HE4-1.jpg|400px|ממוזער|מרכז|איחוי של HE4 ושל IgG ממקור אדם או עכבר לקבלת היברידומות מהם הופקו נוגדנים חד-שבטיים כנגד HE4.{{ש}}(לקוח מ-Hellstrom וחב' ב-Cancer Res משנת 2003.]]

מחקרים אחדים הצביעו על הכדאיות בהכללת מדידת HE4 באנליזה רבת-משתנים של הסיכון לסרטן השחלה, מה שיכול לשפר את הדיוק של בדיקת סקר לגילוי ממאריות זו, או לצורך ניטור המחלה (Andersen וחב' ב-Gynecol Oncol משנת 2009, ו-Lowe וחב' ב-Cancer Epidemiol Biomarkers Rev משנת 2008). מחקר נוסף משנת 2008 בחברת Centocor ב-Malvern פנסילבניה לבחינת נוגדנים חד שבטים להערכת ביצועיהם למדידת HE4 לצורך ניטור נשים עם סרטן השחלות, בחן שינויים ברמות HE4 בנסיוב של 80 מטופלות בדגימות סדרתיות להערכת סטאטוס המחלה.

במחקר זה נמדדו רמות HE4 ב-354 דגימות (ממוצע של 4.4 דגימות לכל מטופלת). שינוי חיובי הוגדר כ"עלייה ברמת HE4 שהייתה גבוהה לפחות ב-25% בהשוואה למדידה קודמת של מדד זה באותה מטופלת". תוצאות מחקר זה הראו שב- 76 מתוך 126 דגימות (60%) מהדגימות עם עלייה ברמת מדד זה, נמצאה גם התקדמות במהלך המחלה. לעומת זאת, ב-171 מתוך 228 דגימות (75%) בהן לא נמצאה עלייה משמעותית ברמת HE4 ביו דגימות נסיוב של אותה מטופלת, לא נמצא כל שינוי בסטאטוס המחלה. סך ההתאמה של ממצאי מדידת HE4 ומצב המחלה נקבע בניסוי זה כ-70%.

על ידי microarrays של רקמות, Drapkin וחב' הראו ש-HE4 היה מוגבל למספר תת-סוגים היסטולוגיים של EOC או epithelial ovarian carcinoma, ובשיטה זו נמצא ש-HE4 התבטא ב-93% בנוזל הסרוזי וב-100% באפיתל הרירית של השחלות במקרי ממאירות. לעומת זאת, רק ב-50% של קרצינומת Clear-cells וב-0% של mucinous tumors היה ביטוי של HE4. יש לציין שהגידולים האחרונים מהווים חלק מה-surface epithelial-stromal tumor של שאתות השחלה, ומהווים כ-36% מכלל שאתות אלה. יחד עם זאת כ-75% מה-mucinous tumors של השחלה הם שפירים, 10% הם גבוליים, ורק 10% מהם ממאירים, מה שיכול להסביר את ההתבטאות האפסית של HE4 בגידולים אלה.

===רגישות וספציפיות של מדידת HE4 בהשוואה ל-CA125===

כאמור נמצא ש-HE4 בא לביטוי במספר רקמות נורמאליות כולל האפיתל של מערכות הנשימה והרבייה (Bingle וחב' ב-Oncogene משנת 2002). רמות מוגברות של HE4 התגלו גם במספר שורות תאים סרטניים, כולל תאי סרטן של שחלה, ריאה, מעי גס ושד. Galgano וחב' ב-Mod Pathol משנת 2004, הדגישו במיוחד את ביטוי HE4 בקרצינומה של השחלה בהשוואה לרקמה בריאה של השחלות. בשנת 2003 דווחו Hellstrom וחב' ב-Cancer Res משנת 2003 על גילוי רמות גבוהות של HE4 בנסיוב של מטופלות עם סרטן שחלות. בדיווח זה הודגש אמנם שהרגישות והספציפיות של מדידת HE4 הייתה דומה לזו CA125 באבחון מבדיל של נשים בגיל חידלון הווסת עם סרטן השחלות מזה של נשים בריאות, אם כי צוין שיש למדידת HE4 יתרון על CA125 בכך שתוצאות חיוביות שלו פחות שכיחות בנשים עם מחלה לא ממאירה.

אחת המטה-אנליזות העדכניות המשוות בין ביצועי HE4 ו-CA125 לגבי אבחון סרטן השלות התפרסמה ע"י Ferraro וחב' ב-J Clin Pathol משנת 2013, והקיפה 13 מאמרים. על ידי שילוב של ספציפיות ורגישות חושב המדד של likelihood ratio או יחס הנראוּת (שהוא מדד המשמש להערכת כוחן או יעילותן של בדיקות אבחון בזיהוי קיומם של מצבים או בזיהוי העדרם. יחס נראוּת הוא היחס בין הסתברות תוצאות בדיקה מסוימת באנשים חולים להסתברות תוצאות הבדיקה באנשים בריאים). לגבי HE4 נקבע יחס נראות חיובי (LR+) של 13.0 ויחס נראוּת שלילי (LR-) של 0.23; לעומת זאת לגבי CA125 יחס הנראות החיובי נקבע כ-4.2 ויחס נראוּת שלילי של 0.27. נראה כי מדידת HE4 עדיפה על זו של CA125 למטרה אבחון סרטן שחלות בנשים חשודות למחלה גינקולוגית ממאירה.

מספר משמעותי של פרסומים הדגימו את היתרון של HE4 על CA125 כסמן של סרטן השחלות. באופן ספציפי, היכולת של HE4 להבדיל בין מחלות שפירות ומחלות ממאירות הודגשה על ידי Rustin וחב' ב-Clin Cancer Res משנת 2004, ע"י Gadducci וחב' ב-Biomed Pharmacother משנת 2004, ע"י Lowe וחב' ב-Cancer Epidemiol Biomarkers Prev משנת 2008 ו-Scholler וחב' ב-Clin Cancer Med משנת 2008. מחקר של Moore וחב' ב-Gynecol Oncol משנת 2008 בחן דגימות נסיוב ושתן של 259 עם מסה אדנקסלית המודגמת בדימות של האגן מטופלות לפני ניתוח לרמות CA125, כמו גם רמות HE4, אקטיבין, אינהיבין, ostepontin, קולטן ל-EGF ,CA72-4 ,soluble mesothelin-related peptide ורמת human epidermal growth factor receptor 2. בין 259 נבדקות אלו נמצאו 233 נשים מתאימות לאנליזת סמנים אלה (67 עם סרטן שחלות אפיתליאלי חודרני, ו-166 עם גידול שפיר בשחלות).
מחקר אחרון זה הראה ש-HE4 כסמן יחיד היה בעל הרגישות הגבוהה ביותר של 72.9% וספציפיות של 95%. השילוב של CA125 ו-HE4, השיג את הרגישות הגבוהה ביותר בהשוואה על כל הסמנים הבודדים האחרים.

תוצאות מחקר זה היו כדלקמן: רמות HE4 היו מוגברות בדמם של-1.1% מקבוצת הנבדקים הבריאים, ומוגברות בדמם של 12.3% מהנבדקים עם מחלות שפירות. לעומת זאת CA125 נמצא מוגבר ב-9.9% מהנבדקים הבריאים, וב-37% מאלה עם מחלות שפירות. כשל כליות היה הגורם השכיח ביותר לרמות מוגברות של HE4 בנבדקים עם מחלות שפירות (p=0.001), בהשוואה לנבדקים עם מחלות שפירות אחרות. HE4 הראה ספציפיות גבוהה יותר מאשר CA125 בנבדקים עם מחלות גינקולוגיות שפירות עם 1.3% של תוצאות מוגברות-כזובות לעומת 33.2% תוצאות מוגברות-כזובות במדידת CA125.

[[קובץ:HE4-2.jpg|400px|ממוזער|מרכז|לקוח מנתוני HE4 EIA KIT Malvern, PA: Fujirebio Diagnostics, Inc. June, 2008.]]

[[קובץ:HE4-3.jpg|400px|ממוזער|מרכז|ביטוי של HE4 ברקמות נורמאליות של האדם: CIC-cortical inclusion cysts ; OSE- ovary surface endometrium.{{ש}}לקוח מ-Drapkin וחב' ב-Cancer Res משנת 2005.]]

שיעור התמותה מסרטן השחלות נמצא במתאם חזק עם שלב גילוי המחלה: הישרדות של 5 שנים גבוהה מ-70% ב-Stage I או ב-stage II, אך פוחתת ל-0-20% כשהאבחון נעשה ב-stage III או ב-stage IV (עפ"י Jacobs וחב' ב-Mol Cell Proteomics משנת 2004, ו-Bast וחב' ב-Int J Gynecol Cancer משנת 2005). למעלה מ-3 עשורים היווה CA125 הסמן השולט בתחום אבחון סרטן השחלות מאז דווח עליו לראשונה על ידי Bast ו-Knapp בשנת 1981 ב-J Clin Invest. אלא שבמרוצת השנים התברר שחולשת סמן זה נעוצה ברגישות ממוצעת ובספציפיות נמוכה. הרגישות האבחונית של CA125 בסרטן השחלות היא של 50% בנבדקות ב-stage I ושל 80-90% בנבדקות ב-stage III וב-stage IV (עפ"י Molina וחב' ב-Tumor Biol משנת 1992, Rosen וחב' ב-Gynecol Oncol משנת 2005, Moore וחב' ב-Gynecol Oncolo משנת 2009, ו-Duffy וחב' ב-Int J Gynecol Cancer משנת 2005).

אך הבעיה החמורה יותר עם CA125 היא הספציפיות היחסית נמוכה שלו, כאשר רמות גבוהות של סמן זה מתקבלות בממאירויות של רקמות גינקולוגיות אחרות כגון endometrium ו-endocervix, שאתות אפיתליאליות אחרות כמו סרטן ריאות, ואף ממאירויות לא-אפיתליאליות כגון לימפומות (עפ"י Molina וחב' ב-Tumor Biol משנת 2009 ו-Sevinc וחב' ב-Oncology משנת 2003). רמות גבוהות של CA125 יכולות להתקבל גם בתרחישים שפירים כולל כּשל של הכבד או הכליות, ציסטות של השחלה, שרירנים (myomas) וכן בנשים בשלב שלפני מחידלון הווסת (Anastasi וחב' ב-Tumor Biol משנת 2010). כמו כן רמות CA125 יכולות להשתנות משמעותית לאורך תקופת המחזור או ההיריון (Moore וחב' ב-Am J Obstet Gynecol משנת 2010 ו-Nolen וחב' ב-Gynecol Oncol משנת 2010).

===שילוב של מדידת HE4 ו-CA125===

Moore וחב' הראו ש-HE4 הוא בעל רגישות מעט טובה יותר מאשר ל-CA125 בדיווח ב-Gynecol Oncol משנת 2008, וכללית קבעו Moore וחב' ששילוב 2 המדדים הללו מנבא טוב יותר ממאירות בשחלה מאשר שימוש יחידני בכל אחד מהשניים. חוקרים אלה מצאו ש-HE4 במיוחד עדיף בגילוי סרטן שחלות ב-stage I, כאשר רגישות זו לא גדלה כאשר המדידה בשלב מוקדם של המחלה נעשה במשולב עם מדידת CA125 (עפ"י Havrilesky וחב' ב-Gynecol Oncol משנת 2008). במחקר זה נמצא ש-HE4 הוא בעל הרגישות הגבוהה ביותר בין סדרה של סמנים כולל CA125, לגילוי של סרטן שחלות בשלביו המוקדמים (62.4-82.7%) או בשלביו המאוחרים (74.6-92.5%). חוקרים אלה מצאו ששילוב של 3 סמנים HE4, MMP7 ו-glycodelin לניטור סרטן השחלות, ניבא ב-56% מהמקרים את הישנות המחלה לפני שנצפתה עלייה ברמת CA125.

במחקר של Montagnana וחב' שהופיע ב-J Clin Lab Anal בשנת 2009, נמצא שעקומת ROC או Receiver Operating Characteristics שנערכה בנשים בריאות ובאלה עם שאתות בשחלה, היה ל-HE4 שטח מתחת לעקומה (AUC) גדול משמעותית (0.99 לעומת 0.91) מזה של CA125, כאשר הרגישות והספציפיות של HE4 נקבעו כ-98% ו-100%, בהתאמה. Huhtinen וחב' ב-Br J Cancer משנת 2009, מצאו שהרמות הממוצעות של HE4 היו גבוהות יותר משמעותית במטופלות עם סרטני השחלה או רירית הרחם, בהשוואה לרמות מדד זה בנשים עם ציסטה של השחלה (אנדומטריומה), או באלו עם סוגים שונים של אנדומטריוזיס. ממצא זה מרמז לכך שמבחן HE4 עשוי לסייע בהבדלה בין שאתות בשחלה לבין ציסטות אנדומטריוטיות. במחקרו זה בחן Huhtinen דגימות נסיוב של 2245 נשים עם סרטן שחלה, סרטן רירית הרחם, אנדומטריוזיס או נשים בריאות.

הבדיקה המשולבת של HE4 פלוס CA125 השיגה רגישות משופרת של 92.9% וספציפיות של 95% בהשוואה למדידת כל אחד מ-2 מדדים האלה בנפרד (HE4 עם רגישות של 78.6% לעומת CA125 עם רגישות של 78.6%). רמות HE4 היו מוגברות בממאירויות של השחלה ושל האנדומטריום, אך לא באנדומטריוזיס. רמות מוגברות של CA125 ללא עלייה ברמת HE4 מהווה ראייה ספציפית לאנדומטריוזיס מתקדמת או לאנדומטריומה שחלתית. לעומת זאת, רמה מוגברת של HE4 ורמה נורמאלית של CA125, מרמזים סרטן שחלה או סוגי סרטן אחרים, כולל סרטן רירית הרחם.

Escudero וחב' פרסמו ב-Clinical Chemistry משנת 2011 מחקר השוואתי בו נבחנו CA125 ו-HE4 כסמנים בנשים בריאות וכן באלו עם מחלה גינקולוגית ממארת. הבסיס למחקר זה נבע מממצאים מהם השתמע ש-HE4 בא לביטוי גם באדנוקרצינומה של מערכת הנשימה, של רירית הרחם ושל השד, וכן במזותליומה, ולעתים פחות שכיחות גם בקרצינומות של מערכת העיכול, של הכליות כמו גם ב-TCC של מערכת השתן, שלפוחית השתן והכליות (Galgano וחב' ב-Mod Pathol משנת 2006, וכן Bingle וחב' ב-Oncogene משנת 2002 ו-Drapkun וחב' ב-Cancer Res משנת 2005).

במחקר זה נמדדו רמות CA125 ו-HE4 בדגימות נסיוב של 101 אנשים בריאים, 535 מטופלים עם פתולוגיות שפירות (מתוכם 292 נשים עם מחלות גינקולוגיות שפירות), ו-423 מטופלים עם ממאירויות שונות (מתוכם 127 נשים עם סרטן השחלות). הסף העליון של הנורמה לגבי CA125 במחקר זה נקבע כ-35kU/L, ואילו ל-HE4 נקבע סף עליון של 140 פיקומול/ליטר.

ריכוזי HH4 היו מוגברים בעיקר בממאירויות גינקולוגיות ובאלה של הריאות. לעומת זאת, רמות CA125 היו מוגברות בממאירויות רבות שאינן שחלתיות, כולל שאתות לא-אפיתליאליות. תוצאות מדידת השטח מתחת עקומת ROC שהתקבלו עם HE4, היו גבוהות משמעותית מאלה שהתקבלו עם CA125 בהבדלה בין מחלות שפירות וממאירות (0.755 לעומת 0.643) וכן בהבדלה אבחונית של מחלות גינקולוגיות שפירות וממאירות (0.874 לעומת 0.722). מסקנות מחקר זה היו ש-HE4 הוא בעל ספציפיות אבחונית גבוהה יותר מזו של CA125, ושמדידה משולבת של שני סמנים אלה, שיפרה את רגישות הזיהוי של סרטן השחלות בהשוואה למדידה יחידנית שלכל אחד מ-2 הסמנים, בכל שלבי המחלה והסוגים ההיסטולוגיים שלה.

יחד עם זאת מדידה משולבת של 2 הסמנים הפחיתה את הספציפיות, זאת כיוון ששיעור התוצאות המוגברות-כזובות של CA125 במחלות גינקולוגיות גבוה יותר בעיקר בנשים לפני גיל חידלון הווסת. תוצאות לא נורמאליות של CA125 נמצאו ב-18.7% (54 נבדקות) עם מחלה שפירה, כאשר מדידת HE4 נתנה תוצאות בתוך תחום הנורמה ב-52 מתוך 54 הנבדקות. ממצאים אלה תואמים את ממצאיהם של Hellström וחב' ב-Cancer Res משנת 2010, וכן את ממצאי Huhtinen וחב' ב-Br J Cancer משנת 2009, ואת אלה של Montagnana וחב' ב-J Clin Lab Anal משנת 2009.

===משמעות מדידת HE4 בסרטן רירית הרחם===

בדומה לסרטן השחלות, ממאירויות של רירית הרחם נוטות לפרוגנוזה רצויה כאשר האבחון הוא מוקדם. לעומת זאת, אבחון בשלב מאוחר, כצפוי מביא לאחוז הישרדות לתקופה של 5 שנים. יחד עם זאת, הופעת תסמינים בשלבים מוקדמים של ממאירות זו, כולל דימומי בנשים בגיל חידלון הווסת, בדרך כלל מאפשר אבחון כבר ב-Stage I בערך ב-70% ממקרי סרטן רירית הרחם. נכון להיום, הישנות של סרטן רירית הרחם מתגלה על ידי הופעת תסמינים קליניים וטכניקות הדמיה, אך אלה באופן כללי מביאים לזיהוי מצבים מתקדמים של המחלה. השימוש במדד CA125 לגילוי הישנות סרטן רירית הרחם מביא לגילוי שלבים מתקדמים של המחלה, שכן רק ב-10-20% מהנשים ב-stage I וב-25% מבין הנשים עם הישנות בלתי תסמינית של המחלה ערכי CA125 יימצאו מוגברים (עפ"י Duk וחב' ב-Am J Obstet Gynecol משנת 1986; Sood וחב' ב-Obstet Gynecol משנת 1997; Vuento וחב' ב-Gynecol Oncol משנת 1997; Ginath וחב' ב-Int J Gynecol Cancer משנת 2002; Hsieh וחב' ב-Gynecol Oncol משנת 2002 ו-Powel וחב' ב-J Reprod Med משנת 2005).

רק מספר מוגבל של קבוצות מחקר החלו לבחון את יעילות HE4 כסמן בנסיוב לממאירות של רירית הרחם, ומהם נובע שלמדד זה יש ערך מבטיח בגילוי סרטן זה. Moore וחב'ב-Gynecol Oncol משנת 2008, מדדו דגימות נסיוב של נשים עם אדנוקרצינומה של ה-endometrioid לפני ניתוח, עם ביקורת של נשים בריאות בגיל חידלון הווסת. נמדדו רמות HE4 ,CA72-4 ,soluble mesothelin-related peptide ו-CA125. התוצאות הצביעו שכמדד יחיד, יש ל-HE4 יתרון על פני המדדים האחרים ללא קשר ל-stage של המחלה.

ערכי השטח מתחת לעקומת ROC עבור HE4 כסמן יחיד היו גבוהים יותר מאלה של כל הסמנים האחרים שנחקרו ב-stage I ו-stage II-IV שנקבעו כ-76.7 ו-83.6, בהתאמה. הרגישות במדידת HE4 הייתה אף היא הגבוהה ביותר בהשוואה לכל הסמנים האחרים, ללא קשר ל-stage של המחלה (רגישות של 48.4% לגבי stage I ושל 71.4% לגבי stage II-IV. הוספת מדידה של CA125 לזו של HE4 הגבירה משמעותית את הרגישות בהשוואה לזו שהושגה עם CA125 כסמן יחיד (50.1% לעומת 24.6%). השילוב של 2 הסמנים CA125 ו-HE4 היה בעל יתרון בהתאם למדד ROC-AUC בהשוואה למדידה של HE4 בלבד לגבי stage II-IV של המחלה (86.6 לעומת 83.6), אך היה חסר יתרון בהשוואה למדידה יחידנית של HE4 ב-stage I של המחלה. נתונים אלה מצביעים על HE4 כסמן המדויק והרגיש ביותר של סרטן רירית הרחם.

===ריכוזי HE4 בדלף לנוזל הפריטונאלי בתרחישים ממאירים או במחלות שחלה שפירות===

במחקר של Chudecka-Glaz וחב' ב-J Ovarian Res נבחן הסמן HE4 בנוזל פריטונאלי במחלות שונות של מערכת הרבייה הנקבית. גויסו למחקר 139 נשים, מהן 40 עם סרטן שחלות, 82 עם מחלה שפירה של השחלות, ו-17 עם ממאירויות אחרות. רמת HE4 נמדדה בנסיוב. בנוזל הפריטונאלי, כמו גם בנוזל מציסטות שחלתיות או מהשאת השחלתית. על פי ממצאי מחקר זה לא נמצאו הבדלים משמעותיים סטטיסטית בין שתי קבוצות הנשים הראשונות, על פי הממצאים הבאים: בקבוצת הנשים עם סרטן השחלות ריכוז HE4 בנוזל הפריטונאום היה בממוצע 3.32 ננומול/ליטר, ריכוזו בקבוצת הנשים עם מחלה שפירה של השחלות היה 2.15 ננומול/ליטר בממוצע, ואילו ריכוזו הממוצע של HE4 בקבוצת הנשים עם ממאירויות באיברים שאינם קשורים ישירות למערכת הרבייה הנשית נקבע כ-0.68 ננומול/ליטר. בין הקבוצה הראשונה והשנייה לא נמצא הבדל מובהק (p=0.206), ההבדל בין הקבוצה הראשונה והשלישית אף הוא לא היה משמעותי במיוחד (p=0.06), וכן לא היה הבדל משמעותי במיוחד בין רמת HE4 בקבוצות השנייה והשלישית. בקבוצת הנשים עם סרטן השחלות, לא נמצאו הבדלים ברמת HE4 בנוזל הפריטונאלי ללא קשר ל-stage, ל-grade או לנוכחות של תאים סרטניים ולמידת התפשטות תאים אלה לפריטונאום. נראה אם כן מתוצאות מחקר זה שהפריטונאום אינו יכול לשמש למדידת HE4 למטרה אבחונית או למטרת ניטור סרטן השחלות.

==הוראות לביצוע הבדיקה==

יש לדגום את הדם במבחנה כימית (פקק אדום או צהוב), ואחר הפרדת הדם יש לקרר או להקפיא מייד. הדגימה יציבה 72 שעות בקירור או 4 שבועות בהקפאה. אין צורך בשום הכנה מוקדמת של הנבדקת. אין להשתמש בפלזמה, ולהקפיד על ביצוע הבדיקה בנסיוב. סיבות לדחיית הדגימה: המוליזה ניכרת, ליפמיה או דגימה איקטרית, נוכחות פיברין, כדוריות דם אדומות או חלקיקים אחרים, זיהום בקטריאלי של הדגימה. אין לבצע מדידת HE4 במקרים מאובחנים של סרטן השחלות מסוגי mucinous או germ-cell.

רמות HE4 נוטות להיות גבוהות יתר בנשים מבוגרות יותר, או בנשים בהם המחזור הופיע בגיל מבוגר יחסית, ועל פי Urban וחב' ב-Cancer Epidemiol Biomarkers Prev משנת 2012, רמה ממוצעת של HE4 בנשים בריאות בגיל 30 שנה הוא 41.4 פיקומול'/ליטר, והיא עולה לרמה ממוצעת של 82.1 פיקומול'/ליטר בגיל 80 שנה. תוצאות כזובות של רמת HE4 עלולות להתקבל בדגימות נסיוב בהן יש נוגדנים אוטו-אימוניים, או נוגדנים הטרופיליים כנגד אימונוגלובולינים של עכברים. רמות HE4 בתוך התחום הנורמאלי אינן שוללות ממאירות, לכן אין להשתמש במדד זה כבדיקת סריקה לגילוי סרטן השחלות. כמו כן אין להשתמש במדידת HE4 בנבדקות עם mucinous ovarian cancer או עם germ-free ovarin cancer. השיטה המקובלת למדידת HE4 היא ELISA. אין ליטול דגימת דם ממטופלים המקבלים ביוטין במינון גבוה (מעל 5 מיליגרם ליום), עד שחלפו לפחות 8 שעות מנטילת הביוטין האחרונה.

ביוני 2008 אישר ה-FDA את הערכה של Fujirebio Diagnostics משוודיה, למדידת HE4. במרס 2010 פיתחה חברת Abbott Diagnostics, UK ביחד עם Fujirebio Diagnostics את ערכת ARCHITECT HE4 לבדידה אוטומטית של סמן זה, גרסה שאושרה על ידי ה-FDA.

==ראו גם==
* [[מדריך בדיקות מעבדה|חזרה לדף מדריך בדיקות מעבדה]]
* [[סמנים סרטניים|בדיקות מעבדה - סמנים סרטניים]]

{{ייחוס|[[משתמש:בן עמי סלע|פרופ' בן-עמי סלע]]}}

[[קטגוריה:בדיקות מעבדה - סמנים סרטניים]]
[[קטגוריה:בדיקות מעבדה: כימיה בדם]]

HE4 - Human epididymal protein 4

2015-09-07T08:19:56Z

בן עמי סלע:

{{בדיקת מעבדה
|שם עברי={{רווח קשיח|2}}
|שם לועזי=HE4 - Human epididymal protein 4
|קיצור=WFDC2 או WAP four-disulfide core domain protein 2
|תמונה=
|כיתוב תמונה=
|מעבדה=[[כימיה בדם]]
|תחום=הערכת [[סרטן השחלות]], וניטור מהלך המחלה
|יחידות מדידה=
|טווח ערכים תקין=בנסיוב של נשים בגיל הפוריות - פחות מ-70 פיקומול'/ליטר; בנסיוב של נשים בגיל חידלון הווסת - פחות מ-140 פיקומול'/ליטר
|יוצר הערך=[[משתמש:בן עמי סלע|פרופ' בן-עמי סלע]]
|אחראי הערך=
}}
{{הרחבה|סרטן השחלות}}
==מטרת הבדיקה==

עזר בניטור נשים מטופלות עם סרטן אפיתליאלי של השחלות להתפתחות המחלה או לחזרתה לאחר טיפול תרופתי או ניתוח.

==בסיס פיזיולוגי==

סרטן השחלות היא הסיבה החמישית במעלה לתמותה מממאירות בקרב נשים בארה"ב, וששית בשכיחותה בקרב נשים בעולם כולו, כאשר שכיחות המחלה עולה עם הגיל ועם הסטאטוס של חידלון הווסת. על פי נתוני ה-ACS התגלו בארה"ב 22,280 מקרים חדשים בשנת 2012, ובאותה שנה 15,500 נשים נפטרו מסרטן השחלות. על פי נתוני ה-IARC בליון משנת 2012 שסוכמו על ידי Ferlay וחב', שכיחות ממאירות זו עולה מ-4.7 לכל מאה אלף נשים מתחת גיל 50 שנה, ל-29.6 מקרים לכל מאה אלף נשים בגיל 50-64 שנה. נכון להיום סרט השחלות היא הסיבה הראשונה במעלה לתמותה ממאירויות גינקולוגיות, שכן כ-75% מהמקרים מתגלים בשלבים מתקדמים ומפושטים שלה, זאת כיוון שבשלבים המוקדמים סרטן השחלות חסר תסמינים, ואין שיטה סריקה יעילה לגילוי מוקדם של ממאירות זו (עפ"י Fountain וחב' ב-Gynecol Oncol משנת 2006). אכן, הפער הגדול בין שיעורי ההישרדות כאשר אבחון המחלה נעשה מוקדם (80-90% הישרדות) או כאשר היא מאובחנת בשלב מאוחר (15-20% הישרדות), מבליט את הנחיצות לסמנים אמינים לאבחון מבדיל בין סרטן שחלות ממאיר לבין מסה שפירה באזור האגן.

===גילוי HE4===

הסמן HE4 זוהה לראשונה ואופיין על ידי Kirchhoff וחב' במהלך סריקה דיפרנציאלית של ספריות cDNA של רקמה אפידידימאלית (יותרת האשך) בגבר, ופרסמו זאת ב-Biol Reprod בשנת 1991. מכאן נגזר שמו של החלבון Human Epididymis Protein 4 או HE4. מחקרי המשך גילו את הביטוי של HE4 במספר רקמות מחוץ למערכת הרבייה הגברית, כאשר בין השאר גילו Bingle וחב' בשיטת northern hybridization mRNA של HE4 בריאות, בכליות ובבלוטות הרוק נורמאליות (Oncogene משנת 2002). אנליזה של ביטוי HE4 ברמות נורמאליות וסרטניות באדם על ידי mRNA microarray על ידי Galgano וחב' (Mod Pathol משנת 2006), וכן נמצא ש-HE4 מתבטא ברמות גבוהות באופן יחסי בבלוטות הרוק ובטרכיאה (Clauss וחב' ב-Biochem Biophys Res Commun משנת 2005). על ידי שימוש בשיטת PCR כמותית, גילו Jiang וחב' רמות גבוהות של HE4 באפידידימיס, בטרכיאה ובריאות, וכמויות ממוצעות בבלוטת הערמונית, ברירית הרחם (אנדומטריום) ובשד. כמויות זעירות או חוסר ביטוי של HE4 יוחסו למעי הגס, לשחלה, לכבד, לשליה, לתאי דם לבנים ולרקמת שריר השלד.

===תכונות ביוכימיות של HE4===

HE4 מקודד כפפטיד בעל משקל מולקולארי של 13,000 דלטון, אך בצורתו הבשלה כגליקו-פרוטאין משקלו המולקולארי הוא 20-25 אלף דלטון, והוא חלבון חד שרשרתי. האנליזה של חומצות אמינו של HE4 העלתה מספר ניכר של שיירי ציסטאין במספר לא זוגי, מה שמאפשר לחלבון זה ליצור אינטראקציות עם חלבונים או פפטידים אחרים בקשר די-סולפידי. כן נמצא שחלבון HE4 מכיל 2 מקטעים של WAP או whey acidic protein שהוא חלבון "מי הגבינה" העיקרי בחלב, והוא חיוני בוויסות שגשוגם של תאי אפיתל ברמת השד. בנוסף, תפקיד WAP הוא כנראה דומה לזה של מעכב סרין-פרוטאזות כגון elastase. מבחינה מבנית, מקטע WAP מורכב מ-50 חומצות אמינו ובתוכן 8 שיירי ציסטאין מה שמאפשר 4 קשרי -S-S- תוך מולקולאריים. מחקרים in vitro תוך שימוש ב-mRNA של WAP הצביעו על כך שחלבון זה משפיע על התמיינותם ושגשוגם של תאים (Clauss וחב' ב-Biochem J משנת 2002).

WFDC2, הגן המקודד ל-HE4, ממוקם באדם על כרומוזום 20q12-13.1 על פי Iwabuchi וחב' ב-Cancer Res משנת 1995, והוא אחד מ-14 גנים הומולוגיים על כרומוזום זה המקודדים לחלבונים עם מקטעי WAP (על פי Drapkin וחב' ב-Cancer Res משנת 2005). מעניין לציין שה-locus הכרומוזומאלי q13.20 לעתים קרובות מייצג יתרונות שגשוגיים למספר סוגי סרטן, כגון ממאירויות של חלל הפה, השד, השחלה, המעי הגס, בלוטת הלבלב, הקיבה והרחם (Sonoda וחב' ב-Genes Chromosomes Cancer משנת 1997).אמנם, locus כרומוזומאלי זה מקודד למספר חלבוני WAP כולל elafinו-SLPI או Secreory Leukocyte Proteinase Inhibitor, שזוהו כסמנים פוטנציאליים למספר סוגי סרטן (Wiedow וחב' ב-J Biol Chem משנת 1990). למרות שאחדים מחלבונים אלה המכילים מקטעי WAP הם בעלי תפקיד כמעכבי פרוטאזות, דווקא HE4 משולל יכולת עיכוב זו.

למרות שהריכוז הגבוה של HE4 ביותרת האשך מרמז על מעורבות של חלבון זה בפוריות הגבר, התפקיד הפיזיולוגי של HE4 עדיין לא פוענח (Schummer וחב' ב-Gene משנת 1999). היו שייחסו ל-HE4 תפקיד בתהליך ההבשלה של תאי זרע (Kirchhoff וחב' ב-Biol Reprod משנת 1991).

===החלבון HE4 כסמן לסרטן השחלות===

תקופה ארוכה עסקו חוקרים בחיפוש אחר סמן אמין לסייע באבחון מוקדם של סרטן השחלות, כמו גם לסייע בניטור יעילות הטיפול בממאירות זו. HE4 הוא אחד החלבונים שביטויים עולה בממאירות של תא אפיתל שחלתיים, וקבוצות אחדות פרסמו נתון זה בראשית העשור הקודם (Ono וחב' וכן Hough וחב' ב-Cancer Res משנת 2000, כמו גם Shridhar וחב' ב-Cancer Res משנת 2001, וכן Welsh וחב' ב-Proc Natl Acad Sci USA משנת 2001, ו-Schaner וחב' ב-Mol Biol Cell וכן Drapkin ב-Cancer Res משנת 2005). בנוסף, הדגימו Hellström וחב' ב-Adv Exp Med Biol משנת 2008, את המשמעות של HE4 ושל SMRP או Soluble Mesothelin-Related Peptides כסמנים לסרטן השחלות בנפרד או כתוספת למדידת CA125.

על מנת למדוד את הריכוז של HE4 בנסיוב ולהחליט האם ריכוז מתאים לשמש סמן לסרטן השחלות, נדרשה שיטת כימות טובה. Hellström וחב' איחו את הגן המקודד ל-HE4 עם מקטעי Ig Fc מעכבר או מאדם, וחיסנו עכברים עם תוצר האיחוי לקבלה של היברידומות מהן הפיקו 2 נוגדנים חד-שבטיים (2H5 ו-3D8) שזיהו אפיטופים שונים של HE4. נוגדנים אלה שימשו לבניית sandwich-ELISA למדידה אמינה של HE4 בנסיוב (Lowe וחב' ב-Cancer Epidemiol Biomarkers Prev משנת 2008 ו-Schller וחב' ב-Clin Cancer Res משנת 2008).

[[קובץ:HE4-1.jpg|400px|ממוזער|מרכז|איחוי של HE4 ושל IgG ממקור אדם או עכבר לקבלת היברידומות מהם הופקו נוגדנים חד-שבטיים כנגד HE4.{{ש}}(לקוח מ-Hellstrom וחב' ב-Cancer Res משנת 2003.]]

מחקרים אחדים הצביעו על הכדאיות בהכללת מדידת HE4 באנליזה רבת-משתנים של הסיכון לסרטן השחלה, מה שיכול לשפר את הדיוק של בדיקת סקר לגילוי ממאריות זו, או לצורך ניטור המחלה (Andersen וחב' ב-Gynecol Oncol משנת 2009, ו-Lowe וחב' ב-Cancer Epidemiol Biomarkers Rev משנת 2008). מחקר נוסף משנת 2008 בחברת Centocor ב-Malvern פנסילבניה לבחינת נוגדנים חד שבטים להערכת ביצועיהם למדידת HE4 לצורך ניטור נשים עם סרטן השחלות, בחן שינויים ברמות HE4 בנסיוב של 80 מטופלות בדגימות סדרתיות להערכת סטאטוס המחלה.

במחקר זה נמדדו רמות HE4 ב-354 דגימות (ממוצע של 4.4 דגימות לכל מטופלת). שינוי חיובי הוגדר כ"עלייה ברמת HE4 שהייתה גבוהה לפחות ב-25% בהשוואה למדידה קודמת של מדד זה באותה מטופלת". תוצאות מחקר זה הראו שב- 76 מתוך 126 דגימות (60%) מהדגימות עם עלייה ברמת מדד זה, נמצאה גם התקדמות במהלך המחלה. לעומת זאת, ב-171 מתוך 228 דגימות (75%) בהן לא נמצאה עלייה משמעותית ברמת HE4 ביו דגימות נסיוב של אותה מטופלת, לא נמצא כל שינוי בסטאטוס המחלה. סך ההתאמה של ממצאי מדידת HE4 ומצב המחלה נקבע בניסוי זה כ-70%.

על ידי microarrays של רקמות, Drapkin וחב' הראו ש-HE4 היה מוגבל למספר תת-סוגים היסטולוגיים של EOC או epithelial ovarian carcinoma, ובשיטה זו נמצא ש-HE4 התבטא ב-93% בנוזל הסרוזי וב-100% באפיתל הרירית של השחלות במקרי ממאירות. לעומת זאת, רק ב-50% של קרצינומת Clear-cells וב-0% של mucinous tumors היה ביטוי של HE4. יש לציין שהגידולים האחרונים מהווים חלק מה-surface epithelial-stromal tumor של שאתות השחלה, ומהווים כ-36% מכלל שאתות אלה. יחד עם זאת כ-75% מה-mucinous tumors של השחלה הם שפירים, 10% הם גבוליים, ורק 10% מהם ממאירים, מה שיכול להסביר את ההתבטאות האפסית של HE4 בגידולים אלה.

===רגישות וספציפיות של מדידת HE4 בהשוואה ל-CA125===

כאמור נמצא ש-HE4 בא לביטוי במספר רקמות נורמאליות כולל האפיתל של מערכות הנשימה והרבייה (Bingle וחב' ב-Oncogene משנת 2002). רמות מוגברות של HE4 התגלו גם במספר שורות תאים סרטניים, כולל תאי סרטן של שחלה, ריאה, מעי גס ושד. Galgano וחב' ב-Mod Pathol משנת 2004, הדגישו במיוחד את ביטוי HE4 בקרצינומה של השחלה בהשוואה לרקמה בריאה של השחלות. בשנת 2003 דווחו Hellstrom וחב' ב-Cancer Res משנת 2003 על גילוי רמות גבוהות של HE4 בנסיוב של מטופלות עם סרטן שחלות. בדיווח זה הודגש אמנם שהרגישות והספציפיות של מדידת HE4 הייתה דומה לזו CA125 באבחון מבדיל של נשים בגיל חידלון הווסת עם סרטן השחלות מזה של נשים בריאות, אם כי צוין שיש למדידת HE4 יתרון על CA125 בכך שתוצאות חיוביות שלו פחות שכיחות בנשים עם מחלה לא ממאירה.

אחת המטה-אנליזות העדכניות המשוות בין ביצועי HE4 ו-CA125 לגבי אבחון סרטן השלות התפרסמה ע"י Ferraro וחב' ב-J Clin Pathol משנת 2013, והקיפה 13 מאמרים. על ידי שילוב של ספציפיות ורגישות חושב המדד של likelihood ratio או יחס הנראוּת (שהוא מדד המשמש להערכת כוחן או יעילותן של בדיקות אבחון בזיהוי קיומם של מצבים או בזיהוי העדרם. יחס נראוּת הוא היחס בין הסתברות תוצאות בדיקה מסוימת באנשים חולים להסתברות תוצאות הבדיקה באנשים בריאים). לגבי HE4 נקבע יחס נראות חיובי (LR+) של 13.0 ויחס נראוּת שלילי (LR-) של 0.23; לעומת זאת לגבי CA125 יחס הנראות החיובי נקבע כ-4.2 ויחס נראוּת שלילי של 0.27. נראה כי מדידת HE4 עדיפה על זו של CA125 למטרה אבחון סרטן שחלות בנשים חשודות למחלה גינקולוגית ממאירה.

מספר משמעותי של פרסומים הדגימו את היתרון של HE4 על CA125 כסמן של סרטן השחלות. באופן ספציפי, היכולת של HE4 להבדיל בין מחלות שפירות ומחלות ממאירות הודגשה על ידי Rustin וחב' ב-Clin Cancer Res משנת 2004, ע"י Gadducci וחב' ב-Biomed Pharmacother משנת 2004, ע"י Lowe וחב' ב-Cancer Epidemiol Biomarkers Prev משנת 2008 ו-Scholler וחב' ב-Clin Cancer Med משנת 2008. מחקר של Moore וחב' ב-Gynecol Oncol משנת 2008 בחן דגימות נסיוב ושתן של 259 עם מסה אדנקסלית המודגמת בדימות של האגן מטופלות לפני ניתוח לרמות CA125, כמו גם רמות HE4, אקטיבין, אינהיבין, ostepontin, קולטן ל-EGF ,CA72-4 ,soluble mesothelin-related peptide ורמת human epidermal growth factor receptor 2. בין 259 נבדקות אלו נמצאו 233 נשים מתאימות לאנליזת סמנים אלה (67 עם סרטן שחלות אפיתליאלי חודרני, ו-166 עם גידול שפיר בשחלות).
מחקר אחרון זה הראה ש-HE4 כסמן יחיד היה בעל הרגישות הגבוהה ביותר של 72.9% וספציפיות של 95%. השילוב של CA125 ו-HE4, השיג את הרגישות הגבוהה ביותר בהשוואה על כל הסמנים הבודדים האחרים.

תוצאות מחקר זה היו כדלקמן: רמות HE4 היו מוגברות בדמם של-1.1% מקבוצת הנבדקים הבריאים, ומוגברות בדמם של 12.3% מהנבדקים עם מחלות שפירות. לעומת זאת CA125 נמצא מוגבר ב-9.9% מהנבדקים הבריאים, וב-37% מאלה עם מחלות שפירות. כשל כליות היה הגורם השכיח ביותר לרמות מוגברות של HE4 בנבדקים עם מחלות שפירות (p=0.001), בהשוואה לנבדקים עם מחלות שפירות אחרות. HE4 הראה ספציפיות גבוהה יותר מאשר CA125 בנבדקים עם מחלות גינקולוגיות שפירות עם 1.3% של תוצאות מוגברות-כזובות לעומת 33.2% תוצאות מוגברות-כזובות במדידת CA125.

[[קובץ:HE4-2.jpg|400px|ממוזער|מרכז|לקוח מנתוני HE4 EIA KIT Malvern, PA: Fujirebio Diagnostics, Inc. June, 2008.]]

[[קובץ:HE4-3.jpg|400px|ממוזער|מרכז|ביטוי של HE4 ברקמות נורמאליות של האדם: CIC-cortical inclusion cysts ; OSE- ovary surface endometrium.{{ש}}לקוח מ-Drapkin וחב' ב-Cancer Res משנת 2005.]]

שיעור התמותה מסרטן השחלות נמצא במתאם חזק עם שלב גילוי המחלה: הישרדות של 5 שנים גבוהה מ-70% ב-Stage I או ב-stage II, אך פוחתת ל-0-20% כשהאבחון נעשה ב-stage III או ב-stage IV (עפ"י Jacobs וחב' ב-Mol Cell Proteomics משנת 2004, ו-Bast וחב' ב-Int J Gynecol Cancer משנת 2005). למעלה מ-3 עשורים היווה CA125 הסמן השולט בתחום אבחון סרטן השחלות מאז דווח עליו לראשונה על ידי Bast ו-Knapp בשנת 1981 ב-J Clin Invest. אלא שבמרוצת השנים התברר שחולשת סמן זה נעוצה ברגישות ממוצעת ובספציפיות נמוכה. הרגישות האבחונית של CA125 בסרטן השחלות היא של 50% בנבדקות ב-stage I ושל 80-90% בנבדקות ב-stage III וב-stage IV (עפ"י Molina וחב' ב-Tumor Biol משנת 1992, Rosen וחב' ב-Gynecol Oncol משנת 2005, Moore וחב' ב-Gynecol Oncolo משנת 2009, ו-Duffy וחב' ב-Int J Gynecol Cancer משנת 2005).

אך הבעיה החמורה יותר עם CA125 היא הספציפיות היחסית נמוכה שלו, כאשר רמות גבוהות של סמן זה מתקבלות בממאירויות של רקמות גינקולוגיות אחרות כגון endometrium ו-endocervix, שאתות אפיתליאליות אחרות כמו סרטן ריאות, ואף ממאירויות לא-אפיתליאליות כגון לימפומות (עפ"י Molina וחב' ב-Tumor Biol משנת 2009 ו-Sevinc וחב' ב-Oncology משנת 2003). רמות גבוהות של CA125 יכולות להתקבל גם בתרחישים שפירים כולל כּשל של הכבד או הכליות, ציסטות של השחלה, שרירנים (myomas) וכן בנשים בשלב שלפני מחידלון הווסת (Anastasi וחב' ב-Tumor Biol משנת 2010). כמו כן רמות CA125 יכולות להשתנות משמעותית לאורך תקופת המחזור או ההיריון (Moore וחב' ב-Am J Obstet Gynecol משנת 2010 ו-Nolen וחב' ב-Gynecol Oncol משנת 2010).

===שילוב של מדידת HE4 ו-CA125===

Moore וחב' הראו ש-HE4 הוא בעל רגישות מעט טובה יותר מאשר ל-CA125 בדיווח ב-Gynecol Oncol משנת 2008, וכללית קבעו Moore וחב' ששילוב 2 המדדים הללו מנבא טוב יותר ממאירות בשחלה מאשר שימוש יחידני בכל אחד מהשניים. חוקרים אלה מצאו ש-HE4 במיוחד עדיף בגילוי סרטן שחלות ב-stage I, כאשר רגישות זו לא גדלה כאשר המדידה בשלב מוקדם של המחלה נעשה במשולב עם מדידת CA125 (עפ"י Havrilesky וחב' ב-Gynecol Oncol משנת 2008). במחקר זה נמצא ש-HE4 הוא בעל הרגישות הגבוהה ביותר בין סדרה של סמנים כולל CA125, לגילוי של סרטן שחלות בשלביו המוקדמים (62.4-82.7%) או בשלביו המאוחרים (74.6-92.5%). חוקרים אלה מצאו ששילוב של 3 סמנים HE4, MMP7 ו-glycodelin לניטור סרטן השחלות, ניבא ב-56% מהמקרים את הישנות המחלה לפני שנצפתה עלייה ברמת CA125.

במחקר של Montagnana וחב' שהופיע ב-J Clin Lab Anal בשנת 2009, נמצא שעקומת ROC או Receiver Operating Characteristics שנערכה בנשים בריאות ובאלה עם שאתות בשחלה, היה ל-HE4 שטח מתחת לעקומה (AUC) גדול משמעותית (0.99 לעומת 0.91) מזה של CA125, כאשר הרגישות והספציפיות של HE4 נקבעו כ-98% ו-100%, בהתאמה. Huhtinen וחב' ב-Br J Cancer משנת 2009, מצאו שהרמות הממוצעות של HE4 היו גבוהות יותר משמעותית במטופלות עם סרטני השחלה או רירית הרחם, בהשוואה לרמות מדד זה בנשים עם ציסטה של השחלה (אנדומטריומה), או באלו עם סוגים שונים של אנדומטריוזיס. ממצא זה מרמז לכך שמבחן HE4 עשוי לסייע בהבדלה בין שאתות בשחלה לבין ציסטות אנדומטריוטיות. במחקרו זה בחן Huhtinen דגימות נסיוב של 2245 נשים עם סרטן שחלה, סרטן רירית הרחם, אנדומטריוזיס או נשים בריאות.

הבדיקה המשולבת של HE4 פלוס CA125 השיגה רגישות משופרת של 92.9% וספציפיות של 95% בהשוואה למדידת כל אחד מ-2 מדדים האלה בנפרד (HE4 עם רגישות של 78.6% לעומת CA125 עם רגישות של 78.6%). רמות HE4 היו מוגברות בממאירויות של השחלה ושל האנדומטריום, אך לא באנדומטריוזיס. רמות מוגברות של CA125 ללא עלייה ברמת HE4 מהווה ראייה ספציפית לאנדומטריוזיס מתקדמת או לאנדומטריומה שחלתית. לעומת זאת, רמה מוגברת של HE4 ורמה נורמאלית של CA125, מרמזים סרטן שחלה או סוגי סרטן אחרים, כולל סרטן רירית הרחם.

Escudero וחב' פרסמו ב-Clinical Chemistry משנת 2011 מחקר השוואתי בו נבחנו CA125 ו-HE4 כסמנים בנשים בריאות וכן באלו עם מחלה גינקולוגית ממארת. הבסיס למחקר זה נבע מממצאים מהם השתמע ש-HE4 בא לביטוי גם באדנוקרצינומה של מערכת הנשימה, של רירית הרחם ושל השד, וכן במזותליומה, ולעתים פחות שכיחות גם בקרצינומות של מערכת העיכול, של הכליות כמו גם ב-TCC של מערכת השתן, שלפוחית השתן והכליות (Galgano וחב' ב-Mod Pathol משנת 2006, וכן Bingle וחב' ב-Oncogene משנת 2002 ו-Drapkun וחב' ב-Cancer Res משנת 2005).

במחקר זה נמדדו רמות CA125 ו-HE4 בדגימות נסיוב של 101 אנשים בריאים, 535 מטופלים עם פתולוגיות שפירות (מתוכם 292 נשים עם מחלות גינקולוגיות שפירות), ו-423 מטופלים עם ממאירויות שונות (מתוכם 127 נשים עם סרטן השחלות). הסף העליון של הנורמה לגבי CA125 במחקר זה נקבע כ-35kU/L, ואילו ל-HE4 נקבע סף עליון של 140 פיקומול/ליטר.

ריכוזי HH4 היו מוגברים בעיקר בממאירויות גינקולוגיות ובאלה של הריאות. לעומת זאת, רמות CA125 היו מוגברות בממאירויות רבות שאינן שחלתיות, כולל שאתות לא-אפיתליאליות. תוצאות מדידת השטח מתחת עקומת ROC שהתקבלו עם HE4, היו גבוהות משמעותית מאלה שהתקבלו עם CA125 בהבדלה בין מחלות שפירות וממאירות (0.755 לעומת 0.643) וכן בהבדלה אבחונית של מחלות גינקולוגיות שפירות וממאירות (0.874 לעומת 0.722). מסקנות מחקר זה היו ש-HE4 הוא בעל ספציפיות אבחונית גבוהה יותר מזו של CA125, ושמדידה משולבת של שני סמנים אלה, שיפרה את רגישות הזיהוי של סרטן השחלות בהשוואה למדידה יחידנית שלכל אחד מ-2 הסמנים, בכל שלבי המחלה והסוגים ההיסטולוגיים שלה.

יחד עם זאת מדידה משולבת של 2 הסמנים הפחיתה את הספציפיות, זאת כיוון ששיעור התוצאות המוגברות-כזובות של CA125 במחלות גינקולוגיות גבוה יותר בעיקר בנשים לפני גיל חידלון הווסת. תוצאות לא נורמאליות של CA125 נמצאו ב-18.7% (54 נבדקות) עם מחלה שפירה, כאשר מדידת HE4 נתנה תוצאות בתוך תחום הנורמה ב-52 מתוך 54 הנבדקות. ממצאים אלה תואמים את ממצאיהם של Hellström וחב' ב-Cancer Res משנת 2010, וכן את ממצאי Huhtinen וחב' ב-Br J Cancer משנת 2009, ואת אלה של Montagnana וחב' ב-J Clin Lab Anal משנת 2009.

===משמעות מדידת HE4 בסרטן רירית הרחם===

בדומה לסרטן השחלות, ממאירויות של רירית הרחם נוטות לפרוגנוזה רצויה כאשר האבחון הוא מוקדם. לעומת זאת, אבחון בשלב מאוחר, כצפוי מביא לאחוז הישרדות לתקופה של 5 שנים. יחד עם זאת, הופעת תסמינים בשלבים מוקדמים של ממאירות זו, כולל דימומי בנשים בגיל חידלון הווסת, בדרך כלל מאפשר אבחון כבר ב-Stage I בערך ב-70% ממקרי סרטן רירית הרחם. נכון להיום, הישנות של סרטן רירית הרחם מתגלה על ידי הופעת תסמינים קליניים וטכניקות הדמיה, אך אלה באופן כללי מביאים לזיהוי מצבים מתקדמים של המחלה. השימוש במדד CA125 לגילוי הישנות סרטן רירית הרחם מביא לגילוי שלבים מתקדמים של המחלה, שכן רק ב-10-20% מהנשים ב-stage I וב-25% מבין הנשים עם הישנות בלתי תסמינית של המחלה ערכי CA125 יימצאו מוגברים (עפ"י Duk וחב' ב-Am J Obstet Gynecol משנת 1986; Sood וחב' ב-Obstet Gynecol משנת 1997; Vuento וחב' ב-Gynecol Oncol משנת 1997; Ginath וחב' ב-Int J Gynecol Cancer משנת 2002; Hsieh וחב' ב-Gynecol Oncol משנת 2002 ו-Powel וחב' ב-J Reprod Med משנת 2005).

רק מספר מוגבל של קבוצות מחקר החלו לבחון את יעילות HE4 כסמן בנסיוב לממאירות של רירית הרחם, ומהם נובע שלמדד זה יש ערך מבטיח בגילוי סרטן זה. Moore וחב'ב-Gynecol Oncol משנת 2008, מדדו דגימות נסיוב של נשים עם אדנוקרצינומה של ה-endometrioid לפני ניתוח, עם ביקורת של נשים בריאות בגיל חידלון הווסת. נמדדו רמות HE4 ,CA72-4 ,soluble mesothelin-related peptide ו-CA125. התוצאות הצביעו שכמדד יחיד, יש ל-HE4 יתרון על פני המדדים האחרים ללא קשר ל-stage של המחלה.

ערכי השטח מתחת לעקומת ROC עבור HE4 כסמן יחיד היו גבוהים יותר מאלה של כל הסמנים האחרים שנחקרו ב-stage I ו-stage II-IV שנקבעו כ-76.7 ו-83.6, בהתאמה. הרגישות במדידת HE4 הייתה אף היא הגבוהה ביותר בהשוואה לכל הסמנים האחרים, ללא קשר ל-stage של המחלה (רגישות של 48.4% לגבי stage I ושל 71.4% לגבי stage II-IV. הוספת מדידה של CA125 לזו של HE4 הגבירה משמעותית את הרגישות בהשוואה לזו שהושגה עם CA125 כסמן יחיד (50.1% לעומת 24.6%). השילוב של 2 הסמנים CA125 ו-HE4 היה בעל יתרון בהתאם למדד ROC-AUC בהשוואה למדידה של HE4 בלבד לגבי stage II-IV של המחלה (86.6 לעומת 83.6), אך היה חסר יתרון בהשוואה למדידה יחידנית של HE4 ב-stage I של המחלה. נתונים אלה מצביעים על HE4 כסמן המדויק והרגיש ביותר של סרטן רירית הרחם.

===ריכוזי HE4 בדלף לנוזל הפריטונאלי בתרחישים ממאירים או במחלות שחלה שפירות===

במחקר של Chudecka-Glaz וחב' ב-J Ovarian Res נבחן הסמן HE4 בנוזל פריטונאלי במחלות שונות של מערכת הרבייה הנקבית. גויסו למחקר 139 נשים, מהן 40 עם סרטן שחלות, 82 עם מחלה שפירה של השחלות, ו-17 עם ממאירויות אחרות. רמת HE4 נמדדה בנסיוב. בנוזל הפריטונאלי, כמו גם בנוזל מציסטות שחלתיות או מהשאת השחלתית. על פי ממצאי מחקר זה לא נמצאו הבדלים משמעותיים סטטיסטית בין שתי קבוצות הנשים הראשונות, על פי הממצאים הבאים: בקבוצת הנשים עם סרטן השחלות ריכוז HE4 בנוזל הפריטונאום היה בממוצע 3.32 ננומול/ליטר, ריכוזו בקבוצת הנשים עם מחלה שפירה של השחלות היה 2.15 ננומול/ליטר בממוצע, ואילו ריכוזו הממוצע של HE4 בקבוצת הנשים עם ממאירויות באיברים שאינם קשורים ישירות למערכת הרבייה הנשית נקבע כ-0.68 ננומול/ליטר. בין הקבוצה הראשונה והשנייה לא נמצא הבדל מובהק (p=0.206), ההבדל בין הקבוצה הראשונה והשלישית אף הוא לא היה משמעותי במיוחד (p=0.06), וכן לא היה הבדל משמעותי במיוחד בין רמת HE4 בקבוצות השנייה והשלישית. בקבוצת הנשים עם סרטן השחלות, לא נמצאו הבדלים ברמת HE4 בנוזל הפריטונאלי ללא קשר ל-stage, ל-grade או לנוכחות של תאים סרטניים ולמידת התפשטות תאים אלה לפריטונאום. נראה אם כן מתוצאות מחקר זה שהפריטונאום אינו יכול לשמש למדידת HE4 למטרה אבחונית או למטרת ניטור סרטן השחלות.

==הוראות לביצוע הבדיקה==

יש לדגום את הדם במבחנה כימית (פקק אדום או צהוב), ואחר הפרדת הדם יש לקרר או להקפיא מייד. הדגימה יציבה 72 שעות בקירור או 4 שבועות בהקפאה. אין צורך בשום הכנה מוקדמת של הנבדקת. אין להשתמש בפלזמה, ולהקפיד על ביצוע הבדיקה בנסיוב. סיבות לדחיית הדגימה: המוליזה ניכרת, ליפמיה או דגימה איקטרית, נוכחות פיברין, כדוריות דם אדומות או חלקיקים אחרים, זיהום בקטריאלי של הדגימה. אין לבצע מדידת HE4 במקרים מאובחנים של סרטן השחלות מסוגי mucinous או germ-cell.

רמות HE4 נוטות להיות גבוהות יתר בנשים מבוגרות יותר, או בנשים בהם המחזור הופיע בגיל מבוגר יחסית, ועל פי Urban וחב' ב-Cancer Epidemiol Biomarkers Prev משנת 2012, רמה ממוצעת של HE4 בנשים בריאות בגיל 30 שנה הוא 41.4 פיקומול'/ליטר, והיא עולה לרמה ממוצעת של 82.1 פיקומול'/ליטר בגיל 80 שנה. תוצאות כזובות של רמת HE4 עלולות להתקבל בדגימות נסיוב בהן יש נוגדנים אוטו-אימוניים, או נוגדנים הטרופיליים כנגד אימונוגלובולינים של עכברים. רמות HE4 בתוך התחום הנורמאלי אינן שוללות ממאירות, לכן אין להשתמש במדד זה כבדיקת סריקה לגילוי סרטן השחלות. כמו כן אין להשתמש במדידת HE4 בנבדקות עם mucinous ovarian cancer או עם germ-free ovarin cancer. השיטה המקובלת למדידת HE4 היא ELISA. אין ליטול דגימת דם ממטופלים המקבלים ביוטין במינון גבוה (מעל 5 מיליגרם ליום), עד שחלפו לפחות 8 שעות מנטילת הביוטין האחרונה.

ביוני 2008 אישר ה-FDA את הערכה של Fujirebio Diagnostics משוודיה, למדידת HE4. במרס 2010 פיתחה חברת Abbott Diagnostics, UK ביחד עם Fujirebio Diagnostics את ערכת ARCHITECT HE4 לבדידה אוטומטית של סמן זה, גרסה שאושרה על ידי ה-FDA.

==ראו גם==
* [[מדריך בדיקות מעבדה|חזרה לדף מדריך בדיקות מעבדה]]
* [[סמנים סרטניים|בדיקות מעבדה - סמנים סרטניים]]

{{ייחוס|[[משתמש:בן עמי סלע|פרופ' בן-עמי סלע]]}}

[[קטגוריה:בדיקות מעבדה - סמנים סרטניים]]
[[קטגוריה:בדיקות מעבדה: כימיה בדם]]

Gastric inhibitory polypeptide

2015-08-27T13:53:37Z

בן עמי סלע:

==polypeptide Gastric inhibitory ==

כינויים נוספים: GIP, glucose-dependent insulinotropic peptide.
תחום: הערכת מצבי סוכרת, השמנת יתר והערכה תפקודית של פעילות בלוטת הלבלב.
טווח ערכים תקין: בדם בצום-50-100 פיקוגרם/מ"ל; בדם לאחר ארוחה-110-720 פיקוגרם/מ"ל.
יוצר הערך: פרופ' בן-עמי סלע.

== בסיס פיזיולוגי ==

חלפו למעלה מ-100 שנה מאז התגלית של מושג האינקרטינים (incretins), שפתח לאחר מכן אפשרות של טיפול חדש בחולי סוכרת. בשנת 1902 פרסמו Bayliss ו-Starling ב-J Physiol, על גילוי secretin, מה שהביא את Moore וחב' להשערה שפורסמה ב-Biochem J בשנת 1906, שתמצית מעי מכילה הורמון המווסת את פעילותו האנדוקרינית של בלוטת הלבלב, ואף הראו שהזרקת תמצית זו הפחיתה את כמות הסוכרים המופרשים בשתן של חולי סוכרת, כנראה על ידי גירוי הפעילות האנדוקרינית של הלבלב. אך רק בשנת 1929 חלה התעוררות בנושא, כאשר La Barre ו-Zunz פרסמו ב-Arch Int Physiol Biochim, שהם ניקו מתמצית מעי את הגורם המפחית גלוקוזה וכינו אותו incretin או INtestine seCRETion Insulin. חלפה תקופה דומה של כמעט שלושים שנה, עד אשר פותחה שיטת RIA לכימות רמת אינסולין בשנות ה-60, ובשנת 1964 הופיעו 2 מאמרים שהראו שהעמסת סוכר באופן פומי, הביאה ליצירה מוגברת יותר של אינסולין מאשר היו מזריקים גלוקוזה ישירות לווריד (Elrick וחב' ב-J Clin Endocrinol Metab משנת 1964, ו-McIntyre וחב' ב-Lancet באותה שנה). כיום מייחסים ממצא זה ל-incretins המופרשים מהמעי לאחר בליעת גלוקוזה אך גם ארוחות עשירות בשומן, מה שמגרה את תאי β בלבלב להפריש יותר אינסולין.

רק 2 הורמוני מעי כאלה נתגלו עד כה שפועלים כ-incretins, והם GIP או gastric inhibitory polypeptide, ו-GLP-1 או glucagon-like peptide-1. ה-GIP הוא הורמון בן 42 חומצות אמינו שמשקלו המולקולארי 4,944 דלטון, המופרש מתאי K בחלק העליון של המעי הדק באזור התריסריון וה-jejunum הקריבני (פרוקסימאלי), אך ניתן למצוא את GIP לאורך כל המעי (Inagaki וחב' ב-Mol Endocrinol משנת 1989). במקור בודדו GIP בשנת 1970 ממעי של חזיר על ידי Brown וחב' על בסיס יכולתו לעכב הפרשת חומצת קיבה ו-gastrin בכלבים כפי שתואר ב-J Physiol. מאוחר יותר פרסמו Dupre וחב' ב-J Clin Endocrinol Metab משנת 1973 שהזרקת GIP מעודדת הפרשת אינסולין במתנדבים בריאים על ידי פעולה ישירה של הורמון זה על תאי הלבלב להפרשת אינסולין (Adrian וחב' ב-Diabetologia משנת 1978, ו-Taminato וחב' ב-Diabetes משנת 1977). נתונים אלה הצביעו על GIPכעל ה-incretin המקורי, ולאחר מכן יש שכינו אותו glucose-dependent insulinotropic polypeptide.

הגן ל-GIP אנושי מורכב מ-6 אֶקסונים כאשר רוב המידע המקודד ל-GIP נמצא ב- 3 exon, וגן זה ממוקם בזרוע הארוכה של כרומוזום 17 בעמדה 17 q21.3-q22. ביטוי הגן ל-GIP התגלה בקיבה ובתאי K במעי במכרסמים כמו גם באדם, כאשר בחולדות ביטוי גן זה מופיע גם בבלוטת הרוק התת-מנדיבולארית. נמצא שבחולדות, רמת mRNA של GIP, עולה בתריסיון ובבלוטת הרוק לאחר ארוחות המכילות גלוקוזה או עשירות בשומן, אך רמת mRNA זה פוחתת בתגובה לצום ממושך.

ביוסינתזה של GIP:

הרצף של חומצות האמינו של GIP בחולדה ובאדם, מצביע על כך שהורמון זה מיוצר מקדם-הורמון (preproGIP) גדול יותר המכיל signal peptide , פפטיד N-טרמינאלי, GIP ופפטיד C-טרמינאלי, על ידי פעילות PC או prohormone convertase 1/3. מחקרים עם עכברי knockout בהם פגום הגן של האנזים PC, וכן ניסויים בתרבית תאים עם פעילות-יתר של PC, הדגימו שהצורה הבשלה והפעילה של GIP, המכילה 42 חומצות אמינו מקורה בקודמן preproGIP המכיל 153 חומצות אמינו, כאשר הביקוע מתבצע ליד שייר ארגינין (Ugleholdt וחב' ב-J Biol Chem משנת 2003). הפפטידים המקוּדדים בתוך המקטעים ה-N-טרמינאלי וה-C-טרמינאלי הם חסרי פעילות ידועה. הרצף של GIP השתמר בצורה בולטת בין מיני בעלי חיים שונים, ורצפי חומצות האמינו של GIP של האדם לבין זה של עכבר, חולדה, חזיר ופרה מראים זהות של למעלה מ-90%. יש עדות מסוימת שגם תאי α בלבלב מסוגלים לייצר כמויות קטנות של preproGIP, שעובר ביקוע על ידי prohormone convertase 2 לייצור הורמון קטום בקצה ה-C טרמינאלי של ה-preproGIP , המוגדר כ-(GIP(1-30, אך אין מידע לגבי פעילות פיזיולוגית של פפטיד זה.

(להכניס כאן תרשים שמתחתיו המקרא מתחיל במילים A) הגן ל-proGIP)
(להכניס כאן ברצף את התרשים השמאלי בלבד מעליו GIP באדום
ומתחתיו מופיע ...הביוסינתזה של GIP)
(להכניס כאן ברצף את התרשים שמתחתיו המקרא.....רצף 42 חומצות האמינו של GIP).

התפקוד של GIP:

במקור נקרא הורמון פפטידי זה gastric inhibitory peptide בגלל יכולתו להפחית את הפרשת חומצת הקיבה בחיות (אם כי לא באדם) (Kim ו-Egan ב-Pharmacol Rev משנת 2008) על מנת להגן על המעי הדק מנזק החומצה, להפחית את קצב העברת המזון דרך הקיבה, ולעכב את התנועתיות (motility) של המעיים. אך לאחרונה מייחסים פעולות אלה ביתר שאת להורמון דומה, secretin. היום מאמינים שתפקידו העיקרי של GIP הוא להשרות הפרשת אינסולין, המושפעת העיקר על ידי היפר-אוסמולריות של גלוקוזה בתריסריון (Thorens ב- Diabète & Métabolisme משנת 1995). לכן יש מעדיפים כיום את כינוי ההורמון כ-glucose-dependent insulinotropic peptide.

משערים שיש ל-GIP השפעות משמעותיות על המטבוליזם של חומצות שומן, דרך הגירוי של פעילות האנזים lipoprotein lipase באדיפוציטים. כמו כן, נמצא ש-GIP מופרש בתגובה להנקה הראשונה של חלב אם (colostrum) בגורי עזים. משיקולים אתיים, הפרשת GIP הודגמה בתינוקות אדם רק בגיל 10 ימים בערך. לאחרונה נמצא שיש ל-GIP תפקיד מרכזי בתהליכי עיצוב (remodeling) של רקמת העצם. Gaudin-Audrain וחב' דיווחו בשנת 2013 ב-Bone שעכברים טרנסגניים עם חסר בקולטן ל-GIP, סבלו משינויים ניכרים במיקרו-ארכיטקטורה, בנפח ובאיכות של העצם הטרבקולארית. ממצאים דומים פורסמו באותו כתב-עת בשנת 2013 על ידי Mieczkowska וחב', כאשר נמצא שאיכות העצם נפגמה והייתה נטייה לשברי עצם בעכברים עם חסר מושרה בקולטן ל-GIP.

הרלוונטיות של GIP לסוכרת type 2 הודגמה, כאשר נמצא שחולים בסוג סוכרת זו מגיבים משמעותית פחות ל-GIP, וכן בחולים אלה יש הפרשה פחותה של GIP לאחר ארוחה, בהשוואה לאנשים ללא סוכרת (Skrha וחב' ב-Physiol Res משנת 2010). במחקר עם עכברי knockout, נמצא שחסר בקולטנים ל-GIPכרוך בעמידות להשמנת-יתר (Yamada ו-Seino ב-Hormone & Metabol Res משנת 2004.

(להכניס כאן את התרשים מתחתיו מופיע המקרא: התפקוד הפנקראטי והחוץ פנקראטי של GIP בהשוואה ל-GLP-1)

הפרשה, מטבוליזם ופינוי של GIP:

כאמור, GIP מיוצר ומופרש מתאי K בתריסריון וב-jejunum הקריבני, עם פעילות סינתטית והפרשתית נמוכה יותר לאורך המעי הדק כולו (Mortensen וחב' ב-Regu Pept משנת 2003, ו-Butchan וחב' ב-Histochemistry משנת 1978). GIP מופרש בתגובה לקליטת מזון, בעיקר גלוקוזה או שומן. באופן ספציפי יותר, הפרשת GIP מושפעת יותר מקצב ספיגת המזון מאשר מנוכחות מזון במעי. לכן, הפרשת GIP פוחתת באנשים עם בעיות ספיגה, או לאחר נטילת תכשירים האמורים להפחית את הספיגה (Besterman וחב' ב-BMJ משנת 1979, ו-Fushiki וחב' ב-J Nutr משנת 1992). ראוי לציין שבעוד שמזון שומני הוא גריין יעיל יותר של הפרשת GIP באדם, פחמימות יותר יעילות בגירוי הפרשה זו במכרסמים ובחזירים. באדם, הרמה הבסיסית של GIP בפלזמה היא מתחת ל-50 פיקוגרם/מ"ל, והיא עולה לאחר ארוחה לרמה של עד 720 פיקוגרם/מ"ל בתלות בסוג וכמות המזון בארוחה (Orskov וחב' ב-Scand J Gastroenterol משנת 1996, ו-Vilsbøll וחב' ב-Diabetes משנת 2001). רמות GIP בפלזמה דומות או מוגברות אך במקצת בחולים עם סוכרת type 2 בהשוואה לזו באנשים בריאים (Ross וחב' ב-Diabetes משנת 1977).

(להכניס כאן את התרשים מתחתיו מופיע: הפרשה ומטבוליזם של GIP בהשוואה ל-GLP-1)
(להכניס כאן ברצף את התרשים מתחתיו מופיע: שני incretins פעילים ביולוגית)

תקופת מחצית החיים של GIP היא פחות מ-2 דקות במכרסמים (Kieffer וחב' ב-Endocrinology משנת 1995), ואילו בבני-אדם בריאים תקופת מחצית החיים היא של 7 דקות, כאשר בחולי סוכרת type 2 היא בת 5 דקות (Deacon וחב' ב-J Clin Endocrinol Metabol משנת 2000). יש לציין שתקופת מחצית החיים של GIP בצורתו הקטומה (לאחר הסרת 2 חומצות האמינו פרולין ואלנין בקצה ה-N טרמינאלי על ידי DPP-4) מתארכת עד כדי 17 דקות (Vilsbøll וחב' ב-Regul Pept משנת 2006).

שייר אלנין בעמדה 2 של רצף חומצות האמינו של GIP, מהווה יעד פעולה של DPP-4 או Dipeptidyl peptidase-4, שהוא האנזים הגורם לאינאקטיבציה של(1-42)GIP על ידי הפיכתו למטבוליט הבלתי-פעיל (GIP(3-42, המאבד את תכונותיו האינסולינוטרופיות (Deacon וחב' ב-J Clin Endocrinol Metabמשנת 2000). אנזים זה ממוקם בממברנות brush-border של המעי והכליות, אך ניתן למצוא אותו גם על פני קפילארות, ובצורה מסיסה בפלזמה (Mentlain ב-Regul Pept משנת 1999).

פעילות זו של DPP-4 כאנזים העיקרי הפוגע בפעילות GIP הודגמה היטב במכרסמים ובבני-אדם בריאים או סוכרתיים. התצפיות לפיהן רמות GIP בפלזמה מוגברות באנשים הסובלים מ-uremia או באלה עם מחלת כליות כרונית, כמו גם הממצאים על פינוי משובש של GIP בחולדות שעברו nephrectomy, מצביעים על הכליות כאיבר דרכו מתבצע רוב הפינוי (clearance) של GIP (על פי Meier וחב' ב-Diabetes משנת 2004). מחקרים של Deacon וחב' ב-Diabetes משנת 2001 מראים שגם לכבד יש תפקיד בספיגת GIP מהדם, ואילו Vilsbøll וחב' דיווחו ב-Regul Pept משנת 2006, שקצב הפינוי של GIPשלם ושל המטבוליטים שלו דומים בין אנשים בריאים לבין אנשים שמנים עם סוכרת type 2.

הקולטן ל-GIP:

GIP פועל על ידי התקשרות לקולטן ספציפי GIPR ששובט במקור מספריית cDNA מקליפת המוח של חולדה, ולאחר מכן שובט ממקור אוגר ואדם. הגן של הקולטן האנושי ל-GIP מכיל 14 exons ש"אורכם" 14kb (ע"פ Yamada וחב' ב-Genomics משנת 1995), והוא ממוקם בכרומוזום 19 בעמדה q13.3. הקולטן ל-GIP באדם מכיל 466 חומצות אמינו, אך יש גם איזופורם של קולטן ל-GIP עם 493 חומצות אמינו. הגן ל-GIPR בא לביטוי בבלוטת הלבלב, בקיבה, במעי הדק, ברקמת השומן, בקורטקס של האדרנל, בבלוטת יותרת המוח (היפופיזה), בלב, באשכים, בתאים אנדותליאליים, ברקמת העצם, בטרכיאה, בטחול, בבלוטת ההרת (תימוס), בריאות, בכליות בבלוטת התריס (תירואיד), ובאזורים אחדים של מערכת העצבים המרכזית (Asmar ב-Dan Med Bull משנת 2011). יחד עם זאת, לא ברורה עדיין המשמעות של תוצאות השפעול של קולטנים חוץ-פנקראטיים אלה.

הקולטן של GIP הוא חבר במשפחת העל של קולטנים החוצים את הממברנה באופן מפותל 7 פעמים, שהם בעלי מבנה הֶטֶרוֹ-טרימרי והם קשורים לחלבוני G בציטופלזמה (Usdin וחב' ב-Endocrinology משנת 1993). מעט יחסית ידוע על הגורמים האחראיים לוויסות ביטויו של הקולטן ל-GIP, אך ידוע רמות ה-mRNA של GIPR ושל חלבון הקולטן עצמו, נמוכות יותר באיי הלבלב של חולדות סוכרתיות, מה שנכון גם לבני אדם (Lynn וחב' ב-Diabetes משנת 2001).

שפעול של איתות המועבר דרך GIPR קשור לשדרוג פעילות האנזים adenylyl cyclase ולעליות ברמת cAMP ויוני סידן תוך תאי, כמו גם לשפעול של החלבונים p38 MAPK, PKB, PKA, PI-3K ו-פוספוליפאז A2 (על פי McIntosh וחב' ב-Vitam Horm משנת 2009). ניסויים in-vitro העלו שהקצה ה-N-טרמינאלי של GIPR והלולאה החוץ תאית הראשונה של GIPR חיוניים לזיקה הגבוהה של קישור של GIP לקולטן שלו, בעוד שחלקים מהקצה ה-N טרמינאלי בנוסף למקטע (domain) הטרנס-ממברנאלי חיוניים לשפעול הקולטן ולצימוד של cAMP. למרות שרוב רצף חומצות האמינו בקצה ה-C טרמינאלי של GIPR נראה מיותר לאיתות התוך-תאי, רצף מינימאלי של הקולטן הכולל 405 חומצות אמינו נדרש להעברה יעילה של האיתות לאחר קישור GIP לקולטן שלו. Wheeler וחב' דיווחו ב-J Biol Chem משנת 1999, ששיירי serine 406 ו-411 בקצה ה-C טרמינאלי חיוניים לנטרול (desensitization) פעולת הקולטן, בעוד ששיירי serine 426 ו-427 חיוניים לתהליך החדרת הקולטן לאחר קישורו של GIP.

הפעילויות הביולוגיות של GIP:

הפעילות של GIP על תאי β בלבלב אנלוגית לזו של GLP-1, ל-GIP יש גם פעילות פיזיולוגית ייחודית ברקמות חוץ-פנקראטיות.

(להכניס כאן את התרשים מתחתיו המקרא ..פעילות GIP ברקמות ההיקפיות...)

בלוטת הלבלב:

התפקיד הפיזיולוגי העיקרי של GIP היא פעילותו כ-incretin, דהיינו בהתקשרות לקולטניו על פני תאי β בלבלב, ובעידוד הפרשת אינסולין. המנגנונים המולקולאריים האחראיים להפרשת אינסולין בהשפעת GIP, חופפים באופן משמעותי את אלה המושפעים על ידי GLP-1, וכוללים הגדלת ריכוז cAMP, עיכוב תעלות KATP, עלייה ברמות התוך-תאיות של יוני סידן וגירויי של exocytosis (על פי Ding וחב' ב-Diabetes משנת 1997). הגירוי על ידי GIP להפרשת אינסולין, מסתייע על ידי שפעול של 2 הצמדים, AMP/Protein kinase A ו- cAMP/Epac2, בנוסף לשפעול של phospholipase A2 ומסלולי איתות ספציפיים של פרוטאין קינאז (Kashima וחב' ב- J Biol Chem משנת 2001, ו-Ehses וחב' ב-J Biol Chem משנת 2002). כמו כן, GIP מגביר את השעתוק של הגן לאינסולין ואת הביוסינתזה של הורמון זה בתאי β וכן את הביטוי של החיישנים לגלוקוזה על פני תאים אלה (Wang וחב' ב-Mol Cell Endocrinol משנת 1996).

החשיבות הפיזיולוגית של GIP כ-incretin, מודגמת על ידי פגיעה בפעילות הורמון זה in vivo. ביטול האיתות העובר דרך הקולטן GIPR על ידי שימוש באנטגוניסטים או בנוגדנים המכוונים כנגד GIPR, או על ידי אינאקטיבציה ממוקדת של הגן ל-GIPR בעכברים טרנסגניים (-/-GIPR), גורמים לעמידות פגומה למתן פומי של גלוקוזה, כמו גם להפרשה משובשת של אינסולין הצפויה בעקבות מתן גלוקוזה (Tseng וחב' ב-J Clin Invest משנת 1996, וכן Lewis וחב' ב-Endocrinology משנת 2000 ו-Miyawaki וחב' ב-Proc Natl Acad Sci USA משנת 1999).

כמו כן GIP פועל בסינרגיזם עם גלוקוזה לעודד שגשוג תאים ולשפר את הישרדותם של תאי β פנקריאטיים, והשפעה הגנתית זו על תאי β ניתנת להדגמה באיי לנגרהנס של עכברי בר תקינים, אך לא בעכברים הומוזיגוטיים טרנסגניים מסוג -/-GIPR (ע"פ Kim וחב' ב-J Biol Chem משנת 2005). מנגנוני האיתות המולקולאריים המתווכים בהשפעה של GIP על שגשוג תאים דרך פעילות אנטי-אפופטוטית פוענחו על ידי שימוש בתאים הטרולוגיים שעברו טרנספקציה עם GIPR, בשורת תאי β של מכרסמים, באיי פנקריאס של עכברים, וכללו שפעול של מסלולי cAMP/PKA, וכן של ו-PKA/CREB ו-p38MAPK (על פי Trumper וחב' ב-Mol Endocrinol משנת 2001, ו-Ehses וחב' ב- Endocrinology משנת 2003).

ניסויים עם חולדות סוכרתיות מזן ZDF הראו שעירוי של GIP למשך שבועיים, הפחית משמעותית את האפופטוזיס בתאי β בלבלב על ידי שפעול של Akt-PKB בתלות ב-PI-3K, וכן שפעול הפוספורילציה והרחקה מגרעין התא של FoxO1, מה שגורם להפחתת ביטויו של הגן מקדם האפופטוזיס Bax, הפחתה בפעילות caspase 3 (אנזים המפתח בתהליך האפופטוזיס), כמו גם דיכוי השעתוק של הגן ל-bax (חלבון מקדם אפופטוזיס נוסף), ולעומת זאת שדרוג בפעולת הגן של החלבון האנטי-אפופטוטי bcl-2 (על פי Kim וחב' ב-J Biol Chem משנת 2005). כמו כן, נמצא ש-GIP מפחית את רמת סמנים ביוכימיים הקשורים לעקה של הרטיקולום האנדופלזמי (ER) בשורת תאים של איי הלבלב לאחר השריית עקה זו של ה-ER בתנאי תרבית תאים (Yusta וחב' ב-Cell Metab משנת 2006). ניתן לומר שהפעילות האינסולינו-טרופית של GIP פחותה בחולדות היפר-גליקמיות, לפחות באופן חלקי בגלל הביטוי המופחת של הקולטן ל-GIP בחולדות אלה (Lynn וחב' ב-Diabetes משנת 2001).

פעילות GIP במערכת העצבים המרכזית:

ב-CNS, ניתן למצוא ביטוי של GIP בהיפוקמפוס, בתאי Purkinje במוחון וב-olfactory bulb (על פי Nyberg וחב' ב-J Neurosci Res משנת 2007). קולטנים ל-GIP אותרו באזורי מוח אחדים כולל בקליפת המוח, בהיפוקמפוס, ב-olfactory bulb (על פי Kaplan ו-Vigna ב-Peptides משנת 1994, ו-Usdin וחב' ב-Endocrinology משנת 1993). עירוי של GIP אקסוגני למוח חולדות, השרתה שגשוג של תאים פרוגניטורים בהיפוקמפוס in vivo כמו גם בתאים פרוגניטרים מההיפוקמפוס בתנאי תרבית תאים (Nyberg וחב' ב-J Neurosci משנת 2005). לעומת זאת, עכברים טרנסגניים בוגרים (-/-GIPR), עם פגיעה מושרית בקולטן ל-GIP, הכילו מספר קטן משמעותית של תאים פרוגניטורים חדשים ב-dentate gyrus של ההיפוקמפוס. כמו כן, עכברים טרנסגניים המבטאים ביתר את הקולטן GIPR, מפגינים קואורדינציה תחושתית-מוטורית משופרת, כמו גם שיפור בממדי זיכרון בהשוואה לעכברים wild-type.

נראה אם כן שהביטוי של GIPR בתאי עצב פרוגניטורים ב-dentate gyrous של ההיפוקמפוס, מצביעים על מעורבות אפשרית של GIP הוויסות של נוירוגנזה ובתפקוד הזיכרון. באופן הצפוי על יסוד ההשפעה השגשוגית של GIP על תאי פרוגניטור עצביים, השפעול של GIPR על ידי אנאלוגים של GIP, מעודד יצירת LTP (או long-term potentiation) בהיפוקמפוס, ואילו עיכוב ביטוי GIPR על ידי אנטגוניסט של GIP דוגמת Pro3)GIP), מפחית את ה-LTP (על פי Gault וחב' ב-J Neurophysiol משנת 2008). לעומת זאת, עכברים טרנסגניים עם ביטוי-יתר של GIP, מראים שיפור בביצוע משימות הכרוכות בזיכרון (Ding וחב' ב-Peptides משנת 2006). פעילות נוספת של GIP במוח קשורה לוויסות תחושות התיאבון והשובע.

GIP ורקמת שומן:

קולטני GIPR פונקציונאליים מבוטאים על פני אדיפוציטים מבודדים מחולדות ועל פני תאי 3T3-L1 (על פי Yip וחב' ב-Endocrinology משנת 1998). כיוון שכך, יש הקושרים את GIP לפיקוח על המטבוליזם של שומן, ולהתפתחות של השמנת-יתר. קליטת שומן מהמזון היא גריין משמעותי של הפרשת GIP באדם, ורמות GIP בפלזמה עולות בחלק מחולי סוכרת type 2 כבדי המשקל (על פי Creutzfeldt וחב' ב-Diabetologia משנת 1978, ו-Salera וחב' ב-J Clin Endocrinol Metab משנת 1982). ההשפעה האנאבולית של GIP על רקמת השומן, כוללת גירוי של סינתזה של חומצות שומן ו-רה-אסטריפיקציה שלהן עידוד של החדרת חומצות שומן לתוך טריגליצרידים המושרית על ידי אינסולין, שדרוג הסינתזה של האנזים lipoprotein lipase, הגברת הזיקה של אינסולין לקולטנים שלו, והפחתה בתהליכים ליפוליטיים המושרים על ידי glucagon. יחד עם זאת, יש ל-GIP כנראה גם השפעות ליפוליטיות, אם כי אלה שנויות במחלוקת (Yip ו-Wolfe ב-Life Sci משנת 2000). עכברים טרנסגניים (-/-GIPR), מראים עמידות להשמנת-יתר הנובעת מקליטת מזון, תוך שהם מראים מסת שומן מופחתת, למרות מספר חודשים של האכלתם בדיאטה עתירת-שומן (Miyawaki וחב' ב-Nat Med משנת 2002).

הוספת GIP נמצאה מגבירה את פינוי כילומיקרונים בכלבים (Wasada וחב' ב-J Clin Invest משנת 1981), מפחיתה את רמת טריגליצרידים לאחר ארוחה בחולדות (Ebert וחב' ב-Horm Metab Res משנת 1991) ומגבירה טרנספורט של גלוקוזה וסינתזת חומצות שומן ב-explants של רקמת שומן מחולדות (Knapper וחב' ב-J Nutr משנת 1995, ו-Oben וחב' ב-J Endocrinol משנת 1991). בנוסף, נראה ש-GIP מגביר את רגישות אדיפוציטים לאינסולין, ובכך מעודד קליטת גלוקוזה וחומצות שומן לאגירה בתאים אלה.

יתרה מכך, ניסוי של Isken וחב' שפורסם ב-Am J Physiol Endocrinol Metab משנת 2008, הראה שהשמנת יתר המושרית בדרך כלל על ידי ניתוח להרחקת השחלות נמנעה בעכברים עם חסר בקולטן ל-GIP, מה שניתן להסביר חלקית על ידי הפחתה בצריכת מזון בגלל החסר ב-GIPR. התברר שעירוי לתוך המוח של NPY או הנוירופפטיד האורקסיגני Y, מעודד הפרשת GIP מתאי העצב, מה שרומז לכך ש-GIP פועל כמווסת שלילי של NPY, ועשוי לווסת צריכת מזון על ידי הכלבים המטופלים (Yavropoulou וחב' ב-Peptides משנת 2008). יחד עם זאת, יש לשקול בזהירות יתרה את ההערכה של תפקוד נוגד-השמנה של GIP במוח, כיוון שיש להורמון האחרון השפעה ישירה על רקמת השומן. יש גם להתחשב בהשפעה של ההורמון האינקרטיני האחר GLP-1 בהקשר של השפעתו על צריכת מזון ושובע באדם. בניגוד ל-GLP-1 המעכב התרוקנות הקיבה, נמצא של-GIP יש השפעה מועטה בלבד על התרוקנות הקיבה באדם ובעכברים (Meier וחב' ב-Am J Physiol Endocrinol Metab משנת 2004).

זאת ועוד, עכברי -/-ob/ob:GIPR עולים פחות במשקלם, הם בעלי רקמת שומן מצומצמת יותר, ומגיבים טוב יותר לעודף גלוקוזה, על ידי רגישות רבה יותר לאינסולין, בהשוואה לעכברי ob/ob. למרות שצריכת המזון דומה בין עכברי -/-GIPR לבין עכברי wild-type, כאשר מאכילים אותם במזון עתיר-שומן, עכברי -/-GIPR מוציאים יותר אנרגיה, ולכן הם משתמשים בשומן כמצע אנרגיה מועדף, ולפיכך נמנעת אגירת שומן באדיפוציטים שלהם. בעכברי ob/ob עירוי כרוני של אנטגוניסט לקולטן GIPR דוגמת Pro3)GIP) משפר את הסבילות לגלוקוזה, מגביר את הרגישות לאינסולין, ומתקן את ההיפרטרופיה של תאי הלבלב המושרית על ידי השמנת-יתר, כמו גם את ההיפרפלזיה של תאי β (על פי Gault וחב' ב-Diabetes משנת 2005).

יחד עם זאת, עכברי -/-GIPR שניזונו על דיאטת chow נורמאלית, מראים חוסר סבילות לגלוקוזה, והחדרה של Pro3)GIP) פוגעת בסבילות לגלוקוזה בעכברי wild-type (על פי Irwin וחב' ב-Biol Chem משנת 2004). בנוסף, שפעול של GIPR כרוך עם שיפור בסבילות לגלוקוזה, ומגביר הפרשת אינסולין במודלים של סוכרת בחיות. לכן, למרות שחולים בסוכרת type 2 עמידים באופן יחסי להשפעות האינסולינוֹ-טרופיות של החדרה אקסוגנית של GIP, ואין קשר ישיר בין השמנת-יתר ו-GIP בבני-אדם, יש לשקול את היתרונות היחסיים של שפעול לעומת עיכוב של GIPR, בכל ניסיון בעתיד לשימוש תרפויטי של GIP או של האנלוגים שלו.

התפקיד הפיזיולוגי של GIP בהצטברות שומן:

שומן מגביר באופן ניכר הפרשת GIP (על פי Carr וחב' ב-Am J Physiol Endocrinol Metab , ו-Thomsen וחב' ב-Am J Clin Nutr משנת 1999) וכמו כן רמות GIP מוגברות בחולי סוכרת type 2 כבדי משקל. קיים מתאם טוב בין רמות GIP בפלזמה לבין ריכוזי טריגליצרידים (Elliotte וחב' ב-J Endocrinol משנת 1993). הייתה השערה ש-GIP הוא בעל תפקיד פיזיולוגי בהצטברות שומן באדיפוציטים, ובתחילת שנות ה-80 נעשה ניסוי שהראה ש-GIP בנוכחות אינסולין משרה החדרה של חומצות שומן תוך בלוטות השמן בעקבי חולדות (Beck ו-Max ב-Regul Pept משנת 1983). כמו כן, כאשר בעכברים כבדי-משקל (ob/ob) כתוצאה מפגם בגן של leptin, מניפולציה גנטית של פגיעה ב-GIPR הביאה לא רק לשיפור של בעיית עודף המשקל על ידי הגברת "שריפת" אנרגיה, אלא גם הגבירה את הרגישות לאינסולין ואת הסבילות לגלוקוזה, ללא פגיעה קשה בהפרשת אינסולין (Zhang וחב' ב-Nature משנת 1994, וכן Vilsbøll וחב' ב-Diabetologia משנת 2002 ו-Yamada וחב' ב-Diabetes משנת 2006).

תצפיות אלו אושרו בעכברים שהוזנו בדיאטה עתירת-שומן וכן בעכברים שמנים ob/ob, שטופלו באנטגוניסט Pro3)GIP) של הקולטן ל-GIP (ע"פ Gault וחב' ב-Diabetologia משנת 2008, וכן Irwin וחב' באותו כתב עת משנת 2007), כמו גם בעכברים טרנסגניים החסרים תאי K מפרישי GIP (ע"פ Althage וחב' ב-J Biol Chem משנת 2008).

למרות ש-GIP נמצא מגביר את פעילות lipoprotein lipase, אנזים הקשור לממברנת תאים אדיפוציטים, ואשר תפקידו לבצע הידרוליזה של טריגליצרידים הקשורים לליפופרוטאין על מנת לייצר חומצות שומן, המנגנון המולקולארי דרכו GIP פועל על אדיפוציטים אינו ברור דיו. Kim וחב' דיווחו בשנת 2007 ב-J Biol Chem, שקישור GIP לקולטניו על פני תאי 3T3-L1 גורם להפרשה מוגברת של resistin במסלול הקשור ל-p38 MAPK ו-SAPK/JNK. אותם חוקרים הראו גם ש-GIP משפעל את PI3K ואת Akt/PKB על ידי הפרשת resistin, ועל ידי כך הוא מדכא את AMPK ומגביר את פעילות lipoprotein lipase וליפוגנזה באדיפוציטים.

ראוי לציין שאגוניסט אחר של GIPR, הידוע כ-(D-Ala2GIP(1-30 מראה פעילות דומה לזו של (1-42)GIP על התפקוד וההישרדות של תאי בתא, אך יש לו השפעה פחותה בהרבה על פעילות lipoprotein lipase בתאי 3T3-L1 (ע"פ Widenmaiser וחב' ב-PLoS ONE משנת 2010).

GIP ורקמת עצם:

האפשרות ש-GIP במטבוליזם של רקמת עצם הועלתה על ידי Tsukiyama וחב' ב-Mol Endocrinol משנת 2006, שהראו שלעכברים החסרים GIPR טרבקולות העצם (כפיסונים) דקות יותר מה שאופייני לאוסטיאופורוזיס. חוקרים אלה הדגימו על ידי אנליזה היסטו-פוטומטרית, שיצירת רקמת עצם בעכברים אלה ירודה יותר, ומספר האוסטיאוקלסטים גדול יותר כאופייני לתהליכי אוסטיאופורוזיס. כן הודגם in vitro במחקר זה ש-GIP מדכא תהליכי אפופטוזיס של אוסטיאובלסטים, מה שמרמז לאפשרות שגם in vivo יש ל-GIP תפקיד במניעת אפופטוזיס של אוסטיאובלסטים.

זאת ועוד, ההגברה של יצירת עצם על ידי GIP, כמנגנון של דיכויים של אוסטיאוקלסטים ומניעת אפופטוזיס של תאים אלה, הודגמה בעכברים טרנסגניים עם פגם בייצור GIP (ע"פ Ding וחב' ב-J Bone Miner Res משנת 2008, וכן Xie וחב' ב-Bone משנת 2007 ו-Zhong וחב' ב-Am J Physiol Endocrinol Metab משנת 2007).

ה-mRNA של GIP וההורמון עצמו מבוטאים בעצם הנורמאלית וכן בשורות תאים של אוסטיאובלסטים (Bollag וחב' ב-Endocrinology משנת 2000). נמצא ש-GIP מעודד הגברה ברמות של cAMP ושל יוני סידן תוך-תאי של אוסטיאובלסטים בתרבית, ושהשפעות אלה של GIP כרוכות בסמנים של יצירת רקמת עצם חדשה, כולל הגברת הפעילות של פוספטאזה בסיסית, ועלייה ברמת mRNA של קולאגן type 1. כן נמצא ש-GIP מגדיל את צפיפות העצם (BMD) בחולדות שעברו כריתת שחלות, המהוות מודל של אוסטיאופורוזיס בנשים בגיל חידלון הווסת (Bollag וחב' ב-Endocrinology משנת 2001). יתרה מכך, GIP עשוי לסייע לשקיעת סידן בעצם בתגובה לארוחה, שכן רמות סידן בפלזמה הוגברו בעכברים החסרים GIPR.

בהשוואה לעכברי ביקורת wild-type בני אותו גיל, מוצאים בעכברים טרנסגניים צעירים -/-GIPR מסת וגודל עצם נמוכים יותר, מיקרו-ארכיטקטורה בלתי-נורמאלית של העצם, תכונות ביו-מכאניות פגומות של העצם וכן שינוים במדדי ספיגה ובנייה מחדש של רקמת עצם (Xie וחב' ב-Bone משנת 2005). יחד עם זאת ככל שהעכברים מתבגרים ההבדלים המוזכרים בביולוגיה של העצם נעשים פחות מובהקים. היפוכו של דבר כאשר מסת העצם גדלה בעכברים טרנסגניים המייצרים GIP ביתר, בהשוואה לעכברי wild-type. בשנת 2007 דיווחו Zhong וחב' ב-Am J Physiol, על גילוי mRNA של GIPR ואת הקולטן עצמו בתאים אוסטיאוקלסטים של מכרסמים, כאשר החדרת GIP נמצאה מעכבת תהליכים של ספיגת עצם.

יתרה מכך, עכברי -/-GIPR מבוגרים הראו ירידות בפרמטרים של יצירת עצם כמו גם עליות ברמת סידן בפלזמה לאחר צריכת מזון, מה שמרמז לכך ש-GIPעשוי לספק קשר ישיר בין סידן במזון לבין שקיעת סידן בעצמות. יחד עם זאת, הוספה של GIP במינון גבוה, אין כדי לשנות את התחלופה בתהליכי ספיגה ובניה של רקמת עצם בניסויים ארוכי-טווח של GIP באדם (Henriksen וחב' ב-J Bone Miner Res משנת 2003). כללית, לא ברור אם מתן ארוך טווח של GIP יביא למודולציה של תהליכי ספיגה ובנייה מחדש של רקמת עצם באדם. למרות שממצאים אלה יכולים לרמז על כך שנשים בגיל חידלון הווסת עלולות להיות מועמדות לאוסטיאפורוזיס באופן חלקי בגלל תגובה מופחתת של GIP (על פי Ahren וחב' ב-Eur J Endocrinol משנת 1997) יהיה צורך לקבוע האם GIP הוא אמנם בעל תפקיד אוסטיאוגני באדם.

GIP ורקמות אחרות:

למרות ש-GIP מעכב בקיבה הפרשת חומצת קיבה, פעילות זו מושגת רק בריכוזים הגבוהים משמעותית מריכוזיו הפיזיולוגיים של הורמון זה (Nauck וחב' ב-Digestion משנת 1992). כמן כן נמצא ש-GIP מגביר את הטרנספורט של סוכרים במעי. בכבד, GIP מחליש יצירה של גלוקוזה המושרית על ידי glucagon, כנראה במנגנון בלתי-ישיר, שכן לא נמצאו עד כה קולטנים ל-GIP בכבד. GIP יכול לעודד פינוי של גלוקוזה התלויה באינסולין בבעלי חיים, אם כי השפעה זו לא נמצאה באדם. GIP יכול גם לעודד הפרשה של גלוקו-קורטיקואיד בחולדות דרך מסלול איתות התלוי ב-cAMP/PKA (על פי Mazzocchi וחב' ב-Peptides משנת 1999).

למרות שלא נראה ש-GIP מווסת הפרשה של קורטיזול בבני-אדם בריאים, ביטוי בלתי נורמאלי של GIPR באדנומות ממקור הקורטקס של האדרנל, כרוך בהתפתחות תסמונת Cushing תלויית-מזון (Lacroix וחב' ב-N Eng J Med משנת 1992). נצפה שקולטנים ל-GIP נמצאים גם באנדותליום הווסקולארי, ואמנם GIP מעודד הגברה של רמות סידן תוך-תאי בתרבית של תאי אנדותל (Zhong וחב' ב-Peptides משנת 2000). עירוי של GIP לכלבים משרה בהם הפרשה של endothelin-1 וכיווץ כלי-דם, או הפרשה של NO והרחבת כלי-דם, בתלות במערכת כלי הדם הרלוונטית. ההשפעות המנוגדות של GIP על כלי-דם שונים, מיוחסות לשונות בדרגת השפעול של מסלולי העברת האיתותים בסוגי תאי אנדותל שונים. למרות שמוצאים mRNA של GIPR גם ברקמת הלב, באשכים, בריאות ובמספר רקמות נוספות, הפעילות הפיזיולוגית של GIP ברקמות אלה אינה ברורה, אם בכלל.

שינויים ברמת GIP בתרחישים קליניים:

רמות מוגברות משמעותית של GIP בולטות לאחר עירוי גלוקוזה בחולים עם פנקראטיטיס. רמות מוגברות אלה ניתן למצוא גם בחולי סוכרת. רמה מוגברת של GIP מוצאים בחולים עם VIPoma הידועה גם כתסמונת Verner-Morrison המאוד נדירה, בה תאי איי-לבלב שאינם תאי-β מייצרים VIP. לעומת זאת רמות GIP נמוכות יותר בטיפול בקלציטונין.

== הוראות לביצוע הבדיקה ==

יש להיות בצום של 10-12 שעות לפני נטילת הדם. תכשירים נוגדי חומציות קיבה (Antacids) או תרופות המשפיעות על תנועתיות המעי, או על הפרשת אינסולין יכולים להשפיע על תוצאות מדידת GIP, ולכן יש להפסיק נטילתם במידת האפשר לפחות לפרק זמן של 48 שעות לפני דגימת הדם. יש לדגום את הדם במבחנת הפארין (פקק ירוק) ולאחר סרכוז יש לאחסן את הפלזמה המופרדת בהקפאה במהירות האפשרית. דגימת הפלזמה יציבה בתנאי הקפאה למשל 6 חודשים. הבדיקה נעשית בשיטת RIA. יש לפסול דגימות שאינן פלזמה, או דגימות מופשרות ששהו זמן ממושך בטמפרטורת החדר. המדידה נעשית בשיטת RIA.

Gastric inhibitory polypeptide

2015-08-27T13:48:58Z

בן עמי סלע:

==polypeptide Gastric inhibitory ==

כינויים נוספים: GIP, glucose-dependent insulinotropic peptide.
תחום: הערכת מצבי סוכרת, השמנת יתר והערכה תפקודית של פעילות בלוטת הלבלב.
טווח ערכים תקין: בדם בצום-50-100 פיקוגרם/מ"ל; בדם לאחר ארוחה-110-720 פיקוגרם/מ"ל.
יוצר הערך: פרופ' בן-עמי סלע.

== בסיס פיזיולוגי ==

חלפו למעלה מ-100 שנה מאז התגלית של מושג האינקרטינים (incretins), שפתח לאחר מכן אפשרות של טיפול חדש בחולי סוכרת. בשנת 1902 פרסמו Bayliss ו-Starling ב-J Physiol, על גילוי secretin, מה שהביא את Moore וחב' להשערה שפורסמה ב-Biochem J בשנת 1906, שתמצית מעי מכילה הורמון המווסת את פעילותו האנדוקרינית של בלוטת הלבלב, ואף הראו שהזרקת תמצית זו הפחיתה את כמות הסוכרים המופרשים בשתן של חולי סוכרת, כנראה על ידי גירוי הפעילות האנדוקרינית של הלבלב. אך רק בשנת 1929 חלה התעוררות בנושא, כאשר La Barre ו-Zunz פרסמו ב-Arch Int Physiol Biochim, שהם ניקו מתמצית מעי את הגורם המפחית גלוקוזה וכינו אותו incretin או INtestine seCRETion Insulin. חלפה תקופה דומה של כמעט שלושים שנה, עד אשר פותחה שיטת RIA לכימות רמת אינסולין בשנות ה-60, ובשנת 1964 הופיעו 2 מאמרים שהראו שהעמסת סוכר באופן פומי, הביאה ליצירה מוגברת יותר של אינסולין מאשר היו מזריקים גלוקוזה ישירות לווריד (Elrick וחב' ב-J Clin Endocrinol Metab משנת 1964, ו-McIntyre וחב' ב-Lancet באותה שנה). כיום מייחסים ממצא זה ל-incretins המופרשים מהמעי לאחר בליעת גלוקוזה אך גם ארוחות עשירות בשומן, מה שמגרה את תאי β בלבלב להפריש יותר אינסולין.

רק 2 הורמוני מעי כאלה נתגלו עד כה שפועלים כ-incretins, והם GIP או gastric inhibitory polypeptide, ו-GLP-1 או glucagon-like peptide-1. ה-GIP הוא הורמון בן 42 חומצות אמינו שמשקלו המולקולארי 4,944 דלטון, המופרש מתאי K בחלק העליון של המעי הדק באזור התריסריון וה-jejunum הקריבני (פרוקסימאלי), אך ניתן למצוא את GIP לאורך כל המעי (Inagaki וחב' ב-Mol Endocrinol משנת 1989). במקור בודדו GIP בשנת 1970 ממעי של חזיר על ידי Brown וחב' על בסיס יכולתו לעכב הפרשת חומצת קיבה ו-gastrin בכלבים כפי שתואר ב-J Physiol. מאוחר יותר פרסמו Dupre וחב' ב-J Clin Endocrinol Metab משנת 1973 שהזרקת GIP מעודדת הפרשת אינסולין במתנדבים בריאים על ידי פעולה ישירה של הורמון זה על תאי הלבלב להפרשת אינסולין (Adrian וחב' ב-Diabetologia משנת 1978, ו-Taminato וחב' ב-Diabetes משנת 1977). נתונים אלה הצביעו על GIPכעל ה-incretin המקורי, ולאחר מכן יש שכינו אותו glucose-dependent insulinotropic polypeptide.

הגן ל-GIP אנושי מורכב מ-6 אֶקסונים כאשר רוב המידע המקודד ל-GIP נמצא ב- 3 exon, וגן זה ממוקם בזרוע הארוכה של כרומוזום 17 בעמדה 17 q21.3-q22. ביטוי הגן ל-GIP התגלה בקיבה ובתאי K במעי במכרסמים כמו גם באדם, כאשר בחולדות ביטוי גן זה מופיע גם בבלוטת הרוק התת-מנדיבולארית. נמצא שבחולדות, רמת mRNA של GIP, עולה בתריסיון ובבלוטת הרוק לאחר ארוחות המכילות גלוקוזה או עשירות בשומן, אך רמת mRNA זה פוחתת בתגובה לצום ממושך.

ביוסינתזה של GIP:

הרצף של חומצות האמינו של GIP בחולדה ובאדם, מצביע על כך שהורמון זה מיוצר מקדם-הורמון (preproGIP) גדול יותר המכיל signal peptide , פפטיד N-טרמינאלי, GIP ופפטיד C-טרמינאלי, על ידי פעילות PC או prohormone convertase 1/3. מחקרים עם עכברי knockout בהם פגום הגן של האנזים PC, וכן ניסויים בתרבית תאים עם פעילות-יתר של PC, הדגימו שהצורה הבשלה והפעילה של GIP, המכילה 42 חומצות אמינו מקורה בקודמן preproGIP המכיל 153 חומצות אמינו, כאשר הביקוע מתבצע ליד שייר ארגינין (Ugleholdt וחב' ב-J Biol Chem משנת 2003). הפפטידים המקוּדדים בתוך המקטעים ה-N-טרמינאלי וה-C-טרמינאלי הם חסרי פעילות ידועה. הרצף של GIP השתמר בצורה בולטת בין מיני בעלי חיים שונים, ורצפי חומצות האמינו של GIP של האדם לבין זה של עכבר, חולדה, חזיר ופרה מראים זהות של למעלה מ-90%. יש עדות מסוימת שגם תאי α בלבלב מסוגלים לייצר כמויות קטנות של preproGIP, שעובר ביקוע על ידי prohormone convertase 2 לייצור הורמון קטום בקצה ה-C טרמינאלי של ה-preproGIP , המוגדר כ-(GIP(1-30, אך אין מידע לגבי פעילות פיזיולוגית של פפטיד זה.

(להכניס כאן תרשים שמתחתיו המקרא מתחיל במילים A) הגן ל-proGIP)
(להכניס כאן ברצף את התרשים השמאלי בלבד מעליו GIP באדום
ומתחתיו מופיע ...הביוסינתזה של GIP)
(להכניס כאן ברצף את התרשים שמתחתיו המקרא.....רצף 42 חומצות האמינו של GIP).

התפקוד של GIP:

במקור נקרא הורמון פפטידי זה gastric inhibitory peptide בגלל יכולתו להפחית את הפרשת חומצת הקיבה בחיות (אם כי לא באדם) (Kim ו-Egan ב-Pharmacol Rev משנת 2008) על מנת להגן על המעי הדק מנזק החומצה, להפחית את קצב העברת המזון דרך הקיבה, ולעכב את התנועתיות (motility) של המעיים. אך לאחרונה מייחסים פעולות אלה ביתר שאת להורמון דומה, secretin. היום מאמינים שתפקידו העיקרי של GIP הוא להשרות הפרשת אינסולין, המושפעת העיקר על ידי היפר-אוסמולריות של גלוקוזה בתריסריון (Thorens ב- Diabète & Métabolisme משנת 1995). לכן יש מעדיפים כיום את כינוי ההורמון כ-glucose-dependent insulinotropic peptide.

משערים שיש ל-GIP השפעות משמעותיות על המטבוליזם של חומצות שומן, דרך הגירוי של פעילות האנזים lipoprotein lipase באדיפוציטים. כמו כן, נמצא ש-GIP מופרש בתגובה להנקה הראשונה של חלב אם (colostrum) בגורי עזים. משיקולים אתיים, הפרשת GIP הודגמה בתינוקות אדם רק בגיל 10 ימים בערך. לאחרונה נמצא שיש ל-GIP תפקיד מרכזי בתהליכי עיצוב (remodeling) של רקמת העצם. Gaudin-Audrain וחב' דיווחו בשנת 2013 ב-Bone שעכברים טרנסגניים עם חסר בקולטן ל-GIP, סבלו משינויים ניכרים במיקרו-ארכיטקטורה, בנפח ובאיכות של העצם הטרבקולארית. ממצאים דומים פורסמו באותו כתב-עת בשנת 2013 על ידי Mieczkowska וחב', כאשר נמצא שאיכות העצם נפגמה והייתה נטייה לשברי עצם בעכברים עם חסר מושרה בקולטן ל-GIP.

הרלוונטיות של GIP לסוכרת type 2 הודגמה, כאשר נמצא שחולים בסוג סוכרת זו מגיבים משמעותית פחות ל-GIP, וכן בחולים אלה יש הפרשה פחותה של GIP לאחר ארוחה, בהשוואה לאנשים ללא סוכרת (Skrha וחב' ב-Physiol Res משנת 2010). במחקר עם עכברי knockout, נמצא שחסר בקולטנים ל-GIPכרוך בעמידות להשמנת-יתר (Yamada ו-Seino ב-Hormone & Metabol Res משנת 2004.

(להכניס כאן את התרשים מתחתיו מופיע המקרא: התפקוד הפנקראטי והחוץ פנקראטי של GIP בהשוואה ל-GLP-1)

הפרשה, מטבוליזם ופינוי של GIP:

כאמור, GIP מיוצר ומופרש מתאי K בתריסריון וב-jejunum הקריבני, עם פעילות סינתטית והפרשתית נמוכה יותר לאורך המעי הדק כולו (Mortensen וחב' ב-Regu Pept משנת 2003, ו-Butchan וחב' ב-Histochemistry משנת 1978). GIP מופרש בתגובה לקליטת מזון, בעיקר גלוקוזה או שומן. באופן ספציפי יותר, הפרשת GIP מושפעת יותר מקצב ספיגת המזון מאשר מנוכחות מזון במעי. לכן, הפרשת GIP פוחתת באנשים עם בעיות ספיגה, או לאחר נטילת תכשירים האמורים להפחית את הספיגה (Besterman וחב' ב-BMJ משנת 1979, ו-Fushiki וחב' ב-J Nutr משנת 1992). ראוי לציין שבעוד שמזון שומני הוא גריין יעיל יותר של הפרשת GIP באדם, פחמימות יותר יעילות בגירוי הפרשה זו במכרסמים ובחזירים. באדם, הרמה הבסיסית של GIP בפלזמה היא מתחת ל-50 פיקוגרם/מ"ל, והיא עולה לאחר ארוחה לרמה של עד 720 פיקוגרם/מ"ל בתלות בסוג וכמות המזון בארוחה (Orskov וחב' ב-Scand J Gastroenterol משנת 1996, ו-Vilsbøll וחב' ב-Diabetes משנת 2001). רמות GIP בפלזמה דומות או מוגברות אך במקצת בחולים עם סוכרת type 2 בהשוואה לזו באנשים בריאים (Ross וחב' ב-Diabetes משנת 1977).

(להכניס כאן את התרשים מתחתיו מופיע: הפרשה ומטבוליזם של GIP בהשוואה ל-GLP-1)
(להכניס כאן ברצף את התרשים מתחתיו מופיע: שני incretins פעילים ביולוגית)

תקופת מחצית החיים של GIP היא פחות מ-2 דקות במכרסמים (Kieffer וחב' ב-Endocrinology משנת 1995), ואילו בבני-אדם בריאים תקופת מחצית החיים היא של 7 דקות, כאשר בחולי סוכרת type 2 היא בת 5 דקות (Deacon וחב' ב-J Clin Endocrinol Metabol משנת 2000). יש לציין שתקופת מחצית החיים של GIP בצורתו הקטומה (לאחר הסרת 2 חומצות האמינו פרולין ואלנין בקצה ה-N טרמינאלי על ידי DPP-4) מתארכת עד כדי 17 דקות (Vilsbøll וחב' ב-Regul Pept משנת 2006).

שייר אלנין בעמדה 2 של רצף חומצות האמינו של GIP, מהווה יעד פעולה של DPP-4 או Dipeptidyl peptidase-4, שהוא האנזים הגורם לאינאקטיבציה של(1-42)GIP על ידי הפיכתו למטבוליט הבלתי-פעיל (GIP(3-42, המאבד את תכונותיו האינסולינוטרופיות (Deacon וחב' ב-J Clin Endocrinol Metabמשנת 2000). אנזים זה ממוקם בממברנות brush-border של המעי והכליות, אך ניתן למצוא אותו גם על פני קפילארות, ובצורה מסיסה בפלזמה (Mentlain ב-Regul Pept משנת 1999).

פעילות זו של DPP-4 כאנזים העיקרי הפוגע בפעילות GIP הודגמה היטב במכרסמים ובבני-אדם בריאים או סוכרתיים. התצפיות לפיהן רמות GIP בפלזמה מוגברות באנשים הסובלים מ-uremia או באלה עם מחלת כליות כרונית, כמו גם הממצאים על פינוי משובש של GIP בחולדות שעברו nephrectomy, מצביעים על הכליות כאיבר דרכו מתבצע רוב הפינוי (clearance) של GIP (על פי Meier וחב' ב-Diabetes משנת 2004). מחקרים של Deacon וחב' ב-Diabetes משנת 2001 מראים שגם לכבד יש תפקיד בספיגת GIP מהדם, ואילו Vilsbøll וחב' דיווחו ב-Regul Pept משנת 2006, שקצב הפינוי של GIPשלם ושל המטבוליטים שלו דומים בין אנשים בריאים לבין אנשים שמנים עם סוכרת type 2.

הקולטן ל-GIP:

GIP פועל על ידי התקשרות לקולטן ספציפי GIPR ששובט במקור מספריית cDNA מקליפת המוח של חולדה, ולאחר מכן שובט ממקור אוגר ואדם. הגן של הקולטן האנושי ל-GIP מכיל 14 exons ש"אורכם" 14kb (ע"פ Yamada וחב' ב-Genomics משנת 1995), והוא ממוקם בכרומוזום 19 בעמדה q13.3. הקולטן ל-GIP באדם מכיל 466 חומצות אמינו, אך יש גם איזופורם של קולטן ל-GIP עם 493 חומצות אמינו. הגן ל-GIPR בא לביטוי בבלוטת הלבלב, בקיבה, במעי הדק, ברקמת השומן, בקורטקס של האדרנל, בבלוטת יותרת המוח (היפופיזה), בלב, באשכים, בתאים אנדותליאליים, ברקמת העצם, בטרכיאה, בטחול, בבלוטת ההרת (תימוס), בריאות, בכליות בבלוטת התריס (תירואיד), ובאזורים אחדים של מערכת העצבים המרכזית (Asmar ב-Dan Med Bull משנת 2011). יחד עם זאת, לא ברורה עדיין המשמעות של תוצאות השפעול של קולטנים חוץ-פנקראטיים אלה.

הקולטן של GIP הוא חבר במשפחת העל של קולטנים החוצים את הממברנה באופן מפותל 7 פעמים, שהם בעלי מבנה הֶטֶרוֹ-טרימרי והם קשורים לחלבוני G בציטופלזמה (Usdin וחב' ב-Endocrinology משנת 1993). מעט יחסית ידוע על הגורמים האחראיים לוויסות ביטויו של הקולטן ל-GIP, אך ידוע רמות ה-mRNA של GIPR ושל חלבון הקולטן עצמו, נמוכות יותר באיי הלבלב של חולדות סוכרתיות, מה שנכון גם לבני אדם (Lynn וחב' ב-Diabetes משנת 2001).

שפעול של איתות המועבר דרך GIPR קשור לשדרוג פעילות האנזים adenylyl cyclase ולעליות ברמת cAMP ויוני סידן תוך תאי, כמו גם לשפעול של החלבונים p38 MAPK, PKB, PKA, PI-3K ו-פוספוליפאז A2 (על פי McIntosh וחב' ב-Vitam Horm משנת 2009). ניסויים in-vitro העלו שהקצה ה-N-טרמינאלי של GIPR והלולאה החוץ תאית הראשונה של GIPR חיוניים לזיקה הגבוהה של קישור של GIP לקולטן שלו, בעוד שחלקים מהקצה ה-N טרמינאלי בנוסף למקטע (domain) הטרנס-ממברנאלי חיוניים לשפעול הקולטן ולצימוד של cAMP. למרות שרוב רצף חומצות האמינו בקצה ה-C טרמינאלי של GIPR נראה מיותר לאיתות התוך-תאי, רצף מינימאלי של הקולטן הכולל 405 חומצות אמינו נדרש להעברה יעילה של האיתות לאחר קישור GIP לקולטן שלו. Wheeler וחב' דיווחו ב-J Biol Chem משנת 1999, ששיירי serine 406 ו-411 בקצה ה-C טרמינאלי חיוניים לנטרול (desensitization) פעולת הקולטן, בעוד ששיירי serine 426 ו-427 חיוניים לתהליך החדרת הקולטן לאחר קישורו של GIP.

הפעילויות הביולוגיות של GIP:

הפעילות של GIP על תאי β בלבלב אנלוגית לזו של GLP-1, ל-GIP יש גם פעילות פיזיולוגית ייחודית ברקמות חוץ-פנקראטיות.

(להכניס כאן את התרשים מתחתיו המקרא ..פעילות GIP ברקמות ההיקפיות...)

בלוטת הלבלב:

התפקיד הפיזיולוגי העיקרי של GIP היא פעילותו כ-incretin, דהיינו בהתקשרות לקולטניו על פני תאי β בלבלב, ובעידוד הפרשת אינסולין. המנגנונים המולקולאריים האחראיים להפרשת אינסולין בהשפעת GIP, חופפים באופן משמעותי את אלה המושפעים על ידי GLP-1, וכוללים הגדלת ריכוז cAMP, עיכוב תעלות KATP, עלייה ברמות התוך-תאיות של יוני סידן וגירויי של exocytosis (על פי Ding וחב' ב-Diabetes משנת 1997). הגירוי על ידי GIP להפרשת אינסולין, מסתייע על ידי שפעול של 2 הצמדים, AMP/Protein kinase A ו- cAMP/Epac2, בנוסף לשפעול של phospholipase A2 ומסלולי איתות ספציפיים של פרוטאין קינאז (Kashima וחב' ב- J Biol Chem משנת 2001, ו-Ehses וחב' ב-J Biol Chem משנת 2002). כמו כן, GIP מגביר את השעתוק של הגן לאינסולין ואת הביוסינתזה של הורמון זה בתאי β וכן את הביטוי של החיישנים לגלוקוזה על פני תאים אלה (Wang וחב' ב-Mol Cell Endocrinol משנת 1996).

החשיבות הפיזיולוגית של GIP כ-incretin, מודגמת על ידי פגיעה בפעילות הורמון זה in vivo. ביטול האיתות העובר דרך הקולטן GIPR על ידי שימוש באנטגוניסטים או בנוגדנים המכוונים כנגד GIPR, או על ידי אינאקטיבציה ממוקדת של הגן ל-GIPR בעכברים טרנסגניים (-/-GIPR), גורמים לעמידות פגומה למתן פומי של גלוקוזה, כמו גם להפרשה משובשת של אינסולין הצפויה בעקבות מתן גלוקוזה (Tseng וחב' ב-J Clin Invest משנת 1996, וכן Lewis וחב' ב-Endocrinology משנת 2000 ו-Miyawaki וחב' ב-Proc Natl Acad Sci USA משנת 1999).

כמו כן GIP פועל בסינרגיזם עם גלוקוזה לעודד שגשוג תאים ולשפר את הישרדותם של תאי β פנקריאטיים, והשפעה הגנתית זו על תאי β ניתנת להדגמה באיי לנגרהנס של עכברי בר תקינים, אך לא בעכברים הומוזיגוטיים טרנסגניים מסוג -/-GIPR (ע"פ Kim וחב' ב-J Biol Chem משנת 2005). מנגנוני האיתות המולקולאריים המתווכים בהשפעה של GIP על שגשוג תאים דרך פעילות אנטי-אפופטוטית פוענחו על ידי שימוש בתאים הטרולוגיים שעברו טרנספקציה עם GIPR, בשורת תאי β של מכרסמים, באיי פנקריאס של עכברים, וכללו שפעול של מסלולי cAMP/PKA, וכן של ו-PKA/CREB ו-p38MAPK (על פי Trumper וחב' ב-Mol Endocrinol משנת 2001, ו-Ehses וחב' ב- Endocrinology משנת 2003).

ניסויים עם חולדות סוכרתיות מזן ZDF הראו שעירוי של GIP למשך שבועיים, הפחית משמעותית את האפופטוזיס בתאי β בלבלב על ידי שפעול של Akt-PKB בתלות ב-PI-3K, וכן שפעול הפוספורילציה והרחקה מגרעין התא של FoxO1, מה שגורם להפחתת ביטויו של הגן מקדם האפופטוזיס Bax, הפחתה בפעילות caspase 3 (אנזים המפתח בתהליך האפופטוזיס), כמו גם דיכוי השעתוק של הגן ל-bax (חלבון מקדם אפופטוזיס נוסף), ולעומת זאת שדרוג בפעולת הגן של החלבון האנטי-אפופטוטי bcl-2 (על פי Kim וחב' ב-J Biol Chem משנת 2005). כמו כן, נמצא ש-GIP מפחית את רמת סמנים ביוכימיים הקשורים לעקה של הרטיקולום האנדופלזמי (ER) בשורת תאים של איי הלבלב לאחר השריית עקה זו של ה-ER בתנאי תרבית תאים (Yusta וחב' ב-Cell Metab משנת 2006). ניתן לומר שהפעילות האינסולינו-טרופית של GIP פחותה בחולדות היפר-גליקמיות, לפחות באופן חלקי בגלל הביטוי המופחת של הקולטן ל-GIP בחולדות אלה (Lynn וחב' ב-Diabetes משנת 2001).

פעילות GIP במערכת העצבים המרכזית:

ב-CNS, ניתן למצוא ביטוי של GIP בהיפוקמפוס, בתאי Purkinje במוחון וב-olfactory bulb (על פי Nyberg וחב' ב-J Neurosci Res משנת 2007). קולטנים ל-GIP אותרו באזורי מוח אחדים כולל בקליפת המוח, בהיפוקמפוס, ב-olfactory bulb (על פי Kaplan ו-Vigna ב-Peptides משנת 1994, ו-Usdin וחב' ב-Endocrinology משנת 1993). עירוי של GIP אקסוגני למוח חולדות, השרתה שגשוג של תאים פרוגניטורים בהיפוקמפוס in vivo כמו גם בתאים פרוגניטרים מההיפוקמפוס בתנאי תרבית תאים (Nyberg וחב' ב-J Neurosci משנת 2005). לעומת זאת, עכברים טרנסגניים בוגרים (-/-GIPR), עם פגיעה מושרית בקולטן ל-GIP, הכילו מספר קטן משמעותית של תאים פרוגניטורים חדשים ב-dentate gyrus של ההיפוקמפוס. כמו כן, עכברים טרנסגניים המבטאים ביתר את הקולטן GIPR, מפגינים קואורדינציה תחושתית-מוטורית משופרת, כמו גם שיפור בממדי זיכרון בהשוואה לעכברים wild-type.

נראה אם כן שהביטוי של GIPR בתאי עצב פרוגניטורים ב-dentate gyrous של ההיפוקמפוס, מצביעים על מעורבות אפשרית של GIP הוויסות של נוירוגנזה ובתפקוד הזיכרון. באופן הצפוי על יסוד ההשפעה השגשוגית של GIP על תאי פרוגניטור עצביים, השפעול של GIPR על ידי אנאלוגים של GIP, מעודד יצירת LTP (או long-term potentiation) בהיפוקמפוס, ואילו עיכוב ביטוי GIPR על ידי אנטגוניסט של GIP דוגמת Pro3)GIP), מפחית את ה-LTP (על פי Gault וחב' ב-J Neurophysiol משנת 2008). לעומת זאת, עכברים טרנסגניים עם ביטוי-יתר של GIP, מראים שיפור בביצוע משימות הכרוכות בזיכרון (Ding וחב' ב-Peptides משנת 2006). פעילות נוספת של GIP במוח קשורה לוויסות תחושות התיאבון והשובע.

GIP ורקמת שומן:

קולטני GIPR פונקציונאליים מבוטאים על פני אדיפוציטים מבודדים מחולדות ועל פני תאי 3T3-L1 (על פי Yip וחב' ב-Endocrinology משנת 1998). כיוון שכך, יש הקושרים את GIP לפיקוח על המטבוליזם של שומן, ולהתפתחות של השמנת-יתר. קליטת שומן מהמזון היא גריין משמעותי של הפרשת GIP באדם, ורמות GIP בפלזמה עולות בחלק מחולי סוכרת type 2 כבדי המשקל (על פי Creutzfeldt וחב' ב-Diabetologia משנת 1978, ו-Salera וחב' ב-J Clin Endocrinol Metab משנת 1982). ההשפעה האנאבולית של GIP על רקמת השומן, כוללת גירוי של סינתזה של חומצות שומן ו-רה-אסטריפיקציה שלהן עידוד של החדרת חומצות שומן לתוך טריגליצרידים המושרית על ידי אינסולין, שדרוג הסינתזה של האנזים lipoprotein lipase, הגברת הזיקה של אינסולין לקולטנים שלו, והפחתה בתהליכים ליפוליטיים המושרים על ידי glucagon. יחד עם זאת, יש ל-GIP כנראה גם השפעות ליפוליטיות, אם כי אלה שנויות במחלוקת (Yip ו-Wolfe ב-Life Sci משנת 2000). עכברים טרנסגניים (-/-GIPR), מראים עמידות להשמנת-יתר הנובעת מקליטת מזון, תוך שהם מראים מסת שומן מופחתת, למרות מספר חודשים של האכלתם בדיאטה עתירת-שומן (Miyawaki וחב' ב-Nat Med משנת 2002).

הוספת GIP נמצאה מגבירה את פינוי כילומיקרונים בכלבים (Wasada וחב' ב-J Clin Invest משנת 1981), מפחיתה את רמת טריגליצרידים לאחר ארוחה בחולדות (Ebert וחב' ב-Horm Metab Res משנת 1991) ומגבירה טרנספורט של גלוקוזה וסינתזת חומצות שומן ב-explants של רקמת שומן מחולדות (Knapper וחב' ב-J Nutr משנת 1995, ו-Oben וחב' ב-J Endocrinol משנת 1991). בנוסף, נראה ש-GIP מגביר את רגישות אדיפוציטים לאינסולין, ובכך מעודד קליטת גלוקוזה וחומצות שומן לאגירה בתאים אלה.

יתרה מכך, ניסוי של Isken וחב' שפורסם ב-Am J Physiol Endocrinol Metab משנת 2008, הראה שהשמנת יתר המושרית בדרך כלל על ידי ניתוח להרחקת השחלות נמנעה בעכברים עם חסר בקולטן ל-GIP, מה שניתן להסביר חלקית על ידי הפחתה בצריכת מזון בגלל החסר ב-GIPR. התברר שעירוי לתוך המוח של NPY או הנוירופפטיד האורקסיגני Y, מעודד הפרשת GIP מתאי העצב, מה שרומז לכך ש-GIP פועל כמווסת שלילי של NPY, ועשוי לווסת צריכת מזון על ידי הכלבים המטופלים (Yavropoulou וחב' ב-Peptides משנת 2008). יחד עם זאת, יש לשקול בזהירות יתרה את ההערכה של תפקוד נוגד-השמנה של GIP במוח, כיוון שיש להורמון האחרון השפעה ישירה על רקמת השומן. יש גם להתחשב בהשפעה של ההורמון האינקרטיני האחר GLP-1 בהקשר של השפעתו על צריכת מזון ושובע באדם. בניגוד ל-GLP-1 המעכב התרוקנות הקיבה, נמצא של-GIP יש השפעה מועטה בלבד על התרוקנות הקיבה באדם ובעכברים (Meier וחב' ב-Am J Physiol Endocrinol Metab משנת 2004).

זאת ועוד, עכברי -/-ob/ob:GIPR עולים פחות במשקלם, הם בעלי רקמת שומן מצומצמת יותר, ומגיבים טוב יותר לעודף גלוקוזה, על ידי רגישות רבה יותר לאינסולין, בהשוואה לעכברי ob/ob. למרות שצריכת המזון דומה בין עכברי -/-GIPR לבין עכברי wild-type, כאשר מאכילים אותם במזון עתיר-שומן, עכברי -/-GIPR מוציאים יותר אנרגיה, ולכן הם משתמשים בשומן כמצע אנרגיה מועדף, ולפיכך נמנעת אגירת שומן באדיפוציטים שלהם. בעכברי ob/ob עירוי כרוני של אנטגוניסט לקולטן GIPR דוגמת Pro3)GIP) משפר את הסבילות לגלוקוזה, מגביר את הרגישות לאינסולין, ומתקן את ההיפרטרופיה של תאי הלבלב המושרית על ידי השמנת-יתר, כמו גם את ההיפרפלזיה של תאי β (על פי Gault וחב' ב-Diabetes משנת 2005).

יחד עם זאת, עכברי -/-GIPR שניזונו על דיאטת chow נורמאלית, מראים חוסר סבילות לגלוקוזה, והחדרה של Pro3)GIP) פוגעת בסבילות לגלוקוזה בעכברי wild-type (על פי Irwin וחב' ב-Biol Chem משנת 2004). בנוסף, שפעול של GIPR כרוך עם שיפור בסבילות לגלוקוזה, ומגביר הפרשת אינסולין במודלים של סוכרת בחיות. לכן, למרות שחולים בסוכרת type 2 עמידים באופן יחסי להשפעות האינסולינוֹ-טרופיות של החדרה אקסוגנית של GIP, ואין קשר ישיר בין השמנת-יתר ו-GIP בבני-אדם, יש לשקול את היתרונות היחסיים של שפעול לעומת עיכוב של GIPR, בכל ניסיון בעתיד לשימוש תרפויטי של GIP או של האנלוגים שלו.

התפקיד הפיזיולוגי של GIP בהצטברות שומן:

שומן מגביר באופן ניכר הפרשת GIP (על פי Carr וחב' ב-Am J Physiol Endocrinol Metab , ו-Thomsen וחב' ב-Am J Clin Nutr משנת 1999) וכמו כן רמות GIP מוגברות בחולי סוכרת type 2 כבדי משקל. קיים מתאם טוב בין רמות GIP בפלזמה לבין ריכוזי טריגליצרידים (Elliotte וחב' ב-J Endocrinol משנת 1993). הייתה השערה ש-GIP הוא בעל תפקיד פיזיולוגי בהצטברות שומן באדיפוציטים, ובתחילת שנות ה-80 נעשה ניסוי שהראה ש-GIP בנוכחות אינסולין משרה החדרה של חומצות שומן תוך בלוטות השמן בעקבי חולדות (Beck ו-Max ב-Regul Pept משנת 1983). כמו כן, כאשר בעכברים כבדי-משקל (ob/ob) כתוצאה מפגם בגן של leptin, מניפולציה גנטית של פגיעה ב-GIPR הביאה לא רק לשיפור של בעיית עודף המשקל על ידי הגברת "שריפת" אנרגיה, אלא גם הגבירה את הרגישות לאינסולין ואת הסבילות לגלוקוזה, ללא פגיעה קשה בהפרשת אינסולין (Zhang וחב' ב-Nature משנת 1994, וכן Vilsbøll וחב' ב-Diabetologia משנת 2002 ו-Yamada וחב' ב-Diabetes משנת 2006).

תצפיות אלו אושרו בעכברים שהוזנו בדיאטה עתירת-שומן וכן בעכברים שמנים ob/ob, שטופלו באנטגוניסט Pro3)GIP) של הקולטן ל-GIP (ע"פ Gault וחב' ב-Diabetologia משנת 2008, וכן Irwin וחב' באותו כתב עת משנת 2007), כמו גם בעכברים טרנסגניים החסרים תאי K מפרישי GIP (ע"פ Althage וחב' ב-J Biol Chem משנת 2008).

למרות ש-GIP נמצא מגביר את פעילות lipoprotein lipase, אנזים הקשור לממברנת תאים אדיפוציטים, ואשר תפקידו לבצע הידרוליזה של טריגליצרידים הקשורים לליפופרוטאין על מנת לייצר חומצות שומן, המנגנון המולקולארי דרכו GIP פועל על אדיפוציטים אינו ברור דיו. Kim וחב' דיווחו בשנת 2007 ב-J Biol Chem, שקישור GIP לקולטניו על פני תאי 3T3-L1 גורם להפרשה מוגברת של resistin במסלול הקשור ל-p38 MAPK ו-SAPK/JNK. אותם חוקרים הראו גם ש-GIP משפעל את PI3K ואת Akt/PKB על ידי הפרשת resistin, ועל ידי כך הוא מדכא את AMPK ומגביר את פעילות lipoprotein lipase וליפוגנזה באדיפוציטים.

ראוי לציין שאגוניסט אחר של GIPR, הידוע כ-(D-Ala2GIP(1-30 מראה פעילות דומה לזו של (1-42)GIP על התפקוד וההישרדות של תאי בתא, אך יש לו השפעה פחותה בהרבה על פעילות lipoprotein lipase בתאי 3T3-L1 (ע"פ Widenmaiser וחב' ב-PLoS ONE משנת 2010).

GIP ורקמת עצם:

האפשרות ש-GIP במטבוליזם של רקמת עצם הועלתה על ידי Tsukiyama וחב' ב-Mol Endocrinol משנת 2006, שהראו שלעכברים החסרים GIPR טרבקולות העצם (כפיסונים) דקות יותר מה שאופייני לאוסטיאופורוזיס. חוקרים אלה הדגימו על ידי אנליזה היסטו-פוטומטרית, שיצירת רקמת עצם בעכברים אלה ירודה יותר, ומספר האוסטיאוקלסטים גדול יותר כאופייני לתהליכי אוסטיאופורוזיס. כן הודגם in vitro במחקר זה ש-GIP מדכא תהליכי אפופטוזיס של אוסטיאובלסטים, מה שמרמז לאפשרות שגם in vivo יש ל-GIP תפקיד במניעת אפופטוזיס של אוסטיאובלסטים.

זאת ועוד, ההגברה של יצירת עצם על ידי GIP, כמנגנון של דיכויים של אוסטיאוקלסטים ומניעת אפופטוזיס של תאים אלה, הודגמה בעכברים טרנסגניים עם פגם בייצור GIP (ע"פ Ding וחב' ב-J Bone Miner Res משנת 2008, וכן Xie וחב' ב-Bone משנת 2007 ו-Zhong וחב' ב-Am J Physiol Endocrinol Metab משנת 2007).

ה-mRNA של GIP וההורמון עצמו מבוטאים בעצם הנורמאלית וכן בשורות תאים של אוסטיאובלסטים (Bollag וחב' ב-Endocrinology משנת 2000). נמצא ש-GIP מעודד הגברה ברמות של cAMP ושל יוני סידן תוך-תאי של אוסטיאובלסטים בתרבית, ושהשפעות אלה של GIP כרוכות בסמנים של יצירת רקמת עצם חדשה, כולל הגברת הפעילות של פוספטאזה בסיסית, ועלייה ברמת mRNA של קולאגן type 1. כן נמצא ש-GIP מגדיל את צפיפות העצם (BMD) בחולדות שעברו כריתת שחלות, המהוות מודל של אוסטיאופורוזיס בנשים בגיל חידלון הווסת (Bollag וחב' ב-Endocrinology משנת 2001). יתרה מכך, GIP עשוי לסייע לשקיעת סידן בעצם בתגובה לארוחה, שכן רמות סידן בפלזמה הוגברו בעכברים החסרים GIPR.

בהשוואה לעכברי ביקורת wild-type בני אותו גיל, מוצאים בעכברים טרנסגניים צעירים -/-GIPR מסת וגודל עצם נמוכים יותר, מיקרו-ארכיטקטורה בלתי-נורמאלית של העצם, תכונות ביו-מכאניות פגומות של העצם וכן שינוים במדדי ספיגה ובנייה מחדש של רקמת עצם (Xie וחב' ב-Bone משנת 2005). יחד עם זאת ככל שהעכברים מתבגרים ההבדלים המוזכרים בביולוגיה של העצם נעשים פחות מובהקים. היפוכו של דבר כאשר מסת העצם גדלה בעכברים טרנסגניים המייצרים GIP ביתר, בהשוואה לעכברי wild-type. בשנת 2007 דיווחו Zhong וחב' ב-Am J Physiol, על גילוי mRNA של GIPR ואת הקולטן עצמו בתאים אוסטיאוקלסטים של מכרסמים, כאשר החדרת GIP נמצאה מעכבת תהליכים של ספיגת עצם.

יתרה מכך, עכברי -/-GIPR מבוגרים הראו ירידות בפרמטרים של יצירת עצם כמו גם עליות ברמת סידן בפלזמה לאחר צריכת מזון, מה שמרמז לכך ש-GIPעשוי לספק קשר ישיר בין סידן במזון לבין שקיעת סידן בעצמות. יחד עם זאת, הוספה של GIP במינון גבוה, אין כדי לשנות את התחלופה בתהליכי ספיגה ובניה של רקמת עצם בניסויים ארוכי-טווח של GIP באדם (Henriksen וחב' ב-J Bone Miner Res משנת 2003). כללית, לא ברור אם מתן ארוך טווח של GIP יביא למודולציה של תהליכי ספיגה ובנייה מחדש של רקמת עצם באדם. למרות שממצאים אלה יכולים לרמז על כך שנשים בגיל חידלון הווסת עלולות להיות מועמדות לאוסטיאפורוזיס באופן חלקי בגלל תגובה מופחתת של GIP (על פי Ahren וחב' ב-Eur J Endocrinol משנת 1997) יהיה צורך לקבוע האם GIP הוא אמנם בעל תפקיד אוסטיאוגני באדם.

GIP ורקמות אחרות:

למרות ש-GIP מעכב בקיבה הפרשת חומצת קיבה, פעילות זו מושגת רק בריכוזים הגבוהים משמעותית מריכוזיו הפיזיולוגיים של הורמון זה (Nauck וחב' ב-Digestion משנת 1992). כמן כן נמצא ש-GIP מגביר את הטרנספורט של סוכרים במעי. בכבד, GIP מחליש יצירה של גלוקוזה המושרית על ידי glucagon, כנראה במנגנון בלתי-ישיר, שכן לא נמצאו עד כה קולטנים ל-GIP בכבד. GIP יכול לעודד פינוי של גלוקוזה התלויה באינסולין בבעלי חיים, אם כי השפעה זו לא נמצאה באדם. GIP יכול גם לעודד הפרשה של גלוקו-קורטיקואיד בחולדות דרך מסלול איתות התלוי ב-cAMP/PKA (על פי Mazzocchi וחב' ב-Peptides משנת 1999).

למרות שלא נראה ש-GIP מווסת הפרשה של קורטיזול בבני-אדם בריאים, ביטוי בלתי נורמאלי של GIPR באדנומות ממקור הקורטקס של האדרנל, כרוך בהתפתחות תסמונת Cushing תלויית-מזון (Lacroix וחב' ב-N Eng J Med משנת 1992). נצפה שקולטנים ל-GIP נמצאים גם באנדותליום הווסקולארי, ואמנם GIP מעודד הגברה של רמות סידן תוך-תאי בתרבית של תאי אנדותל (Zhong וחב' ב-Peptides משנת 2000). עירוי של GIP לכלבים משרה בהם הפרשה של endothelin-1 וכיווץ כלי-דם, או הפרשה של NO והרחבת כלי-דם, בתלות במערכת כלי הדם הרלוונטית. ההשפעות המנוגדות של GIP על כלי-דם שונים, מיוחסות לשונות בדרגת השפעול של מסלולי העברת האיתותים בסוגי תאי אנדותל שונים. למרות שמוצאים mRNA של GIPR גם ברקמת הלב, באשכים, בריאות ובמספר רקמות נוספות, הפעילות הפיזיולוגית של GIP ברקמות אלה אינה ברורה, אם בכלל.

שינויים ברמת GIP בתרחישים קליניים:

רמות מוגברות משמעותית של GIP בולטות לאחר עירוי גלוקוזה בחולים עם פנקראטיטיס. רמות מוגברות אלה ניתן למצוא גם בחולי סוכרת. רמה מוגברת שלGIP מוצאים בחולים עם VIPoma הידועה גם כתסמונת Verner-Morrison המאוד נדירה, בה תאי איי-לבלב שאינם תאי-β מייצרים VIP. לעומת זאת רמות GIP נמוכות יותר בטיפול בקלציטונין.
== הוראות לביצוע הבדיקה ==
יש להיות בצום של 10-12 שעות לפני נטילת הדם. תכשירים נוגדי חומציות קיבה (Antacids) או תרופות המשפיעות על תנועתיות המעי, או על הפרשת אינסולין יכולים להשפיע על תוצאות מדידת GIP, ולכן יש להפסיק נטילתם במידת האפשר לפחות לפרק זמן של 48 שעות לפני דגימת הדם. יש לדגום את הדם במבחנת הפארין (פקק ירוק) ולאחר סרכוז יש לאחסן את הפלזמה המופרדת בהקפאה במהירות האפשרית. דגימת הפלזמה יציבה בתנאי הקפאה למשל 6 חודשים. הבדיקה נעשית בשיטת RIA. יש לפסול דגימות שאינן פלזמה, או דגימות מופשרות ששהו זמן ממושך בטמפרטורת החדר. המדידה נעשית בשיטת RIA.

Gastric inhibitory polypeptide

2015-08-27T13:44:32Z

בן עמי סלע:

==polypeptide Gastric inhibitory ==

כינויים נוספים: GIP, glucose-dependent insulinotropic peptide.
תחום: הערכת מצבי סוכרת, השמנת יתר והערכה תפקודית של פעילות בלוטת הלבלב.
טווח ערכים תקין: בדם בצום-50-100 פיקוגרם/מ"ל; בדם לאחר ארוחה-110-720 פיקוגרם/מ"ל.
יוצר הערך: פרופ' בן-עמי סלע.

== בסיס פיזיולוגי ==

חלפו למעלה מ-100 שנה מאז התגלית של מושג האינקרטינים (incretins), שפתח לאחר מכן אפשרות של טיפול חדש בחולי סוכרת. בשנת 1902 פרסמו Bayliss ו-Starling ב-J Physiol, על גילוי secretin, מה שהביא את Moore וחב' להשערה שפורסמה ב-Biochem J בשנת 1906, שתמצית מעי מכילה הורמון המווסת את פעילותו האנדוקרינית של בלוטת הלבלב, ואף הראו שהזרקת תמצית זו הפחיתה את כמות הסוכרים המופרשים בשתן של חולי סוכרת, כנראה על ידי גירוי הפעילות האנדוקרינית של הלבלב. אך רק בשנת 1929 חלה התעוררות בנושא, כאשר La Barre ו-Zunz פרסמו ב-Arch Int Physiol Biochim, שהם ניקו מתמצית מעי את הגורם המפחית גלוקוזה וכינו אותו incretin או INtestine seCRETion Insulin. חלפה תקופה דומה של כמעט שלושים שנה, עד אשר פותחה שיטת RIA לכימות רמת אינסולין בשנות ה-60, ובשנת 1964 הופיעו 2 מאמרים שהראו שהעמסת סוכר באופן פומי, הביאה ליצירה מוגברת יותר של אינסולין מאשר היו מזריקים גלוקוזה ישירות לווריד (Elrick וחב' ב-J Clin Endocrinol Metab משנת 1964, ו-McIntyre וחב' ב-Lancet באותה שנה). כיום מייחסים ממצא זה ל-incretins המופרשים מהמעי לאחר בליעת גלוקוזה אך גם ארוחות עשירות בשומן, מה שמגרה את תאי β בלבלב להפריש יותר אינסולין.

רק 2 הורמוני מעי כאלה נתגלו עד כה שפועלים כ-incretins, והם GIP או gastric inhibitory polypeptide, ו-GLP-1 או glucagon-like peptide-1. ה-GIP הוא הורמון בן 42 חומצות אמינו שמשקלו המולקולארי 4,944 דלטון, המופרש מתאי K בחלק העליון של המעי הדק באזור התריסריון וה-jejunum הקריבני (פרוקסימאלי), אך ניתן למצוא את GIP לאורך כל המעי (Inagaki וחב' ב-Mol Endocrinol משנת 1989). במקור בודדו GIP בשנת 1970 ממעי של חזיר על ידי Brown וחב' על בסיס יכולתו לעכב הפרשת חומצת קיבה ו-gastrin בכלבים כפי שתואר ב-J Physiol. מאוחר יותר פרסמו Dupre וחב' ב-J Clin Endocrinol Metab משנת 1973 שהזרקת GIP מעודדת הפרשת אינסולין במתנדבים בריאים על ידי פעולה ישירה של הורמון זה על תאי הלבלב להפרשת אינסולין (Adrian וחב' ב-Diabetologia משנת 1978, ו-Taminato וחב' ב-Diabetes משנת 1977). נתונים אלה הצביעו על GIPכעל ה-incretin המקורי, ולאחר מכן יש שכינו אותו glucose-dependent insulinotropic polypeptide.

הגן ל-GIP אנושי מורכב מ-6 אֶקסונים כאשר רוב המידע המקודד ל-GIP נמצא ב- 3 exon, וגן זה ממוקם בזרוע הארוכה של כרומוזום 17 בעמדה 17 q21.3-q22. ביטוי הגן ל-GIP התגלה בקיבה ובתאי K במעי במכרסמים כמו גם באדם, כאשר בחולדות ביטוי גן זה מופיע גם בבלוטת הרוק התת-מנדיבולארית. נמצא שבחולדות, רמת mRNA של GIP, עולה בתריסיון ובבלוטת הרוק לאחר ארוחות המכילות גלוקוזה או עשירות בשומן, אך רמת mRNA זה פוחתת בתגובה לצום ממושך.

ביוסינתזה של GIP:

הרצף של חומצות האמינו של GIP בחולדה ובאדם, מצביע על כך שהורמון זה מיוצר מקדם-הורמון (preproGIP) גדול יותר המכיל signal peptide , פפטיד N-טרמינאלי, GIP ופפטיד C-טרמינאלי, על ידי פעילות PC או prohormone convertase 1/3. מחקרים עם עכברי knockout בהם פגום הגן של האנזים PC, וכן ניסויים בתרבית תאים עם פעילות-יתר של PC, הדגימו שהצורה הבשלה והפעילה של GIP, המכילה 42 חומצות אמינו מקורה בקודמן preproGIP המכיל 153 חומצות אמינו, כאשר הביקוע מתבצע ליד שייר ארגינין (Ugleholdt וחב' ב-J Biol Chem משנת 2003). הפפטידים המקוּדדים בתוך המקטעים ה-N-טרמינאלי וה-C-טרמינאלי הם חסרי פעילות ידועה. הרצף של GIP השתמר בצורה בולטת בין מיני בעלי חיים שונים, ורצפי חומצות האמינו של GIP של האדם לבין זה של עכבר, חולדה, חזיר ופרה מראים זהות של למעלה מ-90%. יש עדות מסוימת שגם תאי α בלבלב מסוגלים לייצר כמויות קטנות של preproGIP, שעובר ביקוע על ידי prohormone convertase 2 לייצור הורמון קטום בקצה ה-C טרמינאלי של ה-preproGIP , המוגדר כ-(GIP(1-30, אך אין מידע לגבי פעילות פיזיולוגית של פפטיד זה.

(להכניס כאן תרשים שמתחתיו המקרא מתחיל במילים A) הגן ל-proGIP)
(להכניס כאן ברצף את התרשים השמאלי בלבד מעליו GIP באדום
ומתחתיו מופיע ...הביוסינתזה של GIP)
(להכניס כאן ברצף את התרשים שמתחתיו המקרא.....רצף 42 חומצות האמינו של GIP).

התפקוד של GIP:

במקור נקרא הורמון פפטידי זה gastric inhibitory peptide בגלל יכולתו להפחית את הפרשת חומצת הקיבה בחיות (אם כי לא באדם) (Kim ו-Egan ב-Pharmacol Rev משנת 2008) על מנת להגן על המעי הדק מנזק החומצה, להפחית את קצב העברת המזון דרך הקיבה, ולעכב את התנועתיות (motility) של המעיים. אך לאחרונה מייחסים פעולות אלה ביתר שאת להורמון דומה, secretin. היום מאמינים שתפקידו העיקרי של GIP הוא להשרות הפרשת אינסולין, המושפעת העיקר על ידי היפר-אוסמולריות של גלוקוזה בתריסריון (Thorens ב- Diabète & Métabolisme משנת 1995). לכן יש מעדיפים כיום את כינוי ההורמון כ-glucose-dependent insulinotropic peptide.

משערים שיש ל-GIP השפעות משמעותיות על המטבוליזם של חומצות שומן, דרך הגירוי של פעילות האנזים lipoprotein lipase באדיפוציטים. כמו כן, נמצא ש-GIP מופרש בתגובה להנקה הראשונה של חלב אם (colostrum) בגורי עזים. משיקולים אתיים, הפרשת GIP הודגמה בתינוקות אדם רק בגיל 10 ימים בערך. לאחרונה נמצא שיש ל-GIP תפקיד מרכזי בתהליכי עיצוב (remodeling) של רקמת העצם. Gaudin-Audrain וחב' דיווחו בשנת 2013 ב-Bone שעכברים טרנסגניים עם חסר בקולטן ל-GIP, סבלו משינויים ניכרים במיקרו-ארכיטקטורה, בנפח ובאיכות של העצם הטרבקולארית. ממצאים דומים פורסמו באותו כתב-עת בשנת 2013 על ידי Mieczkowska וחב', כאשר נמצא שאיכות העצם נפגמה והייתה נטייה לשברי עצם בעכברים עם חסר מושרה בקולטן ל-GIP.

הרלוונטיות של GIP לסוכרת type 2 הודגמה, כאשר נמצא שחולים בסוג סוכרת זו מגיבים משמעותית פחות ל-GIP, וכן בחולים אלה יש הפרשה פחותה של GIP לאחר ארוחה, בהשוואה לאנשים ללא סוכרת (Skrha וחב' ב-Physiol Res משנת 2010). במחקר עם עכברי knockout, נמצא שחסר בקולטנים ל-GIPכרוך בעמידות להשמנת-יתר (Yamada ו-Seino ב-Hormone & Metabol Res משנת 2004.

(להכניס כאן את התרשים מתחתיו מופיע המקרא: התפקוד הפנקראטי והחוץ פנקראטי של GIP בהשוואה ל-GLP-1)

הפרשה, מטבוליזם ופינוי של GIP:

כאמור, GIP מיוצר ומופרש מתאי K בתריסריון וב-jejunum הקריבני, עם פעילות סינתטית והפרשתית נמוכה יותר לאורך המעי הדק כולו (Mortensen וחב' ב-Regu Pept משנת 2003, ו-Butchan וחב' ב-Histochemistry משנת 1978). GIP מופרש בתגובה לקליטת מזון, בעיקר גלוקוזה או שומן. באופן ספציפי יותר, הפרשת GIP מושפעת יותר מקצב ספיגת המזון מאשר מנוכחות מזון במעי. לכן, הפרשת GIP פוחתת באנשים עם בעיות ספיגה, או לאחר נטילת תכשירים האמורים להפחית את הספיגה (Besterman וחב' ב-BMJ משנת 1979, ו-Fushiki וחב' ב-J Nutr משנת 1992). ראוי לציין שבעוד שמזון שומני הוא גריין יעיל יותר של הפרשת GIP באדם, פחמימות יותר יעילות בגירוי הפרשה זו במכרסמים ובחזירים. באדם, הרמה הבסיסית של GIP בפלזמה היא מתחת ל-50 פיקוגרם/מ"ל, והיא עולה לאחר ארוחה לרמה של עד 720 פיקוגרם/מ"ל בתלות בסוג וכמות המזון בארוחה (Orskov וחב' ב-Scand J Gastroenterol משנת 1996, ו-Vilsbøll וחב' ב-Diabetes משנת 2001). רמות GIP בפלזמה דומות או מוגברות אך במקצת בחולים עם סוכרת type 2 בהשוואה לזו באנשים בריאים (Ross וחב' ב-Diabetes משנת 1977).

(להכניס כאן את התרשים מתחתיו מופיע: הפרשה ומטבוליזם של GIP בהשוואה ל-GLP-1)
(להכניס כאן ברצף את התרשים מתחתיו מופיע: שני incretins פעילים ביולוגית)

תקופת מחצית החיים של GIP היא פחות מ-2 דקות במכרסמים (Kieffer וחב' ב-Endocrinology משנת 1995), ואילו בבני-אדם בריאים תקופת מחצית החיים היא של 7 דקות, כאשר בחולי סוכרת type 2 היא בת 5 דקות (Deacon וחב' ב-J Clin Endocrinol Metabol משנת 2000). יש לציין שתקופת מחצית החיים של GIP בצורתו הקטומה (לאחר הסרת 2 חומצות האמינו פרולין ואלנין בקצה ה-N טרמינאלי על ידי DPP-4) מתארכת עד כדי 17 דקות (Vilsbøll וחב' ב-Regul Pept משנת 2006).

שייר אלנין בעמדה 2 של רצף חומצות האמינו של GIP, מהווה יעד פעולה של DPP-4 או Dipeptidyl peptidase-4, שהוא האנזים הגורם לאינאקטיבציה של(1-42)GIP על ידי הפיכתו למטבוליט הבלתי-פעיל (GIP(3-42, המאבד את תכונותיו האינסולינוטרופיות (Deacon וחב' ב-J Clin Endocrinol Metabמשנת 2000). אנזים זה ממוקם בממברנות brush-border של המעי והכליות, אך ניתן למצוא אותו גם על פני קפילארות, ובצורה מסיסה בפלזמה (Mentlain ב-Regul Pept משנת 1999).

פעילות זו של DPP-4 כאנזים העיקרי הפוגע בפעילות GIP הודגמה היטב במכרסמים ובבני-אדם בריאים או סוכרתיים. התצפיות לפיהן רמות GIP בפלזמה מוגברות באנשים הסובלים מ-uremia או באלה עם מחלת כליות כרונית, כמו גם הממצאים על פינוי משובש של GIP בחולדות שעברו nephrectomy, מצביעים על הכליות כאיבר דרכו מתבצע רוב הפינוי (clearance) של GIP (על פי Meier וחב' ב-Diabetes משנת 2004). מחקרים של Deacon וחב' ב-Diabetes משנת 2001 מראים שגם לכבד יש תפקיד בספיגת GIP מהדם, ואילו Vilsbøll וחב' דיווחו ב-Regul Pept משנת 2006, שקצב הפינוי של GIPשלם ושל המטבוליטים שלו דומים בין אנשים בריאים לבין אנשים שמנים עם סוכרת type 2.

הקולטן ל-GIP:

GIP פועל על ידי התקשרות לקולטן ספציפי GIPR ששובט במקור מספריית cDNA מקליפת המוח של חולדה, ולאחר מכן שובט ממקור אוגר ואדם. הגן של הקולטן האנושי ל-GIP מכיל 14 exons ש"אורכם" 14kb (ע"פ Yamada וחב' ב-Genomics משנת 1995), והוא ממוקם בכרומוזום 19 בעמדה q13.3. הקולטן ל-GIP באדם מכיל 466 חומצות אמינו, אך יש גם איזופורם של קולטן ל-GIP עם 493 חומצות אמינו. הגן ל-GIPR בא לביטוי בבלוטת הלבלב, בקיבה, במעי הדק, ברקמת השומן, בקורטקס של האדרנל, בבלוטת יותרת המוח (היפופיזה), בלב, באשכים, בתאים אנדותליאליים, ברקמת העצם, בטרכיאה, בטחול, בבלוטת ההרת (תימוס), בריאות, בכליות בבלוטת התריס (תירואיד), ובאזורים אחדים של מערכת העצבים המרכזית (Asmar ב-Dan Med Bull משנת 2011). יחד עם זאת, לא ברורה עדיין המשמעות של תוצאות השפעול של קולטנים חוץ-פנקראטיים אלה.

הקולטן של GIP הוא חבר במשפחת העל של קולטנים החוצים את הממברנה באופן מפותל 7 פעמים, שהם בעלי מבנה הֶטֶרוֹ-טרימרי והם קשורים לחלבוני G בציטופלזמה (Usdin וחב' ב-Endocrinology משנת 1993). מעט יחסית ידוע על הגורמים האחראיים לוויסות ביטויו של הקולטן ל-GIP, אך ידוע רמות ה-mRNA של GIPR ושל חלבון הקולטן עצמו, נמוכות יותר באיי הלבלב של חולדות סוכרתיות, מה שנכון גם לבני אדם (Lynn וחב' ב-Diabetes משנת 2001).

שפעול של איתות המועבר דרך GIPR קשור לשדרוג פעילות האנזים adenylyl cyclase ולעליות ברמת cAMP ויוני סידן תוך תאי, כמו גם לשפעול של החלבונים p38 MAPK, PKB, PKA, PI-3K ו-פוספוליפאז A2 (על פי McIntosh וחב' ב-Vitam Horm משנת 2009). ניסויים in-vitro העלו שהקצה ה-N-טרמינאלי של GIPR והלולאה החוץ תאית הראשונה של GIPR חיוניים לזיקה הגבוהה של קישור של GIP לקולטן שלו, בעוד שחלקים מהקצה ה-N טרמינאלי בנוסף למקטע (domain) הטרנס-ממברנאלי חיוניים לשפעול הקולטן ולצימוד של cAMP. למרות שרוב רצף חומצות האמינו בקצה ה-C טרמינאלי של GIPR נראה מיותר לאיתות התוך-תאי, רצף מינימאלי של הקולטן הכולל 405 חומצות אמינו נדרש להעברה יעילה של האיתות לאחר קישור GIP לקולטן שלו. Wheeler וחב' דיווחו ב-J Biol Chem משנת 1999, ששיירי serine 406 ו-411 בקצה ה-C טרמינאלי חיוניים לנטרול (desensitization) פעולת הקולטן, בעוד ששיירי serine 426 ו-427 חיוניים לתהליך החדרת הקולטן לאחר קישורו של GIP.

הפעילויות הביולוגיות של GIP:

הפעילות של GIP על תאי β בלבלב אנלוגית לזו של GLP-1, ל-GIP יש גם פעילות פיזיולוגית ייחודית ברקמות חוץ-פנקראטיות.

(להכניס כאן את התרשים מתחתיו המקרא ..פעילות GIP ברקמות ההיקפיות...)

בלוטת הלבלב:

התפקיד הפיזיולוגי העיקרי של GIP היא פעילותו כ-incretin, דהיינו בהתקשרות לקולטניו על פני תאי β בלבלב, ובעידוד הפרשת אינסולין. המנגנונים המולקולאריים האחראיים להפרשת אינסולין בהשפעת GIP, חופפים באופן משמעותי את אלה המושפעים על ידי GLP-1, וכוללים הגדלת ריכוז cAMP, עיכוב תעלות KATP, עלייה ברמות התוך-תאיות של יוני סידן וגירויי של exocytosis (על פי Ding וחב' ב-Diabetes משנת 1997). הגירוי על ידי GIP להפרשת אינסולין, מסתייע על ידי שפעול של 2 הצמדים, AMP/Protein kinase A ו- cAMP/Epac2, בנוסף לשפעול של phospholipase A2 ומסלולי איתות ספציפיים של פרוטאין קינאז (Kashima וחב' ב- J Biol Chem משנת 2001, ו-Ehses וחב' ב-J Biol Chem משנת 2002). כמו כן, GIP מגביר את השעתוק של הגן לאינסולין ואת הביוסינתזה של הורמון זה בתאי β וכן את הביטוי של החיישנים לגלוקוזה על פני תאים אלה (Wang וחב' ב-Mol Cell Endocrinol משנת 1996).

החשיבות הפיזיולוגית של GIP כ-incretin, מודגמת על ידי פגיעה בפעילות הורמון זה in vivo. ביטול האיתות העובר דרך הקולטן GIPR על ידי שימוש באנטגוניסטים או בנוגדנים המכוונים כנגד GIPR, או על ידי אינאקטיבציה ממוקדת של הגן ל-GIPR בעכברים טרנסגניים (-/-GIPR), גורמים לעמידות פגומה למתן פומי של גלוקוזה, כמו גם להפרשה משובשת של אינסולין הצפויה בעקבות מתן גלוקוזה (Tseng וחב' ב-J Clin Invest משנת 1996, וכן Lewis וחב' ב-Endocrinology משנת 2000 ו-Miyawaki וחב' ב-Proc Natl Acad Sci USA משנת 1999).

כמו כן GIP פועל בסינרגיזם עם גלוקוזה לעודד שגשוג תאים ולשפר את הישרדותם של תאי β פנקריאטיים, והשפעה הגנתית זו על תאי β ניתנת להדגמה באיי לנגרהנס של עכברי בר תקינים, אך לא בעכברים הומוזיגוטיים טרנסגניים מסוג -/-GIPR (ע"פ Kim וחב' ב-J Biol Chem משנת 2005). מנגנוני האיתות המולקולאריים המתווכים בהשפעה של GIP על שגשוג תאים דרך פעילות אנטי-אפופטוטית פוענחו על ידי שימוש בתאים הטרולוגיים שעברו טרנספקציה עם GIPR, בשורת תאי β של מכרסמים, באיי פנקריאס של עכברים, וכללו שפעול של מסלולי cAMP/PKA, וכן של ו-PKA/CREB ו-p38MAPK (על פי Trumper וחב' ב-Mol Endocrinol משנת 2001, ו-Ehses וחב' ב- Endocrinology משנת 2003).

ניסויים עם חולדות סוכרתיות מזן ZDF הראו שעירוי של GIP למשך שבועיים, הפחית משמעותית את האפופטוזיס בתאי β בלבלב על ידי שפעול של Akt-PKB בתלות ב-PI-3K, וכן שפעול הפוספורילציה והרחקה מגרעין התא של FoxO1, מה שגורם להפחתת ביטויו של הגן מקדם האפופטוזיס Bax, הפחתה בפעילות caspase 3 (אנזים המפתח בתהליך האפופטוזיס), כמו גם דיכוי השעתוק של הגן ל-bax (חלבון מקדם אפופטוזיס נוסף), ולעומת זאת שדרוג בפעולת הגן של החלבון האנטי-אפופטוטי bcl-2 (על פי Kim וחב' ב-J Biol Chem משנת 2005). כמו כן, נמצא ש-GIP מפחית את רמת סמנים ביוכימיים הקשורים לעקה של הרטיקולום האנדופלזמי (ER) בשורת תאים של איי הלבלב לאחר השריית עקה זו של ה-ER בתנאי תרבית תאים (Yusta וחב' ב-Cell Metab משנת 2006). ניתן לומר שהפעילות האינסולינו-טרופית של GIP פחותה בחולדות היפר-גליקמיות, לפחות באופן חלקי בגלל הביטוי המופחת של הקולטן ל-GIP בחולדות אלה (Lynn וחב' ב-Diabetes משנת 2001).

פעילות GIP במערכת העצבים המרכזית:

ב-CNS, ניתן למצוא ביטוי של GIP בהיפוקמפוס, בתאי Purkinje במוחון וב-olfactory bulb (על פי Nyberg וחב' ב-J Neurosci Res משנת 2007). קולטנים ל-GIP אותרו באזורי מוח אחדים כולל בקליפת המוח, בהיפוקמפוס, ב-olfactory bulb (על פי Kaplan ו-Vigna ב-Peptides משנת 1994, ו-Usdin וחב' ב-Endocrinology משנת 1993). עירוי של GIP אקסוגני למוח חולדות, השרתה שגשוג של תאים פרוגניטורים בהיפוקמפוס in vivo כמו גם בתאים פרוגניטרים מההיפוקמפוס בתנאי תרבית תאים (Nyberg וחב' ב-J Neurosci משנת 2005). לעומת זאת, עכברים טרנסגניים בוגרים (GIPR-/-), עם פגיעה מושרית בקולטן ל-GIP, הכילו מספר קטן משמעותית של תאים פרוגניטורים חדשים ב-dentate gyrus של ההיפוקמפוס. כמו כן, עכברים טרנסגניים המבטאים ביתר את הקולטן GIPR, מפגינים קואורדינציה תחושתית-מוטורית משופרת, כמו גם שיפור בממדי זיכרון בהשוואה לעכברים wild-type.

נראה אם כן שהביטוי של GIPR בתאי עצב פרוגניטורים ב-dentate gyrous של ההיפוקמפוס, מצביעים על מעורבות אפשרית של GIP הוויסות של נוירוגנזה ובתפקוד הזיכרון. באופן הצפוי על יסוד ההשפעה השגשוגית של GIP על תאי פרוגניטור עצביים, השפעול של GIPR על ידי אנאלוגים של GIP, מעודד יצירת LTP (או long-term potentiation) בהיפוקמפוס, ואילו עיכוב ביטוי GIPR על ידי אנטגוניסט של GIP דוגמת Pro3)GIP), מפחית את ה-LTP ( Gault וחב' ב-J Neurophysiol משנת 2008). לעומת זאת, עכברים טרנסגניים עם ביטוי יתר של GIP, מראים שיפור בביצוע משימות הכרוכות בזיכרון (Ding וחב' ב-Peptides משנת 2006). פעילות נוספת של GIP במוח קשורה לוויסות תחושות התיאבון והשובע.

GIP ורקמת שומן:

קולטני GIPR פונקציונאליים מבוטאים על פני אדיפוציטים מבודדים מחולדות ועל פני תאי 3T3-L1 (על פי
Yip וחב' ב-Endocrinology משנת 1998). כיוון שכך, יש הקושרים את GIP לפיקוח על המטבוליזם של שומן, ולהתפתחות של השמנת יתר. קליטת שומן מהמזון היא גריין משמעותי של הפרשת GIP באדם, ורמות GIP בפלזמה עולות בחלק מחולי סוכרת type 2 כבדי המשקל (על פי Creutzfeldt וחב' ב-Diabetologia משנת 1978, ו-Salera וחב' ב-J Clin Endocrinol Metab משנת 1982(. ההשפעה האנאבולית של GIP על רקמת השומן, כוללת גירוי של סינתזה של חומצות שומן ו-רה-אסטריפיקציה שלהן עידוד של החדרת חומצות שומן לתוך טריגליצרידים המושרית על ידי אינסולין, שדרוג הסינתזה של האנזים lipoprotein lipase, הגברת הזיקה של אינסולין לקולטנים שלו, והפחתה בתהליכים ליפוליטיים המושרים על ידי glucagon. יחד עם זאת, יש ל-GIP כנראה גם השפעות ליפוליטיות, אם כי אלה שנויות במחלוקת (Yip ו-Wolfe ב-Life Sci משנת 2000). עכברים טרנסגניים (GIPR-/-), מראים עמידות להשמנת-יתר הנובעת מקליטת מזון, תוך שהם מראים מסת שומן מופחתת, למרות מספר חודשים של האכלתם בדיאטה עתירת-שומן (Miyawaki וחב' ב-Nat Med משנת 2002).

הוספת GIP נמצאה מגבירה את פינוי כילומיקרונים בכלבים (Wasada וחב' ב-J Clin Invest משנת 1981), מפחיתה את רמת טריגליצרידים לאחר ארוחה בחולדות (Ebert וחב' ב-Horm Metab Res משנת 1991) ומגבירה טרנספורט של גלוקוזה וסינתזת חומצות שומן ב-explants של רקמת שומן מחולדות (Knapper וחב' ב-J Nutr משנת 1995, ו-Oben וחב' ב-J Endocrinol משנת 1991). בנוסף, נראה ש-GIP מגביר את רגישות אדיפוציטים לאינסולין, ובכך מעודד קליטת גלוקוזה וחומצות שומן לאגירה בתאים אלה.

יתרה מכך, ניסוי של Isken וחב' שפורסם ב-Am J Physiol Endocrinol Metab משנת 2008, הראה שהשמנת יתר המושרית בדרך כלל על ידי ניתוח להרחקת השחלות נמנעה בעכברים עם חסר בקולטן ל-GIP, מה שניתן להסביר חלקית על ידי הפחתה בצריכת מזון בגלל החסר ב-GIPR. התברר שעירוי לתוך המוח של NPY או הנוירופפטיד האורקסיגני Y, מעודד הפרשת GIP מתאי העצב, מה שרומז לכך ש-GIP פועל כמווסת שלילי של NPY, ועשוי לווסת צריכת מזון על ידי הכלבים המטופלים (Yavropoulou וחב' ב-Peptides משנת 2008). יחד עם זאת, יש לשקול בזהירות יתרה את ההערכה של תפקוד נוגד-השמנה של GIP במוח, כיוון שיש להורמון האחרון השפעה ישירה על רקמת השומן. יש גם להתחשב בהשפעה של ההורמון האינקרטיני האחר GLP-1 בהקשר של השפעתו על צריכת מזון ושובע באדם. בניגוד ל-GLP-1 המעכב התרוקנות הקיבה, נמצא של-GIP יש השפעה מועטה בלבד על התרוקנות הקיבה באדם ובעכברים (Meier וחב' ב-Am J Physiol Endocrinol Metab משנת 2004).

זאת ועוד, עכברי -/-ob/ob:GIPR עולים פחות במשקלם, הם בעלי רקמת שומן מצומצמת יותר, ומגיבים טוב יותר לעודף גלוקוזה, על ידי רגישות רבה יותר לאינסולין, בהשוואה לעכברי ob/ob. למרות שצריכת המזון דומה בין עכברי -/-GIPR לבין עכברי wild-type, כאשר מאכילים אותם במזון עתיר-שומן, עכברי -/-GIPR מוציאים יותר אנרגיה, ולכן הם משתמשים בשומן כמצע אנרגיה מועדף, ולפיכך נמנעת אגירת שומן באדיפוציטים שלהם. בעכברי ob/ob עירוי כרוני של אנטגוניסט לקולטן GIPR דוגמת Pro3)GIP) משפר את הסבילות לגלוקוזה, מגביר את הרגישות לאינסולין, ומתקן את ההיפרטרופיה של תאי הלבלב המושרית על ידי השמנת-יתר, כמו גם את ההיפרפלזיה של תאי β (על פי Gault וחב' ב-Diabetes משנת 2005).

יחד עם זאת, עכברי -/-GIPR שניזונו על דיאטת chow נורמאלית, מראים חוסר סבילות לגלוקוזה, והחדרה של Pro3)GIP) פוגעת בסבילות לגלוקוזה בעכברי wild-type (על פי Irwin וחב' ב-Biol Chem משנת 2004). בנוסף, שפעול של GIPR כרוך עם שיפור בסבילות לגלוקוזה, ומגביר הפרשת אינסולין במודלים של סוכרת בחיות. לכן, למרות שחולים בסוכרת type 2 עמידים באופן יחסי להשפעות האינסולינוֹ-טרופיות של החדרה אקסוגנית של GIP, ואין קשר ישיר בין השמנת-יתר ו-GIP בבני-אדם, יש לשקול את היתרונות היחסיים של שפעול לעומת עיכוב של GIPR, בכל ניסיון בעתיד לשימוש תרפויטי של GIP או של האנלוגים שלו.

התפקיד הפיזיולוגי של GIP בהצטברות שומן:

שומן מגביר באופן ניכר הפרשת GIP (על פי Carr וחב' ב-Am J Physiol Endocrinol Metab , ו-Thomsen וחב' ב-Am J Clin Nutr משנת 1999) וכמו כן רמות GIP מוגברות בחולי סוכרת type 2 כבדי משקל. קיים מתאם טוב בין רמות GIP בפלזמה לבין ריכוזי טריגליצרידים (Elliotte וחב' ב-J Endocrinol משנת 1993). הייתה השערה ש-GIP הוא בעל תפקיד פיזיולוגי בהצטברות שומן באדיפוציטים, ובתחילת שנות ה-80 נעשה ניסוי שהראה ש-GIP בנוכחות אינסולין משרה החדרה של חומצות שומן תוך בלוטות השמן בעקבי חולדות (Beck ו-Max ב-Regul Pept משנת 1983). כמו כן, כאשר בעכברים כבדי-משקל (ob/ob) כתוצאה מפגם בגן של leptin, מניפולציה גנטית של פגיעה ב-GIPR הביאה לא רק לשיפור של בעיית עודף המשקל על ידי הגברת "שריפת" אנרגיה, אלא גם הגבירה את הרגישות לאינסולין ואת הסבילות לגלוקוזה, ללא פגיעה קשה בהפרשת אינסולין (Zhang וחב' ב-Nature משנת 1994, וכן Vilsbøll וחב' ב-Diabetologia משנת 2002 ו-Yamada וחב' ב-Diabetes משנת 2006).

תצפיות אלו אושרו בעכברים שהוזנו בדיאטה עתירת-שומן וכן בעכברים שמנים ob/ob, שטופלו באנטגוניסט Pro3)GIP) של הקולטן ל-GIP (ע"פ Gault וחב' ב-Diabetologia משנת 2008, וכן Irwin וחב' באותו כתב עת משנת 2007), כמו גם בעכברים טרנסגניים החסרים תאי K מפרישי GIP (ע"פ Althage וחב' ב-J Biol Chem משנת 2008).

למרות ש-GIP נמצא מגביר את פעילות lipoprotein lipase, אנזים הקשור לממברנת תאים אדיפוציטים, ואשר תפקידו לבצע הידרוליזה של טריגליצרידים הקשורים לליפופרוטאין על מנת לייצר חומצות שומן, המנגנון המולקולארי דרכו GIP פועל על אדיפוציטים אינו ברור דיו. Kim וחב' דיווחו בשנת 2007 ב-J Biol Chem, שקישור GIP לקולטניו על פני תאי 3T3-L1 גורם להפרשה מוגברת של resistin במסלול הקשור ל-p38 MAPK ו-SAPK/JNK. אותם חוקרים הראו גם ש-GIP משפעל את PI3K ואת Akt/PKB על ידי הפרשת resistin, ועל ידי כך הוא מדכא את AMPK ומגביר את פעילות lipoprotein lipase וליפוגנזה באדיפוציטים.

ראוי לציין שאגוניסט אחר של GIPR, הידוע כ-(D-Ala2GIP(1-30 מראה פעילות דומה לזו של (1-42)GIP על התפקוד וההישרדות של תאי בתא, אך יש לו השפעה פחותה בהרבה על פעילות lipoprotein lipase בתאי 3T3-L1 (ע"פ Widenmaiser וחב' ב-PLoS ONE משנת 2010).

GIP ורקמת עצם:

האפשרות ש-GIP במטבוליזם של רקמת עצם הועלתה על ידי Tsukiyama וחב' ב-Mol Endocrinol משנת 2006, שהראו שלעכברים החסרים GIPR טרבקולות העצם (כפיסונים) דקות יותר מה שאופייני לאוסטיאופורוזיס. חוקרים אלה הדגימו על ידי אנליזה היסטו-פוטומטרית, שיצירת רקמת עצם בעכברים אלה ירודה יותר, ומספר האוסטיאוקלסטים גדול יותר כאופייני לתהליכי אוסטיאופורוזיס. כן הודגם in vitro במחקר זה ש-GIP מדכא תהליכי אפופטוזיס של אוסטיאובלסטים, מה שמרמז לאפשרות שגם in vivo יש ל-GIP תפקיד במניעת אפופטוזיס של אוסטיאובלסטים.

זאת ועוד, ההגברה של יצירת עצם על ידי GIP, כמנגנון של דיכויים של אוסטיאוקלסטים ומניעת אפופטוזיס של תאים אלה, הודגמה בעכברים טרנסגניים עם פגם בייצור GIP (ע"פ Ding וחב' ב-J Bone Miner Res משנת 2008, וכן Xie וחב' ב-Bone משנת 2007 ו-Zhong וחב' ב-Am J Physiol Endocrinol Metab משנת 2007).

ה-mRNA של GIP וההורמון עצמו מבוטאים בעצם הנורמאלית וכן בשורות תאים של אוסטיאובלסטים (Bollag וחב' ב-Endocrinology משנת 2000). נמצא ש-GIP מעודד הגברה ברמות של cAMP ושל יוני סידן תוך-תאי של אוסטיאובלסטים בתרבית, ושהשפעות אלה של GIP כרוכות בסמנים של יצירת רקמת עצם חדשה, כולל הגברת הפעילות של פוספטאזה בסיסית, ועלייה ברמת mRNA של קולאגן type 1. כן נמצא ש-GIP מגדיל את צפיפות העצם (BMD) בחולדות שעברו כריתת שחלות, המהוות מודל של אוסטיאופורוזיס בנשים בגיל חידלון הווסת (Bollag וחב' ב-Endocrinology משנת 2001). יתרה מכך, GIP עשוי לסייע לשקיעת סידן בעצם בתגובה לארוחה, שכן רמות סידן בפלזמה הוגברו בעכברים החסרים GIPR.

בהשוואה לעכברי ביקורת wild-type בני אותו גיל, מוצאים בעכברים טרנסגניים צעירים -/-GIPR מסת וגודל עצם נמוכים יותר, מיקרו-ארכיטקטורה בלתי-נורמאלית של העצם, תכונות ביו-מכאניות פגומות של העצם וכן שינוים במדדי ספיגה ובנייה מחדש של רקמת עצם (Xie וחב' ב-Bone משנת 2005). יחד עם זאת ככל שהעכברים מתבגרים ההבדלים המוזכרים בביולוגיה של העצם נעשים פחות מובהקים. היפוכו של דבר כאשר מסת העצם גדלה בעכברים טרנסגניים המייצרים GIP ביתר, בהשוואה לעכברי wild-type. בשנת 2007 דיווחו Zhong וחב' ב-Am J Physiol, על גילוי mRNA של GIPR ואת הקולטן עצמו בתאים אוסטיאוקלסטים של מכרסמים, כאשר החדרת GIP נמצאה מעכבת תהליכים של ספיגת עצם.

יתרה מכך, עכברי -/-GIPR מבוגרים הראו ירידות בפרמטרים של יצירת עצם כמו גם עליות ברמת סידן בפלזמה לאחר צריכת מזון, מה שמרמז לכך ש-GIPעשוי לספק קשר ישיר בין סידן במזון לבין שקיעת סידן בעצמות. יחד עם זאת, הוספה של GIP במינון גבוה, אין כדי לשנות את התחלופה בתהליכי ספיגה ובניה של רקמת עצם בניסויים ארוכי-טווח של GIP באדם (Henriksen וחב' ב-J Bone Miner Res משנת 2003). כללית, לא ברור אם מתן ארוך טווח של GIP יביא למודולציה של תהליכי ספיגה ובנייה מחדש של רקמת עצם באדם. למרות שממצאים אלה יכולים לרמז על כך שנשים בגיל חידלון הווסת עלולות להיות מועמדות לאוסטיאפורוזיס באופן חלקי בגלל תגובה מופחתת של GIP (על פי Ahren וחב' ב-Eur J Endocrinol משנת 1997) יהיה צורך לקבוע האם GIP הוא אמנם בעל תפקיד אוסטיאוגני באדם.

GIP ורקמות אחרות:

למרות ש-GIP מעכב בקיבה הפרשת חומצת קיבה, פעילות זו מושגת רק בריכוזים הגבוהים משמעותית מריכוזיו הפיזיולוגיים של הורמון זה (Nauck וחב' ב-Digestion משנת 1992). כמן כן נמצא ש-GIP מגביר את הטרנספורט של סוכרים במעי. בכבד, GIP מחליש יצירה של גלוקוזה המושרית על ידי glucagon, כנראה במנגנון בלתי-ישיר, שכן לא נמצאו עד כה קולטנים ל-GIP בכבד. GIP יכול לעודד פינוי של גלוקוזה התלויה באינסולין בבעלי חיים, אם כי השפעה זו לא נמצאה באדם. GIP יכול גם לעודד הפרשה של גלוקו-קורטיקואיד בחולדות דרך מסלול איתות התלוי ב-cAMP/PKA (על פי Mazzocchi וחב' ב-Peptides משנת 1999).

למרות שלא נראה ש-GIP מווסת הפרשה של קורטיזול בבני-אדם בריאים, ביטוי בלתי נורמאלי של GIPR באדנומות ממקור הקורטקס של האדרנל, כרוך בהתפתחות תסמונת Cushing תלויית-מזון (Lacroix וחב' ב-N Eng J Med משנת 1992). נצפה שקולטנים ל-GIP נמצאים גם באנדותליום הווסקולארי, ואמנם GIP מעודד הגברה של רמות סידן תוך-תאי בתרבית של תאי אנדותל (Zhong וחב' ב-Peptides משנת 2000). עירוי של GIP לכלבים משרה בהם הפרשה של endothelin-1 וכיווץ כלי-דם, או הפרשה של NO והרחבת כלי-דם, בתלות במערכת כלי הדם הרלוונטית. ההשפעות המנוגדות של GIP על כלי-דם שונים, מיוחסות לשונות בדרגת השפעול של מסלולי העברת האיתותים בסוגי תאי אנדותל שונים. למרות שמוצאים mRNA של GIPR גם ברקמת הלב, באשכים, בריאות ובמספר רקמות נוספות, הפעילות הפיזיולוגית של GIP ברקמות אלה אינה ברורה, אם בכלל.

שינויים ברמת GIP בתרחישים קליניים:

רמות מוגברות משמעותית של GIP בולטות לאחר עירוי גלוקוזה בחולים עם פנקראטיטיס. רמות מוגברות אלה ניתן למצוא גם בחולי סוכרת. רמה מוגברת שלGIP מוצאים בחולים עם VIPoma הידועה גם כתסמונת Verner-Morrison המאוד נדירה, בה תאי איי-לבלב שאינם תאי-β מייצרים VIP. לעומת זאת רמות GIP נמוכות יותר בטיפול בקלציטונין.
== הוראות לביצוע הבדיקה ==
יש להיות בצום של 10-12 שעות לפני נטילת הדם. תכשירים נוגדי חומציות קיבה (Antacids) או תרופות המשפיעות על תנועתיות המעי, או על הפרשת אינסולין יכולים להשפיע על תוצאות מדידת GIP, ולכן יש להפסיק נטילתם במידת האפשר לפחות לפרק זמן של 48 שעות לפני דגימת הדם. יש לדגום את הדם במבחנת הפארין (פקק ירוק) ולאחר סרכוז יש לאחסן את הפלזמה המופרדת בהקפאה במהירות האפשרית. דגימת הפלזמה יציבה בתנאי הקפאה למשל 6 חודשים. הבדיקה נעשית בשיטת RIA. יש לפסול דגימות שאינן פלזמה, או דגימות מופשרות ששהו זמן ממושך בטמפרטורת החדר. המדידה נעשית בשיטת RIA.

Gastric inhibitory polypeptide

2015-08-27T13:42:02Z

בן עמי סלע:

==polypeptide Gastric inhibitory ==

כינויים נוספים: GIP, glucose-dependent insulinotropic peptide.
תחום: הערכת מצבי סוכרת, השמנת יתר והערכה תפקודית של פעילות בלוטת הלבלב.
טווח ערכים תקין: בדם בצום-50-100 פיקוגרם/מ"ל; בדם לאחר ארוחה-110-720 פיקוגרם/מ"ל.
יוצר הערך: פרופ' בן-עמי סלע.

== בסיס פיזיולוגי ==

חלפו למעלה מ-100 שנה מאז התגלית של מושג האינקרטינים (incretins), שפתח לאחר מכן אפשרות של טיפול חדש בחולי סוכרת. בשנת 1902 פרסמו Bayliss ו-Starling ב-J Physiol, על גילוי secretin, מה שהביא את Moore וחב' להשערה שפורסמה ב-Biochem J בשנת 1906, שתמצית מעי מכילה הורמון המווסת את פעילותו האנדוקרינית של בלוטת הלבלב, ואף הראו שהזרקת תמצית זו הפחיתה את כמות הסוכרים המופרשים בשתן של חולי סוכרת, כנראה על ידי גירוי הפעילות האנדוקרינית של הלבלב. אך רק בשנת 1929 חלה התעוררות בנושא, כאשר La Barre ו-Zunz פרסמו ב-Arch Int Physiol Biochim, שהם ניקו מתמצית מעי את הגורם המפחית גלוקוזה וכינו אותו incretin או INtestine seCRETion Insulin. חלפה תקופה דומה של כמעט שלושים שנה, עד אשר פותחה שיטת RIA לכימות רמת אינסולין בשנות ה-60, ובשנת 1964 הופיעו 2 מאמרים שהראו שהעמסת סוכר באופן פומי, הביאה ליצירה מוגברת יותר של אינסולין מאשר היו מזריקים גלוקוזה ישירות לווריד (Elrick וחב' ב-J Clin Endocrinol Metab משנת 1964, ו-McIntyre וחב' ב-Lancet באותה שנה). כיום מייחסים ממצא זה ל-incretins המופרשים מהמעי לאחר בליעת גלוקוזה אך גם ארוחות עשירות בשומן, מה שמגרה את תאי β בלבלב להפריש יותר אינסולין.

רק 2 הורמוני מעי כאלה נתגלו עד כה שפועלים כ-incretins, והם GIP או gastric inhibitory polypeptide, ו-GLP-1 או glucagon-like peptide-1. ה-GIP הוא הורמון בן 42 חומצות אמינו שמשקלו המולקולארי 4,944 דלטון, המופרש מתאי K בחלק העליון של המעי הדק באזור התריסריון וה-jejunum הקריבני (פרוקסימאלי), אך ניתן למצוא את GIP לאורך כל המעי (Inagaki וחב' ב-Mol Endocrinol משנת 1989). במקור בודדו GIP בשנת 1970 ממעי של חזיר על ידי Brown וחב' על בסיס יכולתו לעכב הפרשת חומצת קיבה ו-gastrin בכלבים כפי שתואר ב-J Physiol. מאוחר יותר פרסמו Dupre וחב' ב-J Clin Endocrinol Metab משנת 1973 שהזרקת GIP מעודדת הפרשת אינסולין במתנדבים בריאים על ידי פעולה ישירה של הורמון זה על תאי הלבלב להפרשת אינסולין (Adrian וחב' ב-Diabetologia משנת 1978, ו-Taminato וחב' ב-Diabetes משנת 1977). נתונים אלה הצביעו על GIPכעל ה-incretin המקורי, ולאחר מכן יש שכינו אותו glucose-dependent insulinotropic polypeptide.

הגן ל-GIP אנושי מורכב מ-6 אֶקסונים כאשר רוב המידע המקודד ל-GIP נמצא ב- 3 exon, וגן זה ממוקם בזרוע הארוכה של כרומוזום 17 בעמדה 17 q21.3-q22. ביטוי הגן ל-GIP התגלה בקיבה ובתאי K במעי במכרסמים כמו גם באדם, כאשר בחולדות ביטוי גן זה מופיע גם בבלוטת הרוק התת-מנדיבולארית. נמצא שבחולדות, רמת mRNA של GIP, עולה בתריסיון ובבלוטת הרוק לאחר ארוחות המכילות גלוקוזה או עשירות בשומן, אך רמת mRNA זה פוחתת בתגובה לצום ממושך.

ביוסינתזה של GIP:

הרצף של חומצות האמינו של GIP בחולדה ובאדם, מצביע על כך שהורמון זה מיוצר מקדם-הורמון (preproGIP) גדול יותר המכיל signal peptide , פפטיד N-טרמינאלי, GIP ופפטיד C-טרמינאלי, על ידי פעילות PC או prohormone convertase 1/3. מחקרים עם עכברי knockout בהם פגום הגן של האנזים PC, וכן ניסויים בתרבית תאים עם פעילות-יתר של PC, הדגימו שהצורה הבשלה והפעילה של GIP, המכילה 42 חומצות אמינו מקורה בקודמן preproGIP המכיל 153 חומצות אמינו, כאשר הביקוע מתבצע ליד שייר ארגינין (Ugleholdt וחב' ב-J Biol Chem משנת 2003). הפפטידים המקוּדדים בתוך המקטעים ה-N-טרמינאלי וה-C-טרמינאלי הם חסרי פעילות ידועה. הרצף של GIP השתמר בצורה בולטת בין מיני בעלי חיים שונים, ורצפי חומצות האמינו של GIP של האדם לבין זה של עכבר, חולדה, חזיר ופרה מראים זהות של למעלה מ-90%. יש עדות מסוימת שגם תאי α בלבלב מסוגלים לייצר כמויות קטנות של preproGIP, שעובר ביקוע על ידי prohormone convertase 2 לייצור הורמון קטום בקצה ה-C טרמינאלי של ה-preproGIP , המוגדר כ-(GIP(1-30, אך אין מידע לגבי פעילות פיזיולוגית של פפטיד זה.

(להכניס כאן תרשים שמתחתיו המקרא מתחיל במילים A) הגן ל-proGIP)
(להכניס כאן ברצף את התרשים השמאלי בלבד מעליו GIP באדום
ומתחתיו מופיע ...הביוסינתזה של GIP)
(להכניס כאן ברצף את התרשים שמתחתיו המקרא.....רצף 42 חומצות האמינו של GIP).

התפקוד של GIP:

במקור נקרא הורמון פפטידי זה gastric inhibitory peptide בגלל יכולתו להפחית את הפרשת חומצת הקיבה בחיות (אם כי לא באדם) (Kim ו-Egan ב-Pharmacol Rev משנת 2008) על מנת להגן על המעי הדק מנזק החומצה, להפחית את קצב העברת המזון דרך הקיבה, ולעכב את התנועתיות (motility) של המעיים. אך לאחרונה מייחסים פעולות אלה ביתר שאת להורמון דומה, secretin. היום מאמינים שתפקידו העיקרי של GIP הוא להשרות הפרשת אינסולין, המושפעת העיקר על ידי היפר-אוסמולריות של גלוקוזה בתריסריון (Thorens ב- Diabète & Métabolisme משנת 1995). לכן יש מעדיפים כיום את כינוי ההורמון כ-glucose-dependent insulinotropic peptide.

משערים שיש ל-GIP השפעות משמעותיות על המטבוליזם של חומצות שומן, דרך הגירוי של פעילות האנזים lipoprotein lipase באדיפוציטים. כמו כן, נמצא ש-GIP מופרש בתגובה להנקה הראשונה של חלב אם (colostrum) בגורי עזים. משיקולים אתיים, הפרשת GIP הודגמה בתינוקות אדם רק בגיל 10 ימים בערך. לאחרונה נמצא שיש ל-GIP תפקיד מרכזי בתהליכי עיצוב (remodeling) של רקמת העצם. Gaudin-Audrain וחב' דיווחו בשנת 2013 ב-Bone שעכברים טרנסגניים עם חסר בקולטן ל-GIP, סבלו משינויים ניכרים במיקרו-ארכיטקטורה, בנפח ובאיכות של העצם הטרבקולארית. ממצאים דומים פורסמו באותו כתב-עת בשנת 2013 על ידי Mieczkowska וחב', כאשר נמצא שאיכות העצם נפגמה והייתה נטייה לשברי עצם בעכברים עם חסר מושרה בקולטן ל-GIP.

הרלוונטיות של GIP לסוכרת type 2 הודגמה, כאשר נמצא שחולים בסוג סוכרת זו מגיבים משמעותית פחות ל-GIP, וכן בחולים אלה יש הפרשה פחותה של GIP לאחר ארוחה, בהשוואה לאנשים ללא סוכרת (Skrha וחב' ב-Physiol Res משנת 2010). במחקר עם עכברי knockout, נמצא שחסר בקולטנים ל-GIPכרוך בעמידות להשמנת-יתר (Yamada ו-Seino ב-Hormone & Metabol Res משנת 2004.

(להכניס כאן את התרשים מתחתיו מופיע המקרא: התפקוד הפנקראטי והחוץ פנקראטי של GIP בהשוואה ל-GLP-1)

הפרשה, מטבוליזם ופינוי של GIP:

כאמור, GIP מיוצר ומופרש מתאי K בתריסריון וב-jejunum הקריבני, עם פעילות סינתטית והפרשתית נמוכה יותר לאורך המעי הדק כולו (Mortensen וחב' ב-Regu Pept משנת 2003, ו-Butchan וחב' ב-Histochemistry משנת 1978). GIP מופרש בתגובה לקליטת מזון, בעיקר גלוקוזה או שומן. באופן ספציפי יותר, הפרשת GIP מושפעת יותר מקצב ספיגת המזון מאשר מנוכחות מזון במעי. לכן, הפרשת GIP פוחתת באנשים עם בעיות ספיגה, או לאחר נטילת תכשירים האמורים להפחית את הספיגה (Besterman וחב' ב-BMJ משנת 1979, ו-Fushiki וחב' ב-J Nutr משנת 1992). ראוי לציין שבעוד שמזון שומני הוא גריין יעיל יותר של הפרשת GIP באדם, פחמימות יותר יעילות בגירוי הפרשה זו במכרסמים ובחזירים. באדם, הרמה הבסיסית של GIP בפלזמה היא מתחת ל-50 פיקוגרם/מ"ל, והיא עולה לאחר ארוחה לרמה של עד 720 פיקוגרם/מ"ל בתלות בסוג וכמות המזון בארוחה (Orskov וחב' ב-Scand J Gastroenterol משנת 1996, ו-Vilsbøll וחב' ב-Diabetes משנת 2001). רמות GIP בפלזמה דומות או מוגברות אך במקצת בחולים עם סוכרת type 2 בהשוואה לזו באנשים בריאים (Ross וחב' ב-Diabetes משנת 1977).

(להכניס כאן את התרשים מתחתיו מופיע: הפרשה ומטבוליזם של GIP בהשוואה ל-GLP-1)
(להכניס כאן ברצף את התרשים מתחתיו מופיע: שני incretins פעילים ביולוגית)

תקופת מחצית החיים של GIP היא פחות מ-2 דקות במכרסמים (Kieffer וחב' ב-Endocrinology משנת 1995), ואילו בבני-אדם בריאים תקופת מחצית החיים היא של 7 דקות, כאשר בחולי סוכרת type 2 היא בת 5 דקות (Deacon וחב' ב-J Clin Endocrinol Metabol משנת 2000). יש לציין שתקופת מחצית החיים של GIP בצורתו הקטומה (לאחר הסרת 2 חומצות האמינו פרולין ואלנין בקצה ה-N טרמינאלי על ידי DPP-4) מתארכת עד כדי 17 דקות (Vilsbøll וחב' ב-Regul Pept משנת 2006).

שייר אלנין בעמדה 2 של רצף חומצות האמינו של GIP, מהווה יעד פעולה של DPP-4 או Dipeptidyl peptidase-4, שהוא האנזים הגורם לאינאקטיבציה של(1-42)GIP על ידי הפיכתו למטבוליט הבלתי-פעיל (GIP(3-42, המאבד את תכונותיו האינסולינוטרופיות (Deacon וחב' ב-J Clin Endocrinol Metabמשנת 2000). אנזים זה ממוקם בממברנות brush-border של המעי והכליות, אך ניתן למצוא אותו גם על פני קפילארות, ובצורה מסיסה בפלזמה (Mentlain ב-Regul Pept משנת 1999).

פעילות זו של DPP-4 כאנזים העיקרי הפוגע בפעילות GIP הודגמה היטב במכרסמים ובבני-אדם בריאים או סוכרתיים. התצפיות לפיהן רמות GIP בפלזמה מוגברות באנשים הסובלים מ-uremia או באלה עם מחלת כליות כרונית, כמו גם הממצאים על פינוי משובש של GIP בחולדות שעברו nephrectomy, מצביעים על הכליות כאיבר דרכו מתבצע רוב הפינוי (clearance) של GIP (על פי Meier וחב' ב-Diabetes משנת 2004). מחקרים של Deacon וחב' ב-Diabetes משנת 2001 מראים שגם לכבד יש תפקיד בספיגת GIP מהדם, ואילו Vilsbøll וחב' דיווחו ב-Regul Pept משנת 2006, שקצב הפינוי של GIPשלם ושל המטבוליטים שלו דומים בין אנשים בריאים לבין אנשים שמנים עם סוכרת type 2.

הקולטן ל-GIP:

GIP פועל על ידי התקשרות לקולטן ספציפי GIPR ששובט במקור מספריית cDNA מקליפת המוח של חולדה, ולאחר מכן שובט ממקור אוגר ואדם. הגן של הקולטן האנושי ל-GIP מכיל 14 exons ש"אורכם" 14kb (ע"פ Yamada וחב' ב-Genomics משנת 1995), והוא ממוקם בכרומוזום 19 בעמדה q13.3. הקולטן ל-GIP באדם מכיל 466 חומצות אמינו, אך יש גם איזופורם של קולטן ל-GIP עם 493 חומצות אמינו. הגן ל-GIPR בא לביטוי בבלוטת הלבלב, בקיבה, במעי הדק, ברקמת השומן, בקורטקס של האדרנל, בבלוטת יותרת המוח (היפופיזה), בלב, באשכים, בתאים אנדותליאליים, ברקמת העצם, בטרכיאה, בטחול, בבלוטת ההרת (תימוס), בריאות, בכליות בבלוטת התריס (תירואיד), ובאזורים אחדים של מערכת העצבים המרכזית (Asmar ב-Dan Med Bull משנת 2011). יחד עם זאת, לא ברורה עדיין המשמעות של תוצאות השפעול של קולטנים חוץ-פנקראטיים אלה.

הקולטן של GIP הוא חבר במשפחת העל של קולטנים החוצים את הממברנה באופן מפותל 7 פעמים, שהם בעלי מבנה הֶטֶרוֹ-טרימרי והם קשורים לחלבוני G בציטופלזמה (Usdin וחב' ב-Endocrinology משנת 1993). מעט יחסית ידוע על הגורמים האחראיים לוויסות ביטויו של הקולטן ל-GIP, אך ידוע רמות ה-mRNA של GIPR ושל חלבון הקולטן עצמו, נמוכות יותר באיי הלבלב של חולדות סוכרתיות, מה שנכון גם לבני אדם (Lynn וחב' ב-Diabetes משנת 2001).

שפעול של איתות המועבר דרך GIPR קשור לשדרוג פעילות האנזים adenylyl cyclase ולעליות ברמת cAMP ויוני סידן תוך תאי, כמו גם לשפעול של החלבונים p38 MAPK, PKB, PKA, PI-3K ו-פוספוליפאז A2 (על פי McIntosh וחב' ב-Vitam Horm משנת 2009). ניסויים in-vitro העלו שהקצה ה-N-טרמינאלי של GIPR והלולאה החוץ תאית הראשונה של GIPR חיוניים לזיקה הגבוהה של קישור של GIP לקולטן שלו, בעוד שחלקים מהקצה ה-N טרמינאלי בנוסף למקטע (domain) הטרנס-ממברנאלי חיוניים לשפעול הקולטן ולצימוד של cAMP. למרות שרוב רצף חומצות האמינו בקצה ה-C טרמינאלי של GIPR נראה מיותר לאיתות התוך-תאי, רצף מינימאלי של הקולטן הכולל 405 חומצות אמינו נדרש להעברה יעילה של האיתות לאחר קישור GIP לקולטן שלו. Wheeler וחב' דיווחו ב-J Biol Chem משנת 1999, ששיירי serine 406 ו-411 בקצה ה-C טרמינאלי חיוניים לנטרול (desensitization) פעולת הקולטן, בעוד ששיירי serine 426 ו-427 חיוניים לתהליך החדרת הקולטן לאחר קישורו של GIP.

הפעילויות הביולוגיות של GIP:

הפעילות של GIP על תאי β בלבלב אנלוגית לזו של GLP-1, ל-GIP יש גם פעילות פיזיולוגית ייחודית ברקמות חוץ-פנקראטיות.

(להכניס כאן את התרשים מתחתיו המקרא ..פעילות GIP ברקמות ההיקפיות...)

בלוטת הלבלב:

התפקיד הפיזיולוגי העיקרי של GIP היא פעילותו כ-incretin, דהיינו בהתקשרות לקולטניו על פני תאי β בלבלב, ובעידוד הפרשת אינסולין. המנגנונים המולקולאריים האחראיים להפרשת אינסולין בהשפעת GIP, חופפים באופן משמעותי את אלה המושפעים על ידי GLP-1, וכוללים הגדלת ריכוז cAMP, עיכוב תעלות KATP, עלייה ברמות התוך-תאיות של יוני סידן וגירויי של exocytosis (על פי Ding וחב' ב-Diabetes משנת 1997). הגירוי על ידי GIP להפרשת אינסולין, מסתייע על ידי שפעול של 2 הצמדים, AMP/Protein kinase A ו- cAMP/Epac2, בנוסף לשפעול של phospholipase A2 ומסלולי איתות ספציפיים של פרוטאין קינאז (Kashima וחב' ב- J Biol Chem משנת 2001, ו-Ehses וחב' ב-J Biol Chem משנת 2002). כמו כן, GIP מגביר את השעתוק של הגן לאינסולין ואת הביוסינתזה של הורמון זה בתאי β וכן את הביטוי של החיישנים לגלוקוזה על פני תאים אלה (Wang וחב' ב-Mol Cell Endocrinol משנת 1996).

החשיבות הפיזיולוגית של GIP כ-incretin, מודגמת על ידי פגיעה בפעילות הורמון זה in vivo. ביטול האיתות העובר דרך הקולטן GIPR על ידי שימוש באנטגוניסטים או בנוגדנים המכוונים כנגד GIPR, או על ידי אינאקטיבציה ממוקדת של הגן ל-GIPR בעכברים טרנסגניים (-/-GIPR), גורמים לעמידות פגומה למתן פומי של גלוקוזה, כמו גם להפרשה משובשת של אינסולין הצפויה בעקבות מתן גלוקוזה (Tseng וחב' ב-J Clin Invest משנת 1996, וכן Lewis וחב' ב-Endocrinology משנת 2000 ו-Miyawaki וחב' ב-Proc Natl Acad Sci USA משנת 1999).

כמו כן GIP פועל בסינרגיזם עם גלוקוזה לעודד שגשוג תאים ולשפר את הישרדותם של תאי β פנקריאטיים, והשפעה הגנתית זו על תאי β ניתנת להדגמה באיי לנגרהנס של עכברי בר תקינים, אך לא בעכברים הומוזיגוטיים טרנסגניים מסוג -/-GIPR (ע"פ Kim וחב' ב-J Biol Chem משנת 2005). מנגנוני האיתות המולקולאריים המתווכים בהשפעה של GIP על שגשוג תאים דרך פעילות אנטי-אפופטוטית פוענחו על ידי שימוש בתאים הטרולוגיים שעברו טרנספקציה עם GIPR, בשורת תאי β של מכרסמים, באיי פנקריאס של עכברים, וכללו שפעול של מסלולי cAMP/PKA, וכן של ו-PKA/CREB ו-p38MAPK (על פי Trumper וחב' ב-Mol Endocrinol משנת 2001, ו-Ehses וחב' ב- Endocrinology משנת 2003).

ניסויים עם חולדות סוכרתיות מזן ZDF הראו שעירוי של GIP למשך שבועיים, הפחית משמעותית את האפופטוזיס בתאי β בלבלב על ידי שפעול של Akt-PKB בתלות ב-PI-3K, וכן שפעול הפוספורילציה והרחקה מגרעין התא של FoxO1, מה שגורם להפחתת ביטויו של הגן מקדם האפופטוזיס Bax, הפחתה בפעילות caspase 3 (אנזים המפתח בתהליך האפופטוזיס), כמו גם דיכוי השעתוק של הגן ל-bax (חלבון מקדם אפופטוזיס נוסף), ולעומת זאת שדרוג בפעולת הגן של החלבון האנטי-אפופטוטי bcl-2 (על פי Kim וחב' ב-J Biol Chem משנת 2005). כמו כן, נמצא ש-GIP מפחית את רמת סמנים ביוכימיים הקשורים לעקה של הרטיקולום האנדופלזמי (ER) בשורת תאים של איי הלבלב לאחר השריית עקה זו של ה-ER בתנאי תרבית תאים (Yusta וחב' ב-Cell Metab משנת 2006). ניתן לומר שהפעילות האינסולינו-טרופית של GIP פחותה בחולדות היפר-גליקמיות, לפחות באופן חלקי בגלל הביטוי המופחת של הקולטן ל-GIP בחולדות אלה (Lynn וחב' ב-Diabetes משנת 2001).

פעילות GIP במערכת העצבים המרכזית:

ב-CNS, ניתן למצוא ביטוי של GIP בהיפוקמפוס, בתאי Purkinje במוחון וב-olfactory bulb (על פי Nyberg וחב' ב-J Neurosci Res משנת 2007). קולטנים ל-GIP אותרו באזורי מוח אחדים כולל בקליפת המוח, בהיפוקמפוס, ב-olfactory bulb (על פי Kaplan ו-Vigna ב-Peptides משנת 1994, ו-Usdin וחב' ב-Endocrinology משנת 1993). עירוי של GIP אקסוגני למוח חולדות, השרתה שגשוג של תאים פרוגניטורים בהיפוקמפוס in vivo כמו גם בתאים פרוגניטרים מההיפוקמפוס בתנאי תרבית תאים (Nyberg וחב' ב-J Neurosci משנת 2005). לעומת זאת, עכברים טרנסגניים בוגרים (GIPR-/-), עם פגיעה מושרית בקולטן ל-GIP, הכילו מספר קטן משמעותית של תאים פרוגניטורים חדשים ב-dentate gyrus של ההיפוקמפוס. כמו כן, עכברים טרנסגניים המבטאים ביתר את הקולטן GIPR, מפגינים קואורדינציה תחושתית-מוטורית משופרת, כמו גם שיפור בממדי זיכרון בהשוואה לעכברים wild-type.

נראה אם כן שהביטוי של GIPR בתאי עצב פרוגניטורים ב-dentate gyrous של ההיפוקמפוס, מצביעים על מעורבות אפשרית של GIP הוויסות של נוירוגנזה ובתפקוד הזיכרון. באופן הצפוי על יסוד ההשפעה השגשוגית של GIP על תאי פרוגניטור עצביים, השפעול של GIPR על ידי אנאלוגים של GIP, מעודד יצירת LTP (או long-term potentiation) בהיפוקמפוס, ואילו עיכוב ביטוי GIPR על ידי אנטגוניסט של GIP דוגמת Pro3)GIP), מפחית את ה-LTP ( Gault וחב' ב-J Neurophysiol משנת 2008). לעומת זאת, עכברים טרנסגניים עם ביטוי יתר של GIP, מראים שיפור בביצוע משימות הכרוכות בזיכרון (Ding וחב' ב-Peptides משנת 2006). פעילות נוספת של GIP במוח קשורה לוויסות תחושות התיאבון והשובע.

GIP ורקמת שומן:

קולטני GIPR פונקציונאליים מבוטאים על פני אדיפוציטים מבודדים מחולדות ועל פני תאי 3T3-L1 (על פי
Yip וחב' ב-Endocrinology משנת 1998). כיוון שכך, יש הקושרים את GIP לפיקוח על המטבוליזם של שומן, ולהתפתחות של השמנת יתר. קליטת שומן מהמזון היא גריין משמעותי של הפרשת GIP באדם, ורמות GIP בפלזמה עולות בחלק מחולי סוכרת type 2 כבדי המשקל (על פי Creutzfeldt וחב' ב-Diabetologia משנת 1978, ו-Salera וחב' ב-J Clin Endocrinol Metab משנת 1982(. ההשפעה האנאבולית של GIP על רקמת השומן, כוללת גירוי של סינתזה של חומצות שומן ו-רה-אסטריפיקציה שלהן עידוד של החדרת חומצות שומן לתוך טריגליצרידים המושרית על ידי אינסולין, שדרוג הסינתזה של האנזים lipoprotein lipase, הגברת הזיקה של אינסולין לקולטנים שלו, והפחתה בתהליכים ליפוליטיים המושרים על ידי glucagon. יחד עם זאת, יש ל-GIP כנראה גם השפעות ליפוליטיות, אם כי אלה שנויות במחלוקת (Yip ו-Wolfe ב-Life Sci משנת 2000). עכברים טרנסגניים (GIPR-/-), מראים עמידות להשמנת-יתר הנובעת מקליטת מזון, תוך שהם מראים מסת שומן מופחתת, למרות מספר חודשים של האכלתם בדיאטה עתירת-שומן (Miyawaki וחב' ב-Nat Med משנת 2002).

הוספת GIP נמצאה מגבירה את פינוי כילומיקרונים בכלבים (Wasada וחב' ב-J Clin Invest משנת 1981), מפחיתה את רמת טריגליצרידים לאחר ארוחה בחולדות (Ebert וחב' ב-Horm Metab Res משנת 1991) ומגבירה טרנספורט של גלוקוזה וסינתזת חומצות שומן ב-explants של רקמת שומן מחולדות (Knapper וחב' ב-J Nutr משנת 1995, ו-Oben וחב' ב-J Endocrinol משנת 1991). בנוסף, נראה ש-GIP מגביר את רגישות אדיפוציטים לאינסולין, ובכך מעודד קליטת גלוקוזה וחומצות שומן לאגירה בתאים אלה.

יתרה מכך, ניסוי של Isken וחב' שפורסם ב-Am J Physiol Endocrinol Metab משנת 2008, הראה שהשמנת יתר המושרית בדרך כלל על ידי ניתוח להרחקת השחלות נמנעה בעכברים עם חסר בקולטן ל-GIP, מה שניתן להסביר חלקית על ידי הפחתה בצריכת מזון בגלל החסר ב-GIPR. התברר שעירוי לתוך המוח של NPY או הנוירופפטיד האורקסיגני Y, מעודד הפרשת GIP מתאי העצב, מה שרומז לכך ש-GIP פועל כמווסת שלילי של NPY, ועשוי לווסת צריכת מזון על ידי הכלבים המטופלים (Yavropoulou וחב' ב-Peptides משנת 2008). יחד עם זאת, יש לשקול בזהירות יתרה את ההערכה של תפקוד נוגד-השמנה של GIP במוח, כיוון שיש להורמון האחרון השפעה ישירה על רקמת השומן. יש גם להתחשב בהשפעה של ההורמון האינקרטיני האחר GLP-1 בהקשר של השפעתו על צריכת מזון ושובע באדם. בניגוד ל-GLP-1 המעכב התרוקנות הקיבה, נמצא של-GIP יש השפעה מועטה בלבד על התרוקנות הקיבה באדם ובעכברים (Meier וחב' ב-Am J Physiol Endocrinol Metab משנת 2004).

זאת ועוד, עכברי -/-ob/ob:GIPR עולים פחות במשקלם, הם בעלי רקמת שומן מצומצמת יותר, ומגיבים טוב יותר לעודף גלוקוזה, על ידי רגישות רבה יותר לאינסולין, בהשוואה לעכברי ob/ob. למרות שצריכת המזון דומה בין עכברי -/-GIPR לבין עכברי wild-type, כאשר מאכילים אותם במזון עתיר-שומן, עכברי -/-GIPR מוציאים יותר אנרגיה, ולכן הם משתמשים בשומן כמצע אנרגיה מועדף, ולפיכך נמנעת אגירת שומן באדיפוציטים שלהם. בעכברי ob/ob עירוי כרוני של אנטגוניסט לקולטן GIPR דוגמת Pro3)GIP) משפר את הסבילות לגלוקוזה, מגביר את הרגישות לאינסולין, ומתקן את ההיפרטרופיה של תאי הלבלב המושרית על ידי השמנת-יתר, כמו גם את ההיפרפלזיה של תאי β (על פי Gault וחב' ב-Diabetes משנת 2005).

יחד עם זאת, עכברי -/-GIPR שניזונו על דיאטת chow נורמאלית, מראים חוסר סבילות לגלוקוזה, והחדרה של Pro3)GIP) פוגעת בסבילות לגלוקוזה בעכברי wild-type (על פי Irwin וחב' ב-Biol Chem משנת 2004). בנוסף, שפעול של GIPR כרוך עם שיפור בסבילות לגלוקוזה, ומגביר הפרשת אינסולין במודלים של סוכרת בחיות. לכן, למרות שחולים בסוכרת type 2 עמידים באופן יחסי להשפעות האינסולינוֹ-טרופיות של החדרה אקסוגנית של GIP, ואין קשר ישיר בין השמנת-יתר ו-GIP בבני-אדם, יש לשקול את היתרונות היחסיים של שפעול לעומת עיכוב של GIPR, בכל ניסיון בעתיד לשימוש תרפויטי של GIP או של האנלוגים שלו.

התפקיד הפיזיולוגי של GIP בהצטברות שומן:

שומן מגביר באופן ניכר הפרשת GIP (על פי Carr וחב' ב-Am J Physiol Endocrinol Metab , ו-Thomsen וחב' ב-Am J Clin Nutr משנת 1999) וכמו כן רמות GIP מוגברות בחולי סוכרת type 2 כבדי משקל. קיים מתאם טוב בין רמות GIP בפלזמה לבין ריכוזי טריגליצרידים (Elliotte וחב' ב-J Endocrinol משנת 1993). הייתה השערה ש-GIP הוא בעל תפקיד פיזיולוגי בהצטברות שומן באדיפוציטים, ובתחילת שנות ה-80 נעשה ניסוי שהראה ש-GIP בנוכחות אינסולין משרה החדרה של חומצות שומן תוך בלוטות השמן בעקבי חולדות (Beck ו-Max ב-Regul Pept משנת 1983). כמו כן, כאשר בעכברים כבדי-משקל (ob/ob) כתוצאה מפגם בגן של leptin, מניפולציה גנטית של פגיעה ב-GIPR הביאה לא רק לשיפור של בעיית עודף המשקל על ידי הגברת "שריפת" אנרגיה, אלא גם הגבירה את הרגישות לאינסולין ואת הסבילות לגלוקוזה, ללא פגיעה קשה בהפרשת אינסולין (Zhang וחב' ב-Nature משנת 1994, וכן Vilsbøll וחב' ב-Diabetologia משנת 2002 ו-Yamada וחב' ב-Diabetes משנת 2006).

תצפיות אלו אושרו בעכברים שהוזנו בדיאטה עתירת-שומן וכן בעכברים שמנים ob/ob, שטופלו באנטגוניסט Pro3)GIP) של הקולטן ל-GIP (ע"פ Gault וחב' ב-Diabetologia משנת 2008, וכן Irwin וחב' באותו כתב עת משנת 2007), כמו גם בעכברים טרנסגניים החסרים תאי K מפרישי GIP (ע"פ Althage וחב' ב-J Biol Chem משנת 2008).

למרות ש-GIP נמצא מגביר את פעילות lipoprotein lipase, אנזים הקשור לממברנת תאים אדיפוציטים, ואשר תפקידו לבצע הידרוליזה של טריגליצרידים הקשורים לליפופרוטאין על מנת לייצר חומצות שומן, המנגנון המולקולארי דרכו GIP פועל על אדיפוציטים אינו ברור דיו. Kim וחב' דיווחו בשנת 2007 ב-J Biol Chem, שקישור GIP לקולטניו על פני תאי 3T3-L1 גורם להפרשה מוגברת של resistin במסלול הקשור ל-p38 MAPK ו-SAPK/JNK. אותם חוקרים הראו גם ש-GIP משפעל את PI3K ואת Akt/PKB על ידי הפרשת resistin, ועל ידי כך הוא מדכא את AMPK ומגביר את פעילות lipoprotein lipase וליפוגנזה באדיפוציטים.

ראוי לציין שאגוניסט אחר של GIPR, הידוע כ-(D-Ala2GIP(1-30 מראה פעילות דומה לזו של (1-42)GIP על התפקוד וההישרדות של תאי בתא, אך יש לו השפעה פחותה בהרבה על פעילות lipoprotein lipase בתאי 3T3-L1 (ע"פ Widenmaiser וחב' ב-PLoS ONE משנת 2010).

GIP ורקמת עצם:

האפשרות ש-GIP במטבוליזם של רקמת עצם הועלתה על ידי Tsukiyama וחב' ב-Mol Endocrinol משנת 2006, שהראו שלעכברים החסרים GIPR טרבקולות העצם (כפיסונים) דקות יותר מה שאופייני לאוסטיאופורוזיס. חוקרים אלה הדגימו על ידי אנליזה היסטו-פוטומטרית, שיצירת רקמת עצם בעכברים אלה ירודה יותר, ומספר האוסטיאוקלסטים גדול יותר כאופייני לתהליכי אוסטיאופורוזיס. כן הודגם in vitro במחקר זה ש-GIP מדכא תהליכי אפופטוזיס של אוסטיאובלסטים, מה שמרמז לאפשרות שגם in vivo יש ל-GIP תפקיד במניעת אפופטוזיס של אוסטיאובלסטים.

זאת ועוד, ההגברה של יצירת עצם על ידי GIP, כמנגנון של דיכויים של אוסטיאוקלסטים ומניעת אפופטוזיס של תאים אלה, הודגמה בעכברים טרנסגניים עם פגם בייצור GIP (ע"פ Ding וחב' ב-J Bone Miner Res משנת 2008, וכן Xie וחב' ב-Bone משנת 2007 ו-Zhong וחב' ב-Am J Physiol Endocrinol Metab משנת 2007).

ה-mRNA של GIP וההורמון עצמו מבוטאים בעצם הנורמאלית וכן בשורות תאים של אוסטיאובלסטים (Bollag וחב' ב-Endocrinology משנת 2000). נמצא ש-GIP מעודד הגברה ברמות של cAMP ושל יוני סידן תוך-תאי של אוסטיאובלסטים בתרבית, ושהשפעות אלה של GIP כרוכות בסמנים של יצירת רקמת עצם חדשה, כולל הגברת הפעילות של פוספטאזה בסיסית, ועלייה ברמת mRNA של קולאגן type 1. כן נמצא ש-GIP מגדיל את צפיפות העצם (BMD) בחולדות שעברו כריתת שחלות, המהוות מודל של אוסטיאופורוזיס בנשים בגיל חידלון הווסת (Bollag וחב' ב-Endocrinology משנת 2001). יתרה מכך, GIP עשוי לסייע לשקיעת סידן בעצם בתגובה לארוחה, שכן רמות סידן בפלזמה הוגברו בעכברים החסרים GIPR.

בהשוואה לעכברי ביקורת wild-type בני אותו גיל, מוצאים בעכברים טרנסגניים צעירים -/-GIPR מסת וגודל עצם נמוכים יותר, מיקרו-ארכיטקטורה בלתי-נורמאלית של העצם, תכונות ביו-מכאניות פגומות של העצם וכן שינוים במדדי ספיגה ובנייה מחדש של רקמת עצם (Xie וחב' ב-Bone משנת 2005). יחד עם זאת ככל שהעכברים מתבגרים ההבדלים המוזכרים בביולוגיה של העצם נעשים פחות מובהקים. היפוכו של דבר כאשר מסת העצם גדלה בעכברים טרנסגניים המייצרים GIP ביתר, בהשוואה לעכברי wild-type. בשנת 2007 דיווחו Zhong וחב' ב-Am J Physiol, על גילוי mRNA של GIPR ואת הקולטן עצמו בתאים אוסטיאוקלסטים של מכרסמים, כאשר החדרת GIP נמצאה מעכבת תהליכים של ספיגת עצם.

יתרה מכך, עכברי -/-GIPR מבוגרים הראו ירידות בפרמטרים של יצירת עצם כמו גם עליות ברמת סידן בפלזמה לאחר צריכת מזון, מה שמרמז לכך ש-GIPעשוי לספק קשר ישיר בין סידן במזון לבין שקיעת סידן בעצמות. יחד עם זאת, הוספה של GIP במינון גבוה, אין כדי לשנות את התחלופה בתהליכי ספיגה ובניה של רקמת עצם בניסויים ארוכי-טווח של GIP באדם (Henriksen וחב' ב-J Bone Miner Res משנת 2003). כללית, לא ברור אם מתן ארוך טווח של GIP יביא למודולציה של תהליכי ספיגה ובנייה מחדש של רקמת עצם באדם. למרות שממצאים אלה יכולים לרמז על כך שנשים בגיל חידלון הווסת עלולות להיות מועמדות לאוסטיאפורוזיס באופן חלקי בגלל תגובה מופחתת של GIP (על פי Ahren וחב' ב-Eur J Endocrinol משנת 1997) יהיה צורך לקבוע האם GIP הוא אמנם בעל תפקיד אוסטיאוגני באדם.

GIP ורקמות אחרות:

למרות ש-GIP מעכב בקיבה הפרשת חומצת קיבה, פעילות זו מושגת רק בריכוזים הגבוהים משמעותית מריכוזיו הפיזיולוגיים של הורמון זה (Nauck וחב' ב-Digestion משנת 1992). כמן כן נמצא ש-GIP מגביר את הטרנספורט של סוכרים במעי. בכבד, GIP מחליש יצירה של גלוקוזה המושרית על ידי glucagon, כנראה במנגנון בלתי-ישיר, שכן לא נמצאו עד כה קולטנים ל-GIP בכבד. GIP יכול לעודד פינוי של גלוקוזה התלויה באינסולין בבעלי חיים, אם כי השפעה זו לא נמצאה באדם. GIP יכול גם לעודד הפרשה של גלוקו-קורטיקואיד בחולדות דרך מסלול איתות התלוי ב-cAMP/PKA (על פי Mazzocchi וחב' ב-Peptides משנת 1999).

למרות שלא נראה ש-GIP מווסת הפרשה של קורטיזול בבני-אדם בריאים, ביטוי בלתי נורמאלי של GIPR באדנומות ממקור הקורטקס של האדרנל, כרוך בהתפתחות תסמונת Cushing תלויית-מזון (Lacroix וחב' ב-N Eng J Med משנת 1992). נצפה שקולטנים ל-GIP נמצאים גם באנדותליום הווסקולארי, ואמנם GIP מעודד הגברה של רמות סידן תוך-תאי בתרבית של תאי אנדותל (Zhong וחב' ב-Peptides משנת 2000). עירוי של GIP לכלבים משרה בהם הפרשה של endothelin-1 וכיווץ כלי-דם, או הפרשה של NO והרחבת כלי-דם, בתלות במערכת כלי הדם הרלוונטית. ההשפעות המנוגדות של GIP על כלי-דם שונים, מיוחסות לשונות בדרגת השפעול של מסלולי העברת האיתותים בסוגי תאי אנדותל שונים. למרות שמוצאים mRNA של GIPR גם ברקמת הלב, באשכים, בריאות ובמספר רקמות נוספות, הפעילות הפיזיולוגית של GIP ברקמות אלה אינה ברורה, אם בכלל.

שינויים ברמת GIP בתרחישים קליניים:

רמות מוגברות משמעותית של GIP בולטות לאחר עירוי גלוקוזה בחולים עם פנקראטיטיס. רמות מוגברות אלה ניתן למצוא גם בחולי סוכרת. רמה מוגברת שלGIP מוצאים בחולים עם VIPoma הידועה גם כתסמונת Verner-Morrison המאוד נדירה, בה תאי איי-לבלב שאינם תאי-β מייצרים VIP. לעומת זאת רמות GIP נמוכות יותר בטיפול בקלציטונין.
== הוראות לביצוע הבדיקה ==
יש להיות בצום של 10-12 שעות לפני נטילת הדם. תכשירים נוגדי חומציות קיבה (Antacids) או תרופות המשפיעות על תנועתיות המעי, או על הפרשת אינסולין יכולים להשפיע על תוצאות מדידת GIP, ולכן יש להפסיק נטילתם במידת האפשר לפחות לפרק זמן של 48 שעות לפני דגימת הדם. יש לדגום את הדם במבחנת הפארין (פקק ירוק) ולאחר סרכוז יש לאחסן את הפלזמה המופרדת בהקפאה במהירות האפשרית. דגימת הפלזמה יציבה בתנאי הקפאה למשל 6 חודשים. הבדיקה נעשית בשיטת RIA. יש לפסול דגימות שאינן פלזמה, או דגימות מופשרות ששהו זמן ממושך בטמפרטורת החדר. המדידה נעשית בשיטת RIA.

Gastric inhibitory polypeptide

2015-08-27T13:38:19Z

בן עמי סלע: יצירת דף עם התוכן "==polypeptide Gastric inhibitory == כינויים נוספים: GIP, glucose-dependent insulinotropic peptide. תחום: הערכת מצבי סוכרת, הש..."

==polypeptide Gastric inhibitory ==

כינויים נוספים: GIP, glucose-dependent insulinotropic peptide.
תחום: הערכת מצבי סוכרת, השמנת יתר והערכה תפקודית של פעילות בלוטת הלבלב.
טווח ערכים תקין: בדם בצום-50-100 פיקוגרם/מ"ל; בדם לאחר ארוחה-110-720 פיקוגרם/מ"ל.
יוצר הערך: פרופ' בן-עמי סלע.

== בסיס פיזיולוגי ==

חלפו למעלה מ-100 שנה מאז התגלית של מושג האינקרטינים (incretins), שפתח לאחר מכן אפשרות של טיפול חדש בחולי סוכרת. בשנת 1902 פרסמו Bayliss ו-Starling ב-J Physiol, על גילוי secretin, מה שהביא את Moore וחב' להשערה שפורסמה ב-Biochem J בשנת 1906, שתמצית מעי מכילה הורמון המווסת את פעילותו האנדוקרינית של בלוטת הלבלב, ואף הראו שהזרקת תמצית זו הפחיתה את כמות הסוכרים המופרשים בשתן של חולי סוכרת, כנראה על ידי גירוי הפעילות האנדוקרינית של הלבלב. אך רק בשנת 1929 חלה התעוררות בנושא, כאשר La Barre ו-Zunz פרסמו ב-Arch Int Physiol Biochim, שהם ניקו מתמצית מעי את הגורם המפחית גלוקוזה וכינו אותו incretin או INtestine seCRETion Insulin. חלפה תקופה דומה של כמעט שלושים שנה, עד אשר פותחה שיטת RIA לכימות רמת אינסולין בשנות ה-60, ובשנת 1964 הופיעו 2 מאמרים שהראו שהעמסת סוכר באופן פומי, הביאה ליצירה מוגברת יותר של אינסולין מאשר היו מזריקים גלוקוזה ישירות לווריד (Elrick וחב' ב-J Clin Endocrinol Metab משנת 1964, ו-McIntyre וחב' ב-Lancet באותה שנה). כיום מייחסים ממצא זה ל-incretins המופרשים מהמעי לאחר בליעת גלוקוזה אך גם ארוחות עשירות בשומן, מה שמגרה את תאי β בלבלב להפריש יותר אינסולין.

רק 2 הורמוני מעי כאלה נתגלו עד כה שפועלים כ-incretins, והם GIP או gastric inhibitory polypeptide, ו-GLP-1 או glucagon-like peptide-1. ה-GIP הוא הורמון בן 42 חומצות אמינו שמשקלו המולקולארי 4,944 דלטון, המופרש מתאי K בחלק העליון של המעי הדק באזור התריסריון וה-jejunum הקריבני (פרוקסימאלי), אך ניתן למצוא את GIP לאורך כל המעי (Inagaki וחב' ב-Mol Endocrinol משנת 1989). במקור בודדו GIP בשנת 1970 ממעי של חזיר על ידי Brown וחב' על בסיס יכולתו לעכב הפרשת חומצת קיבה ו-gastrin בכלבים כפי שתואר ב-J Physiol. מאוחר יותר פרסמו Dupre וחב' ב-J Clin Endocrinol Metab משנת 1973 שהזרקת GIP מעודדת הפרשת אינסולין במתנדבים בריאים על ידי פעולה ישירה של הורמון זה על תאי הלבלב להפרשת אינסולין (Adrian וחב' ב-Diabetologia משנת 1978, ו-Taminato וחב' ב-Diabetes משנת 1977). נתונים אלה הצביעו על GIPכעל ה-incretin המקורי, ולאחר מכן יש שכינו אותו glucose-dependent insulinotropic polypeptide.

הגן ל-GIP אנושי מורכב מ-6 אֶקסונים כאשר רוב המידע המקודד ל-GIP נמצא ב- 3 exon, וגן זה ממוקם בזרוע הארוכה של כרומוזום 17 בעמדה 17 q21.3-q22. ביטוי הגן ל-GIP התגלה בקיבה ובתאי K במעי במכרסמים כמו גם באדם, כאשר בחולדות ביטוי גן זה מופיע גם בבלוטת הרוק התת-מנדיבולארית. נמצא שבחולדות, רמת mRNA של GIP, עולה בתריסיון ובבלוטת הרוק לאחר ארוחות המכילות גלוקוזה או עשירות בשומן, אך רמת mRNA זה פוחתת בתגובה לצום ממושך.

ביוסינתזה של GIP:

הרצף של חומצות האמינו של GIP בחולדה ובאדם, מצביע על כך שהורמון זה מיוצר מקדם-הורמון (preproGIP) גדול יותר המכיל signal peptide , פפטיד N-טרמינאלי, GIP ופפטיד C-טרמינאלי, על ידי פעילות PC או prohormone convertase 1/3. מחקרים עם עכברי knockout בהם פגום הגן של האנזים PC, וכן ניסויים בתרבית תאים עם פעילות-יתר של PC, הדגימו שהצורה הבשלה והפעילה של GIP, המכילה 42 חומצות אמינו מקורה בקודמן preproGIP המכיל 153 חומצות אמינו, כאשר הביקוע מתבצע ליד שייר ארגינין (Ugleholdt וחב' ב-J Biol Chem משנת 2003). הפפטידים המקוּדדים בתוך המקטעים ה-N-טרמינאלי וה-C-טרמינאלי הם חסרי פעילות ידועה. הרצף של GIP השתמר בצורה בולטת בין מיני בעלי חיים שונים, ורצפי חומצות האמינו של GIP של האדם לבין זה של עכבר, חולדה, חזיר ופרה מראים זהות של למעלה מ-90%. יש עדות מסוימת שגם תאי α בלבלב מסוגלים לייצר כמויות קטנות של preproGIP, שעובר ביקוע על ידי prohormone convertase 2 לייצור הורמון קטום בקצה ה-C טרמינאלי של ה-preproGIP , המוגדר כ-(GIP(1-30, אך אין מידע לגבי פעילות פיזיולוגית של פפטיד זה.

(להכניס כאן תרשים שמתחתיו המקרא מתחיל במילים A) הגן ל-proGIP)
(להכניס כאן ברצף את התרשים השמאלי בלבד מעליו GIP באדום
ומתחתיו מופיע ...הביוסינתזה של GIP)
(להכניס כאן ברצף את התרשים שמתחתיו המקרא.....רצף 42 חומצות האמינו של GIP).

התפקוד של GIP:

במקור נקרא הורמון פפטידי זה gastric inhibitory peptide בגלל יכולתו להפחית את הפרשת חומצת הקיבה בחיות (אם כי לא באדם) (Kim ו-Egan ב-Pharmacol Rev משנת 2008) על מנת להגן על המעי הדק מנזק החומצה, להפחית את קצב העברת המזון דרך הקיבה, ולעכב את התנועתיות (motility) של המעיים. אך לאחרונה מייחסים פעולות אלה ביתר שאת להורמון דומה, secretin. היום מאמינים שתפקידו העיקרי של GIP הוא להשרות הפרשת אינסולין, המושפעת העיקר על ידי היפר-אוסמולריות של גלוקוזה בתריסריון (Thorens ב- Diabète & Métabolisme משנת 1995). לכן יש מעדיפים כיום את כינוי ההורמון כ-glucose-dependent insulinotropic peptide.

משערים שיש ל-GIP השפעות משמעותיות על המטבוליזם של חומצות שומן, דרך הגירוי של פעילות האנזים lipoprotein lipase באדיפוציטים. כמו כן, נמצא ש-GIP מופרש בתגובה להנקה הראשונה של חלב אם (colostrum) בגורי עזים. משיקולים אתיים, הפרשת GIP הודגמה בתינוקות אדם רק בגיל 10 ימים בערך. לאחרונה נמצא שיש ל-GIP תפקיד מרכזי בתהליכי עיצוב (remodeling) של רקמת העצם. Gaudin-Audrain וחב' דיווחו בשנת 2013 ב-Bone שעכברים טרנסגניים עם חסר בקולטן ל-GIP, סבלו משינויים ניכרים במיקרו-ארכיטקטורה, בנפח ובאיכות של העצם הטרבקולארית. ממצאים דומים פורסמו באותו כתב-עת בשנת 2013 על ידי Mieczkowska וחב', כאשר נמצא שאיכות העצם נפגמה והייתה נטייה לשברי עצם בעכברים עם חסר מושרה בקולטן ל-GIP.

הרלוונטיות של GIP לסוכרת type 2 הודגמה, כאשר נמצא שחולים בסוג סוכרת זו מגיבים משמעותית פחות ל-GIP, וכן בחולים אלה יש הפרשה פחותה של GIP לאחר ארוחה, בהשוואה לאנשים ללא סוכרת (Skrha וחב' ב-Physiol Res משנת 2010). במחקר עם עכברי knockout, נמצא שחסר בקולטנים ל-GIPכרוך בעמידות להשמנת-יתר (Yamada ו-Seino ב-Hormone & Metabol Res משנת 2004.

(להכניס כאן את התרשים מתחתיו מופיע המקרא: התפקוד הפנקראטי והחוץ פנקראטי של GIP בהשוואה ל-GLP-1)

הפרשה, מטבוליזם ופינוי של GIP:

כאמור, GIP מיוצר ומופרש מתאי K בתריסריון וב-jejunum הקריבני, עם פעילות סינתטית והפרשתית נמוכה יותר לאורך המעי הדק כולו (Mortensen וחב' ב-Regu Pept משנת 2003, ו-Butchan וחב' ב-Histochemistry משנת 1978). GIP מופרש בתגובה לקליטת מזון, בעיקר גלוקוזה או שומן. באופן ספציפי יותר, הפרשת GIP מושפעת יותר מקצב ספיגת המזון מאשר מנוכחות מזון במעי. לכן, הפרשת GIP פוחתת באנשים עם בעיות ספיגה, או לאחר נטילת תכשירים האמורים להפחית את הספיגה (Besterman וחב' ב-BMJ משנת 1979, ו-Fushiki וחב' ב-J Nutr משנת 1992). ראוי לציין שבעוד שמזון שומני הוא גריין יעיל יותר של הפרשת GIP באדם, פחמימות יותר יעילות בגירוי הפרשה זו במכרסמים ובחזירים. באדם, הרמה הבסיסית של GIP בפלזמה היא מתחת ל-50 פיקוגרם/מ"ל, והיא עולה לאחר ארוחה לרמה של עד 720 פיקוגרם/מ"ל בתלות בסוג וכמות המזון בארוחה (Orskov וחב' ב-Scand J Gastroenterol משנת 1996, ו-Vilsbøll וחב' ב-Diabetes משנת 2001). רמות GIP בפלזמה דומות או מוגברות אך במקצת בחולים עם סוכרת type 2 בהשוואה לזו באנשים בריאים (Ross וחב' ב-Diabetes משנת 1977).

(להכניס כאן את התרשים מתחתיו מופיע: הפרשה ומטבוליזם של GIP בהשוואה ל-GLP-1)
(להכניס כאן ברצף את התרשים מתחתיו מופיע: שני incretins פעילים ביולוגית)

תקופת מחצית החיים של GIP היא פחות מ-2 דקות במכרסמים (Kieffer וחב' ב-Endocrinology משנת 1995), ואילו בבני-אדם בריאים תקופת מחצית החיים היא של 7 דקות, כאשר בחולי סוכרת type 2 היא בת 5 דקות (Deacon וחב' ב-J Clin Endocrinol Metabol משנת 2000). יש לציין שתקופת מחצית החיים של GIP בצורתו הקטומה (לאחר הסרת 2 חומצות האמינו פרולין ואלנין בקצה ה-N טרמינאלי על ידי DPP-4) מתארכת עד כדי 17 דקות (Vilsbøll וחב' ב-Regul Pept משנת 2006).

שייר אלנין בעמדה 2 של רצף חומצות האמינו של GIP, מהווה יעד פעולה של DPP-4 או Dipeptidyl peptidase-4, שהוא האנזים הגורם לאינאקטיבציה של(1-42)GIP על ידי הפיכתו למטבוליט הבלתי-פעיל (GIP(3-42, המאבד את תכונותיו האינסולינוטרופיות (Deacon וחב' ב-J Clin Endocrinol Metabמשנת 2000). אנזים זה ממוקם בממברנות brush-border של המעי והכליות, אך ניתן למצוא אותו גם על פני קפילארות, ובצורה מסיסה בפלזמה (Mentlain ב-Regul Pept משנת 1999).

פעילות זו של DPP-4 כאנזים העיקרי הפוגע בפעילות GIP הודגמה היטב במכרסמים ובבני-אדם בריאים או סוכרתיים. התצפיות לפיהן רמות GIP בפלזמה מוגברות באנשים הסובלים מ-uremia או באלה עם מחלת כליות כרונית, כמו גם הממצאים על פינוי משובש של GIP בחולדות שעברו nephrectomy, מצביעים על הכליות כאיבר דרכו מתבצע רוב הפינוי (clearance) של GIP (על פי Meier וחב' ב-Diabetes משנת 2004). מחקרים של Deacon וחב' ב-Diabetes משנת 2001 מראים שגם לכבד יש תפקיד בספיגת GIP מהדם, ואילו Vilsbøll וחב' דיווחו ב-Regul Pept משנת 2006, שקצב הפינוי של GIPשלם ושל המטבוליטים שלו דומים בין אנשים בריאים לבין אנשים שמנים עם סוכרת type 2.

הקולטן ל-GIP:

GIP פועל על ידי התקשרות לקולטן ספציפי GIPR ששובט במקור מספריית cDNA מקליפת המוח של חולדה, ולאחר מכן שובט ממקור אוגר ואדם. הגן של הקולטן האנושי ל-GIP מכיל 14 exons ש"אורכם" 14 kb (ע"פ Yamada וחב' ב-Genomics משנת 1995), והוא ממוקם בכרומוזום 19 בעמדה q13.3. הקולטן ל-GIP באדם מכיל 466 חומצות אמינו, אך יש גם איזופורם של קולטן ל-GIP עם 493 חומצות אמינו. הגן ל-GIPR בא לביטוי בבלוטת הלבלב, בקיבה, במעי הדק, ברקמת השומן, בקורטקס של האדרנל, בבלוטת יותרת המוח (היפופיזה), בלב, באשכים, בתאים אנדותליאליים, ברקמת העצם, בטרכיאה, בטחול, בבלוטת ההרת (תימוס), בריאות, בכליות בבלוטת התריס (תירואיד), ובאזורים אחדים של מערכת העצבים המרכזית (Asmar ב-Dan Med Bull משנת 2011). יחד עם זאת, לא ברורה עדיין המשמעות של תוצאות השפעול של קולטנים חוץ-פנקראטיים אלה.

הקולטן של GIP הוא חבר במשפחת העל של קולטנים החוצים את הממברנה באופן מפותל 7 פעמים, שהם בעלי מבנה הֶטֶרוֹ-טרימרי והם קשורים לחלבוני G בציטופלזמה (Usdin וחב' ב-Endocrinology משנת 1993). מעט יחסית ידוע על הגורמים האחראיים לוויסות ביטויו של הקולטן ל-GIP, אך ידוע רמות ה-mRNA של GIPR ושל חלבון הקולטן עצמו, נמוכות יותר באיי הלבלב של חולדות סוכרתיות, מה שנכון גם לבני אדם (Lynn וחב' ב-Diabetes משנת 2001).

שפעול של איתות המועבר דרך GIPR קשור לשדרוג פעילות האנזיםadenylyl cyclase ולעליות ברמת cAMP ויוני סידן תוך תאי, כמו גם לשפעול של החלבוניםp38 MAPK, PKB, PKA, PI-3K ו-פוספוליפאזA2 (על פי McIntosh וחב' ב-Vitam Horm משנת 2009). ניסויים in-vitro העלו שהקצה ה-N-טרמינאלי של GIPR והלולאה החוץ תאית הראשונה של GIPR חיוניים לזיקה הגבוהה של קישור של GIP לקולטן שלו, בעוד שחלקים מהקצה ה-N טרמינאלי בנוסף למקטע (domain) הטרנס-ממברנאלי חיוניים לשפעול הקולטן ולצימוד של cAMP. למרות שרוב רצף חומצות האמינו בקצה ה-C טרמינאלי של GIPR נראה מיותר לאיתות התוך-תאי, רצף מינימאלי של הקולטן הכולל 405 חומצות אמינו נדרש להעברה יעילה של האיתות לאחר קישור GIP לקולטן שלו. Wheeler וחב' דיווחו ב-J Biol Chem משנת 1999, ששיירי serine 406 ו-411 בקצה ה-C טרמינאלי חיוניים לנטרול (desensitization) פעולת הקולטן, בעוד ששיירי serine 426 ו-427 חיוניים לתהליך החדרת הקולטן לאחר קישורו של GIP.

הפעילויות הביולוגיות של GIP:

הפעילות של GIP על תאי β בלבלב אנלוגית לזו של GLP-1, ל-GIP יש גם פעילות פיזיולוגית ייחודית ברקמות חוץ-פנקראטיות.

(להכניס כאן את התרשים מתחתיו המקרא ..פעילות GIP ברקמות ההיקפיות...)

בלוטת הלבלב:

התפקיד הפיזיולוגי העיקרי של GIP היא פעילותו כ-incretin, דהיינו בהתקשרות לקולטניו על פני תאי β בלבלב, ובעידוד הפרשת אינסולין. המנגנונים המולקולאריים האחראיים להפרשת אינסולין בהשפעת GIP, חופפים באופן משמעותי את אלה המושפעים על ידי GLP-1, וכוללים הגדלת ריכוז cAMP, עיכוב תעלות KATP, עלייה ברמות התוך-תאיות של יוני סידן וגירויי של exocytosis (Ding וחב' ב-Diabetes משנת 1997). הגירוי על ידי GIP להפרשת אינסולין, מסתייע על ידי שפעול של 2 הצמדים, AMP/Protein kinase A ו- cAMP/Epac2, בנוסף לשפעול של phospholipase A2 ומסלולי איתות ספציפיים של פרוטאין קינאז (Kashima וחב' ב- J Biol Chem משנת 2001, ו-Ehses וחב' ב-J Biol Chem משנת 2002). כמו כן, GIP מגביר את השעתוק של הגן לאינסולין ואת הביוסינתזה של הורמון זה בתאי β וכן את הביטוי של החיישנים לגלוקוזה על פני תאים אלה (Wang וחב' ב-Mol Cell Endocrinol משנת 1996).

החשיבות הפיזיולוגית של GIP כ-incretin, מודגמת על ידי פגיעה בפעילות הורמון זה in vivo. ביטול האיתות העובר דרך הקולטן GIPR על ידי שימוש באנטגוניסטים או בנוגדנים המכוונים כנגד GIPR, או על ידי אינאקטיבציה ממוקדת של הגן ל-GIPR בעכברים טרנסגניים (-/-GIPR), גורמים לעמידות פגומה למתן פומי של גלוקוזה, כמו גם להפרשה משובשת של אינסולין הצפויה בעקבות מתן גלוקוזה (Tseng וחב' ב-J Clin Invest משנת 1996, וכן Lewis וחב' ב-Endocrinology משנת 2000 ו-Miyawaki וחב' ב-Proc Natl Acad Sci USA משנת 1999).

כמו כן GIP פועל בסינרגיזם עם גלוקוזה לעודד שגשוג תאים ולשפר את הישרדותם של תאי β פנקריאטיים, והשפעה הגנתית זו על תאי β ניתנת להדגמה באיי לנגרהנס של עכברי בר תקינים, אך לא בעכברים הומוזיגוטיים טרנסגניים מסוג -/-GIPR (ע"פ Kim וחב' ב-J Biol Chem משנת 2005). מנגנוני האיתות המולקולאריים המתווכים בהשפעה של GIP על שגשוג תאים דרך פעילות אנטי-אפופטוטית פוענחו על ידי שימוש בתאים הטרולוגיים שעברו טרנספקציה עם GIPR, בשורת תאי β של מכרסמים, באיי פנקריאס של עכברים, וכללו שפעול של מסלולי cAMP/PKA, וכן של ו-PKA/CREB ו-p38MAPK (על פי Trumper וחב' ב-Mol Endocrinol משנת 2001, ו-Ehses וחב' ב- Endocrinology משנת 2003).

ניסויים עם חולדות סוכרתיות מזן ZDF הראו שעירוי של GIP למשך שבועיים, הפחית משמעותית את האפופטוזיס בתאי β בלבלב על ידי שפעול של Akt-PKB בתלות ב-PI-3K, וכן שפעול הפוספורילציה והרחקה מגרעין התא של FoxO1, מה שגורם להפחתת ביטויו של הגן מקדם האפופטוזיס Bax, הפחתה בפעילות caspase 3 (אנזים המפתח בתהליך האפופטוזיס), כמו גם דיכוי השעתוק של הגן ל-bax (חלבון מקדם אפופטוזיס נוסף), ולעומת זאת שדרוג בפעולת הגן של החלבון האנטי-אפופטוטי bcl-2 (על פי Kim וחב' ב-J Biol Chem משנת 2005). כמו כן, נמצא ש-GIP מפחית את רמת סמנים ביוכימיים הקשורים לעקה של הרטיקולום האנדופלזמי (ER) בשורת תאים של איי הלבלב לאחר השריית עקה זו של ה-ER בתנאי תרבית תאים (Yusta וחב' ב-Cell Metab משנת 2006). ניתן לומר שהפעילות האינסולינו-טרופית של GIP פחותה בחולדות היפר-גליקמיות, לפחות באופן חלקי בגלל הביטוי המופחת של הקולטן ל-GIP בחולדות אלה (Lynn וחב' ב-Diabetes משנת 2001).

פעילות GIP במערכת העצבים המרכזית:

ב-CNS, ניתן למצוא ביטוי של GIP בהיפוקמפוס, בתאי Purkinje במוחון וב-olfactory bulb (על פי Nyberg וחב' ב-J Neurosci Res משנת 2007). קולטנים ל-GIP אותרו באזורי מוח אחדים כולל בקליפת המוח, בהיפוקמפוס, ב-olfactory bulb (על פי Kaplan ו-Vigna ב-Peptides משנת 1994, ו-Usdin וחב' ב-Endocrinology משנת 1993). עירוי של GIP אקסוגני למוח חולדות, השרתה שגשוג של תאים פרוגניטורים בהיפוקמפוס in vivo כמו גם בתאים פרוגניטרים מההיפוקמפוס בתנאי תרבית תאים (Nyberg וחב' ב-J Neurosci משנת 2005). לעומת זאת, עכברים טרנסגניים בוגרים (GIPR-/-), עם פגיעה מושרית בקולטן ל-GIP, הכילו מספר קטן משמעותית של תאים פרוגניטורים חדשים ב-dentate gyrus של ההיפוקמפוס. כמו כן, עכברים טרנסגניים המבטאים ביתר את הקולטן GIPR, מפגינים קואורדינציה תחושתית-מוטורית משופרת, כמו גם שיפור בממדי זיכרון בהשוואה לעכברים wild-type.

נראה אם כן שהביטוי של GIPR בתאי עצב פרוגניטורים ב-dentate gyrous של ההיפוקמפוס, מצביעים על מעורבות אפשרית של GIP הוויסות של נוירוגנזה ובתפקוד הזיכרון. באופן הצפוי על יסוד ההשפעה השגשוגית של GIP על תאי פרוגניטור עצביים, השפעול של GIPR על ידי אנאלוגים של GIP, מעודד יצירת LTP (או long-term potentiation) בהיפוקמפוס, ואילו עיכוב ביטוי GIPR על ידי אנטגוניסט של GIP דוגמת Pro3)GIP), מפחית את ה-LTP ( Gault וחב' ב-J Neurophysiol משנת 2008). לעומת זאת, עכברים טרנסגניים עם ביטוי יתר של GIP, מראים שיפור בביצוע משימות הכרוכות בזיכרון (Ding וחב' ב-Peptides משנת 2006). פעילות נוספת של GIP במוח קשורה לוויסות תחושות התיאבון והשובע.

GIP ורקמת שומן:

קולטני GIPR פונקציונאליים מבוטאים על פני אדיפוציטים מבודדים מחולדות ועל פני תאי 3T3-L1 (על פי
Yip וחב' ב-Endocrinology משנת 1998). כיוון שכך, יש הקושרים את GIP לפיקוח על המטבוליזם של שומן, ולהתפתחות של השמנת יתר. קליטת שומן מהמזון היא גריין משמעותי של הפרשת GIP באדם, ורמות GIP בפלזמה עולות בחלק מחולי סוכרת type 2 כבדי המשקל (על פי Creutzfeldt וחב' ב-Diabetologia משנת 1978, ו-Salera וחב' ב-J Clin Endocrinol Metab משנת 1982(. ההשפעה האנאבולית של GIP על רקמת השומן, כוללת גירוי של סינתזה של חומצות שומן ו-רה-אסטריפיקציה שלהן עידוד של החדרת חומצות שומן לתוך טריגליצרידים המושרית על ידי אינסולין, שדרוג הסינתזה של האנזים lipoprotein lipase, הגברת הזיקה של אינסולין לקולטנים שלו, והפחתה בתהליכים ליפוליטיים המושרים על ידי glucagon. יחד עם זאת, יש ל-GIP כנראה גם השפעות ליפוליטיות, אם כי אלה שנויות במחלוקת (Yip ו-Wolfe ב-Life Sci משנת 2000). עכברים טרנסגניים (GIPR-/-), מראים עמידות להשמנת-יתר הנובעת מקליטת מזון, תוך שהם מראים מסת שומן מופחתת, למרות מספר חודשים של האכלתם בדיאטה עתירת-שומן (Miyawaki וחב' ב-Nat Med משנת 2002).

הוספת GIP נמצאה מגבירה את פינוי כילומיקרונים בכלבים (Wasada וחב' ב-J Clin Invest משנת 1981), מפחיתה את רמת טריגליצרידים לאחר ארוחה בחולדות (Ebert וחב' ב-Horm Metab Res משנת 1991) ומגבירה טרנספורט של גלוקוזה וסינתזת חומצות שומן ב-explants של רקמת שומן מחולדות (Knapper וחב' ב-J Nutr משנת 1995, ו-Oben וחב' ב-J Endocrinol משנת 1991). בנוסף, נראה ש-GIP מגביר את רגישות אדיפוציטים לאינסולין, ובכך מעודד קליטת גלוקוזה וחומצות שומן לאגירה בתאים אלה.

יתרה מכך, ניסוי של Isken וחב' שפורסם ב-Am J Physiol Endocrinol Metab משנת 2008, הראה שהשמנת יתר המושרית בדרך כלל על ידי ניתוח להרחקת השחלות נמנעה בעכברים עם חסר בקולטן ל-GIP, מה שניתן להסביר חלקית על ידי הפחתה בצריכת מזון בגלל החסר ב-GIPR. התברר שעירוי לתוך המוח של NPY או הנוירופפטיד האורקסיגני Y, מעודד הפרשת GIP מתאי העצב, מה שרומז לכך ש-GIP פועל כמווסת שלילי של NPY, ועשוי לווסת צריכת מזון על ידי הכלבים המטופלים (Yavropoulou וחב' ב-Peptides משנת 2008). יחד עם זאת, יש לשקול בזהירות יתרה את ההערכה של תפקוד נוגד-השמנה של GIP במוח, כיוון שיש להורמון האחרון השפעה ישירה על רקמת השומן. יש גם להתחשב בהשפעה של ההורמון האינקרטיני האחר GLP-1 בהקשר של השפעתו על צריכת מזון ושובע באדם. בניגוד ל-GLP-1 המעכב התרוקנות הקיבה, נמצא של-GIP יש השפעה מועטה בלבד על התרוקנות הקיבה באדם ובעכברים (Meier וחב' ב-Am J Physiol Endocrinol Metab משנת 2004).

זאת ועוד, עכברי -/-ob/ob:GIPR עולים פחות במשקלם, הם בעלי רקמת שומן מצומצמת יותר, ומגיבים טוב יותר לעודף גלוקוזה, על ידי רגישות רבה יותר לאינסולין, בהשוואה לעכברי ob/ob. למרות שצריכת המזון דומה בין עכברי -/-GIPR לבין עכברי wild-type, כאשר מאכילים אותם במזון עתיר-שומן, עכברי -/-GIPR מוציאים יותר אנרגיה, ולכן הם משתמשים בשומן כמצע אנרגיה מועדף, ולפיכך נמנעת אגירת שומן באדיפוציטים שלהם. בעכברי ob/ob עירוי כרוני של אנטגוניסט לקולטן GIPR דוגמת Pro3)GIP) משפר את הסבילות לגלוקוזה, מגביר את הרגישות לאינסולין, ומתקן את ההיפרטרופיה של תאי הלבלב המושרית על ידי השמנת-יתר, כמו גם את ההיפרפלזיה של תאי β (על פי Gault וחב' ב-Diabetes משנת 2005).

יחד עם זאת, עכברי -/-GIPR שניזונו על דיאטת chow נורמאלית, מראים חוסר סבילות לגלוקוזה, והחדרה של Pro3)GIP) פוגעת בסבילות לגלוקוזה בעכברי wild-type (על פי Irwin וחב' ב-Biol Chem משנת 2004). בנוסף, שפעול של GIPR כרוך עם שיפור בסבילות לגלוקוזה, ומגביר הפרשת אינסולין במודלים של סוכרת בחיות. לכן, למרות שחולים בסוכרת type 2 עמידים באופן יחסי להשפעות האינסולינוֹ-טרופיות של החדרה אקסוגנית של GIP, ואין קשר ישיר בין השמנת-יתר ו-GIP בבני-אדם, יש לשקול את היתרונות היחסיים של שפעול לעומת עיכוב של GIPR, בכל ניסיון בעתיד לשימוש תרפויטי של GIP או של האנלוגים שלו.

התפקיד הפיזיולוגי של GIP בהצטברות שומן:

שומן מגביר באופן ניכר הפרשת GIP (על פי Carr וחב' ב-Am J Physiol Endocrinol Metab , ו-Thomsen וחב' ב-Am J Clin Nutr משנת 1999) וכמו כן רמות GIP מוגברות בחולי סוכרת type 2 כבדי משקל. קיים מתאם טוב בין רמות GIP בפלזמה לבין ריכוזי טריגליצרידים (Elliotte וחב' ב-J Endocrinol משנת 1993). הייתה השערה ש-GIP הוא בעל תפקיד פיזיולוגי בהצטברות שומן באדיפוציטים, ובתחילת שנות ה-80 נעשה ניסוי שהראה ש-GIP בנוכחות אינסולין משרה החדרה של חומצות שומן תוך בלוטות השמן בעקבי חולדות (Beck ו-Max ב-Regul Pept משנת 1983). כמו כן, כאשר בעכברים כבדי-משקל (ob/ob) כתוצאה מפגם בגן של leptin, מניפולציה גנטית של פגיעה ב-GIPR הביאה לא רק לשיפור של בעיית עודף המשקל על ידי הגברת "שריפת" אנרגיה, אלא גם הגבירה את הרגישות לאינסולין ואת הסבילות לגלוקוזה, ללא פגיעה קשה בהפרשת אינסולין (Zhang וחב' ב-Nature משנת 1994, וכן Vilsbøll וחב' ב-Diabetologia משנת 2002 ו-Yamada וחב' ב-Diabetes משנת 2006).

תצפיות אלו אושרו בעכברים שהוזנו בדיאטה עתירת-שומן וכן בעכברים שמנים ob/ob, שטופלו באנטגוניסט Pro3)GIP) של הקולטן ל-GIP (ע"פ Gault וחב' ב-Diabetologia משנת 2008, וכן Irwin וחב' באותו כתב עת משנת 2007), כמו גם בעכברים טרנסגניים החסרים תאי K מפרישי GIP (ע"פ Althage וחב' ב-J Biol Chem משנת 2008).

למרות ש-GIP נמצא מגביר את פעילות lipoprotein lipase, אנזים הקשור לממברנת תאים אדיפוציטים, ואשר תפקידו לבצע הידרוליזה של טריגליצרידים הקשורים לליפופרוטאין על מנת לייצר חומצות שומן, המנגנון המולקולארי דרכו GIP פועל על אדיפוציטים אינו ברור דיו. Kim וחב' דיווחו בשנת 2007 ב-J Biol Chem, שקישור GIP לקולטניו על פני תאי 3T3-L1 גורם להפרשה מוגברת של resistin במסלול הקשור ל-p38 MAPK ו-SAPK/JNK. אותם חוקרים הראו גם ש-GIP משפעל את PI3K ואת Akt/PKB על ידי הפרשת resistin, ועל ידי כך הוא מדכא את AMPK ומגביר את פעילות lipoprotein lipase וליפוגנזה באדיפוציטים.

ראוי לציין שאגוניסט אחר של GIPR, הידוע כ-(D-Ala2GIP(1-30 מראה פעילות דומה לזו של (1-42)GIP על התפקוד וההישרדות של תאי בתא, אך יש לו השפעה פחותה בהרבה על פעילות lipoprotein lipase בתאי 3T3-L1 (ע"פ Widenmaiser וחב' ב-PLoS ONE משנת 2010).

GIP ורקמת עצם:

האפשרות ש-GIP במטבוליזם של רקמת עצם הועלתה על ידי Tsukiyama וחב' ב-Mol Endocrinol משנת 2006, שהראו שלעכברים החסרים GIPR טרבקולות העצם (כפיסונים) דקות יותר מה שאופייני לאוסטיאופורוזיס. חוקרים אלה הדגימו על ידי אנליזה היסטו-פוטומטרית, שיצירת רקמת עצם בעכברים אלה ירודה יותר, ומספר האוסטיאוקלסטים גדול יותר כאופייני לתהליכי אוסטיאופורוזיס. כן הודגם in vitro במחקר זה ש-GIP מדכא תהליכי אפופטוזיס של אוסטיאובלסטים, מה שמרמז לאפשרות שגם in vivo יש ל-GIP תפקיד במניעת אפופטוזיס של אוסטיאובלסטים.

זאת ועוד, ההגברה של יצירת עצם על ידי GIP, כמנגנון של דיכויים של אוסטיאוקלסטים ומניעת אפופטוזיס של תאים אלה, הודגמה בעכברים טרנסגניים עם פגם בייצור GIP (ע"פ Ding וחב' ב-J Bone Miner Res משנת 2008, וכן Xie וחב' ב-Bone משנת 2007 ו-Zhong וחב' ב-Am J Physiol Endocrinol Metab משנת 2007).

ה-mRNA של GIP וההורמון עצמו מבוטאים בעצם הנורמאלית וכן בשורות תאים של אוסטיאובלסטים (Bollag וחב' ב-Endocrinology משנת 2000). נמצא ש-GIP מעודד הגברה ברמות של cAMP ושל יוני סידן תוך-תאי של אוסטיאובלסטים בתרבית, ושהשפעות אלה של GIP כרוכות בסמנים של יצירת רקמת עצם חדשה, כולל הגברת הפעילות של פוספטאזה בסיסית, ועלייה ברמת mRNA של קולאגן type 1. כן נמצא ש-GIP מגדיל את צפיפות העצם (BMD) בחולדות שעברו כריתת שחלות, המהוות מודל של אוסטיאופורוזיס בנשים בגיל חידלון הווסת (Bollag וחב' ב-Endocrinology משנת 2001). יתרה מכך, GIP עשוי לסייע לשקיעת סידן בעצם בתגובה לארוחה, שכן רמות סידן בפלזמה הוגברו בעכברים החסרים GIPR.

בהשוואה לעכברי ביקורת wild-type בני אותו גיל, מוצאים בעכברים טרנסגניים צעירים -/-GIPR מסת וגודל עצם נמוכים יותר, מיקרו-ארכיטקטורה בלתי-נורמאלית של העצם, תכונות ביו-מכאניות פגומות של העצם וכן שינוים במדדי ספיגה ובנייה מחדש של רקמת עצם (Xie וחב' ב-Bone משנת 2005). יחד עם זאת ככל שהעכברים מתבגרים ההבדלים המוזכרים בביולוגיה של העצם נעשים פחות מובהקים. היפוכו של דבר כאשר מסת העצם גדלה בעכברים טרנסגניים המייצרים GIP ביתר, בהשוואה לעכברי wild-type. בשנת 2007 דיווחו Zhong וחב' ב-Am J Physiol, על גילוי mRNA של GIPR ואת הקולטן עצמו בתאים אוסטיאוקלסטים של מכרסמים, כאשר החדרת GIP נמצאה מעכבת תהליכים של ספיגת עצם.

יתרה מכך, עכברי -/-GIPR מבוגרים הראו ירידות בפרמטרים של יצירת עצם כמו גם עליות ברמת סידן בפלזמה לאחר צריכת מזון, מה שמרמז לכך ש-GIPעשוי לספק קשר ישיר בין סידן במזון לבין שקיעת סידן בעצמות. יחד עם זאת, הוספה של GIP במינון גבוה, אין כדי לשנות את התחלופה בתהליכי ספיגה ובניה של רקמת עצם בניסויים ארוכי-טווח של GIP באדם (Henriksen וחב' ב-J Bone Miner Res משנת 2003). כללית, לא ברור אם מתן ארוך טווח של GIP יביא למודולציה של תהליכי ספיגה ובנייה מחדש של רקמת עצם באדם. למרות שממצאים אלה יכולים לרמז על כך שנשים בגיל חידלון הווסת עלולות להיות מועמדות לאוסטיאפורוזיס באופן חלקי בגלל תגובה מופחתת של GIP (על פי Ahren וחב' ב-Eur J Endocrinol משנת 1997) יהיה צורך לקבוע האם GIP הוא אמנם בעל תפקיד אוסטיאוגני באדם.

GIP ורקמות אחרות:

למרות ש-GIP מעכב בקיבה הפרשת חומצת קיבה, פעילות זו מושגת רק בריכוזים הגבוהים משמעותית מריכוזיו הפיזיולוגיים של הורמון זה (Nauck וחב' ב-Digestion משנת 1992). כמן כן נמצא ש-GIP מגביר את הטרנספורט של סוכרים במעי. בכבד, GIP מחליש יצירה של גלוקוזה המושרית על ידי glucagon, כנראה במנגנון בלתי-ישיר, שכן לא נמצאו עד כה קולטנים ל-GIP בכבד. GIP יכול לעודד פינוי של גלוקוזה התלויה באינסולין בבעלי חיים, אם כי השפעה זו לא נמצאה באדם. GIP יכול גם לעודד הפרשה של גלוקו-קורטיקואיד בחולדות דרך מסלול איתות התלוי ב-cAMP/PKA (על פי Mazzocchi וחב' ב-Peptides משנת 1999).

למרות שלא נראה ש-GIP מווסת הפרשה של קורטיזול בבני-אדם בריאים, ביטוי בלתי נורמאלי של GIPR באדנומות ממקור הקורטקס של האדרנל, כרוך בהתפתחות תסמונת Cushing תלויית-מזון (Lacroix וחב' ב-N Eng J Med משנת 1992). נצפה שקולטנים ל-GIP נמצאים גם באנדותליום הווסקולארי, ואמנם GIP מעודד הגברה של רמות סידן תוך-תאי בתרבית של תאי אנדותל (Zhong וחב' ב-Peptides משנת 2000). עירוי של GIP לכלבים משרה בהם הפרשה של endothelin-1 וכיווץ כלי-דם, או הפרשה של NO והרחבת כלי-דם, בתלות במערכת כלי הדם הרלוונטית. ההשפעות המנוגדות של GIP על כלי-דם שונים, מיוחסות לשונות בדרגת השפעול של מסלולי העברת האיתותים בסוגי תאי אנדותל שונים. למרות שמוצאים mRNA של GIPR גם ברקמת הלב, באשכים, בריאות ובמספר רקמות נוספות, הפעילות הפיזיולוגית של GIP ברקמות אלה אינה ברורה, אם בכלל.

שינויים ברמת GIP בתרחישים קליניים:

רמות מוגברות משמעותית של GIP בולטות לאחר עירוי גלוקוזה בחולים עם פנקראטיטיס. רמות מוגברות אלה ניתן למצוא גם בחולי סוכרת. רמה מוגברת שלGIP מוצאים בחולים עם VIPoma הידועה גם כתסמונת Verner-Morrison המאוד נדירה, בה תאי איי-לבלב שאינם תאי-β מייצרים VIP. לעומת זאת רמות GIP נמוכות יותר בטיפול בקלציטונין.
== הוראות לביצוע הבדיקה ==
יש להיות בצום של 10-12 שעות לפני נטילת הדם. תכשירים נוגדי חומציות קיבה (Antacids) או תרופות המשפיעות על תנועתיות המעי, או על הפרשת אינסולין יכולים להשפיע על תוצאות מדידת GIP, ולכן יש להפסיק נטילתם במידת האפשר לפחות לפרק זמן של 48 שעות לפני דגימת הדם. יש לדגום את הדם במבחנת הפארין (פקק ירוק) ולאחר סרכוז יש לאחסן את הפלזמה המופרדת בהקפאה במהירות האפשרית. דגימת הפלזמה יציבה בתנאי הקפאה למשל 6 חודשים. הבדיקה נעשית בשיטת RIA. יש לפסול דגימות שאינן פלזמה, או דגימות מופשרות ששהו זמן ממושך בטמפרטורת החדר. המדידה נעשית בשיטת RIA.

17 הידרוקסי-פרוגסטרון - 17OH progesterone

2015-08-16T12:06:56Z

בן עמי סלע:

== 17 הידרוקסי-פרוגסטרון - 17OH progesterone ==

כינויים נוספים: 17OHPG, 17αhydroxyprogesterone.

תחום: הערכת congenital adrenal hyperplasia או CAH; שיבושים בפעילות האדרנל, פגיעה בהתפתחות המינית והפריון.
טווח ערכים תקין (ביחידות של ננוגרם/דציליטר): דם טבורי-95-4,000; יילודים (גיל 3 ימים)-7-77; תינוקות שנולדו בעיתם עד גיל 28 יום-פחות מ-604; תינוקות שנולדו טרם-עת (preterm)-ערכי 17OHPG יכולים להיות מעל 604, אך ערכים מעל 1,000 בתינוקות preterm אינם שכיחים; הערכים של הורמון זה דועכים מ-604 לערכים המקובלים בגיל 9-12 שנה ולפני ההתבגרות המינית (prepubertal) תוך 6 חודשים.

הערכים בזכרים בגיל 10-13-פחות מ-110; הערכים בזכרים בוגרים-פחות מ-220. הערכים בנערות בגיל 9-12 (prepubertal)-פחות מ-100; בנשים בוגרות בשלב המחזור החודשי הפוליקולארי לפני הביוץ-פחות מ-80; ובשלב הלוטאלי שלאחר הביוץ-פחות מ- 285 (רמה מוגברת של 17OHPG בשלב הלוטאלי משקפת פעילות של ה-corpus luteum); בנשים בגיל חידלון הווסת-פחות מ-60; ואילו בנשים הרות רמות ההורמון היא בטווח של 200-1,000. רמת 17OHPG במהלך המחזור החודשי עולה משמעותית יום אחד לפני השיא ברמת luteinizing hormone.

רמות 17OHPG בנשים הרות (על פי Saldin וחב' ב-Fertil Steril משנת 2005) הם כדלקמן: בטרימסטר הראשון 134±9; בטרימסטר השני-230±12; בטרימסטר השלישי-351±18 ; בנשים שנה לאחר הלידה-40±6.
יוצר הערך: פרופ' בן-עמי סלע.

== בסיס פיזיולוגי ==

17hydroxy progesterone (להלן 17OHPG) הוא הורמון סטרואידי הנוצר מכולסטרול והוא חלק מהמסלול המביא ליצירת ההורמון קורטיזול.

(להכניס כאן את נוסחת 17 הידרוקסיפרוגסטרון).

17OHPG מיוצר בבלוטות האדרנל, בשחלות באשכים ואף בשלייה. הידרוקסילציה שלו בעמדות 11 ו-21 מביאה ליצירת קורטיזול. חסר של אחד משני ההידרוקסילזות יגרום לסינתזה מופחתת של קורטיזול, והפרשת ACTH המעוכבת במצב פיזיולוגי תקין על ידי פעולת משוב (feedback), מתגברת, מה שגורם בעקיפין שגשוג (היפרפלזיה) של בלוטות האדרנל. ההגברה המתקבלת בהפרשת ACTH על ידי ההיפופיזה, מגבירה את יצירת 17OHPG. אך אם יש חסר באנזים 17αhydroxylase המייצר 17OHPG מפרוגסטרון, או חסר באנזים 3βhydroxysteroid dehydrogenase type 2 המייצר 17OHPG מ-17-hydroxypregnenolone, רמות 17OHPG נמוכות עם עליה אפשרית ברמות פרוגסטרון ו-pregnenolone, בהתאמה.

התרחיש המולד של CAH מביא ליצירה מופחתת של קורטיזול ואלדוסטרון באדרנל, ובדיעבד ליצירה מוגברת של האנדרוגנים, או הורמוני המין הגבריים.17OHPG מסייע לפירוק של חלבונים, למטבוליזם של גלוקוזה וליפידים, מסייע לייצב את לחץ הדם, ומווסת את מערכת החיסון. בלוטות האדרנל מייצרות גם הורמונים סטרואידים אחרים, כמו אלדוסטרון, המסייע בוויסות רמות המלח בגוף כמו גם את לחץ הדם, וכן מייצרות בלוטות האדרנל אנדרוגנים שבדומה לטסטוסטרון משפיעים על מאפיינים מיניים של הגבר, במקביל להשפעות פיזיולוגיות נוספות.

מספר אנזימים נחוצים להשלים את השלבים של יצירת קורטיזול. אם אחד או יותר מהאנזימים הללו חסר או שתפקודו לקוי, כך תיווצרנה רמות לא תקינות של קורטיזול, כמו שקורה ב-CAH. הסיבה השכיחה ביותר האחראית לכ-90% מהמקרים של CAH היא חסר באנזים 21hydroxylase, כתוצאה ממוטציות בגן CYP21A2 (הידוע גם כ-P450c1).

(להכניס כאן את הטבלה מתחתיה מופיע...מערכת הריאקציות בבלוטות יותרת הכליה...)

מבחן 17OHPG, מתבצע באופן שגרתי כחלק מבדיקות סקר-יילודים לגילוי congenital adrenal hyperplasia או CAH הנגרמת כתוצאה מחסר באנזים 21hydroxylase. בדיקה זו יכולה להיות מוזמנת לעתים בילדים מבוגרים יותר או במבוגרים כאשר יש חשד לצורה היותר מתונה (late-onset) של CAH. הבדיקה יכולה להתבצע כאשר בילדה או באישה מופיעים תסמינים שיכולים לנבוע מ-CAH, או מתרחיש אחר כגון PCOS. תסמונות אלה יכולים לכלול: שעירות יתר של הפנים וחלקי גוף אחרים (hirsutism); חסר במחזור או אי-סדירותו; התפתחות של מאפיינים מיניים זכריים; אי-פריון.
יצירת 17OHPG יכולה להיות ממקור של פרוגסטרון על ידי האנזים 17hydroxylase, שהוא למעשה האנזים הציטוכרומי P450c17, או ממקור 17hydroxypregnenolone, על ידי האנזים 3β-hydroxysteroid dehydrogenase/Δ5-4 isomerase. יש לציין שיצירת הסטרואיד 17OHPG גדלה בטרימסטר ה-3 של ההיריון בעיקר בגלל יצירתו בבלוטת האדרנל של העובר. סטרואיד זה כאמור נוצר בעיקר בבלוטות האדרנל, אך במידה מסוימת גם בבלוטות המין (gonads), ובאופן ספציפי ב-corpus luteum בשחלות. כמות מסוימת נוצרת גם בשלייה.

מטרת מדידת 17OHPG:

השימוש העיקרי במדידת 17OHPG הוא לאשש או לשלול CAH בתינוקות הנולדים עם אברי מין חיצוניים שאינם תואמים את אלה האופייניים לתינוקות זכרים או נקבות. מדידת הורמון זה משמשת גם לזיהוי אנשים עם הצורה המתונה והלא-קלאסית של adrenal hyperplasia. בדיקה זו תתבקש גם במקרים של נשים ונערות עם שעירות-יתר בחלקי גוף בהם לא מופיעה שעירות בנשים, או עם עיבוי קול, או הגדלת מסת השריר. לעתים תידרש בדיקה זו כאשר יש סיפור משפחתי של CAH, גם אם בנבדק עצמו אין תסמינים מובהקים המחשידים ל-CAH. בדיקה זו מקובלת בבנים/נערים עם התפתחות מינית בגיל צעיר מהמקובל. יש שבדיקה זו נדרשת במסגרת פנל של בדיקות נוספות להערכת תפקוד בלוטות יותרת הכליה.

מדידת רמות של 17OHPG שימושית להערכה של מטופלים עם חשד ל-CAH כתוצאה מפגם בשני האנזימים, 21hydroxylase ו-11βhydroxylase מה שמביא לעלייה ברמת 17OHPG. לעומת זאת, במקרה הנדיר של נבדק עם פגם או חסר של האנזים 17αhydroxylase, רמת 17OHPG תהיה נמוכה ביותר או אפילו לא ניתנה לגילוי. מדידת רמות 17OHPG יכולה לשמש גם למדידת התרומה של פעילות פרוגסטרונאלית של ה-corpus luteum בעת ההיריון, שכן פרוגסטרון, אך לא 17OHPG נתרם גם כן על ידי השלייה.

בנבדק שאובחן עם חסר באנזים 21hydroxylase מדידת רמות 17OHPG תתבקש בפרקי זמן קצובים על מנת לנטר את יעילות הטיפול בו. בנוסף למדידת 17OHPG יש לבצע במקביל מדידה של רמות קורטיזול ו-androstenedione.

מדידת 17OHPG בדם באה במקום ביצוע מדידת pregnanetriol בשתן, כבדיקת הסקר הטובה יותר לאבחון CAH. במטופלים עם תסמונת זו ניתן גם למצוא רמה מוגברת של 17ketosteroides, ומדידה של רמת 11deoxycortisol עשויה לסייע להבדיל בין חסר ב-11β ו-21hydroxylase.

מדידת רמת 17OHPG יכולה לעתים לשמש יחד עם בדיקות הורמונאליות נוספות לסייע בשלילת CAH בנשים עם מאפיינים כגון שעירות-יתר בפנים ובגוף, ומחזורים בלתי סדירים. בכך נכללות נשים עם חשד לתסמונת שחלות פוליציסטיות (PCOS) ואי-פריון, ולעתים רחוקות יותר בנשים עם חשד לסרטן באדרנל או בשחלות (על פי Sciarra וחב' ב-Minerva Endocrinol משנת 1995).

תסמונת CAH עם חסר של 21hydroxylase מורשת בצורה חמורה או בצורה מתונה:

תסמונת CAH נגרמת על ידי פגמים מולדים בביוסינתזה של סטרואידים. התוצאה של אי-איזון הורמונאלי עם רמות מופחתות של גלוקו-קורטיקו-סטרואידים ומינראלו-קורטיקואידים ולעומתם רמות מוגברות של 17OHPG ושל אנדרוגנים עלולים לגרום למצבי חמורים של פגיעה במאזן המלחים (כתוצאה מפגיעה ביצירת אלדוסטרון), התייבשות והלם מסכני-חיים ביילודים בתקופה המיידית שלאחר הלידה, ולמפגעים של פגיעה בזיהוי מגדרי ושיבושים בהתפתחות המינית בגיל מאוחר יותר, בעיקר בנקבות.

מספר צורות חמורות של תסמונת זו (הידועה גם כתסמונת אדרנו-גניטלית) גורמות לתינוקות להיוולד עם חסר משמעותי של אלדוסטרון וקורטיזול באופן המחייב תשומת לב רפואית. צורה חמורה זו לעתים תכופות מתגלה במהלך סקר יילודים שגרתי, או כבר בחודשי הילדות הראשונים (Therrell ב-Endocrinol Metab Clin North Am משנת 2001). אם התסמונת אינה מתגלה בסקר יילודים, ברוב המקרים היא מופיעה עם תסמינים כגון הקאות, אדישות, לתרגיה, אכילה לא מאוזנת, כשל שגשוגי (FTT), נטייה להתייבשות, ולחץ-דם נמוך. בנשים, עודף של אנדרוגנים עלול לגרום להתפתחות אברי-מין זכריים (virilization) וחטטת (acne), ואמנם בתינוקות של המין הנשי עם פגם זה מוצאים אברי מין שאינם בירור נשיים או זכריים (ambiguous genitalia), העלולים אף להקשות על קביעת מינן. גברים עם פגם זה, נראים נורמאליים בלידה, אך עלולים לפתח מאפיינים מיניים טרם-עת (Von Schnaken וחב' ב-Eur J Pediatr משנת 1980).

(להכניס כאן את הטבלה על ויריליזציה)

צורת התסמונת המתונה יותר אם כי השכיחה יותר, יכולה להופיע כתוצאה מחסר חלקי ב-21hydroxylase. בצורת תסמונת מתונה יותר המוגדרת לעתים כ-late onset או כ-CAH לא-קלאסית, התסמינים יכולים להופיע בשלב מאוחר יותר כשנות הילדות, או שנות העֶשרֶה (adolescent) או אפילו בשנים הבוגרות (Bachega וחב' ב-Clin Endocrinol משנת 2000). התסמינים יכולים להיות מעורפלים, והתפתחותם יכולה להיות איטית עם השנים, תוך שהם שונים בין נושאי הפגם המתון. למרות שהצורה המתונה של CAH אינה מסכנת חיים, היא עלולה לגרום לבעיות בגדילה, בהתפתחות, ובהתבגרות מינית מוקדמת, שעלולה לגרום לאי-פריון במבוגרים (על פי Collett-Solberg ב-Clin Pediatr משנת 2001).

האבחון ועוד יותר מכך האבחון המבדיל של CAH דורש תמיד מדידת רמתם של מספר סטרואידים. במטופלים עם CAH כתוצאה ממוטציות בגן CYP21A2, מוצאים בדרך כלל רמות מאוד גבוהות של androstenedione (לרוב עלייה של פי 5-10 ברמתו). הרמות של 17OHPG הן בדרך כלל אף גבוהות יותר, ואילו רמות קורטיזול נמוכות אן אף לא ניתנות לגילוי. במוטציה הנדירה יחסית של הגן CYP11A1, רמות androstenedione מוגברות באותה מידה כמו במוטציה ב-CYP21A2, וגם רמת קורטיזול נמוכה, אך רמת 17OHPG מוגברת רק במידה מועטה אם בכלל.

המטרה של טיפול במקרים של CAH, היא לגרום לנורמליזציה של רמות קורטיזול, ובאופן אידיאלי גם של רמות סטרואידי המין. באופן מסורתי נמדדות רמת 17OHPG בדם, כמו גם רמות pregnanetriol וקטו-סטרואידים אחרים המופרשים בשתן, כדי לכוון את הטיפול בגלוקו-קורטיקוסטרואידים, אך מבדקים אלה תואמים רק באופן מתון את רמות האנדרוגן. לכן, יש למדוד גם את רמות טסטוסטרון ו-androstenedione. קשה אמנם להביא לרמות האנדרוגן של התקופה של קדם ההתפתחות המינית (prepubertal), אך אם רמות טסטוסטרון הן בתחום הערכים התקינים, רמות androstenedione של עד 100 ננוגרם/דציליטר, מקובלות בדרך כלל כרצויות.

רוב המקרים של CAH (כ-90%), נובעים ממוטציות בגן הסטרואידי 21hydroxylase או CYP21A2, שניתן למדוד על ידי הגברה ברמת 17OHPG ו-androstenedione והפחתה ברמת קורטיזול. לעומת זאת, בשתי הצורות הפחות שכיחות של CAH הנובעות מחסר באנזימים 17hydroxylase ו-11hydroxylase, אין עליה משמעותית ברמות 17OHPG ו-androstenedione, ולכן מדידת רמת פרוגסטרון, כמו גם רמת deoxycorticosterone, חיונית לצורך אבחון (Speiser וחב' ב-J Clin Endocrinol Metabol משנת 2010).

מדידת 17OHPG עלולה לתת לעתים תוצאות חיוביות-כזובות (false positive). אם רמת הורמון זה אינה מוגברת באופן גבוה במיוחד שהוא אבחנתי לתרחיש CAH, מבדק נוספים צריכים להתבצע כמו מדידת androstenedione וטסטוסטרון. ניתן גם לבצע בדיקת ACTH stimulation test, שכן סטימולציה של ACTH תגרום לעלייה ניכרת ברמת 17OHPG (על פי Chrousos וחב' ב-Ann Intern Med משנת 1982). ניתן לבצע גם מבדק גנטי-מולקולארי לגילוי מוטציות בגן CYP21A2. אפשרות נוספת היא בדיקת karyotype לגילוי פגם כרומוזומאלי, וכן לסייע בקביעת מינו של התינוק/ת. מבדק אחר בעל משמעות מסייעת, היא מדידת אלקטרוליטים לקביעת רמות נתרן ואשלגן שעלולות להשתבש ב-CAH.

חסר באנזים 11hydroxylase מעלה את רמת 17OHPG באופן מתון יותר מחסר ב-21hydroxylase, אך ניתן גם למדוד את רמת 11desoxycortisol (הידוע גם כ-substance S) בנסיוב, על מנת להבדיל טוב יותר בין החסרים ב-2 האנזימים.

משמעות תוצאות בדיקת 17OHPG:

תוצאות תקינות של 17OHPG משמעותן שלנבדק אין CAH כתוצאה מחסר האנזים 21hydroxylase. רמות נמוכות או במגמת ירידה של 17OHPG במי שמאובחן עם CAH, מצביעות על תגובה חיובית לטיפול, בעוד שרמות גבוהות או כאלה בקו-עליה של 17OHPG מצביעות על טיפול לא יעיל.

כאשר ביילוד או בתינוק מתקבלת תוצאה גבוהה משמעותית של 17OHPG בסדר גודל של 2,000-40,000 ננוגרם/מ"ל, יש סבירות שמדובר ב-CAH. אם באדם בוגר מתקבלת תוצאה מוגברת באופן מתון של הורמון זה (רמות מעל 200 ננוגרם/מ"ל), נראה שהוא סובל מהצורה המתונה הלא-קלאסית של CAH, או שיש לו חסר באנזים hydroxylaseβ11. רמות גבוהות של 17OHPG בבוגרים יכולות להצביע על גידול או על היפרפלזיה של בלוטות האדרנל. בבוגרים עם רמות 17OHPG של 200-800 ננוגרם/מ"ל, יש סבירות בביצוע מדידה של רמת ACTH. בגברים רמת 17OHPG נמוכה ב-male pseudohermaphrodites, עם חסר של 17αhydroxylase או CYPc17, וכן במחלת אדיסון.

ליילודים טרם-עת (פגים) יש ברוב המקרים רמות 17OHPG גבוהות. לכן יש צורך לחזור על בדיקת סקר היילודים במועד מאוחר יותר. לעתים נדירות יש צורך לבצע את מדידת רמת 17OHPG במי השפיר, כדי לגלות ולטפל ב-CAH של העובר בעת ההיריון. רמת 17OHPG במי שפיר בשבוע ה-12 עד 19 להיריון היא 0.4-2.5 ננוגרם/מ"ל, ורמתו במי-שפיר עם הלידה 0.3-0.6 ננוגרם/מ"ל.

בעת הלידה יש שפעול של הציר היפותאלאמוס-היפופיזה-בלוטות האדרנל כמו גם של הציר היפותאלאמוס-היפופיזה-בלוטות המין, וכך גבוהה רמתם של הסטרואידים ממקור אדרנל ובלוטות המין. בפגים, רמות אלה יכולות להיות מוגברות אף יותר כתוצאה מהעקה של תהליך הלידה לגבי יילוד טרם-עיתו. לכן רמות 17OHPG בפגים יכולות להגיע עד 1,000 ננוגרם/דציליטר, בעוד שרמות הורמון זה ביילודים בעיתם לא תעלה מעל 604 ננוגרם/דציליטר.

בתרחיש של חסר מאוד נדיר של 17α-hydroxylase, מוצאים רמות נמוכות של androstenedione, כמו גם של כל הקודמנים של אנדרוגן (17αhydroxypregnenolone וכן 17OHPG ו-dehydroepiandrosterone), אנדרוגנים כגון טסטוסטרון, estrone ו-estradiol, וכן קורטיזול, ולעומת זאת מוגברת יצירתם של קורטיקואיד מינראלי והקודמנים שלו (בעיקר פרוגסטרון, 11deoxycorticosterone ו-18deoxycorticisterone).

17OHPG קשור בדם הן ל-corticosteroid binding globulin וכן לאלבומין, והמדידה קובעת למעשה את סך רמת 17OHPG החופשי והקשור. בהמשך המסלול הפיזיולוגי שלו, 17OHPG מותמר ל-pregnanetriol, שעובר קוניוגציה ומופרש בשתן.

== הוראות לביצוע הבדיקה ==

כיוון שרמות 17OHPG משתנות באופן צירקדיאלי לאורך שעות היממה, מקובל לדגום את הדם בין השעות 0600-0800 באופן עקבי. אין צורך בהכנות מיוחדות דוגמת צום, אך יש לקחת בחשבון שנטילת קורטיקוסטרואידים וכן גלולות למניעת הריון, עלולה להשפיע על תוצאות מדידת 17OHPG. במקרה של נשים בגיל הפוריות, על מנת לשמור על עקביות במקרה של נטילת דם למספר בדיקות במהלך תקופה אחת, יש ליטול הדם באותה נקודת זמן בעת המחזור החודשי. דגימת הדם יכולה להילקח במבחנה כימית (פקק אדום או צהוב), גם במבחנת ספירת-דם (EDTA, פקק סגלגל) או מבחנת ליתיום הפארין (פקק ירוק). בטמפרטורת החדר יציבות הבדיקה היא עד 48 שעות, בקירור עד 7 ימים, ובהקפאה עד 6 חודשים.

בעבר נהוג היה למדוד רמות 17OHPG ב-immunoassays דוגמת RIA או ב-immunoradiometric assay או IRMA. כיום מודדים את ההורמון הזה בשיטות של גאז-כרומטוגרפיה או ב-liquid chromatography משולבת ב-mass spectrometry (דהינו LC-MS/MS).

17 הידרוקסי-פרוגסטרון - 17OH progesterone

2015-08-16T12:05:09Z

בן עמי סלע:

== 17 הידרוקסי-פרוגסטרון - 17OH progesterone ==

כינויים נוספים: 17OHPG, 17αhydroxyprogesterone.

תחום: הערכת congenital adrenal hyperplasia או CAH; שיבושים בפעילות האדרנל, פגיעה בהתפתחות המינית והפריון.
טווח ערכים תקין (ביחידות של ננוגרם/דציליטר): דם טבורי-95-4,000; יילודים (גיל 3 ימים)-7-77; תינוקות שנולדו בעיתם עד גיל 28 יום-פחות מ-604; תינוקות שנולדו טרם-עת (preterm)-ערכי 17OHPG יכולים להיות מעל 604, אך ערכים מעל 1,000 בתינוקות preterm אינם שכיחים; הערכים של הורמון זה דועכים מ-604 לערכים המקובלים בגיל 9-12 שנה ולפני ההתבגרות המינית (prepubertal) תוך 6 חודשים.

הערכים בזכרים בגיל 10-13-פחות מ-110; הערכים בזכרים בוגרים-פחות מ-220. הערכים בנערות בגיל 9-12 (prepubertal)-פחות מ-100; בנשים בוגרות בשלב המחזור החודשי הפוליקולארי לפני הביוץ-פחות מ-80; ובשלב הלוטאלי שלאחר הביוץ-פחות מ- 285 (רמה מוגברת של 17OHPG בשלב הלוטאלי משקפת פעילות של ה-corpus luteum); בנשים בגיל חידלון הווסת-פחות מ-60; ואילו בנשים הרות רמות ההורמון היא בטווח של 200-1,000. רמת 17OHPG במהלך המחזור החודשי עולה משמעותית יום אחד לפני השיא ברמת luteinizing hormone.

רמות 17OHPG בנשים הרות (על פי Saldin וחב' ב-Fertil Steril משנת 2005) הם כדלקמן: בטרימסטר הראשון 134±9; בטרימסטר השני-230±12; בטרימסטר השלישי-351±18 ; בנשים שנה לאחר הלידה-40±6.
יוצר הערך: פרופ' בן-עמי סלע.

== בסיס פיזיולוגי ==

17hydroxy progesterone (להלן 17OHPG) הוא הורמון סטרואידי הנוצר מכולסטרול והוא חלק מהמסלול המביא ליצירת ההורמון קורטיזול.

(להכניס כאן את נוסחת 17 הידרוקסיפרוגסטרון).

17OHPG מיוצר בבלוטות האדרנל, בשחלות באשכים ואף בשלייה. הידרוקסילציה שלו בעמדות 11 ו-21 מביאה ליצירת קורטיזול. חסר של אחד משני ההידרוקסילזות יגרום לסינתזה מופחתת של קורטיזול, והפרשת ACTH המעוכבת במצב פיזיולוגי תקין על ידי פעולת משוב (feedback), מתגברת, מה שגורם בעקיפין שגשוג (היפרפלזיה) של בלוטות האדרנל. ההגברה המתקבלת בהפרשת ACTH על ידי ההיפופיזה, מגבירה את יצירת 17OHPG. אך אם יש חסר באנזים 17αhydroxylase המייצר 17OHPG מפרוגסטרון, או חסר באנזים 3βhydroxysteroid dehydrogenase type 2 המייצר 17OHPG מ-17-hydroxypregnenolone, רמות 17OHPG נמוכות עם עליה אפשרית ברמות פרוגסטרון ו-pregnenolone, בהתאמה.

התרחיש המולד של CAH מביא ליצירה מופחתת של קורטיזול ואלדוסטרון באדרנל, ובדיעבד ליצירה מוגברת של האנדרוגנים, או הורמוני המין הגבריים.17OHPG מסייע לפירוק של חלבונים, למטבוליזם של גלוקוזה וליפידים, מסייע לייצב את לחץ הדם, ומווסת את מערכת החיסון. בלוטות האדרנל מייצרות גם הורמונים סטרואידים אחרים, כמו אלדוסטרון, המסייע בוויסות רמות המלח בגוף כמו גם את לחץ הדם, וכן מייצרות בלוטות האדרנל אנדרוגנים שבדומה לטסטוסטרון משפיעים על מאפיינים מיניים של הגבר, במקביל להשפעות פיזיולוגיות נוספות.

מספר אנזימים נחוצים להשלים את השלבים של יצירת קורטיזול. אם אחד או יותר מהאנזימים הללו חסר או שתפקודו לקוי, כך תיווצרנה רמות לא תקינות של קורטיזול, כמו שקורה ב-CAH. הסיבה השכיחה ביותר האחראית לכ-90% מהמקרים של CAH היא חסר באנזים 21hydroxylase, כתוצאה ממוטציות בגן CYP21A2 (הידוע גם כ-P450c1).

(להכניס כאן את הטבלה מתחתיה מופיע...מערכת הריאקציות בבלוטות יותרת הכליה...)

מבחן 17OHPG, מתבצע באופן שגרתי כחלק מבדיקות סקר-יילודים לגילוי congenital adrenal hyperplasia או CAH הנגרמת כתוצאה מחסר באנזים 21hydroxylase. בדיקה זו יכולה להיות מוזמנת לעתים בילדים מבוגרים יותר או במבוגרים כאשר יש חשד לצורה היותר מתונה (late-onset) של CAH. הבדיקה יכולה להתבצע כאשר בילדה או באישה מופיעים תסמינים שיכולים לנבוע מ-CAH, או מתרחיש אחר כגון PCOS. תסמונות אלה יכולים לכלול: שעירות יתר של הפנים וחלקי גוף אחרים (hirsutism); חסר במחזור או אי-סדירותו; התפתחות של מאפיינים מיניים זכריים; אי-פריון.
יצירת 17OHPG יכולה להיות ממקור של פרוגסטרון על ידי האנזים 17hydroxylase, שהוא למעשה האנזים הציטוכרומי P450c17, או ממקור 17hydroxypregnenolone, על ידי האנזים 3β-hydroxysteroid dehydrogenase/Δ5-4 isomerase. יש לציין שיצירת הסטרואיד 17OHPG גדלה בטרימסטר ה-3 של ההיריון בעיקר בגלל יצירתו בבלוטת האדרנל של העובר. סטרואיד זה כאמור נוצר בעיקר בבלוטות האדרנל, אך במידה מסוימת גם בבלוטות המין (gonads), ובאופן ספציפי ב-corpus luteum בשחלות. כמות מסוימת נוצרת גם בשלייה.

מטרת מדידת 17OHPG:

השימוש העיקרי במדידת 17OHPG הוא לאשש או לשלול CAH בתינוקות הנולדים עם אברי מין חיצוניים שאינם תואמים את אלה האופייניים לתינוקות זכרים או נקבות. מדידת הורמון זה משמשת גם לזיהוי אנשים עם הצורה המתונה והלא-קלאסית של adrenal hyperplasia. בדיקה זו תתבקש גם במקרים של נשים ונערות עם שעירות-יתר בחלקי גוף בהם לא מופיעה שעירות בנשים, או עם עיבוי קול, או הגדלת מסת השריר. לעתים תידרש בדיקה זו כאשר יש סיפור משפחתי של CAH, גם אם בנבדק עצמו אין תסמינים מובהקים המחשידים ל-CAH. בדיקה זו מקובלת בבנים/נערים עם התפתחות מינית בגיל צעיר מהמקובל. יש שבדיקה זו נדרשת במסגרת פנל של בדיקות נוספות להערכת תפקוד בלוטות יותרת הכליה.

מדידת רמות של 17OHPG שימושית להערכה של מטופלים עם חשד ל-CAH כתוצאה מפגם בשני האנזימים, 21hydroxylase ו-11βhydroxylase מה שמביא לעלייה ברמת 17OHPG. לעומת זאת, במקרה הנדיר של נבדק עם פגם או חסר של האנזים 17αhydroxylase, רמת 17OHPG תהיה נמוכה ביותר או אפילו לא ניתנה לגילוי. מדידת רמות 17OHPG יכולה לשמש גם למדידת התרומה של פעילות פרוגסטרונאלית של ה-corpus luteum בעת ההיריון, שכן פרוגסטרון, אך לא 17OHPG נתרם גם כן על ידי השלייה.

בנבדק שאובחן עם חסר באנזים 21hydroxylase מדידת רמות 17OHPG תתבקש בפרקי זמן קצובים על מנת לנטר את יעילות הטיפול בו. בנוסף למדידת 17OHPG יש לבצע במקביל מדידה של רמות קורטיזול ו-androstenedione.

מדידת 17OHPG בדם באה במקום ביצוע מדידת pregnanetriol בשתן, כבדיקת הסקר הטובה יותר לאבחון CAH. במטופלים עם תסמונת זו ניתן גם למצוא רמה מוגברת של 17ketosteroides, ומדידה של רמת 11deoxycortisol עשויה לסייע להבדיל בין חסר ב-11β ו-21hydroxylase.

מדידת רמת 17OHPG יכולה לעתים לשמש יחד עם בדיקות הורמונאליות נוספות לסייע בשלילת CAH בנשים עם מאפיינים כגון שעירות-יתר בפנים ובגוף, ומחזורים בלתי סדירים. בכך נכללות נשים עם חשד לתסמונת שחלות פוליציסטיות (PCOS) ואי-פריון, ולעתים רחוקות יותר בנשים עם חשד לסרטן באדרנל או בשחלות (על פי Sciarra וחב' ב-Minerva Endocrinol משנת 1995).

תסמונת CAH עם חסר של 21hydroxylase מורשת בצורה חמורה או בצורה מתונה:

תסמונת CAH נגרמת על ידי פגמים מולדים בביוסינתזה של סטרואידים. התוצאה של אי-איזון הורמונאלי עם רמות מופחתות של גלוקו-קורטיקו-סטרואידים ומינראלו-קורטיקואידים ולעומתם רמות מוגברות של 17OHPG ושל אנדרוגנים עלולים לגרום למצבי חמורים של פגיעה במאזן המלחים (כתוצאה מפגיעה ביצירת אלדוסטרון), התייבשות והלם מסכני-חיים ביילודים בתקופה המיידית שלאחר הלידה, ולמפגעים של פגיעה בזיהוי מגדרי ושיבושים בהתפתחות המינית בגיל מאוחר יותר, בעיקר בנקבות.

מספר צורות חמורות של תסמונת זו (הידועה גם כתסמונת אדרנו-גניטלית) גורמות לתינוקות להיוולד עם חסר משמעותי של אלדוסטרון וקורטיזול באופן המחייב תשומת לב רפואית. צורה חמורה זו לעתים תכופות מתגלה במהלך סקר יילודים שגרתי, או כבר בחודשי הילדות הראשונים (Therrell ב-Endocrinol Metab Clin North Am משנת 2001). אם התסמונת אינה מתגלה בסקר יילודים, ברוב המקרים היא מופיעה עם תסמינים כגון הקאות, אדישות, לתרגיה, אכילה לא מאוזנת, כשל שגשוגי (FTT), נטייה להתייבשות, ולחץ-דם נמוך. בנשים, עודף של אנדרוגנים עלול לגרום להתפתחות אברי-מין זכריים (virilization) וחטטת (acne), ואמנם בתינוקות של המין הנשי עם פגם זה מוצאים אברי מין שאינם בירור נשיים או זכריים (ambiguous genitalia), העלולים אף להקשות על קביעת מינן. גברים עם פגם זה, נראים נורמאליים בלידה, אך עלולים לפתח מאפיינים מיניים טרם-עת (Von Schnaken וחב' ב-Eur J Pediatr משנת 1980).

(להכניס כאן את הטבלה על ויריליזציה)

צורת התסמונת המתונה יותר אם כי השכיחה יותר, יכולה להופיע כתוצאה מחסר חלקי ב-21hydroxylase. בצורת תסמונת מתונה יותר המוגדרת לעתים כ-late onset או כ-CAH לא-קלאסית, התסמינים יכולים להופיע בשלב מאוחר יותר כשנות הילדות, או שנות העֶשרֶה (adolescent) או אפילו בשנים הבוגרות (Bachega וחב' ב-Clin Endocrinol משנת 2000). התסמינים יכולים להיות מעורפלים, והתפתחותם יכולה להיות איטית עם השנים, תוך שהם שונים בין נושאי הפגם המתון. למרות שהצורה המתונה של CAH אינה מסכנת חיים, היא עלולה לגרום לבעיות בגדילה, בהתפתחות, ובהתבגרות מינית מוקדמת, שעלולה לגרום לאי-פריון במבוגרים (על פי Collett-Solberg ב-Clin Pediatr משנת 2001).

האבחון ועוד יותר מכך האבחון המבדיל של CAH דורש תמיד מדידת רמתם של מספר סטרואידים. במטופלים עם CAH כתוצאה ממוטציות בגן CYP21A2, מוצאים בדרך כלל רמות מאוד גבוהות של androstenedione (לרוב עלייה של פי 5-10 ברמתו). הרמות של 17OHPG הן בדרך כלל אף גבוהות יותר, ואילו רמות קורטיזול נמוכות אן אף לא ניתנות לגילוי. במוטציה הנדירה יחסית של הגן CYP11A1, רמות androstenedione מוגברות באותה מידה כמו במוטציה ב-CYP21A2, וגם רמת קורטיזול נמוכה, אך רמת OHPG17מוגברת רק במידה מועטה אם בכלל.

המטרה של טיפול במקרים של CAH, היא לגרום לנורמליזציה של רמות קורטיזול, ובאופן אידיאלי גם של רמות סטרואידי המין. באופן מסורתי נמדדות רמת 17OHPG בדם, כמו גם רמות pregnanetriol וקטו-סטרואידים אחרים המופרשים בשתן, כדי לכוון את הטיפול בגלוקו-קורטיקוסטרואידים, אך מבדקים אלה תואמים רק באופן מתון את רמות האנדרוגן. לכן, יש למדוד גם את רמות טסטוסטרון ו-androstenedione. קשה אמנם להביא לרמות האנדרוגן של התקופה של קדם ההתפתחות המינית (prepubertal), אך אם רמות טסטוסטרון הן בתחום הערכים התקינים, רמות androstenedione של עד 100 ננוגרם/דציליטר, מקובלות בדרך כלל כרצויות.

רוב המקרים של CAH (כ-90%), נובעים ממוטציות בגן הסטרואידי 21hydroxylase או CYP21A2, שניתן למדוד על ידי הגברה ברמת 17OHPG ו-androstenedione והפחתה ברמת קורטיזול. לעומת זאת, בשתי הצורות הפחות שכיחות של CAH הנובעות מחסר באנזימים 17hydroxylase ו-11hydroxylase, אין עליה משמעותית ברמות 17OHPG ו-androstenedione, ולכן מדידת רמת פרוגסטרון, כמו גם רמת deoxycorticosterone, חיונית לצורך אבחון (Speiser וחב' ב-J Clin Endocrinol Metabol משנת 2010).

מדידת 17OHPG עלולה לתת לעתים תוצאות חיוביות-כזובות (false positive). אם רמת הורמון זה אינה מוגברת באופן גבוה במיוחד שהוא אבחנתי לתרחיש CAH, מבדק נוספים צריכים להתבצע כמו מדידת androstenedione וטסטוסטרון. ניתן גם לבצע בדיקת ACTH stimulation test, שכן סטימולציה של ACTH תגרום לעלייה ניכרת ברמת 17OHPG (על פי Chrousos וחב' ב-Ann Intern Med משנת 1982). ניתן לבצע גם מבדק גנטי-מולקולארי לגילוי מוטציות בגן CYP21A2. אפשרות נוספת היא בדיקת karyotype לגילוי פגם כרומוזומאלי, וכן לסייע בקביעת מינו של התינוק/ת. מבדק אחר בעל משמעות מסייעת, היא מדידת אלקטרוליטים לקביעת רמות נתרן ואשלגן שעלולות להשתבש ב-CAH.

חסר באנזים 11hydroxylase מעלה את רמת 17OHPG באופן מתון יותר מחסר ב-21hydroxylase, אך ניתן גם למדוד את רמת 11desoxycortisol (הידוע גם כ-substance S) בנסיוב, על מנת להבדיל טוב יותר בין החסרים ב-2 האנזימים.

משמעות תוצאות בדיקת 17OHPG:

תוצאות תקינות של 17OHPG משמעותן שלנבדק אין CAH כתוצאה מחסר האנזים 21hydroxylase. רמות נמוכות או במגמת ירידה של 17OHPG במי שמאובחן עם CAH, מצביעות על תגובה חיובית לטיפול, בעוד שרמות גבוהות או כאלה בקו-עליה של 17OHPG מצביעות על טיפול לא יעיל.

כאשר ביילוד או בתינוק מתקבלת תוצאה גבוהה משמעותית של 17OHPG בסדר גודל של 2,000-40,000 ננוגרם/מ"ל, יש סבירות שמדובר ב-CAH. אם באדם בוגר מתקבלת תוצאה מוגברת באופן מתון של הורמון זה (רמות מעל 200 ננוגרם/מ"ל), נראה שהוא סובל מהצורה המתונה הלא-קלאסית של CAH, או שיש לו חסר באנזים hydroxylaseβ11. רמות גבוהות של 17OHPG בבוגרים יכולות להצביע על גידול או על היפרפלזיה של בלוטות האדרנל. בבוגרים עם רמות 17OHPG של 200-800 ננוגרם/מ"ל, יש סבירות בביצוע מדידה של רמת ACTH. בגברים רמת 17OHPG נמוכה ב-male pseudohermaphrodites, עם חסר של 17αhydroxylase או CYPc17, וכן במחלת אדיסון.

ליילודים טרם-עת (פגים) יש ברוב המקרים רמות 17OHPG גבוהות. לכן יש צורך לחזור על בדיקת סקר היילודים במועד מאוחר יותר. לעתים נדירות יש צורך לבצע את מדידת רמת 17OHPG במי השפיר, כדי לגלות ולטפל ב-CAH של העובר בעת ההיריון. רמת 17OHPG במי שפיר בשבוע ה-12 עד 19 להיריון היא 0.4-2.5 ננוגרם/מ"ל, ורמתו במי-שפיר עם הלידה 0.3-0.6 ננוגרם/מ"ל.

בעת הלידה יש שפעול של הציר היפותאלאמוס-היפופיזה-בלוטות האדרנל כמו גם של הציר היפותאלאמוס-היפופיזה-בלוטות המין, וכך גבוהה רמתם של הסטרואידים ממקור אדרנל ובלוטות המין. בפגים, רמות אלה יכולות להיות מוגברות אף יותר כתוצאה מהעקה של תהליך הלידה לגבי יילוד טרם-עיתו. לכן רמות 17OHPG בפגים יכולות להגיע עד 1,000 ננוגרם/דציליטר, בעוד שרמות הורמון זה ביילודים בעיתם לא תעלה מעל 604 ננוגרם/דציליטר.

בתרחיש של חסר מאוד נדיר של 17α-hydroxylase, מוצאים רמות נמוכות של androstenedione, כמו גם של כל הקודמנים של אנדרוגן (17αhydroxypregnenolone וכן 17OHPG ו-dehydroepiandrosterone), אנדרוגנים כגון טסטוסטרון, estrone ו-estradiol, וכן קורטיזול, ולעומת זאת מוגברת יצירתם של קורטיקואיד מינראלי והקודמנים שלו (בעיקר פרוגסטרון, 11deoxycorticosterone ו-18deoxycorticisterone).

17OHPG קשור בדם הן ל-corticosteroid binding globulin וכן לאלבומין, והמדידה קובעת למעשה את סך רמת 17OHPG החופשי והקשור. בהמשך המסלול הפיזיולוגי שלו, 17OHPG מותמר ל-pregnanetriol, שעובר קוניוגציה ומופרש בשתן.

== הוראות לביצוע הבדיקה ==

כיוון שרמות 17OHPG משתנות באופן צירקדיאלי לאורך שעות היממה, מקובל לדגום את הדם בין השעות 0600-0800 באופן עקבי. אין צורך בהכנות מיוחדות דוגמת צום, אך יש לקחת בחשבון שנטילת קורטיקוסטרואידים וכן גלולות למניעת הריון, עלולה להשפיע על תוצאות מדידת 17OHPG. במקרה של נשים בגיל הפוריות, על מנת לשמור על עקביות במקרה של נטילת דם למספר בדיקות במהלך תקופה אחת, יש ליטול הדם באותה נקודת זמן בעת המחזור החודשי. דגימת הדם יכולה להילקח במבחנה כימית (פקק אדום או צהוב), גם במבחנת ספירת-דם (EDTA, פקק סגלגל) או מבחנת ליתיום הפארין (פקק ירוק). בטמפרטורת החדר יציבות הבדיקה היא עד 48 שעות, בקירור עד 7 ימים, ובהקפאה עד 6 חודשים.

בעבר נהוג היה למדוד רמות 17OHPG ב-immunoassays דוגמת RIA או ב-immunoradiometric assay או IRMA. כיום מודדים את ההורמון הזה בשיטות של גאז-כרומטוגרפיה או ב-liquid chromatography משולבת ב-mass spectrometry (דהינו LC-MS/MS).

17 הידרוקסי-פרוגסטרון - 17OH progesterone

2015-08-16T11:45:03Z

בן עמי סלע:

== 17 הידרוקסי-פרוגסטרון - 17OH progesterone ==

כינויים נוספים: 17OHPG, 17αhydroxyprogesterone.

תחום: הערכת congenital adrenal hyperplasia או CAH; שיבושים בפעילות האדרנל, פגיעה בהתפתחות המינית והפריון.
טווח ערכים תקין (ביחידות של ננוגרם/דציליטר): דם טבורי-95-4,000; יילודים (גיל 3 ימים)-7-77; תינוקות שנולדו בעיתם עד גיל 28 יום-פחות מ-604; תינוקות שנולדו טרם-עת (preterm)-ערכי 17OHPG יכולים להיות מעל 604, אך ערכים מעל 1,000 בתינוקות preterm אינם שכיחים; הערכים של הורמון זה דועכים מ-604 לערכים המקובלים בגיל 9-12 שנה ולפני ההתבגרות המינית (prepubertal) תוך 6 חודשים.

הערכים בזכרים בגיל 10-13-פחות מ-110; הערכים בזכרים בוגרים-פחות מ-220. הערכים בנערות בגיל 9-12 (prepubertal)-פחות מ-100; בנשים בוגרות בשלב המחזור החודשי הפוליקולארי לפני הביוץ-פחות מ-80; ובשלב הלוטאלי שלאחר הביוץ-פחות מ- 285 (רמה מוגברת של 17OHPG בשלב הלוטאלי משקפת פעילות של ה-corpus luteum); בנשים בגיל חידלון הווסת-פחות מ-60; ואילו בנשים הרות רמות ההורמון היא בטווח של 200-1,000. רמת 17OHPG במהלך המחזור החודשי עולה משמעותית יום אחד לפני השיא ברמת luteinizing hormone.

רמות 17OHPG בנשים הרות (על פי Saldin וחב' ב-Fertil Steril משנת 2005) הם כדלקמן: בטרימסטר הראשון 134±9; בטרימסטר השני-230±12; בטרימסטר השלישי-351±18 ; בנשים שנה לאחר הלידה-40±6.
יוצר הערך: פרופ' בן-עמי סלע.

== בסיס פיזיולוגי ==

17hydroxy progesterone (להלן 17OHPG) הוא הורמון סטרואידי הנוצר מכולסטרול והוא חלק מהמסלול המביא ליצירת ההורמון קורטיזול.

(להכניס כאן את נוסחת 17 הידרוקסיפרוגסטרון).

17OHPG מיוצר בבלוטות האדרנל, בשחלות באשכים ואף בשלייה. הידרוקסילציה שלו בעמדות 11 ו-21 מביאה ליצירת קורטיזול. חסר של אחד משני ההידרוקסילזות יגרום לסינתזה מופחתת של קורטיזול, והפרשת ACTH המעוכבת במצב פיזיולוגי תקין על ידי פעולת משוב (feedback), מתגברת, מה שגורם בעקיפין שגשוג (היפרפלזיה) של בלוטות האדרנל. ההגברה המתקבלת בהפרשת ACTH על ידי ההיפופיזה, מגבירה את יצירת 17OHPG. אך אם יש חסר באנזים 17αhydroxylase המייצר 17OHPG מפרוגסטרון, או חסר באנזים 3βhydroxysteroid dehydrogenase type 2 המייצר 17OHPG מ-17-hydroxypregnenolone, רמות 17OHPG נמוכות עם עליה אפשרית ברמות פרוגסטרון ו-pregnenolone, בהתאמה.

התרחיש המולד של CAH מביא ליצירה מופחתת של קורטיזול ואלדוסטרון באדרנל, ובדיעבד ליצירה מוגברת של האנדרוגנים, או הורמוני המין הגבריים.17OHPG מסייע לפירוק של חלבונים, למטבוליזם של גלוקוזה וליפידים, מסייע לייצב את לחץ הדם, ומווסת את מערכת החיסון. בלוטות האדרנל מייצרות גם הורמונים סטרואידים אחרים, כמו אלדוסטרון, המסייע בוויסות רמות המלח בגוף כמו גם את לחץ הדם, וכן מייצרות בלוטות האדרנל אנדרוגנים שבדומה לטסטוסטרון משפיעים על מאפיינים מיניים של הגבר, במקביל להשפעות פיזיולוגיות נוספות.

מספר אנזימים נחוצים להשלים את השלבים של יצירת קורטיזול. אם אחד או יותר מהאנזימים הללו חסר או שתפקודו לקוי, כך תיווצרנה רמות לא תקינות של קורטיזול, כמו שקורה ב-CAH. הסיבה השכיחה ביותר האחראית לכ-90% מהמקרים של CAH היא חסר באנזים 21hydroxylase, כתוצאה ממוטציות בגן CYP21A2 (הידוע גם כ-P450c1).

(להכניס כאן את הטבלה מתחתיה מופיע...מערכת הריאקציות בבלוטות יותרת הכליה...)

מבחן 17OHPG, מתבצע באופן שגרתי כחלק מבדיקות סקר-יילודים לגילוי congenital adrenal hyperplasia או CAH הנגרמת כתוצאה מחסר באנזים 21hydroxylase. בדיקה זו יכולה להיות מוזמנת לעתים בילדים מבוגרים יותר או במבוגרים כאשר יש חשד לצורה היותר מתונה (late-onset) של CAH. הבדיקה יכולה להתבצע כאשר בילדה או באישה מופיעים תסמינים שיכולים לנבוע מ-CAH, או מתרחיש אחר כגון PCOS. תסמונות אלה יכולים לכלול: שעירות יתר של הפנים וחלקי גוף אחרים (hirsutism); חסר במחזור או אי-סדירותו; התפתחות של מאפיינים מיניים זכריים; אי-פריון.
יצירת 17OHPG יכולה להיות ממקור של פרוגסטרון על ידי האנזים 17hydroxylase, שהוא למעשה האנזים הציטוכרומי P450c17, או ממקור 17hydroxypregnenolone, על ידי האנזים 3β-hydroxysteroid dehydrogenase/Δ5-4 isomerase. יש לציין שיצירת הסטרואיד 17OHPG גדלה בטרימסטר ה-3 של ההיריון בעיקר בגלל יצירתו בבלוטת האדרנל של העובר. סטרואיד זה כאמור נוצר בעיקר בבלוטות האדרנל, אך במידה מסוימת גם בבלוטות המין (gonads), ובאופן ספציפי ב-corpus luteum בשחלות. כמות מסוימת נוצרת גם בשלייה.

מטרת מדידת 17OHPG:

השימוש העיקרי במדידת 17OHPG הוא לאשש או לשלול CAH בתינוקות הנולדים עם אברי מין חיצוניים שאינם תואמים את אלה האופייניים לתינוקות זכרים או נקבות. מדידת הורמון זה משמשת גם לזיהוי אנשים עם הצורה המתונה והלא-קלאסית של adrenal hyperplasia. בדיקה זו תתבקש גם במקרים של נשים ונערות עם שעירות-יתר בחלקי גוף בהם לא מופיעה שעירות בנשים, או עם עיבוי קול, או הגדלת מסת השריר. לעתים תידרש בדיקה זו כאשר יש סיפור משפחתי של CAH, גם אם בנבדק עצמו אין תסמינים מובהקים המחשידים ל-CAH. בדיקה זו מקובלת בבנים/נערים עם התפתחות מינית בגיל צעיר מהמקובל. יש שבדיקה זו נדרשת במסגרת פנל של בדיקות נוספות להערכת תפקוד בלוטות יותרת הכליה.

מדידת רמות של 17OHPG שימושית להערכה של מטופלים עם חשד ל-CAH כתוצאה מפגם בשני האנזימים, 21hydroxylase ו-11βhydroxylase מה שמביא לעלייה ברמת 17OHPG. לעומת זאת, במקרה הנדיר של נבדק עם פגם או חסר של האנזים 17αhydroxylase, רמת 17OHPG תהיה נמוכה ביותר או אפילו לא ניתנה לגילוי. מדידת רמות 17OHPG יכולה לשמש גם למדידת התרומה של פעילות פרוגסטרונאלית של ה-corpus luteum בעת ההיריון, שכן פרוגסטרון, אך לא 17OHPG נתרם גם כן על ידי השלייה.

בנבדק שאובחן עם חסר באנזים 21hydroxylase מדידת רמות 17OHPG תתבקש בפרקי זמן קצובים על מנת לנטר את יעילות הטיפול בו. בנוסף למדידת 17OHPG יש לבצע במקביל מדידה של רמות קורטיזול ו-androstenedione.

מדידת 17OHPG בדם באה במקום ביצוע מדידת pregnanetriol בשתן, כבדיקת הסקר הטובה יותר לאבחון CAH. במטופלים עם תסמונת זו ניתן גם למצוא רמה מוגברת של 17ketosteroides, ומדידה של רמת 11deoxycortisol עשויה לסייע להבדיל בין חסר ב-11β ו-21hydroxylase.

מדידת רמת 17OHPG יכולה לעתים לשמש יחד עם בדיקות הורמונאליות נוספות לסייע בשלילת CAH בנשים עם מאפיינים כגון שעירות-יתר בפנים ובגוף, ומחזורים בלתי סדירים. בכך נכללות נשים עם חשד לתסמונת שחלות פוליציסטיות (PCOS) ואי-פריון, ולעתים רחוקות יותר בנשים עם חשד לסרטן באדרנל או בשחלות (על פי Sciarra וחב' ב-Minerva Endocrinol משנת 1995).

תסמונת CAH עם חסר של 21hydroxylase מורשת בצורה חמורה או בצורה מתונה:

תסמונת CAH נגרמת על ידי פגמים מולדים בביוסינתזה של סטרואידים. התוצאה של אי-איזון הורמונאלי עם רמות מופחתות של גלוקו-קורטיקו-סטרואידים ומינראלו-קורטיקואידים ולעומתם רמות מוגברות של 17OHPG ושל אנדרוגנים עלולים לגרום למצבי חמורים של פגיעה במאזן המלחים (כתוצאה מפגיעה ביצירת אלדוסטרון), התייבשות והלם מסכני-חיים ביילודים בתקופה המיידית שלאחר הלידה, ולמפגעים של פגיעה בזיהוי מגדרי ושיבושים בהתפתחות המינית בגיל מאוחר יותר, בעיקר בנקבות.

מספר צורות חמורות של תסמונת זו (הידועה גם כתסמונת אדרנו-גניטלית) גורמות לתינוקות להיוולד עם חסר משמעותי של אלדוסטרון וקורטיזול באופן המחייב תשומת לב רפואית. צורה חמורה זו לעתים תכופות מתגלה במהלך סקר יילודים שגרתי, או כבר בחודשי הילדות הראשונים (Therrell ב-Endocrinol Metab Clin North Am משנת 2001). אם התסמונת אינה מתגלה בסקר יילודים, ברוב המקרים היא מופיעה עם תסמינים כגון הקאות, אדישות, לתרגיה, אכילה לא מאוזנת, כשל שגשוגי (FTT), נטייה להתייבשות, ולחץ-דם נמוך. בנשים, עודף של אנדרוגנים עלול לגרום להתפתחות אברי-מין זכריים (virilization) וחטטת (acne), ואמנם בתינוקות של המין הנשי עם פגם זה מוצאים אברי מין שאינם בירור נשיים או זכריים (ambiguous genitalia), העלולים אף להקשות על קביעת מינן. גברים עם פגם זה, נראים נורמאליים בלידה, אך עלולים לפתח מאפיינים מיניים טרם-עת (Von Schnaken וחב' ב-Eur J Pediatr משנת 1980).

(להכניס כאן את הטבלה על ויריליזציה)

צורת התסמונת המתונה יותר אם כי השכיחה יותר, יכולה להופיע כתוצאה מחסר חלקי ב-21hydroxylase. בצורת תסמונת מתונה יותר המוגדרת לעתים כ-late onset או כ-CAH לא-קלאסית, התסמינים יכולים להופיע בשלב מאוחר יותר כשנות הילדות, או שנות העֶשרֶה (adolescent) או אפילו בשנים הבוגרות (Bachega וחב' ב-Clin Endocrinol משנת 2000). התסמינים יכולים להיות מעורפלים, והתפתחותם יכולה להיות איטית עם השנים, תוך שהם שונים בין נושאי הפגם המתון. למרות שהצורה המתונה של CAH אינה מסכנת חיים, היא עלולה לגרום לבעיות בגדילה, בהתפתחות, ובהתבגרות מינית מוקדמת, שעלולה לגרום לאי-פריון במבוגרים (על פי Collett-Solberg ב-Clin Pediatr משנת 2001).

האבחון ועוד יותר מכך האבחון המבדיל של CAH דורש תמיד מדידת רמתם של מספר סטרואידים. במטופלים עם CAH כתוצאה ממוטציות בגן CYP21A2, מוצאים בדרך כלל רמות מאוד גבוהות של androstenedione (לרוב עלייה של פי 5-10 ברמתו). הרמות של 17OHPG הן בדרך כלל אף גבוהות יותר, ואילו רמות קורטיזול נמוכות אן אף לא ניתנות לגילוי. במוטציה הנדירה יחסית של הגן CYP11A1, רמות androstenedione מוגברות באותה מידה כמו במוטציה ב-CYP21A2, וגם רמת קורטיזול נמוכה, אך רמת OHPG17מוגברת רק במידה מועטה אם בכלל.

המטרה של טיפול במקרים של CAH, היא לגרום לנורמליזציה של רמות קורטיזול, ובאופן אידיאלי גם של רמות סטרואידי המין. באופן מסורתי נמדדות רמת 17OHPG בדם, כמו גם רמות pregnanetriol וקטו-סטרואידים אחרים המופרשים בשתן, כדי לכוון את הטיפול בגלוקו-קורטיקוסטרואידים, אך מבדקים אלה תואמים רק באופן מתון את רמות האנדרוגן. לכן, יש למדוד גם את רמות טסטוסטרון ו-androstenedione. קשה אמנם להביא לרמות האנדרוגן של התקופה של קדם ההתפתחות המינית (prepubertal), אך אם רמות טסטוסטרון הן בתחום הערכים התקינים, רמות androstenedione של עד 100 ננוגרם/דציליטר, מקובלות בדרך כלל כרצויות.

רוב המקרים של CAH (כ-90%), נובעים ממוטציות בגן הסטרואידי 21hydroxylase או CYP21A2, שניתן למדוד על ידי הגברה ברמת 17OHPG ו-androstenedione והפחתה ברמת קורטיזול. לעומת זאת, בשתי הצורות הפחות שכיחות של CAH הנובעות מחסר באנזימים 17hydroxylase ו-11hydroxylase, אין עליה משמעותית ברמות 17OHPG ו-androstenedione, ולכן מדידת רמת פרוגסטרון, כמו גם רמת deoxycorticosterone, חיונית לצורך אבחון (Speiser וחב' ב-J Clin Endocrinol Metabol משנת 2010).

מדידת 17OHPG עלולה לתת לעתים תוצאות חיוביות-כזובות (false positive). אם רמת הורמון זה אינה מוגברת באופן גבוה במיוחד שהוא אבחנתי לתרחיש CAH, מבדק נוספים צריכים להתבצע כמו מדידת androstenedione וטסטוסטרון. ניתן גם לבצע בדיקת ACTH stimulation test, שכן סטימולציה של ACTH תגרום לעלייה ניכרת ברמת 17OHPG (על פי Chrousos וחב' ב-Ann Intern Med משנת 1982). ניתן לבצע גם מבדק גנטי-מולקולארי לגילוי מוטציות בגן CYP21A2. אפשרות נוספת היא בדיקת karyotype לגילוי פגם כרומוזומאלי, וכן לסייע בקביעת מינו של התינוק/ת. מבדק אחר בעל משמעות מסייעת, היא מדידת אלקטרוליטים לקביעת רמות נתרן ואשלגן שעלולות להשתבש ב-CAH.

חסר באנזים 11hydroxylase מעלה את רמת 17OHPG באופן מתון יותר מחסר ב-21hydroxylase, אך ניתן גם למדוד את רמת 11desoxycortisol (הידוע גם כ-substance S) בנסיוב, על מנת להבדיל טוב יותר בין החסרים ב-2 האנזימים.

משמעות תוצאות בדיקת 17OHPG:

תוצאות תקינות של 17OHPG משמעותן שלנבדק אין CAH כתוצאה מחסר האנזים 21hydroxylase. רמות נמוכות או במגמת ירידה של 17OHPG במי שמאובחן עם CAH, מצביעות על תגובה חיובית לטיפול, בעוד שרמות גבוהות או כאלה בקו-עליה של 17OHPG מצביעות על טיפול לא יעיל.

כאשר ביילוד או בתינוק מתקבלת תוצאה גבוהה משמעותית של 17OHPG בסדר גודל של 2,000-40,000 ננוגרם/מ"ל, יש סבירות שמדובר ב-CAH. אם באדם בוגר מתקבלת תוצאה מוגברת באופן מתון של הורמון זה (רמות מעל 200 ננוגרם/מ"ל), נראה שהוא סובל מהצורה המתונה הלא-קלאסית של CAH, או שיש לו חסר באנזים hydroxylaseβ11. רמות גבוהות של 17OHPG בבוגרים יכולות להצביע על גידול או על היפרפלזיה של בלוטות האדרנל. בבוגרים עם רמות 17OHPG של 200-800 ננוגרם/מ"ל, יש סבירות בביצוע מדידה של רמת ACTH. בגברים רמת 17OHPG נמוכה ב-male pseudohermaphrodites, עם חסר של 17αhydroxylase או CYPc17, וכן במחלת אדיסון.

ליילודים טרם-עת (פגים) יש ברוב המקרים רמות 17OHPG גבוהות. לכן יש צורך לחזור על בדיקת סקר היילודים במועד מאוחר יותר. לעתים נדירות יש צורך לבצע את מדידת רמת 17OHPG במי השפיר, כדי לגלות ולטפל ב-CAH של העובר בעת ההיריון. רמת 17OHPG במי שפיר בשבוע ה-12 עד 19 להיריון היא 0.4-2.5 ננוגרם/מ"ל, ורמתו במי-שפיר עם הלידה 0.3-0.6 ננוגרם/מ"ל.

בעת הלידה יש שפעול של הציר היפותאלאמוס-היפופיזה-בלוטות האדרנל כמו גם של הציר היפותאלאמוס-היפופיזה-בלוטות המין, וכך גבוהה רמתם של הסטרואידים ממקור אדרנל ובלוטות המין. בפגים, רמות אלה יכולות להיות מוגברות אף יותר כתוצאה מהעקה של תהליך הלידה לגבי יילוד טרם-עיתו. לכן רמות 17OHPG בפגים יכולות להגיע עד 1,000 ננוגרם/דציליטר, בעוד שרמות הורמון זה ביילודים בעיתם לא תעלה מעל 604 ננוגרם/דציליטר.

בתרחיש של חסר מאוד נדיר של 17α-hydroxylase, מוצאים רמות נמוכות של androstenedione, כמו גם של כל הקודמנים של אנדרוגן (7αhydroxypregnenolone1 וכן 17OHPG ו-dehydroepiandrosterone), אנדרוגנים כגון טסטוסטרון, estrone ו-estradiol, וכן קורטיזול, ולעומת זאת מוגברת יצירתם של קורטיקואיד מינראלי והקודמנים שלו (בעיקר פרוגסטרון, 11deoxycorticosterone ו-18deoxycorticisterone).

17OHPG קשור בדם הן ל-corticosteroid binding globulin וכן לאלבומין, והמדידה קובעת למעשה את סך רמת 17OHPG החופשי והקשור. בהמשך המסלול הפיזיולוגי שלו, 17OHPG מותמר ל-pregnanetriol, שעובר קוניוגציה ומופרש בשתן.

== הוראות לביצוע הבדיקה ==

כיוון שרמות 17OHPG משתנות באופן צירקדיאלי לאורך שעות היממה, מקובל לדגום את הדם בין השעות 0600-0800 באופן עקבי. אין צורך בהכנות מיוחדות דוגמת צום, אך יש לקחת בחשבון שנטילת קורטיקוסטרואידים וכן גלולות למניעת הריון, עלולה להשפיע על תוצאות מדידת 17OHPG. במקרה של נשים בגיל הפוריות, על מנת לשמור על עקביות במקרה של נטילת דם למספר בדיקות במהלך תקופה אחת, יש ליטול הדם באותה נקודת זמן בעת המחזור החודשי. דגימת הדם יכולה להילקח במבחנה כימית (פקק אדום או צהוב), גם במבחנת ספירת-דם (EDTA, פקק סגלגל) או מבחנת ליתיום הפארין (פקק ירוק). בטמפרטורת החדר יציבות הבדיקה היא עד 48 שעות, בקירור עד 7 ימים, ובהקפאה עד 6 חודשים.

בעבר נהוג היה למדוד רמות 17OHPG ב-immunoassays דוגמת RIA או ב-immunoradiometric assay או IRMA. כיום מודדים את ההורמון הזה בשיטות של גאז-כרומטוגרפיה או ב-liquid chromatography משולבת ב-mass spectrometry (דהינו LC-MS/MS).

17 הידרוקסי-פרוגסטרון - 17OH progesterone

2015-08-16T11:43:20Z

בן עמי סלע: יצירת דף עם התוכן "== 17 הידרוקסי-פרוגסטרון - 17OH progesterone == כינויים נוספים: 17OHPG, 17αhydroxyprogesterone. תחום: הערכת congenita..."

== 17 הידרוקסי-פרוגסטרון - 17OH progesterone ==

כינויים נוספים: 17OHPG, 17αhydroxyprogesterone.

תחום: הערכת congenital adrenal hyperplasia או CAH; שיבושים בפעילות האדרנל, פגיעה בהתפתחות המינית והפריון.
טווח ערכים תקין (ביחידות של ננוגרם/דציליטר): דם טבורי-95-4,000; יילודים (גיל 3 ימים)-7-77; תינוקות שנולדו בעיתם עד גיל 28 יום-פחות מ-604; תינוקות שנולדו טרם-עת (preterm)-ערכי 17OHPG יכולים להיות מעל 604, אך ערכים מעל 1,000 בתינוקות preterm אינם שכיחים; הערכים של הורמון זה דועכים מ-604 לערכים המקובלים בגיל 9-12 שנה ולפני ההתבגרות המינית (prepubertal) תוך 6 חודשים.

הערכים בזכרים בגיל 10-13-פחות מ-110; הערכים בזכרים בוגרים-פחות מ-220. הערכים בנערות בגיל 9-12 (prepubertal)-פחות מ-100; בנשים בוגרות בשלב המחזור החודשי הפוליקולארי לפני הביוץ-פחות מ-80; ובשלב הלוטאלי שלאחר הביוץ-פחות מ- 285 (רמה מוגברת של 17OHPG בשלב הלוטאלי משקפת פעילות של ה-corpus luteum); בנשים בגיל חידלון הווסת-פחות מ-60; ואילו בנשים הרות רמות ההורמון היא בטווח של 200-1,000. רמת 17OHPG במהלך המחזור החודשי עולה משמעותית יום אחד לפני השיא ברמת luteinizing hormone.

רמות 17OHPG בנשים הרות (על פי Saldin וחב' ב-Fertil Steril משנת 2005) הם כדלקמן: בטרימסטר הראשון 134±9; בטרימסטר השני-230±12; בטרימסטר השלישי-351±18 ; בנשים שנה לאחר הלידה-40±6.
יוצר הערך: פרופ' בן-עמי סלע.

== בסיס פיזיולוגי ==

17hydroxy progesterone (להלן 17OHPG) הוא הורמון סטרואידי הנוצר מכולסטרול והוא חלק מהמסלול המביא ליצירת ההורמון קורטיזול.

(להכניס כאן את נוסחת 17 הידרוקסיפרוגסטרון).

17OHPG מיוצר בבלוטות האדרנל, בשחלות באשכים ואף בשלייה. הידרוקסילציה שלו בעמדות 11 ו-21 מביאה ליצירת קורטיזול. חסר של אחד משני ההידרוקסילזות יגרום לסינתזה מופחתת של קורטיזול, והפרשת ACTH המעוכבת במצב פיזיולוגי תקין על ידי פעולת משוב (feedback), מתגברת, מה שגורם בעקיפין שגשוג (היפרפלזיה) של בלוטות האדרנל. ההגברה המתקבלת בהפרשת ACTH על ידי ההיפופיזה, מגבירה את יצירת 17OHPG. אך אם יש חסר באנזים 17αhydroxylase המייצר 17OHPG מפרוגסטרון, או חסר באנזים 3βhydroxysteroid dehydrogenase type 2 המייצר 17OHPG מ-17-hydroxypregnenolone, רמות 17OHPG נמוכות עם עליה אפשרית ברמות פרוגסטרון ו-pregnenolone, בהתאמה.

התרחיש המולד של CAH מביא ליצירה מופחתת של קורטיזול ואלדוסטרון באדרנל, ובדיעבד ליצירה מוגברת של האנדרוגנים, או הורמוני המין הגבריים.17OHPG מסייע לפירוק של חלבונים, למטבוליזם של גלוקוזה וליפידים, מסייע לייצב את לחץ הדם, ומווסת את מערכת החיסון. בלוטות האדרנל מייצרות גם הורמונים סטרואידים אחרים, כמו אלדוסטרון, המסייע בוויסות רמות המלח בגוף כמו גם את לחץ הדם, וכן מייצרות בלוטות האדרנל אנדרוגנים שבדומה לטסטוסטרון משפיעים על מאפיינים מיניים של הגבר, במקביל להשפעות פיזיולוגיות נוספות.

מספר אנזימים נחוצים להשלים את השלבים של יצירת קורטיזול. אם אחד או יותר מהאנזימים הללו חסר או שתפקודו לקוי, כך תיווצרנה רמות לא תקינות של קורטיזול, כמו שקורה ב-CAH. הסיבה השכיחה ביותר האחראית לכ-90% מהמקרים של CAH היא חסר באנזים 21hydroxylase, כתוצאה ממוטציות בגן CYP21A2 (הידוע גם כ-P450c1).

(להכניס כאן את הטבלה מתחתיה מופיע...מערכת הריאקציות בבלוטות יותרת הכליה...)

מבחן 17OHPG, מתבצע באופן שגרתי כחלק מבדיקות סקר-יילודים לגילוי congenital adrenal hyperplasia או CAH הנגרמת כתוצאה מחסר באנזים 21hydroxylase. בדיקה זו יכולה להיות מוזמנת לעתים בילדים מבוגרים יותר או במבוגרים כאשר יש חשד לצורה היותר מתונה (late-onset) של CAH. הבדיקה יכולה להתבצע כאשר בילדה או באישה מופיעים תסמינים שיכולים לנבוע מ-CAH, או מתרחיש אחר כגון PCOS. תסמונות אלה יכולים לכלול: שעירות יתר של הפנים וחלקי גוף אחרים (hirsutism); חסר במחזור או אי-סדירותו; התפתחות של מאפיינים מיניים זכריים; אי-פריון.
יצירת 17OHPG יכולה להיות ממקור של פרוגסטרון על ידי האנזים 17hydroxylase, שהוא למעשה האנזים הציטוכרומי P450c17, או ממקור 17hydroxypregnenolone, על ידי האנזים 3β-hydroxysteroid dehydrogenase/Δ5-4 isomerase. יש לציין שיצירת הסטרואיד 17OHPG גדלה בטרימסטר ה-3 של ההיריון בעיקר בגלל יצירתו בבלוטת האדרנל של העובר. סטרואיד זה כאמור נוצר בעיקר בבלוטות האדרנל, אך במידה מסוימת גם בבלוטות המין (gonads), ובאופן ספציפי ב-corpus luteum בשחלות. כמות מסוימת נוצרת גם בשלייה.

מטרת מדידת 17OHPG:

השימוש העיקרי במדידת 17OHPG הוא לאשש או לשלול CAH בתינוקות הנולדים עם אברי מין חיצוניים שאינם תואמים את אלה האופייניים לתינוקות זכרים או נקבות. מדידת הורמון זה משמשת גם לזיהוי אנשים עם הצורה המתונה והלא-קלאסית של adrenal hyperplasia. בדיקה זו תתבקש גם במקרים של נשים ונערות עם שעירות-יתר בחלקי גוף בהם לא מופיעה שעירות בנשים, או עם עיבוי קול, או הגדלת מסת השריר. לעתים תידרש בדיקה זו כאשר יש סיפור משפחתי של CAH, גם אם בנבדק עצמו אין תסמינים מובהקים המחשידים ל-CAH. בדיקה זו מקובלת בבנים/נערים עם התפתחות מינית בגיל צעיר מהמקובל. יש שבדיקה זו נדרשת במסגרת פנל של בדיקות נוספות להערכת תפקוד בלוטות יותרת הכליה.

מדידת רמות של 17OHPG שימושית להערכה של מטופלים עם חשד ל-CAH כתוצאה מפגם בשני האנזימים, 21hydroxylase ו-11βhydroxylase מה שמביא לעלייה ברמת 17OHPG. לעומת זאת, במקרה הנדיר של נבדק עם פגם או חסר של האנזים 17αhydroxylase, רמת 17OHPG תהיה נמוכה ביותר או אפילו לא ניתנה לגילוי. מדידת רמות 17OHPG יכולה לשמש גם למדידת התרומה של פעילות פרוגסטרונאלית של ה-corpus luteum בעת ההיריון, שכן פרוגסטרון, אך לא 17OHPG נתרם גם כן על ידי השלייה.

בנבדק שאובחן עם חסר באנזים 21hydroxylase מדידת רמות 17OHPG תתבקש בפרקי זמן קצובים על מנת לנטר את יעילות הטיפול בו. בנוסף למדידת 17OHPG יש לבצע במקביל מדידה של רמות קורטיזול ו-androstenedione.

מדידת 17OHPG בדם באה במקום ביצוע מדידת pregnanetriol בשתן, כבדיקת הסקר הטובה יותר לאבחון CAH. במטופלים עם תסמונת זו ניתן גם למצוא רמה מוגברת של 17ketosteroides, ומדידה של רמת 11deoxycortisol עשויה לסייע להבדיל בין חסר ב-11β ו-21hydroxylase.

מדידת רמת 17OHPG יכולה לעתים לשמש יחד עם בדיקות הורמונאליות נוספות לסייע בשלילת CAH בנשים עם מאפיינים כגון שעירות-יתר בפנים ובגוף, ומחזורים בלתי סדירים. בכך נכללות נשים עם חשד לתסמונת שחלות פוליציסטיות (PCOS) ואי-פריון, ולעתים רחוקות יותר בנשים עם חשד לסרטן באדרנל או בשחלות (על פי Sciarra וחב' ב-Minerva Endocrinol משנת 1995).

תסמונת CAH עם חסר של 21hydroxylase מורשת בצורה חמורה או בצורה מתונה:

תסמונת CAH נגרמת על ידי פגמים מולדים בביוסינתזה של סטרואידים. התוצאה של אי-איזון הורמונאלי עם רמות מופחתות של גלוקו-קורטיקו-סטרואידים ומינראלו-קורטיקואידים ולעומתם רמות מוגברות של 17OHPG ושל אנדרוגנים עלולים לגרום למצבי חמורים של פגיעה במאזן המלחים (כתוצאה מפגיעה ביצירת אלדוסטרון), התייבשות והלם מסכני-חיים ביילודים בתקופה המיידית שלאחר הלידה, ולמפגעים של פגיעה בזיהוי מגדרי ושיבושים בהתפתחות המינית בגיל מאוחר יותר, בעיקר בנקבות.

מספר צורות חמורות של תסמונת זו (הידועה גם כתסמונת אדרנו-גניטלית) גורמות לתינוקות להיוולד עם חסר משמעותי של אלדוסטרון וקורטיזול באופן המחייב תשומת לב רפואית. צורה חמורה זו לעתים תכופות מתגלה במהלך סקר יילודים שגרתי, או כבר בחודשי הילדות הראשונים (Therrell ב-Endocrinol Metab Clin North Am משנת 2001). אם התסמונת אינה מתגלה בסקר יילודים, ברוב המקרים היא מופיעה עם תסמינים כגון הקאות, אדישות, לתרגיה, אכילה לא מאוזנת, כשל שגשוגי (FTT), נטייה להתייבשות, ולחץ-דם נמוך. בנשים, עודף של אנדרוגנים עלול לגרום להתפתחות אברי-מין זכריים (virilization) וחטטת (acne), ואמנם בתינוקות של המין הנשי עם פגם זה מוצאים אברי מין שאינם בירור נשיים או זכריים (ambiguous genitalia), העלולים אף להקשות על קביעת מינן. גברים עם פגם זה, נראים נורמאליים בלידה, אך עלולים לפתח מאפיינים מיניים טרם-עת (Von Schnaken וחב' ב-Eur J Pediatr משנת 1980).

(להכניס כאן את הטבלה על ויריליזציה)

צורת התסמונת המתונה יותר אם כי השכיחה יותר, יכולה להופיע כתוצאה מחסר חלקי ב-21hydroxylase. בצורת תסמונת מתונה יותר המוגדרת לעתים כ-late onset או כ-CAH לא-קלאסית, התסמינים יכולים להופיע בשלב מאוחר יותר כשנות הילדות, או שנות העֶשרֶה (adolescent) או אפילו בשנים הבוגרות (Bachega וחב' ב-Clin Endocrinol משנת 2000). התסמינים יכולים להיות מעורפלים, והתפתחותם יכולה להיות איטית עם השנים, תוך שהם שונים בין נושאי הפגם המתון. למרות שהצורה המתונה של CAH אינה מסכנת חיים, היא עלולה לגרום לבעיות בגדילה, בהתפתחות, ובהתבגרות מינית מוקדמת, שעלולה לגרום לאי-פריון במבוגרים (על פי Collett-Solberg ב-Clin Pediatr משנת 2001).

האבחון ועוד יותר מכך האבחון המבדיל של CAH דורש תמיד מדידת רמתם של מספר סטרואידים. במטופלים עם CAH כתוצאה ממוטציות בגן CYP21A2, מוצאים בדרך כלל רמות מאוד גבוהות של androstenedione (לרוב עלייה של פי 5-10 ברמתו). הרמות של 17OHPG הן בדרך כלל אף גבוהות יותר, ואילו רמות קורטיזול נמוכות אן אף לא ניתנות לגילוי. במוטציה הנדירה יחסית של הגן CYP11A1, רמות androstenedione מוגברות באותה מידה כמו במוטציה ב-CYP21A2, וגם רמת קורטיזול נמוכה, אך רמת OHPG17מוגברת רק במידה מועטה אם בכלל.

המטרה של טיפול במקרים של CAH, היא לגרום לנורמליזציה של רמות קורטיזול, ובאופן אידיאלי גם של רמות סטרואידי המין. באופן מסורתי נמדדות רמת 17OHPG בדם, כמו גם רמות pregnanetriol וקטו-סטרואידים אחרים המופרשים בשתן, כדי לכוון את הטיפול בגלוקו-קורטיקוסטרואידים, אך מבדקים אלה תואמים רק באופן מתון את רמות האנדרוגן. לכן, יש למדוד גם את רמות טסטוסטרון ו-androstenedione. קשה אמנם להביא לרמות האנדרוגן של התקופה של קדם ההתפתחות המינית (prepubertal), אך אם רמות טסטוסטרון הן בתחום הערכים התקינים, רמות androstenedione של עד 100 ננוגרם/דציליטר, מקובלות בדרך כלל כרצויות.

רוב המקרים של CAH (כ-90%), נובעים ממוטציות בגן הסטרואידי 21hydroxylase או CYP21A2, שניתן למדוד על ידי הגברה ברמת 17OHPG ו-androstenedione והפחתה ברמת קורטיזול. לעומת זאת, בשתי הצורות הפחות שכיחות של CAH הנובעות מחסר באנזימים 17hydroxylase ו-11hydroxylase, אין עליה משמעותית ברמות 17OHPG ו-androstenedione, ולכן מדידת רמת פרוגסטרון, כמו גם רמת deoxycorticosterone, חיונית לצורך אבחון (Speiser וחב' ב-J Clin Endocrinol Metabol משנת 2010).

מדידת 17OHPG עלולה לתת לעתים תוצאות חיוביות-כזובות (false positive). אם רמת הורמון זה אינה מוגברת באופן גבוה במיוחד שהוא אבחנתי לתרחיש CAH, מבדק נוספים צריכים להתבצע כמו מדידת androstenedione וטסטוסטרון. ניתן גם לבצע בדיקת ACTH stimulation test, שכן סטימולציה של ACTH תגרום לעלייה ניכרת ברמת 17OHPG (על פי Chrousos וחב' ב-Ann Intern Med משנת 1982). ניתן לבצע גם מבדק גנטי-מולקולארי לגילוי מוטציות בגן CYP21A2. אפשרות נוספת היא בדיקת karyotype לגילוי פגם כרומוזומאלי, וכן לסייע בקביעת מינו של התינוק/ת. מבדק אחר בעל משמעות מסייעת, היא מדידת אלקטרוליטים לקביעת רמות נתרן ואשלגן שעלולות להשתבש ב-CAH.

חסר באנזים 11hydroxylase מעלה את רמת 17OHPG באופן מתון יותר מחסר ב-21hydroxylase, אך ניתן גם למדוד את רמת 11desoxycortisol (הידוע גם כ-substance S) בנסיוב, על מנת להבדיל טוב יותר בין החסרים ב-2 האנזימים.

משמעות תוצאות בדיקת 17OHPG:

תוצאות תקינות של 17OHPG משמעותן שלנבדק אין CAH כתוצאה מחסר האנזים 21hydroxylase. רמות נמוכות או במגמת ירידה של 17OHPG במי שמאובחן עם CAH, מצביעות על תגובה חיובית לטיפול, בעוד שרמות גבוהות או כאלה בקו-עליה של 17OHPG מצביעות על טיפול לא יעיל.

כאשר ביילוד או בתינוק מתקבלת תוצאה גבוהה משמעותית של 17OHPG בסדר גודל של 2,000-40,000 ננוגרם/מ"ל, יש סבירות שמדובר ב-CAH. אם באדם בוגר מתקבלת תוצאה מוגברת באופן מתון של הורמון זה (רמות מעל 200 ננוגרם/מ"ל), נראה שהוא סובל מהצורה המתונה הלא-קלאסית של CAH, או שיש לו חסר באנזים hydroxylaseβ11. רמות גבוהות של 17OHPG בבוגרים יכולות להצביע על גידול או על היפרפלזיה של בלוטות האדרנל. בבוגרים עם רמות 17OHPG של 200-800 ננוגרם/מ"ל, יש סבירות בביצוע מדידה של רמת ACTH. בגברים רמת 17OHPG נמוכה ב-male pseudohermaphrodites, עם חסר של 17αhydroxylase או CYPc17, וכן במחלת אדיסון.

ליילודים טרם-עת (פגים) יש ברוב המקרים רמות 17OHPG גבוהות. לכן יש צורך לחזור על בדיקת סקר היילודים במועד מאוחר יותר. לעתים נדירות יש צורך לבצע את מדידת רמת 17OHPG במי השפיר, כדי לגלות ולטפל ב-CAH של העובר בעת ההיריון. רמת 17OHPG במי שפיר בשבוע ה-12 עד 19 להיריון היא 0.4-2.5 ננוגרם/מ"ל, ורמתו במי-שפיר עם הלידה 0.3-0.6 ננוגרם/מ"ל.

בעת הלידה יש שפעול של הציר היפותאלאמוס-היפופיזה-בלוטות האדרנל כמו גם של הציר היפותאלאמוס-היפופיזה-בלוטות המין, וכך גבוהה רמתם של הסטרואידים ממקור אדרנל ובלוטות המין. בפגים, רמות אלה יכולות להיות מוגברות אף יותר כתוצאה מהעקה של תהליך הלידה לגבי יילוד טרם-עיתו. לכן רמות 17OHPG בפגים יכולות להגיע עד 1,000 ננוגרם/דציליטר, בעוד שרמות הורמון זה ביילודים בעיתם לא תעלה מעל 604 ננוגרם/דציליטר.

בתרחיש של חסר מאוד נדיר של 17α-hydroxylase, מוצאים רמות נמוכות של androstenedione, כמו גם של כל הקודמנים של אנדרוגן (αhydroxypregnenolone17 וכן 17OHPG ו-dehydroepiandrosterone), אנדרוגנים כגון טסטוסטרון, estrone ו-estradiol, וכן קורטיזול, ולעומת זאת מוגברת יצירתם של קורטיקואיד מינראלי והקודמנים שלו (בעיקר פרוגסטרון, 11deoxycorticosterone ו-18deoxycorticisterone).

17OHPG קשור בדם הן ל-corticosteroid binding globulin וכן לאלבומין, והמדידה קובעת למעשה את סך רמת 17OHPG החופשי והקשור. בהמשך המסלול הפיזיולוגי שלו, 17OHPG מותמר ל-pregnanetriol, שעובר קוניוגציה ומופרש בשתן.

== הוראות לביצוע הבדיקה ==

כיוון שרמות 17OHPG משתנות באופן צירקדיאלי לאורך שעות היממה, מקובל לדגום את הדם בין השעות 0600-0800 באופן עקבי. אין צורך בהכנות מיוחדות דוגמת צום, אך יש לקחת בחשבון שנטילת קורטיקוסטרואידים וכן גלולות למניעת הריון, עלולה להשפיע על תוצאות מדידת 17OHPG. במקרה של נשים בגיל הפוריות, על מנת לשמור על עקביות במקרה של נטילת דם למספר בדיקות במהלך תקופה אחת, יש ליטול הדם באותה נקודת זמן בעת המחזור החודשי. דגימת הדם יכולה להילקח במבחנה כימית (פקק אדום או צהוב), גם במבחנת ספירת-דם (EDTA, פקק סגלגל) או מבחנת ליתיום הפארין (פקק ירוק). בטמפרטורת החדר יציבות הבדיקה היא עד 48 שעות, בקירור עד 7 ימים, ובהקפאה עד 6 חודשים.

בעבר נהוג היה למדוד רמות 17OHPG ב-immunoassays דוגמת RIA או ב-immunoradiometric assay או IRMA. כיום מודדים את ההורמון הזה בשיטות של גאז-כרומטוגרפיה או ב-liquid chromatography משולבת ב-mass spectrometry (דהינו LC-MS/MS).

Ki-67

2015-07-23T11:20:34Z

בן עמי סלע: יצירת דף עם התוכן "== Ki-67 == כינויים נוספים: MIB-1 clone, MIB, MIB1Q, MKi67. תחום: הערכה פרוגנוסטית של סרטן שד, אך גם של סוגי ..."

== Ki-67 ==

כינויים נוספים: MIB-1 clone, MIB, MIB1Q, MKi67.
תחום: הערכה פרוגנוסטית של סרטן שד, אך גם של סוגי סרטן נוספים.
טווח ערכים תקין: צביעה חיובית של גרעיני 10-25% מתאי הסרטן הנסקרים.
יוצר הערך: פרופ' בן-עמי סלע.

== מטרת הבדיקה ==

להעריך את שיעור השגשוג (פרוליפרציה) של תאים סרטניים (אנלוגי לבדיקת cytometry flow של פאזת S). כמו כן עשויה בדיקה זו לסייע בהערכה פרוגנוסטית של סרטני שלפוחית השתן, המוח, השד, הכליה, הריאות, השחלה, בלוטת הערמונית ובלוטת התריס. קביעת רמת Ki-67 מסייעת ב-staging של גידולים נוירו-אנדוקריניים וההערכה הפרוגנוסטית שלהם. בהתאם, מטופלים הראויים לבדיקת Ki-67, הם אלה עם ממאירויות בשלפוחית השתן, המוח, השד, הכליה, הריאות, השחלה, בלוטת הערמונית ובלוטת התריס. כמו כן ביצוע בדיקה זו יכול להישקל במקרים של אלה עם גידולים נוירו-אנדוקריניים של הלבלב ומערכת העיכול.

== תכונות החלבון Ki-67 ==

האנטיגן Ki-67 זוהה על ידי Gerdes וחב' על ידי שימוש בנוגדן החד-שבטי MIB1 ותואר ב-1983 ב-Int J Cancer כחלבון לא-היסטוני הממוקם בגרעין התא. הנוגדן נוצר על ידי חיסון עכברים עם חומר גרעיני משורת התאים L428 שבודדה מ- Hodgkin’s lymphoma. שם האנטיגן מקורו בעיר Kiel בה בודד האנטיגן, והמספר נובע ממיקומו של שבט התאים בפלטת ELISA של 96 בארות. שנה לאחר מכן פרסמו Gerdes וחב' ב-J Immunol, שנוגדן זה מגיב עם מבנה גרעיני שניתן לאתרו באופן בלעדי רק בתאים מתחלקים. אנליזה מפורטת של מחזור חלוקת התאים, גילתה שהאנטיגן האמור נמצא בגרעיני תאים בפאזות G1 ו-G2 ובמחצית המאוחרת של פאזת S, של מחזור חלוקתם, כמו גם במיטוזה (פאזת M). לעומת זאת, האנטיגן Ki-67 לא ניתן לאיתור בתאים בלתי מתחלקים או כאלה הנמצאים בשלב G0, עפ"י Gerdes וחב' ב-J Immunol משנת 1984.

התברר שכתוצאה מ-splicing חלופי של הקודמן (precursor) של mRNA ששועתק מגן בודד המכיל 16 אקסונים, נוצרו 2 איזופורמים של Ki-67: הגדול מבין השניים, בעל משקל מולקולארי של 359 אלף דלטון, ואילו האיזופורם הקטן בעל משקל מולקולארי של 320 אלף דלטון. הסיבה ליצירת 2 איזופורמים אלה, נובעת מנוכחות או מחסר של רצף המקודד על ידי אקסון 7 של הגן ל-Ki-67. נמצא ש-2 האיזופורמים מכילים אזור מרכזי גדול המורכב מ-16 רצפים החוזרים על עצמם הידועים כ-"Ki-67 repeats", המקודדים על ידי אקסון 13 המורכב מ-6,854 זוגות בסיסים, ואקסון גדול זה מקודד ל-70% ול-79% מה-open reading frame של האיזופורמים ה"גדול" וה"קטן", בהתאמה.

בתוך ה-"repeats" הללו זוהה רצף של 22 חומצות אמינו, המכונה Ki-67 motif, שהשתמר היטב באבולוציה בין מינים שונים, מוטיף זה מכיל את ה-epitope הידוע כ-FKEL אליו מכוון הנוגדן החד-שבטי Ki-67. בשנת 1996 דווחו Gerdes וחב' ב-Cell Prolif על הריצוף של הגן של Ki-67 בשלמותו, גן המכיל כמעט 30,000 זוגות בסיסים.

== ההקשר הציטולוגי של Ki-67 ==

כיוון שהאנטיגן Ki-67 נוכח בכלל התאים המתחלקים (נורמאליים כמו גם סרטניים), התעורר בו עניין רב, שכן הוא זוהה כסמן יעיל להחליט לפיו את סטאטוס הפרוליפרציה של כל אוכלוסיית תאים נתונה, בפרט בהערכה אבחונית של שאתות סרטניות שונות. יחד עם זאת, אופיו של אנטיגן זה נותר בלתי מפוענח שנים אחדות, עד שקבוצתו של Gerdes החלה בסריקה של ספריית cDNA ותיעדה ב-Am J Pathol את היותו של Ki-67 חלבון גרעיני לא-היסטוני. מכאן ואילך החל מאמץ מחקרי מרשים להבנת אופיו ותפקידו של אנטיגן Ki-67. בשנת 1991 פרסמו Fonatsch וחב' ב-Genomics שהגן MKi67 המקודד לאנטיגן זה ממוקם על הזרוע הארוכה של כרומוזום 10 בעמדה 10q25-26 (על פי Schonk וחב' ב-Hum Genet ב-1989), ובשנת 1993 פרסמו Schlüter וחב' את תוצאות השיבוט והרצף השלם של ה-cDNA של Ki-67 ב-J Cell Biol.

כיוון ש-Ki-67 נוכח בגרעין התא בריכוזים קטנים בתאים "נחים", ובריכוזים גבוהים בתאים מתחלקים, ניתן בעזרת צביעה אימונו-היסטוכימית לקבוע את אחוז התאים הסרטניים החיוביים לצביעה זו, כמדד גרעיני לדרגת פעילותם. ביטוי יתר של Ki-67 מתגלה לעתים תכופות בתאים ממאירים הכרוכים בהישרדות נמוכה, בסוגי סרטן שונים. וכך ניתן להשתמש במדד זה בסרטן שלפוחית שתן (Kilicli-Camur וחב' ב-Pathol Int משנת 2002), בסרטן מוח מסוג אסטרוציטומה (Johannessen וחב' ב-Pathol Oncol Res משנת 2006), בסרטן שד (Stuart-Harris וחב' ב-Breast משנת 2008, שעשו מטה-אנליזה של 85 מחקרים שכללו 32,825 נשים, וכן Viale וחב' שבחנו את משמעות בדיקת Ki-67 במסגרת המחקר הבינלאומי Trial 1-98 בנשים עם סרטן שד במחקר שהופיע בשנת 2008 ב-J Clin Oncol), בסרטן כליות (על פי Kankuri וחב' ב-Anticancer Res משנת 2006), בסרטן ריאות (על פי Shiba וחב' משנת 2000 ב-Cancer), בסרטן שחלות (על פי Müunstedt וחב' ב-Cancer Invest משנת 2004), בסרטן ערמונית (על פי Pollack וחב' ב-J Clin Oncol משנת 2004), ובסרטן מֶדולארי של בלוטת התריס (על פי Tisell וחב' ב-Br J Cancer משנת 2003).

הביטוי התאי והמיקום של Ki-67 לאורך ה-cell cycle אינו הומוגני. בשלב המוקדם של G1 צביעת החלבון חלשה באופן כללי כאשר הצביעה מתמקדת בנקודות (foci) על פני כל הקריופלזמה (Kill וחב' ב-J Cell Sci משנת 1996). בהדרגה יש דחיסה של החלבון בשלב המאוחר של G1, ליצירת גרנולות סב-גרעיניות גדולות יותר (Starborg וחב' ב-J Cell Sci משנת 1996, ו-Braun וחב' ב-Virchows Arch B Cell Pathol משנת 1988). במהלך פאזות S ו-G2, מוצאים את Ki-67 בעיקר קשור לאזור גרעין התא כגרעין צביעה גדול יותר, וכן מוצאים אותו ביחד עם אזורים הֶטֶרוֹ-כרומאטיניים בתא. כאשר ממברנת הגרעין מתפוררת בשלב המוקדם של המיטוזה, נצבע Ki-67 באופן חזק כאשר הוא צמוד לשטח הפנים של כרומוזומים דחוסים בציטופלזמה. אך צביעה אינטנסיבית זו מתפוגגת בפאזות האנאפאזה והטלופאזה.

המיקום התאי של חלבון Ki-67 נמצא בתלות בפאזת מחזור חלוקת התא:

כיום כבר ברור שהפיזור התאי של החלבון Ki-67 אינו קבוע, אלא נקבע על ידי השינויים הדרמטיים במהלך מחזור חלוקת התא. בשלב המוקדם של פאזת G1, הצביעה של Ki-67 מוגבלת למספר מוקדים ב-nucleoplasm. עלתה הצעה על ידי van Dierendonck וחב' ב-Cancer Res משנת 1989, ועל ידי du Manoir וחב' ב-Cytometry שנת 1991, שמוקדים אלה תואמים בעיקר לאזורי ההתהוות מחדש של הגרעינונים (nucleoli). לעומתם, טען Kill ב-J Cell Sci משנת 1996, שמוקדי הצביעה של Ki-67 אינם תואמים את אלה של הגרעינונים, ודעה זו אוששה על ידי מחקר שהראה שהחלבון Ki-67 עובר אינטגרציה עם הגרעינונים רק בנקודת זמן מאוחרת, כאשר האנטיגנים hPop1 ,Nop52 ,nucleolin ו-fibrillarin כבר נמצאים בגרעינון (Savino וחב' ב-J Cell Sci משנת 1999).

במחקר מפורט הראו Bridger וחב' ב-Chromosome Res משנת 1998, שהמיקום של Ki-67 בשלבים המאוד מוקדמים של G1, תואם את האזורים של ה-satellite DNA (כמו centromeric α ,telomeric minisatellite ו-satellite III). במהלך ההתקדמות של פאזת G1, הולך נחלש המיקום ה"משותף" של Ki-67 והגרעינון, אך לאחר האיחוד מחדש של הגרעינונים באמצע פאזת G1, שוב נראה ש-Ki-67 מופיע בצמידות למבנים אלה (Verheijen וחב' ב-J Cell Sci משנת 1989). חוקרים אחרונים אלה השתמשו בשיטת immuno-electron microscopy להראות ש-Ki-67 לא מופיע באזורים הגרנולאריים ובמוקדים הסיביים שבתוך הגרעינון.

הפיזור של Ki-67 בפאזת S נתון אף הוא לוויכוח. בעוד ש-Kill גורס שצביעת Ki-67 מוגבלת לגרעינון, du Manoir ו-Dierendonck סבורים שהצביעה בשלב זה מוגבלת ל-nucleoplasm. יש גם דיווחים סותרים באשר למיקום חלבון זה בפאזת G2. בעוד ש-du Manoir וחב' מוצאים ש-Ki-67 ממוקם על פני כל הגרעין, אחרים מצדדים בפיזורו על פני ה-nucleoplasm. מעניין פיזור Ki-67 במהלך המיטוזה. בפּרוֹפאזה, עובר Ki-67 רה-ארגון ונראה בפיזור דמוי-רשת עדינה הקשורה עם הכרומטין הנדחס (Verheijen וחב' ב-J Cell Sci משנת 1989). בשלב המטפאזה, הצביעה הבוהקת של Ki-67 נראית מכסה את פני הכרומוזומים האינדיבידואלים (Starborg וחב' ב- J Cell Sci משנת 1996), אך יחד עם זאת החלבון Ki-67 אינו כרוך עם הכרומטין.

לאחר התפרקות ממברנת הגרעין, חלק מ-Ki-67 ניתן לגילוי כשהוא מפוזר באופן דיפוזי בציטופלזמה, ומספר חוקרים (Braun, Starborg וחב') מדווחים על כך שלקראת סוף המיטוזה, בפאזות האנפאזה והטלוֹפאזה, החלבון Ki-67 מפגין מצג של צביעה גרנולארית, ואילו du Manoir וחב' מצאו דווקא צביעה הומוגנית של חלבון זה בשתי פאזות מאוחרות אלו. אין ספק שהסיבה למחלוקות ולסתירות בדיווחים לגבי מיקומו של Ki-67 מקורן בעובדה שמדובר בסוגי תאים שונים מזנים שונים, תוך שימוש בפרוטוקולים שונים של קיבוע וצביעה אימונו-היסטוכימית.

תפקוד Ki-67:

Ki-67 הוא חלבון גרעיני הכרוך בתהליך השגשוג התאי, דרך מעורבותו בשעתוק של RNA ריבוזומאלי (Bullwinkel וחב' ב-J Cell Physiol משנת 2006), כאשר אינאקטיבציה של Ki-67 מובילה לעיכוב הסינתזה של RNA ריבוזומאלי (Rahmanzadeh וחב' ב-Cell Prolif משנת 2007). בשלב ה-interphase, האנטיגן Ki-67 ממוקם באופן בלעדי בתוך גרעין התא, ואילו במיטוזה רובו עובר לשטח הפנים של הכרומוזומים.

בשנת 1983 כאשר תוארו לראשונה נוגדנים חד שבטיים כנגד Ki-67, התמונה של המנגנונים המולקולאריים המפקחים על מחזור חיי תא האאוקריוטי, הייתה ממש בחיתוליה. באותה שנה, הוצע על ידי Evans וחב' ב-Cell המושג cyclin עבור חלבונים הנהרסים בנקודות מסוימות של חלוקת תאי ביציות של קיפוד ים, ובשנים שלאחר מכן חלה התקדמות מהירה בהבנת המארג המסובך של ה-cyclins, ושל הקינאזות התלויות ב-cyclins כמו גם במעכבים השולטים על הקואורדינציה של התקדמות ה-cell cycle (כפי שסקר Pines ב-Biochem J משנת 1995). כמו כן נרשמה התקדמות בהבנת הגורמים המפקחים על אירועי מפתח במחזור חלוקת התא, לדוגמה במעבר מפאזה אחת במחזור התא לפאזה שבאה אחריה, שלב הרפליקציה של DNA, ותהליכי דחיסת הכרומוזומים והיפרדותם.

נמצא ששני הגנים מדכאי הסרטן, p53 ו-pRb, הם יעדים מרכזיים בבקרה של מעבר התא מפאזה G1 לפאזה S (עפ"י Agarwal וחב' ב-J Biol Chem משנת 1998). למרות שהבנתנו את הבקרה המולקולארית של מחזור חלקת תאים רחוקה מלהיות מושלמת, מתחילה להצטייר התמונה המפורטת של המארג המורכב המווסת על ידי ביטוים של חלבונים שונים, ותהליכים הקשורים לחלבונים אלה כגון פוספורילציה, ubiquitination ופרוק חלבונים אלה, ואף טרנסלוקציה של מספר חלבונים. אך עדיין קיימת אי-ודאות באשר לחלבון Ki-67, למרות שברור לכל הקשר שלו לנקודות חיוניות במחזור חלוקת התא.

במספר מחקרים נמצא שהביטוי של Ki-67 בפאזה G1 יכול להיות מינימאלי, מה שעלול להוות מגבלה בדיוק הביטוי של חלבון זה לצורך זיהוי תאים בפאזה זו (Gerdes וחב' ב-J Immunol משנת 1984, וכן du Manoir וחב' ב-Cytometry משנת 1991, ו-Bruno ו-Darzynkiewicz ב-Cell Prolif משנת 1992). ביטוי בלתי רגולארי זה של Ki-67 בפאזת G1 לפי הסברה, נובע כתוצאה מההבדלים בין פאזת G1 בתאים שהיו קודם לכן רדומים, לבין פאזת G1 בתאים שסיימו אך זה מחזור קודם של חלוקת תא, או אפילו כאינדיקציה לתנאי גידול שונים של התא. משך מחצית החיים של החלבון Ki-67 מוערך סביב 60-90 דקות (Heidebrecht וחב' ב-Cell Prolif משנת 1996).ההבדלים בביטוי Ki-67 לאורך מחזור חלוקת התא אינם נובעים כנראה מהצטברות של חלבון זה שלא עבר פירוק, אלא שהם משקפים בעיקר שונות בסינתזה de novo של החלבון.

למרות כל הנתונים הללו על מיקום ועוצמת הביטוי של Ki-67, ידוע רק מעט על תפקודו מעבר לעובדה שחלבון זה עובר פוספוריליציה דרך שיירי serine ו-threonine שלו, עם תפקיד קריטי במנגנון חלוקת התא. למסקנה האחרונה הגיעו על בסיס העצירה המוחלטת של שגשוג תאים כאשר Ki-67 נחסם או על ידי מיקרו-הזרקה של נוגדנים המנטרלים חלבון זה, או על ידי עיכוב שלב הדה-פוספורילציה שלו.

משמעות Ki-67 בהתנהלות הטיפולית של סרטן השד:

סרטן שד קל לאבחון, אך קשה יותר להערכה פרוגנוסטית. אכן, הגורמים הפרוגנוסטיים והטיפול המתבקש בתרחישים של סרטן שד עם קשרי לימפה בלתי נגועים, הם גיל המטופלת, גודל השאת בשד, הדירוג ההיסטולוגי, נוכחותם של קולטנים לאסטרוגן (ER), הסטאטוס של קולטנים לפרוגסטרון (PR), כמו גם הסטאטוס של HER2 או human epidermal growth factor receptor 2 (עפ"י Harris וחב' ב-J Clin Oncol משנת 2007, כמו גם Eifel וחב' ב-J Natl Cancer Inst משנת 2001 ו-Goldhirsch וחב' ב-Ann Oncol משנת 2009). יחד עם זאת, יש צורך לזיהוי טוב יותר של מטופלות עם סיכון גבוה ל-relapse, כדי שאלו מהן עם סיכון נמוך ל-relapse, לא תעבורנה טיפול כימותרפי שיש להימנע ממנו במקרים האחרונים. בסרטן השד, שיעורים גבוהים של חלוקת תאים, כרוכים בפרוגנוזה גרועה יותר, אך יחד עם זאת בסבירות גבוהה יותר לתגובה לכימותרפיה (עפ"י Beresford וחב' ב-Breast Cancer Res משנת 2006, וכן Colozza וחב' ב-Ann Oncol משנת 2005, ו-de Azambuja וחב' ב-Br J Cancer משנת 2007).

קצב חלוקות תאי סרטן השד יכול להימדד על ידי אינדקס סימון על ידי תימידין רדיואקטיבי, או על ידי אנליזת flow cytometry של מקטע פאזת S. שני סמנים אלה נבחנו בניסויים פרוספקטיבים אך הסיבוך בביצועם והצורך ברקמת-שד קפואה טרייה מגבילים את השימוש השגרתי בשיטות אלו (עפ"י Malmstrom וחב' ב-J Clin Oncol משנת 2001, ו-Silvestrini וחב' באותו כתב עת משנת 1995). עם הכנסת הטכנולוגיה של gene microarray נוצר כלי פרוגנוסטי בו על ידי תת-קלספיקציה בסרטן שד, ניתן לקבל הבדלים פרוגנוסטיים בקבוצת אלו עם מחלה חיובית ל-ER ומטופלות עם מדרג היסטולוגי- grade 2, כאשר בעבר תת-קבוצות אלו נחשבו הומוגניות (Ivshina וחב' ב-Cancer Res משנת 2006; Paik וחב' ב-N Eng J Med משנת 2004; Sorlie וחב' ב-Proc Natl Acad Sci USA משנת 2001; van’t Veer וחב' ב-Nature משנת 2002 ו-Sotiriou וחב' ב-J Natl Cancer Inst משנת 2006). בשיטת ה-microarray עושים שימוש בשבבי זכוכית או פלסטיק אליהם מודבקות פיסות DNA חד-גדילי לרוב (DNA chips), על מנת לאתר נוכחות של mRNA המשועתק מגנים שונים. לכל גן מוקצה נקודה על פני השבב, וכאשר זו מאירה, מסיקים שהגן בא לביטוי.

בשנים האחרונות, פותחו מספר מבחני multigene להערכת הסיכון בשלבים מוקדמים של סרטן השד. שני ניסויים גדולים פרוספקטיבים רב-מוסדיים, הידועים כ-TAILORx או Trial for Assigning IndividuaLized Options for Treatment Rx, שתואר על ידי Sparano וחב' ב-J Clin Oncol משנת 2008, תוך שימוש ב-Oncotype DX שתואר על ידי Paik וחב' ב-N Eng J Med משנת 2004, וכן MINDACT או Microarray in Node-Negative Disease May Avoid ChemoTherapy (עפ"י Cardoso וחב' ב-J Clin Oncol משנת 2008, תוך שימוש בערכת Mammaprint (עפ"י van de Vijer וחב' ב-N Eng J Med משנת 2002). השימוש בשתי הערכות האחרונות נועד לזהות את התועלת שבטיפול כימותרפי בנוסף לטיפול אנדוקריני בשלבים המוקדמים של סרטן שד ללא נגיעות קשרי הלימפה (Oakman וחב' ב-Breast cancer Res משנת 2009).

כיוון שמדידת רמת Ki-67 זמינה יותר לביצוע הרקמה סרטנית משוקעת בפרפין, היא כבר הוכנסה לשימוש, למרות שהיא לא הומלצה באופן גורף לשימוש בכל הקטגוריות של סרטן השד, כיוון שלא קיימת סטנדרטיזציה בינלאומית לשיטה זו. יחד עם זאת, שיטות Ki-67 ו-תדירות מיטוטית נכללו לאחרונה בהנחיות של St Gallen, אם כי הודגש שאמינותן של 2 שיטות אלו שונה באזורים גיאוגרפיים שונים. אכן, נכון להיום לא קיים עדיין תהליך בחינה תקני (SOP או standard operating procedure), וכן לא קיימת הסכמה גורפת לגבי סף "נורמה" או הגדרת ערך "cutoff" לגבי Ki-67 (עפ"י Yerushalmi וחב' ב-Lancet Oncol משנת 2010, וכן Luporsi וחב' ב-Breast Cancer Res משנת 2012). מסיבה זו ההשוואה הבין-מעבדתית של ערכי Ki-67 אינה מיושמת בשגרת ההערכה הפתולוגית (Gnant וחב' ב-Breast Care משנת 2011, וכן Untch וחב' באותו כתב עת משנת 2013).

בדגימות מרקמת שד בריאה, נמצא ש-Ki-67 מבוטא ברמות נמוכות של (בפחות מ-3% מהתאים) בתאים שליליים לקולטני אסטרוגן (ER-negative), אך לא ניתן היה למצוא אנטיגן זה בתאי שד חיוביים לקולטני אסטרוגן (ER-positive) על פי Urruticoechea וחב' ב-J Clin Oncol משנת 2005. בשיטות של immunostaining עם נוגדן חד-שבטי כנגד Ki-67 ניתן להעריך את מידת השגשוג של אוכלוסיית תאים סרטניים, אך יחד עם זאת עד כה לא הוגדרה באופן מוסכם רמת הסף של האנטיגן Ki-67 (על פי Gnant וחב' ב-Breast Care משנת 2011 ו-Untch וחב' באותו כתב עת כמאמר עוקב), ולכן לא השתלב Ki-67 עד כה בשגרת הפעילות הקלינית עם סרטן שד.

ערכים מוחלטים של Ki-67 ופרמטרים היסטו-פתולוגיים של סרטן שד:

Inwald וחב' במחקרם ב-Breast Cancer Res Treat משנת 2013, בחנו על ידי ANOVA את המתאם בין ערכים מוחלטים של Ki-67 לבין פרמטרים היסטו-פתולוגיים. ערך ממוצע של Ki-67 בנשים premenopausal היה 19% ובנשים postmenppausal הוא היה 24%. באשר לגודל השאת בשד, לא נמצאו הבדלים מהותיים ברמת Ki-67, אך הבדלים כאלה נמצאו בהקשר של סטאטוס קשרי הלימפה: רמה ממוצעת של Ki-67 בגידולי-שד שליליים לנגיעות קשרי הלימפה הייתה 19%, ואילו במקרים של גידולי שד בדרגה N3 רמת Ki-67 הייתה בממוצע 24%.

מעניין שבמושגים היסטולוגיים, במקרים של קרצינומה דוקטלית-חודרנית רמת הביטוי של Ki-67 הייתה 22%, בניגוד לגידול לובולרי בו רמת הביטוי הממוצעת של Ki-67 הייתה 13%. יצוין שדרגת ההתמיינות של גידולי השד הראתה מתאם טוב עם Ki-67. לגידולי G1 נקבע ה-labeling index של Ki-67 כ-10%, לגידולי G2 אינדקס הסימון של Ki-67 היה 16%, ולגידולי G3 נקבע אינדקס סימון של 37%. חודרנות לימפאטית ווסקולארית הראו ממצאים דומים של ביטוי Ki-67. בגידולי L0 של השד, רמת הביטוי הממוצעת של Ki-67 הייתה 18%, ואילו בגידולי V0 היא נקבעה כ-20%. בגידולי L1 ו-V1 הרמה הממוצעת של Ki-67 הייתה 24% ו-28%, בהתאמה. בגידולים חיוביים לקולטן של אסטרוגן (ER) או לקולטן של פרוגסטרון (PR), רמת Ki-67 הייתה זהה-17%. בגידולי שד שליליים לקולטני ההורמונים הביטוי של Ki-67 היה גבוה יותר (42%) בגידול שלילי לאסטרוגן, מאשר לגידול שלילי לפרוגסטרון (34%). רמה ממוצעת של Ki-67 של גידולים חיוביים ל-HER2/neu הייתה 27%, לעומת 19% בגידולים שליליים ל-HER2/neu.

(להכניס כאן את הטבלה מתחתיה מופיע ...ניתוח הקשר בין רמת הצביעה של Ki-67....)

הקשר בין רמות Ki-67 והפרוגנוזה של סרטן שד:

היעדרותו של Ki-67 מתאים בלתי מתחלקים (quiescent cells) והביטוי האוניברסאלי שלו בתאים מתחלקים, הביאו למספר ניכר של מחקרים על סגולותיו האפשריות כסמן פרוגנוסטי של התהליך הסרטני (van Dierendonck וחב' ב-Cancer Res משנת 1989). העובדה ש-Ki-67 לא נקלט בתודעה של האונקולוגים כסמן משמעותי, קשורה אולי לכך שהביטוי של חלבון זה, משתנה בעוצמת הצביעה האימונו-היסטו-כימית שלו לאורך כל מחזור חיי התא, מה שהוליד ספקות שמא יתכן זיהוי שגוי של תאים מתחלקים שיסווגו כתאים נייחים. כללית, הראיות מצביעות על כך שרמת Ki-67 נמוכה יחסית במשך שלב G1 ובשלבים המוקדמים של פאזת S, ורמתו עולה בהדרגה ומגיעה לשיאה בעת המיטוזה. ירידה מהירה ברמת Ki-67 מתחילה במשך האנפאזה והטלופאזה (Lopez וחב' ב-Cytometry משנת 1991).

כדי להעריך את הערך הפרוגנוסטי של Ki-67 בחנו Klintman וחב' מקבוצת "סרטן השד של דרום שוודיה", את ביצועי Ki-67 ביחס לגורמים פרוגנוסטיים מוסכמים, במטופלות עם קשרי-לימפה בלתי נגועים, וכמו כן בחנו חוקרים אלה האם המשמעות הפרוגנוסטית הייתה בתלות בסטאטוס של הקולטן לאסטרוגן (ER) וכן ב-grade ההיסטולוגי. ממצאי מחקר זה הופיעו ב-Modern Pathol משנת 2010. המדגם כלל 200 נשים בשנות הפריון שלהן, וכולן נמצאו במעקב של 5 שנים כאשר Ki-67 נקבע בשיטת tissue microarrays. באנליזה חד-משתנית (univariate) הושוו מקרים של Ki-67 נמוך מ-20%, למקרים של Ki-67 גבוה מ-20%, ונמצא ש-Ki-67 בערכיו הנמוכים הוא גורם פרוגנוסטי להישרדות נקייה מתהליך גרורתי מרוחק, בעוד שבערכיו הגבוהים הוא מהווה גורם סיכון למחלה מפושטת (HR=2.7 עם p=0.003).

מטה-אנליזה שכללה 12,155 משתתפות, הראתה שרמות גבוהות של Ki-67 בשלב מוקדם של סרטן השד, כרוכה בסיכון מוגבר להישנות המחלה (recurrence), לפרוגנוזה גרועה יותר ולהישרדות נמוכה יותר (de Azambuja וחב' ב-Br J Cancer משנת 2007). מטה-אנליזה נוספת שבחנה הישרדות ב-32,825 נשים עם סרטן שד בשלב מחלה מוקדם, מצאה שביטוי של Ki-67 היה כרוך בשיעורי הישרדות גרועים יותר (Stuart-Hearris וחב' ב-Breast משנת 2008). למרות זאת, נראה שסמן זה עדיין אינו בשל לשימוש שגרתי. הוועדה לסמני סרטן של החברה האמריקנית לאונקולוגיה קלינית (ASCO), לא המליצה על השימוש ב-Ki-67 כמדד פרוגנוסטי בנשים שזוהו זה מקרוב עם סרטן שד בגין מה שמוגדר כ-insufficient Quality assurance" " על ידי Harris וחב' ב-J Clin Oncol משנת 2007.

Inwald וחב' אנשי אוניברסיטת Regensburg, ערכו מחקר שנועד להעריך את ערכו של Ki-67 כסמן פרוגנוסטי, כמו גם לנתח את הקשר בין ביטוי חלבון זה לבין פרמטרים היסטולוגיים בשגרה הקלינית של טיפול בסרטן השד. נתונים נאספו מרישומי תיעוד באזור העיר רגנסבורג בחבל בוואריה בדרום גרמניה. המדגם כלל 4,692 נשים שאובחנו בין השנים 2005 ו-2011 עם סרטן שד, כאשר ב-3,658 מתוכן נקבעה באופן רוטיני רמת הביטוי של Ki-67. בכל 3,658 הנשים הללו אובחן תהליך מפושט וחודרני של סרטן שד. המתאם החזק ביותר נמצא בין רמת Ki-67 לבין ה-grading ההיסטולוגי של השאת בשד, כאשרp<0.001 . במושגים של ניתוחי סך-הישרדות (overall survival), חולק Ki-67 ל-5 קטגוריות, כאשר קטגוריית ההתייחסות הייתה זו בה Ki-67 בא לביטוי בפחות מ-15% מהתאים שנסקרו.

(להכניס כאן ברצף את שני התרשימים מתחתם המקרא מתחיל במילים....עקומת Kaplan-Meyer.....)

(להכניס כאן את הטבלה (Table 5) מתחתיה מופיע ..לקוח מ-Inwald וחב'...)

באנליזה רב-משתנית (multivariate) נמצא ש-Ki-67 היה פרמטר פרוגנוסטי בלתי-תלוי בגורמים קליניים או היסטולוגיים הן לגבי הישרדות חופשית ממחלה (DFS) וכן להישרדות בכלל (OS). שיעור ההישרדות בנשים עם Ki-67 נמוך מ-15% לתקופה של 5 שנים חופשית ממחלה נקבע כ-86.7%, ואילו שיעור ההישרדות בכלל בנשים אלו היה 89.3%. זאת בהשוואה לנשים בהן ערכי Ki-67 נמצאו גבוהים מ-45%, בהן שיעור ההישרדות ל-5 שנים ללא מחלה היה 75.8%, ואילו שיעור ההישרדות בכלל היה 82.8%.

ברבות מ"טביעות אצבע" גנטיות אלו, רוב הגנים הם גנים של שגשוג (proliferation) בקביעת הפרוגנוזה של המטופלת. באשר ל-Ki-67, מספר מחקרים הראו שאינדקס שגשוג גבוה של Ki-67 כרוך בהישרדות גרועה יותר נקייה-ממחלה, ובמשך הישרדות כללית קצר יותר, של מטופלות עם קשרי לימפה נגועים או בלתי נגועים (Railo וחב' ב-Tumour Biol משנת 2007; Ahlin וחב' ב-Histppathlogy משנת 2007; Brown וחב' ב-Clin Cancer Res משנת 1996; Pinder וחב' ב-Br J Cancer משנת 1995; Rudolph וחב' ב-J Natl Cancer Inst משנת 1999 ו- Jung וחב' ב-Ann Surg Oncol משנת 2009). כמו כן נמצא ש-Ki-67 הוא מנבא טוב יותר של תגובה לטיפול כימותרפי (Urruticoeches וחב' ב-J Clin Oncol משנת 2005).

מספר גדול מחקרים בוצעו לקבוע את ערכו של Ki-67 כסמן סרטני. יש הסכמה שרמות גבוהות של Ki-67 מצביעים על גידול אגרסיבי ועל פרוגנוזה גרועה. מחקר בריטי מצא שאופיו של סרטן שד יכול להיות שונה בהתאם לרגישותו להורמונים, ולסטאטוס הנגיעות של קשרי הלימפה. אך עם תאי סרטן השד מתקבלים עשירים במיוחד עם Ki-67, הסיכון להישנות הנגע גדולה יותר מהממוצע.

בשנת 2011 "קבוצת העבודה הבינלאומית להערכה של Ki-67" פרסמה ב-J Natl Cancer Inst המלצות של Dowsett וחב', בהן הודגש הפוטנציאל של מדד ה-Ki-67 באשר להערכת הפרוגנוזה, ניבוי התגובה לטיפול כימותרפי, וכמדד דינאמי ליעילות הטיפול בסרטן שד. בכינוס הקונצנזוס ב-St Gallen בשנת 2013 רוב המשתתפים הצביעו בעד הכללת Ki-67 בין השיקולים להתחלת adjuvant chemotherapy. יחד עם זאת, מסקנות ASCO, כמו גם אלו של St Gallen, ואף אלה של וועדה בינתחומית בגרמניה, אינן ממליצות על הכנסת Ki-67 באופן מיידי לשגרת הטיפולים והמדידות בסרטן השד.

לאחרונה, יצאו לשימוש מספר סמנים מולקולאריים, כולל ERCC1 או excision repair cross-complementation group 1, כמו גם RRM1 או ribonucleotide reductase M1, ו-ROS1, שניתן להשתמש בהם כסמני ניבוי להישרדות וכן להעריך את השפעת הטיפול. אך יחד עם זאת, שיטות ה-IHC של שלושת סמנים אלה שנויות במחלוקת, והם בעלי שימוש מוגבל בשגרת המעקב הפתולוגי. נראה אם כן שיתרונותיו של Ki-67 רבים ממגבלותיו, כפי שהדגיש Dowsett בסיכום המלצות כינוס בינלאומי משנת 2011 על תפקיד Ki-67 בתחום סרטן השד שהתפרסם ב-J Natl Cancer Inst באותה שנה.

בכל הקשור להתייחסות לחלבון Ki-67, הקהילייה המדעית מתחלקת ל-3 קבוצות: הקבוצה הראשונה מתחום הפתולוגיה, מכירה היטב את Ki-67 ואת הנוגדנים כנגדו, כאשר הקבוצה השנייה של אנשי רפואה מתחומים אחרים נוטה להתעלם מחלבון זה. הקבוצה השלישית, שהיא גם הקטנה ביותר מתעניינת בעיקר בביולוגיה של Ki-67 ובתפקודו. על כל פנים נראה שלמעלה מ-3 עשורים מאז תואר לראשונה, Ki-67 לה זכה עדיין להכרה גורפת ולניצול בשגרת העשייה הטיפולית בתחום מחלת הסרטן. אם קיימת הסכמה בין החוקרים לגבי Ki-67, היא קשורה לעובדה ש-Ki-67, היה ונותר פרמטר שנוי במחלוקת באשר ליתרונותיו לגבי החלטה על טיפולים בסרטן השד.

ראיות עדכניות לערך האבחוני של Ki-67 בסוגי סרטן שונים:

על ידי מדידה של כמות התאים הסרטניים המבטאים את האנטיגן Ki-67, ניתן לעשות הערכה של סינתזת DNA. מחקרים מרמזים לכך שאנליזה של דגימות רקמה מקובעת בפרפין עשויה לספק מידע פרוגנוסטי שימושי במספר סוגי שאת סרטניות. המתאם של labeling index של Ki-67 עם הפרוגנוזה של שאתות באיברים רבים נידון בהרחבה במחקרים אחדים, ביניהם סרטן השד (Veronese וחב' ב-Cancer משנת 1993, ו-Tawfik וחב' ב-Hum Pathol משנת 2013), סרטן הערמונית (Miyake וחב' ב-Urol Oncol משנת 2010), סרטן שלפוחית השתן (Pfister וחב' ב-Hum Pathol משנת 1999), סרטן נוירו-אנדוקריני במערכת העיכול ובבלוטת הלבלב (Jamali וחב' ב-Endocr Pathol משנת 2008) וסרטן ריאות (Macdonald וחב' ב-Eur J Cancer משנת 2004, וכן Haga וחב' ב-Ann Thorac Surg משנת 2003 ו-Hommura וחב' ב-Clin Cancer Res משנת 2000).

ייאמר, שבחלק מהמחקרים האחרונים המצוטטים, נמצא ש-Ki-67 נכשל כגורם פרוגנוסטי בלתי תלוי, באנליזה רב-משתנית. Takano וחב' ב-Japan J Clin Oncol משנת 2008, ו-Bergethon וחב' ב-J Clin Oncol משנת 2012, דיווחו שבסרטן ריאות נמצא שיש ל-Ki-67 ערך פרוגנוסטי מוגבל או אף שלילי. לעומתם, Cheng וחב' ב-N Eng J Med משנת 2007, הראו שה-score הגבוה ביותר של Ki-67 ב-NSCLC, באדנוקרצינומה וב-squamous cell carcinoma של הריאה, היו במתאם טוב עם ההישרדות הכללית (OS), באנליזה חד-משתנית ורב-משתנית. אי ההסכמה במחקרים השונים, עלולה לנבוע כתוצאה משוני בשיטת הבחינה ה-IHC, והן בהטרוגניות של הרקמות הנבחנות, וכן בבחינה מיקרוסקופית של מספר שדות קטן מדי.

בשנת 2014 פרסמו Ding וחב' ב-Urol Oncol מחקר שנועד לבחון את משמעות Ki-67 כמדד בלתי-תלוי בשילוב עם גורמי הסיכון של EORTC בהערכה של סרטן שלפוחית השתן, ושיפור ה-risk stratification של NMIBC או non-muscle invasive bladder cancer. בניסוי זה שנמשך מאוקטובר 2002 עד יולי 2010, השתתפו 332 מטופלים שעברו פרוצדורת TUR של סרטן השלפוחית ואובחנו עם NMIBC על ידי אנליזה היסטו-פתולוגית. הביטוי של Ki-67 נקבע הן מבחינת כמות השטח הנצבע והן מבחינת עוצמת הצביעה, והתבצע ניתוח המִתאם בין ביטוי Ki-67 לבין המאפיינים הקליניים והפתולוגיים.

המעקב אחר משתתפי המחקר נמשך 47 חודשים בממוצע, ונמצא שב-119 מתוכם הייתה חזרה של הגידול, וב-40 מהם נרשמה התקדמות בממדי הגידול. נמצא שחיוביות בביטוי Ki-67 (מעל 25%) נרשמה ב-108 משתתפי המחקר (32.5%), והוא נכרך משמעותית עם ביטוי גבוה של מאפייני סיכון (EORTC). באנליזת רב-משתנים, ביטוי Ki-67 נמצא גורם סיכון בלתי-תלוי ומנבא טוב לחזרת הגידול (HR=2.14; ו-p<0.0001). או להתקדמותו ( HR=2.97; ו-p=0.004). עקומות Kaplan-Meier הצביעו על כך ששילוב מאפייני סיכון של EORTC עם ממצאי צביעת Ki-67 הביאו לניבוי מדויק יותר של חזרת הגידול או מידת התקדמותו (0.0001p<).

ערך פרוגנוסטי של Ki-67 במטופלים עם סרטן כליות גרורתי:

Gorelov וחב' פרסמו בשנת 2014 ב-Urologia תוצאות מחקר שנועד לקבוע את תפקיד Ki-67 בבחירת החלופות הניתוחיות במטופלים עם סרטן כליות גרורתי. במדגם נכללו 71 מטופלים עם RCC גרורתי: בקבוצה הראשונה נכללו 16 מטופלים שעברו nephrectomy והרחקה מלאה של גרורות; הקבוצה השנייה כללה 55 מטופלים שעברו רק cytoreductive nephrectomy. אנליזה אימונו-היסטוכימית של הרקמות שהורחקו בוצעה בכל המטופלים להערכת רמות הביטוי של Ki-67. כאשר הושוו התוצאות הקליניות במטופלים שעברו הרחקת גרורות בתלות בביטוי Ki-67 (של פחות מ-10% או יותר מ-10%), נמצאה הגברה משמעותית (p=0.0001) בהישרדות של אלה בהם רמת Ki-67 הייתה נמוכה מ-10%. אותה תוצאה התקבלה גם בקבוצת המטופלים בהם בוצעה רק nephrectomy. ברמת ביטוי של Ki-67 הנמוכה מ-10%, שיעור ההישרדות במטופלים שעברו פרוצדורה כפול של nephrectomy והרחקת הגרורות נמצא גבוה משמעותית (p=0.001) בהשוואה לאלה שעברו רק nephrectomy. נמצא אם כן מתאם טוב בין רמת ביטוי Ki-67 לבין דרגת התהליך הגרורתי ב-RCC.

הביטוי של Ki-67 בסרטן הערמונית והיחס בינו לבין מדרג Gleason כמנבאים של תמותה מסרטן הערמונית במחקר ב-Mayo Clinic:

בשנת 2014 פורסם ב-Mayo Clin Proc מחקרם של Tollefson וחב' שבוצע בין השנים 1993 ו-2012, בו נמדדה כמותית ה-DNA ploidy ורמת Ki-67 ברוב הדגימות בהן בוצעה ביופסיית מחט. המדגם כלל 451 גברים עם סרטן ערמונית מוכח בביופסיה, שטופלו בין ינואר 1995 עד דצמבר 1998 בהרחקה מלאה של הבלוטה, ללא טיפול הורמונאלי. נתונים קליניים ונתוני הביופסיה התקבלו לפני ניתוח הרחקת הבלוטה, ועובדו במודל רב-משתנית של Cox proportional hazards regression על מנת לנבא תהליך גרורתי ומוות ספציפי לתהליך הסרטני.

תקופת המעקב הממוצעת נמשכה 12.9 שנים, כאשר במהלכה נמצא תהליך גרורתי סיסטמי או מקומי ב-46 מתוך משתתפי המחקר, ו-18 מטופלים מתוכם נפטרו במחלה. באנליזה רב-משתנית נמצא שביטוי Ki-67 בדגימות הביופסיה שנלקחו מהמטופלים, ממצאי החודרנות ה-perineural, ומדרג Gleason נתנו תמונה מהימנה של התהליך הגרורתי, כאשר שלושה פרמטרים אלה היו כרוכים במוות תוצאת תהליך סרטני זה, עם concordance index של 0.892. לאחר התאמה לחודרנות ה-perineural ןלמדרג Gleason, נמצא שכל עלייה של 1% בביטוי של Ki-67 הייתה כרוכה בעלייה של 12% במוות-תלוי סרטן הערמונית (p<0.001). הביטוי של Ki-67 כשלעצמו נמצא מנבא חזק של התוצאות הקליניות של סרטן הערמונית, שיכול לשפר את יכולת הניבוי של האלגוריתמים הטיפוליים הנהוגים כיום. בהתחשב בעלות הנמוכה של בדיקת Ki-67, קלות הביצוע, ועוצמת הניבוי הגדולה שלו, בעלי מחקר זה מאמינים שהוספת מבדק Ki-67 לפרוטוקול הסטנדרטי של המבדקים האחרים הנהוגים בסוג סרטן זה, בהחלט סבירה.

Ki67 הוא סמן פרוגנוסטי יעיל של NSCLC, כאשר הרקמה הנבחנת נמצאת הטרוגנית:

Tabata וחב' פרסמו ב- BMC Clin Pathol בשנת 2014 את תוצאות מחקרם על חולי סרטן ריאות (68 גברים ו-32 נשים) בטווח הגילים שבין 33 ו-88 שנה (גיל ממוצע 66.3 שנה). מתוך 100 משתתפי המחקר, נפטרו במחלה 44 משתתפים עם טווח הישרדות של 6-156 חודשים, עם משך הישרדות ממוצע של 44.6 חודשים). כמו כן 34 נותרו בחיים לאחר תקופת מעקב ממוצעת של 21.6 חודשים. שניים ממשתתפי המחקר נפטרו מסיבות אחרות, ונתוני 20 משתתפים אבדו, מחוסר שיתוף פעולה. נתוני השלב הפתולוגי של המחלה היו ידועים לגבי 91 מטופלים, שכללו 43 ב-stage 1A, בעוד ש-22 היו ב-stage IB, שני משתתפים ב-stage IIA, עוד 9 מהם ב-stage IIB, עוד 13 משתתפים ב-stage IIIA, אחד ב-stage IIIB ואחד ב-stage IV. בין 98 משתתפים, 5 טופלו באופן נאו-אדג'ובנטי לפני הניתוח, ואילו 31 מהם טופלו באופן אדג'ובנטי לאחר הניתוח.

(להכניס כאן את התרשים שמתחתיו מופיע המקרא: המתאם בין צביעה אימונו-היסטוכימית של Ki-67 לבין ה-grading של NSCLC....)

הדירוג ההיסטולוגי היה כדלקמן: ב-61 מהמקרים אובחנה adenocarcinoma, ב- 30 מקרים squamous cell carcinoma, ב-3 מקרים small cell carcinoma, ב-4 מקרים large cell carcinoma, וב-2 מקרים adenosquamous cell carcinoma. כמו כן היו נתונים היסטופתולוגיים של pleural invasion, תהליכי גרורות פולמונאריות, חודרנות וסקולארית ופרמיאציה לימפטית.

המתאם בין רמת Ki-67 להישרדות הכללית בסרטן ריאות:

על פי עוצמת הצביעה האימונו-היסטוכימית של Ki-67, נעשתה חלוקה ל-2 קטגוריות, של עוצמות צביעה 0 ו-1 לעומת עוצמות צביעה 2 ו-3. על ידי שימוש בעקומות Kaplan-Meyer נמצא שסך-ההישרדות (OS או overall survival) של מטופלים עם צביעת Ki-67 בדרגת צביעה 2-3, היה משמעותית קצר יותר, בהשוואה לאלה עם דרגת צביעה של 0-1, כאשר ההישרדות הממוצעת של אלה עם דרגת צביעה של Ki-67 מעל 2 הייתה 29.4 חודשים לעומת משך הישרדות ממוצעת של 56.6 חודשים באלה עם דרגת צביעה של Ki-67 הנמוכה מ-2, הבדל משמעותי סטטיסטית (p<0.001).

הערכה אוטומטית של Ki-67 בשאת נוירו-אנדוקרינית של בלוטת הלבלב:

Xing וחב' פרסמו בשנת 2013 ב-Med Image Comput Assist Interv, את תוצאות מחקרם על הערכה אוטומאטית של רמת Ki-67 בשאת נוירו-אנדוקרינית של הלבלב. בשיטה אוטומטית זו של קביעת רמת Ki-67 לצורך אבחון תהליך סרטני בבלוטת הלבלב, נבחנו 101 דגימות בשיטת TMA או tissue microarray, ונמצא שמדידה אוטומטית של Ki-67 הייתה מאוד מדויקת בהשוואה להערכה של פתולוגים מיומנים.

בנוסף, ארגון הבריאות העולמי WHO)) המליץ לכלול את פעילות Ki-67 בין שאר המדדים הנלקחים בחשבון לצורך grading של גידולים נוירו-אנדוקריניים של בלוטת הלבלב ושל צינור העיכול. הנחיות אלה סוכמו על ידי Kloppel וחב' בשנת 2004 ב-Ann NY Acad Sci. גם Jamali ו-Chetty מחקרם משנת 2008 ב-Endocrn Pathol, קבעו שביטוי-יתר של Ki-67 כרוך בפרוגנוזה גרועה במטופלים עם גידולים נוירו-אנדוקריניים.

אינטרפרטציה של צביעת Ki-67 ואופן ההערכה (scoring) של תאים צבועים:

הביטוי של Ki-67 או ה-labeling index שלו, מוערך בדרך כלל כאחוז של תאי סרטן הנצבעים חיובית על ידי הנוגדן MIB1, כאשר צביעת הגרעין של תאים אלה היא הקריטריון המקובל ל"חיוביות" הצביעה. צביעת הציטופלזמה של התאים, ולעתים אף צביעה היקפית של ממברנת התאים, יכולה להופיע בחומר של סרטן השד במקרים של שינויים המוגדרים כ-squamous metaplastic, הכרוכים בסטאטוס של HER2 ו-ER בקרצינומה חודרנית של סרטן השד (עפ"י Faratian וחב' ב-Histopathlogy משנת 2009). הקפדה על הפרוטוקול הקדם-אנליטי, או אפילו שימוש בנוגדן SP6 עשויים להפחית באופן חלקי את הצביעה החוץ-גרעינית הזאת, אך כאשר היא מופיעה, יש להתעלם ממנה לצורך ה-scoring של Ki-67. על מנת להגביר את אמינות ה-IHC של Ki-67, רצוי להשתמש כביקורת בדגימות הנחשבות חיוביות לצביעה זו, כמו לדעת את הנתונים המיטוטיים של תאי סרטן השד, להשתמש כביקורת בחומר הנלקח מ-breast ducts נורמאליים, וכן להכיר את אופן הצביעה של לימפוציטים תקינים. במידה פחותה חיוני גם להכיר את אופן הצביעה של תאי אנדותל ותאי סטרומה.

שיטות להחלטה על רף נורמה עליון של תאים חיוביים ל-Ki-67, שיוכל להבדיל בצורה מהימנה בין תוצאה חיובית או שלילית, נידונו בהרחבה בספרות הרפואית (Hollander וחב' ב-Stat Med משנת 2004). לגבי IHC של Ki-67, נוסו cutoffs אחדים אם כי רוב המחקרים ממליצים על תחום של 10-20% כתואם ביותר על פי המטה-אנליזה של Stuart-Harris וחב' שהופיעה ב-Breast משנת 2008, ואשר הקיפה 85 מחקרים שכללו סך הכול 32,825 מטופלות עם סרטן השד.

סוגיות מתודולוגיות סביב מדידת Ki-67: תיקוף אנליטי.

בשנות ה-80, הנוגדן המקורי כנגד Ki-67, יושם לצורך IHC בחומר טרי קפוא. מאוחר יותר, נוגדנים חד-שבטיים ממקור של עכבר פותחו והתקבלו
תוצאות הדירות על ידי צביעת חתכים מקובעים בפורמלין ומשוקעים בפרפין. הנוגדן הפופולארי ביותר בשימוש היה ונותר ה-clone MIB1 שהוא בעל התכונה המיטבית של גילוי אפּיטוֹפּ אופייני ל-Ki-67 החוזר על עצמו 16 פעמים לאורך חלבון זה, מה שמגביר את רגישות הצביעה (Scholzen ו-Gerdesב-J Cell Physiol משנת 2000). יתרון נוסף של הנוגדן האמור, הוא יכולתו להיקשר ולצבוע Ki-67 בתנאים מגוונים (McCormick וחב' ב-Histopathology משנת 1993), בהשוואה לסמני פרוליפרציה אחרים כמו PCNA או Proliferating Cell Nuclear Antigen.

אך למרות שה-IHC של Ki-67 סובלנית למגוון של פרוטוקולים, מדגיש Boon ב- Eur J Morphol משנת 1996, שיש להימנע מפעילות פרוטאוליטית או מתנאים של pH נמוך. יש לציין שלמרות ש-MIB1 נחשב ל-"Gold standard", יש המשתמשים בנוגדן חד-שבטי ממקור ארנבת כנגד Ki-67, שסימונו SP6, המכיר את אותו אפּיטוֹפּ כמו MIB1, מה שבא לביטוי מהופעת פסים זהים ב-Western immunoblots (עפ"י Key וחב' ב-Lab Invest משנת 1993), ויש לו לכאורה רגישות גבוהה יותר (Wong וחב' ב-Arch Pathol Lab Med משנת 2007), ועל פי Zabaglo וחב' ב-J Clin Pathol יש לו אף יתרונות מסוימים באנליזה בחתכים של סרטן השד (על פי Niu וחב' ב-Clin Cancer Res משנת 2010).

השאיפה לכלול מדידת חלבון זה בשגרה הקלינית, חייבת קודם לכול להבטיח מתודולוגיה הדירה ועקבית , במלים אחרות התיקוף האנליטי (validation), חייב להיות בדרגת סטנדרטיזציה על פי עקרונות EGAPP אוEvaluation of Genomic Applications in Practice and Prevention (עפ"יTeutsch וחב' ב-Genet Med משנת 2009). למרות שבדיקת Ki-67 נחשבת פשוטה יחסית לביצוע כבדיקת IHC, ישנם מספר שלבים במהלך ביצוע הבדיקה שעלולים להכניס שוֹנוּת בתוצאות הבדיקה בין המעבדות המבצעות אותה.

מספר צעדים קדם-אנליטיים עלולים להשפיע ולפגום במדידת Ki-67. הם כוללים את סוג הביופסיה, את משך הזמן מלקיחת הרקמה עד לשלב הקיבוע, בסוג ה-fixative, משך הקיבוע, ובצורת האחסון של הדגימה לפרק זמן ממושך. מידע מ-2 מחקרים עדכניים מצביע על כך שבאופן כללי החלבון Ki-67 מגלה סובלנות גדולה יותר לשונות בצעדים הקדם-אנליטיים בהשוואה לרוב שיטות IHC האחרות להערכת סרטן השד (Pinhel וחב' ב-Breast cancer Res משנת 2010, ו-Bai וחב' ב-Modern Pathol משנת 2011). לדוגמה, הצביעה של Ki-67 של ביופסיות מליבת הנגע המבוצעת של חומר טרי לא הראתה כל שינוי בעוצמת הצביעה גם לאחר איחור של 20-80 דקות עד לקיבוע החומר, ולא הראתה כל שינוי באם המדידה של הצביעה התבצעה על כל חתך הביופסיה. לעומת זאת, הבדלים בצביעה של גרעיני התאים ניכרו לעתים קרובות במחקרים אלה מהסיבות הבאות:

נמצא שקישור הנוגדנים לחלבון זה תלוי בגורמים שונים כגון חוזק יוני או אפילו הקישור של Ki-67 לDNA שהוא פולימר אניוני. הועלתה לדוגמה טענה שמולקולות חדשות של החלבון Ki-67 המסונתזות בציטופלזמה אינן יכולות להתגלות בגלל מיסוך של השיירים האנטיגניים. כמו כן, שינויי קונפורמציה של Ki-67 עקב קישורו עם חלבונים אחרים, או עם חומצות גרעין, עלול להפריע לקישור הנוגדן ל-Ki-67. נמצא לדוגמה, שבנוכחות יוני סידן, המבנה של Ki-57 משתנה באופן שהפחית משמעותית את הקישור של הנוגדן MIB1 (עפ"י Shi וחב' ב-J Histochem Cytochem משנת 1999).

נתונים מעבדתיים לגבי ביצוע המבדק:

השיטה האימונו-היסטוכימית טובה לקביעת השגשוג של תאי סרטן ברקמות משוקעת בפרפין, ומקובעת בפורמלין. ככל שחתכי הביופסיה מקובעים מהר יותר, כך גם צביעת Ki-67 בגרעין נראית אחידה יותר, אך אי הקפדה בתחום זה יכולה להתבטא באזורים עם עוצמת צביעה משתנה. אמנם שוֹנוּת זו אינה פוגעת בהערכת Ki-67 כאשר ההערכה נעשית ויזואלית על ידי הפתולוג, אך עלולה להיות מסובכת יותר כאשר האנליזה נעשית בשיטות imaging דיגיטאליות. שיטות הצביעה המקובלות לגבי Ki-67 בסרטן השד הן על ידי קיבוע עם neutral buffered formalin, ולאחר הדגרה על ידי הנוגדן החד-שבטי MIB1, המופיעה בצבע חום, מתבצעת צביעה נגדית עם Meyer's hematoxylin המופיעה בצבע כחול.

מספר מחקרים בחנו את ההדירות של צביעת IHC של Ki-67, ומצאו שגורמים קדם-אנליטיים עלולים להפחית באופן כזוב את ה-labeling index של החלבון הזה ויש להימנע מהם: מדובר בהשהיית קיבוע הדגימה למשך הלילה, הקפאת הדגימה לצורך אנליזה של frozen section לפני הקיבוע, או שימוש באתנול או בתמיסת Bouin במקום בבופר פורמלין ניטראלי, וכן שימוש ב-EDTA או בפרוטוקולים של acid decalcification (עפ"י Mengel וחב' ב-J Pathol משנת 2002, ו-Benini וחב' ב-Cell Prolif משנת 1997).

קיבוע בבופר פורמלין ניטראלי למשך 4-48 שעות נמצא מתאים (Munakata ו-Hendricks ב-J Histochem Cytochem משנת 1993), ו-Arber דיווח ב-Appl Immunohistochem Mol Morphol שקיבוע בפורמלין שנמשך אפילו 154 יום לא הפחית את עוצמת הצביעה של Ki-67. נראה בסיכום נקודה זו שקיבוע בפורמלין למשך 8-72 שעות הוא סביר בהחלט עבור Ki-67 (עפ"י Hammond וחב' ב-Arch Pathol Lab Med משנת 2010). כאשר הרקמה מקובעת היטב ומשוקעת בפרפין, האנטיגניות של Ki-67 יכולה להישמר שנים רבות (Cattoretti וחב' ב-J Pathol משנת 1992). יחד עם זאת, יש דיווח על אובדן של אימונו-ריאקטיביות של Ki-67, אם הבלוקים נחתכים והחתכים נשמרים על זכוכיות-נושא מזכוכית בטמפרטורת החדר למשך 3 חודשים או יותר (DiVitto וחב' ב-Lab Invest משנת 2004). ציפוי בפרפין של זכוכית הנושא תחת ייבוש בחנקן מגן אך באופן חלקי מפני אובדן האנטיגניות של Ki-67.

Muscle-specific kinase (MuSK) autoantibodies

2015-07-19T11:06:51Z

בן עמי סלע: יצירת דף עם התוכן "== Muscle-Specific Kinase (MuSK) autoantibodies == תחום: הערכת התגובה האוטו-אימונית ב-myasthenia gravis. טווח ערכים תקי..."

== Muscle-Specific Kinase (MuSK) autoantibodies ==

תחום: הערכת התגובה האוטו-אימונית ב-myasthenia gravis.
טווח ערכים תקין: נוגדנים כנגד MuSK בריכוז השווה או נמוך מ-0.02 ננומול'/ליטר.
יוצר הערך: פרופ' בן-עמי סלע.

== מטרת הבדיקה ==

אבחון וריאנט של MG על רקע נוגדנים עצמיים ל-MuSK, זאת כאשר מבחן הקו-הראשון של חיפוש אחר נוגדנים כנגד הקולטן לאצטילכולין מתקבל שלילי בנבדקים עם אבחנה קלינית ואלקטרו-פיזיולוגית של MG. קביעה כמותית של רמת בסיס של נוגדנים ל-MuSK המאפשרת השוואה עם רמת נוגדנים אלה בבדיקה עתידית אם יש החמרה בתסמיני החולשה.

== בסיס פיזיולוגי של myasthenia gravis ==

המחלה האוטואימונית myasthenia gravis (להלן MG), היא המפגע השכיח ביותר של הסינפסה הנוירו-מוסקולארית, הפוגעת ב-10-20 איש מתוך 100,000(עפ"י Phillips ב-Ann NY Acad Sci משנת 2003). למעשה, רק ב-1960 הציע Simpson ב-Scott Med J שמדובר במחלה אוטואימונית, זאת על בסיס התצפיות שלו לפיהן אלה עם MG סבלו בשכיחות גבוהה יותר ממחלת בלוטת תריס אוטואימונית, מדלקת פרקים שגרונית, או מ-SLE. חלפו 16 שנים עד ש-Lindstrom וחב' אישרו במאמר ב-Neurology משנת 1976 את הבסיס האוטואימוני של MG, כאשר מצאו ש-85% מאלה עם MG הכילו נוגדנים עצמיים לקולטנים הניקוטיניים של אצטילכולין (להלן AChR). יחד עם זאת, חלפו עוד 25 שנה, עד ש-Hoch וחב' הדגימו ב-Nat Med משנת 2001, שב-70% מחולי MG שאינם מכילים נוגדנים ל-AChR ומוגדרים כ-seronegatives, ניתן למצוא בנסיוב נוגדנים ל-muscle-specific receptor tyrosine kinase(להלן MuSK-Ab).

נתונים אפידמיולוגיים של MG:

לגבי הנתונים בארה"ב, השיעור השנתי של מקרים חדשים של MG אינו עולה על 2 מקרים לכל 100 אלף, ובהתאם מספר המאובחנים עם MG בארה"ב נע על פי הערכות שונות על 0.5-14.2 מקרים ל-100 אלף, אם כי יש נטייה לעליה בשיעורים אלה ב-20 השנים האחרונות בעקבות העלייה בתוחלת החיים, אך גם כתוצאה מאבחון מקרים בקבוצת הגיל הצעירה יותר. בערך 15-20% מהמאובחנים עם MG יחוו בשלב זה או אחר "משבר מיאסטיני", כאשר כ-75% מבין אלה יחוו משבר זה תוך שנתיים מאבחון המחלה אצלם. באשר לשיעורי המחלה בעולם כולו, נציין שבבריטניה מדובר על 15 מקרים לכל 100 אלף, בקרואטיה מדובר על 10 מקרים ל-100 אלף, ואילו בסרדיניה מספר מקרי MG טיפס מ-0.75 ל-100 אלף בשנת 1958, ל-4.5 מקרים לכל 100 אלף בשנת בשנת 1986.

MG יכולה להתרחש בכל גיל כאשר בין נשים השכיחות מגיעה לשיאה בעשור השלישי לחיים, בעוד שבין גברים המחלה מאובחנת בעיקר בעשורים ה-5 וה-6 לחיים. גיל האבחון הממוצע הוא 28 שנה בין נשים, ובין הגברים -42 שנה. מוכרת התופעה של MG חולפת ביילודים ותינוקות בגיל הרך אליהם הועברו נוגדנים כנגד AChR של האם שעברו לעובר דרך השליה. רוב התינוקות הנולדים לאימהות עם MG, מכילים נוגדנים אלה בשעת הלידה, אך 10-20%מתוכם מפתחים MG בגיל הרך, זאת כנראה כתוצאה מהפעולה המגינה של α-fetoprotein המעכב את קישורו של הנוגדן ל-AChR לקולטן זה. יש המציעים לבדוק את רמת נוגדנים אלה באישה ההרה הידועה כלוקה ב-MG, ואם רמתם גבוהה ביוחד, יש הגורסים שכדאי להפחית רמה זו על ידי plasmapheresis.

מקובל ששכיחות MG בנשים, ביחס לזו בגברים, היא 3:2 , כאשר השכיחות בנשים דווקא גבוהה יותר באלו בנות 20-30 שנה, כאשר בין הגברים גיל האבחון גבוה ב-13-20 שנה. ההתבטאות העינית (ocular) של MG שכיחה יותר בקרב גברים. הופעת MG בקרב ילדים שכיחה יותר בקרב זכרים מאשר בנקבות ביחס של 5:1. MG בגיל הצעיר שכיחה מעט יותר בקרב אסיאתים מאשר בקבוצות אתניות אחרות.

מיאסתניה גראביס על רקע נוגדנים עצמיים ל-MuSK:

MuSK הוא טירוזין קינאזה טרנס-ממברנאלי בעל משקל מולקולארי מקורב של 100,000 דלטון. חלבון זה נוקה במקור מהגוף החשמלי העתיר בסינפסות של דג הסחוס Torpedo californica על ידי Jennings וחב' בשנת 1993 ופורסם ב-Proc Natl Acad Sci USA. בצומת (junction) עצב-שריר בבעלי-חוליות, מופרשים בקצוות האקסונים המוטוריים גופיפים (vesicles) המפרישים אצטילכולין הנקלט על ידי הקולטנים הבתר-סינפטיים של נוירוטרנסמיטור זה. וכך מתחיל תהליך כיווץ השריר. מעבר יעיל של הנוירוטרנמיטור תלוי במארז הדוק של של הקולטנים של אצטיל כולין לצברים (clusters) של קולטנים אלה, ומי שחיוני ליציבות של צברי קולטנים אלה הוא MuSK המהווה כמובן חלק מהקולטן וממוקם בקצה ה-C טרמינאלי שלו. (עפ"י DeChiara וחב' ב-Cell משנת 1996, וכן Kummer וחב' ב-Curr Opin Neurobiol משנת 2006 ו-Wu וחב' ב-Development משנת 2010).

המבנה של MuSK ושל הקומפלקס של MuSK:

הגן MuSK ממוקם בעכבר בכרומוזום 4, אך באדם הוא ממוקם על כרומוזום 9. בגן 14 exons התורמים ליצירת של מספר שעתוקים (transcripts), שרובם מקודדים בשינויים קלים לפוליפפטיד השלם (100,000 דלטון) המהווה את המבנה הטרנס-ממברנאלי החוצה את ממברנת התא, כאשר הקצה ה-C טרינאלי של MuSK נמצא בציטפלזמה, והקצה ה-N טרמינאלי משתרבב מחוץ לתא. החלק החוץ-תאי של MuSK מורכב מ-4 מקטעים דמויי-אימונוגלובולין (IgG3, IgG2, IgG1 ו-IgG4) וביניהם מקטע עתיר בציסטאין המוגדר כ-C6. המקטע של MuSK הממוקם בתוך הממברנה קרוי TM או transmembrane domain, והמקטע הציטופלזמטי הראשון של MuSK הסמוך לממברנה קרוי JM אוjuxtamembrane domain, ומיד אחריו ממוקם הקטע הקטליטי של tyrosine kinase.
(להכניס כאן את התרשים שמתחתיו מופיע...המבנה של הקומפלקס של MuSK.....)

להשלים את תמונת הקומפלקס של MuSK נתעכב על 3 מרכיבים נוספים: החלבון Tid1 או tumourous imaginal discs preotein, נקשר באופן מובנה (constitutive) לחלק הציטופלזמי של MuSK (עפ"י Linnoila וחב' ב-Neuron משנת 2008). חלבון נוסף Dvl או disheveled (חלבון סתור) נקשר למקטעי JM והקינאזה של MuSK, והוא שכורך את MuSK עם PAK1 או p21-activated kinase (עפ"י Luo וחב' ב-Neuron משנת 2002). כל המרכיבים הללו של קומפלקס האיתות של MuSK, נדרשים לתווך ביצירת צברי AChR בתגובה ל-agrin.

איתות דרך קולטן MuSK:

הליגנד הנקשר ל-MuSK הוא פרוטאו-גליקן מסוג heparin-sulfate הידוע כ-agrin, המופרש מקצות תאי עצב מוטורי (עפ"י Mittaud וחב' ב-Mol Cell Biol משנת 2004), וכך MuSK יוצר את הליבה של קומפלקס איתות רב-חלבוני. הפרוטאוגליקן agrin אינו נקשר ישירות עם MuSK, אלא שהוא נקשר למרכיב בקומפלקס זה הידוע כ-LRP4 או low-density lipoprotein receptor-related protein 4 (עפ"י Kim וחב' ב-Cell משנת 2008 ו-Zhang וחב' ב-Neuron משנת 2008). שני החלבונים, LRP4 ו-MuSK, מגיבים ביניהם דרך המקטעים החוץ-תאיים שלהם.

בהיקשרו אל agrin ,MuSK שולח signal דרך רצף של 3 חלבונים :Casein kinase 2 או CK2 הגורם לפוספורילציה של שיירי serine ב-MuSK, מארגן את שלד ה-actin מה שמסייע לוויסות של תהליך האגרגציה של קולטני אצטילכולין (עפ"י Cheusova וחב' ב-Genes Develop משנת 2006; החלבון Dok-7(עפ"י Okada וחב' ב-Science משנת 2006)ו-rapsin שחשיבותו ביצירת צברי AChRs. החלבון המתאם DOK7 (או downstream-of-tyrosine-kinase-7) נקשר ל-motif של הטירוזין המזורחן במקטע JM של MuSK שכינויו NPXY553 (עפ"י Bergamin וחב' ב-Cell Mol משנת 2010). מעורבות של שלושת חלבונים אלה נדרשת להשרות יצירת צברים (clusters) של קולטני אצטילכולין. שני החלבונים CK2 ו-Dok-7, נחוצים ליצירת צומת (junction) נוירו-מוסקלארי תקינה, כיוון שעכברים החסרים Dok-7 נכשלו ביצור צברי קולטנים של אצטילכולין, וכמו כן הפחתה מושרית ביצירת CK2 פגעה בגיוס של AChR ליצירת הצברים האמורים.

(להכניס כאן את התרשים שמתחתיו מופיע ...שפעול של קומפלקס MuSK ...)

התפקיד של MuSK ב-MG:

כאמור נוגדנים כנגד MuSK מוצאים בחולים עם MG להם אין נוגדנים כנגד הקולטן לאצטילכולין. בחולים אלה עדיין מוצאים אובדן אוטואימוני של פעילות הקולטנים לאצטילכולין (עפ"י Barrett-Jolley ב-Pflügers Archiv משנת 1994), אך צורת המחלה נראית שונה מ-MG קלאסית במספר פרמטרים: יותר שכיחה בנשים, פחות מעורבות של העיניים, יש יותר חולשה בצוואר, בשריר הסוגר העליון (oropharynx), בשרירי הכתף, ושכיחות גבוהה יותר בקרב אפרו-אמריקנים. (עפ"י Evoli וחב' ב-Brain משנת 2003 ו-Sanders וחב' בAnn Neurol משנת 1987). במודלים קדם-קליניים של MG מהסוג של נוגדנים עצמיים ל-MuSK, מתן 3,4diaminopyridine הגביר את ההפרשה של אצטילכולין והפחית את חולשת השרירים (עפ"י Morsch וחב' ב-J Physiol משנת 2013).

MG עם נוגדנים עצמיים כנגד MuSK היא תרחיש נדיר יחסית המהווה רק 5-8% מכלל מקרי MG. נתןנים אפידמיולוגיים פורמאליים באשר לשכיחות של MuSK-MG, קיימים רק לגבי שני אזורים באירופה, עם שכיחות של 2.9 מקרים לכל מיליון איש באוכלוסייה ביוון, ו-1.9 מקרים לכל מיליון בדרום הולנד (עפ"י Niks וחב' ב-J Neurol Neurosurg Psychiatry משנת 2007 ו-Carr וחב' ב- BMC Neurol משנת 2010). כאשר רק להמחשה עפ"י Carr השכיחות של AChR-MG גבוהה מהמצופה, עם 70-163 מקרים למיליון. מספר המאובחנים עם MuSK-MG המדווחים ממרכזים רפואיים אחדים של MG, מרמז על דעיכה במספר מרקרים ככל שנעים דרומה מצפון אירופה לדרומה:

ההשפעה יכולה להיות גנטית או סביבתית, שכן בעוד ש-AChR-MG כרוך עם HLA-B8DR3 (עפ"י Compston וחב' ב-Brain משנת 1980) וכן עם HLA-A02 ו-HLH-A25 (עפ"י Karmouch וחב' ב-Chem Biol Interact משנת 2012), הרי ש-MuSK-MG כרוך עם HLA-DR14-DQ5 (עפ"י Niks וחב' ב-Neurology משנת 2006), מה שמרמז על גורמים גנטיים שונים בהתפתחות כל אחת מ-2 הצורות של MG. בנוסף, המרכיב הגנטי הבא לביטוי בהתרחשות MG, בולט בעובדה ששכיחות מחלה זו גבוהה משמעותית בקרה אפרו-אמריקנים (Oh וחב' ב-Muscle Nerve משנת 2006, ו-Sanders וחב' ב-Neurology משנת 2003). כך על פי Oh באלבאמה לדוגמה, בשחורים במדינה זו בכ-50% מוצאים את צורת MuSK-MG בעוד שבין הלבנים באלאבמה רק ב-17% מוצאים סוג זה של MG. גם ממצאיהם של Burns וחב' ב-Neurology משנת 2008 תומכים בנתונים של Ho.

הפעילות הביולוגית של MuSK:

נראה ש-MuSK משחק תפקיד קואורדינטיבי מרכזי ביצירת ה-neuromuscular junction או NMJ בעת התפתחות העוברית. עוברי עכברים החסרים MuSK נכשלים ביצירת NMJs יציבים, מה גורם להם לשיתוק ולמוות עוד בטרם הלידה. בשלב ההתפתחות העוברית, צברים של AChR נוצרים על פני סיבי שריר בלתי-בשלים לפני הבשלת תאי עצב מוטוריים (Harris וחב' ב-Philos Trans R Soc Lond B משנת 1981, ו-Lin וחב' ב-Nature משנת 2001). ואמנם, צברי AChR מוגבלים לחלק המרכזי של סיב השריר, אזור בו הביטוי של MuSK הוא הניכר ביותר.

יש ראיות לכך שהאיתות המתחיל במקור מאינטראקציה של agrin ו-MuSK, נחוץ לייצב את הסינפסות העובריות. כאשר השתמשו ב-promoter של actin לגרום אופן מלאכותי לרמות גבוהות של ביטוי MuSK לאורך סיב השריר העוברי, הופיעו צברי AChR באזורים יותר דיסטאלים של הסיב העצבי (Kim ו-Burden ב-Nat Neurosci משנת 2008). מחקרים בעוברים של דגי zebra, גם כן מצביעים על תפקידו של MuSK בהכוונה של אקסונים מוטוריים מתפתחים של תאי עצב.

הפרוטאו-גליקן agrin הוא כפי שידוע כיום המשפעל היעיל ביותר של MuSK. מחקרים עם החלק התוך-תאי המבודד של MuSK מצביעים על כך שהפוספורילציה העצמית של טירוזין בעמדה 533 (מה שמופיע כ- Y553) מקדימה את האוטו-פוספורילציה של 3 שיירי טירוזין אחרים (בעמדות 750, 754ו-755), הממוקמות בלולאת השפעול של מקטע הקינאזה (עפ"י Till וחב' ב-Structure משנת 2002). נראה שהזרחון של שלושת שיירי הטירוזין האחרונים חיוני להעברת MuSK לפאזה פעילה ויציבה. במכרסמים ובאדם הקצה הקרבוקסילי התוך-תאי של MuSK הידוע כ-VXV, מעודד את הקישור של PDZRN3, שהוא האנזים E3 ubiquitin ligase. כאשר תאי שריר נחשפים ל-agrin, הופך MuSK למצע לפעילות האנזים PDZRN3 (עפ"י Lu וחב' ב-J Cell Biol משנת 2007). ביטוי-יתר של PDZRN3 מפחית את הביטוי של MuSK על פני ממברנת תאי השריר, בעוד שביטוי-חסר של אנזים זה מגדיל את רמות MuSK על פני הממברנה. חוקרים אחרים הראו ש-NSF או N-ethylmalemide Sensitive Factor, נדרש לצורך השפעול של MuSK על ידי Agrin וההחדרה שלו אל תוך התא, שהם 2 תהליכים משולבים (Zhu וחב' ב-J Neurosci משנת 2008). במחקר של Hezel וחב' ב-Mol Biol Cell משנת 2010 הודגם שקישור agrin מעודד את קישור MuSK ל-caveolin-3, שידוע בפעילותו של יצירת צברי AChR ומעורבותו בפעילות הנוירו-מוסקלארית במתחם הסינפסה.

נראה שתהליך האיגור (aggregation) ויצירת הצברים של קולטני אצטילכולין דורש את פעילותם של 2 חלבוני G מאותתים, Rac ו-Rou, בעלי פעילות של האנזים GTPase שמשקלם המולקולארי 21,000 דלטון (Weston וחב' ב-J Biol Chem משנת 2003). כאשר מוסיפים agrin לתאי שריר, השפעול של MuSKוהזרחון של שיירי טירוזין של האנזים geranylgeranyl transferase I גורם לשפעול של Rac I וליצירה של מיקרו-צברים של AChR (עפ"י Lou וחב' ב-Neuron משנת 2013). השפעול של Rac מלווה על ידי שפעול של Rou, וזה פועל על פי הסברה דרך Pak I להגדיל את המיקרו-צברים של AChR והפיכתם לצברים גדולים (בקוטר של מעל 10 מיקרון) (Lou וחב' ב-Neuron משנת 2002).

שני ה-tyrosine kinases הציטופלזמטיים, Abl ו-Src, גם כן משופעלים על ידי MuSK. שתי קינאזות אלה חופפות בפעילותן, בתחזוק השפעול של MuSKתוך זרחון שייר טירוזין 390 בתת היחידה β של AChR. זרחון אחרון זה מגייס את החלבון המתאם rapsyn, ועל ידי כך מייצב את צברי AChR (עפ"י Borgers וחב' ב-J Neurosci משנת 2008). יש לציין שפעילות MuSK תלויה במנגנוני משוב חיוביים ושליליים: לדוגמה, Abl kinase פועל כמשוב לאחור לסייע בזרחון של MuSK, אך לעומת זאת מערכות אחרות דווקא פועלות למנוע את גידולם של צברי AChR. לדוגמה, השפעול של MuSK מאתחל מסלול של משוב שלילי בו מעורב האנזים tyrosine phosphatase, הידוע כ-Shp2 (עפ"י Qian וחב' ב-BMC Neurosci משנת 2008).

יתרה מכך, אצטילכולין המופרש על ידי קצוות העצבים המתהווים, פועל דרך האנזימים calpain ו-5cyclin-dependent kinase הפועלים במתחם הבתר-סינפטי, כדי לגרום לפירוק צברי AChR. כתגובה, מערכת ה-agrin-MuSK-rapsyn פועלת באופן מקומי כדי למנוע תהליך זה של פירוק צברי AChR, על ידי בידודו של rapsyn מיתר מרכיבי המערכת (Chen וחב' ב-Neuron משנת 2007).

MuSK מבוטא גם כן במוח ובתאי זרע של יונקים. כדי לבחון את המשמעות של MuSK בתאי עצב של ה-CNS, הוזרק להיפוקמפוס של מוח חולדות antisense oligonucleotide, על ידי Garcia-Osta וחב' ב-J Neurosci משנת 2006. דיכוי של ביטוי MuSK בהיפוקמפוס, גרם לאי-סדירות בתהליכי זיכרון. מעניין לציין שבחלקם המרכזי של תאי זרע יש ביטוי של הצורה המקוטעת (truncated) של MuSK המופיעה בסמוך ל-agrin, ל-rapsyn ולצורה הנוירונית של הקולטנים ל-AChR, צורת alfa7 בתאי זרע (עפ"י Kumar וחב' ב-Biochem Biophys Res Commun משנת 2006).

מחלות מולדות ואוטואימוניות הפועלות על מערכת MuSK:

מספר תסמונות מיאסטיניות נדירות נגרמות על ידי מוטציות ב-rapsyn, ב-DOK7 או ב-MUSK. אנשים עם מוטציה ב-MuSK, מראים כצפוי חסכים ביצירת צברי AChR בתר-סינפטיים, כמו גם בהתמיינות (דיפרנציאציה) של קצות עצבים במתחם הקדם-סינפטי (Chevessier וחב' ב-Hum Mol Genet משנת 2004). מעט נדירים פחות (בערך מקרה אחד ל-100,000) הם המקרים של MG אוטואימונית הנגרמת על ידי נוגדנים כנגד MuSK. כאשר הזריקו לעכברים IgG שנלקח מאנשים שנמצאו חיוביים לנוכחות נוגדני אנטי-MuSK, הביא הדבר להיעלמות של MuSK מהממברנה הבתר-סינפטית (Cole וחב' ב-J Physiol (Lond) משנת 2010). פעולה זו גרמה לפירוק צברי AChR בתר-סינפטיים ולעייפות וחולשה בעכברים המטופלים. בניסוי נוסף של Cole וחב' שתואר ב-Ann Neurol משנת 2008, הוזרקו עכברים בני 6 שבועות מזני C57BL/6J ו-FVB/NJ עם IgG מנסיוב אנשים שאובחנו עם MG על רקע נוגדנים ל-MuSK. הזרקות תוך-צפקיות למשך 45 יום במינון יומי של 45 מיליגרם, הביאו לירידה משמעותית של עד 78% בצביעה הבתר-סינפטית של AChR , בהשוואה לעכברים שהוזרקו עם IgG של אנשים בריאים. העכברים המוזרקים עם IgG מאנשים עם נוגדנים עצמיים ל-MuSK איבדו ממשקלם ופיתחו חולשת שרירים.

נתונים קליניים:

עייפות וחולשה כתוצאה משיבוש בהעברת איתותים ברמת ה-NMJ היא מאפיין של MG. האבחון מתבצע על ידי קריטריונים קליניים ובדיקת EMG. רוב המקרים הם על בסיס אוטו-אימוני כתוצאה מהופעת IgG עצמי המגיב עם הקולטן לאצטיכולין (Li וחב' ב-Cleve Clin J Med משנת 2013). התדירות של גילוי נוגדנים עצמיים ל-AChR היא הנמוכה ביותר במטופלים עם חולשה המוגבלת לשרירים extraocular (עפ"י Lennon ב-Neurology משנת 1997). בניסויים של חוקרי Mayo Clinic נמצאו נוגדנים עצמיים ל-AChR ב-92% מהמאובחנים עם MG, כאשר נוגדנים כנגד MuSK נתגלו ביותר משליש מאלה עם חולשה כללית כתוצאה מ-MG בהם לא נתגלו נוגדנים כנגד AChR (אלה המוגדרים כ-seronegative), כאשר האחרונים מהווים פחות מ-4% מכלל מקרי MG (עפ"י Chan וחב' ב-Muscle Nerve משנת 2007).

בכ-6% מהמטופלים הסובלים מ-MG ואשר מערכת החיסון שלהם אינה פגועה, אין מוצאים נוגדנים עצמיים כנגד AChR או כנגד MuSK, והם מוגדרים כ- double seronegative (או DSN). לאחרונה הופיעו מספר פרסומים לפיהם מטופלים עם MG ללא נוגדנים ל-AChR ול-MuSK מכילים נוגדנים כנגד LPR4 (עפ"י Motomura ו-Higuchi ב-Rinsho Shinkeigaku משנת 2012; Richman ב-Arch Neurol משנת 2012; Pevzner וחב' ב-J Neurol nab, 2012 ו-Zhang וחב' ב-Arch Neurol משנת 2012). יחד עם זאת נראה שישנם עדיין נוגדנים עצמיים נוספים שעדיין לא התגלו בהקשר זה. נשים בדרך כלל יותר נפגעות מהופעת נוגדנים עצמיים ל-MuSK ב-MG, כאשר התסמינים הקליניים עלולים להופיע בכל גיל. כיוון ש-MG על רקע נוגדנים ל-MuSK אינה מושפעת מאי תפקוד בלוטת הטימוס או מ-thymoma, טיפול על ידי כריתת בלוטה זו אינו מועיל. חולשות בשרירי הפנים ובמערכת הנשימה כמו גם של המערכת ה-bulbar, כן משמעותיות ב-MG על רקע נוגדנים ל-MuSK, כאשר משברים מיאסתניים בהחלט שכיחים (Skjei וחב' ב-Neuromuscul Disord משנת 2013).

מסתבר שיש ל-MuSK-MG שלושה פנוטיפים קליניים שונים : א) תרחיש קליני שאינו ניתן להבדלה מ-AChR-MG עם חולשת שרירית יותר כללית; ב) תרחיש יותר מקומי עם חולשת שרירים בצוואר, בכתף ובמערכת הנשימה; ג) צורה חמורה יותר עם חולשה ועייפות באזור הצוואר ושרירי הלסת מה שעלול לגרום לקשיי דיבור, לעיסה, בליעה, ואחיזת הראש במנח זקוף כל אלה המוגדרים ב-bulbar weakness על כך שהעצבים המעורבים מקורם מגזע המוח ומהמוח המוארך), כאשר צורת מפגע זה עלולה להיות מלווה עם משברי נשימה תכופים (Illa וחב' ב-Clin Med משנת 2005, Lee וחב' ב-J Clin Neurosci משנת 2006, Ohta וחב' ב-Eur J Neurol משנת 2007, Evoli וחב' ב-Ann NY Acad Sci משנת 2008, Chang וחב' ב-J Neurol Sci משנת 2009 ו-Guptill ו-Sanders ב-Curr Opin Neurol משנת 2010).

נוגדנים כנגד AChR הם בדרך כלל מסוג IgG1 והם הם גורמים לאיבוד של AChR מה-NMJ על ידי שלושה מנגנונים עיקריים: נזק המשופעל על ידי משלים (complement), מודולציה אנטיגנית כתוצאה מקישור דו-ולנטי של הנוגדנים, וחסימה ישירה של תפקוד הקולטן. לעומת זאת, הנוגדנים העיקריים בצורת MuSK של MG הם מסוג IgG4 שאינם משפעלים את המשלים, ולכן לא נגרם נזק על ידי האחרון ב-MuSK-MG (עפ"י McConville וחב' ב-Ann Neurol משנת 2004). ביופסיות שריר ומחקרים אלקטרופיזיולוגיים מרקמות שרירי צלעות (intercostal) מוחלשים במטופלים עם MuSK-MG לא הראו כל אובדן של AChR או שקיעה והתרבצות של משלים למרות שאובחנה בנבדקים אלה ירידה ב-MEPPs או miniature endplate potentials שהם תהליכי הדה-פולריזציה של סיבי שרירי שלד הנגרמים על ידי קישור של נוירוטרנסמיטורים דוגמת אצטילכולין לממברנה הבתר-סינפטית ב-NMJ (עפ"י Selcen וחב' ב-Neurology משנת 2004, ו-Shiraishi וחב' ב-Ann Neurol משנת 2005).

למרות ששרירי הצלעות ששימשו במחקר של Selcen היו מוחלשים באופן בולט, בדרך כלל שרירי הפנים מעורבים הרבה יותר ב-MuSK-MG, וניסויי העברת גירוי עצבי בשרירים אלה in vivo מצביעים על פגמים רבים יותר ב-MuSK-MG מאשר בשרירי הצלעות (Nemoto וחב' ב-J Neurol Neurosurg Psychaitryמשנת 2005 ו-Farrugia וחב' ב-Brain משנת 2006). אך מסיבות מובנות לא נוטלים ביופסיות משרירי הפנים בבני אדם, ולכן אופי הפגמים בשרירים אלה במאובחנים שם MuSK-MG לא יכול להיחקר.

למרות ש-70% עם-MG מטיפוס seronegative AChR באזור אוקספורד נמצאו כבעלי נוגדנים כנגד MuSK, מחקרים באזורים גיאוגרפיים אחרים הראו שכיחות ממוצעת של 37% בלבד של נוגדנים כנגד MuSK באלה שהם סרו-נגטיביים ל-AChR (עפ"י Wolfe ו-Wu ב-Ann NY Acad Sci משנת 2007). אכן בנורווגיה נרשם 0% (עפ"י Romi וחב' ב-Eur J Neurol משנת 2005), ובטורקיה נרשמו 49% (עפ"י Deymeer וחב' ב-Neurology משנת 2007). ראוי לציין שלעומת שיעור התחלואה היציב יחסית של AChR-MG בתוך כלל חולי MG שנע בתחום שבין 62-90% (בממוצע 77%) בעולם כולו, תופעת התנודות החדות בשיעורי התחלואה ב-MuSK-MG באזורים שונים ובקרב קבוצות אתניות שונות מאוד בהחלט בולטת. למרות שבאירופה קיים גרדיאנט של שיעורי תחלואה ב-SK-MG הפוחתים כל שמדרימים בקווי האורך הגיאוגרפיים, לא נמצאה מגמה דומה כאשר מדרימים בארה"ב או באסיה.

הפנוטיפ הקליני:

החולשה המיאסתנית ב-MuSK-MG, נוטה להיות חמורה יותר ומגיבה פחות לטיפול בהשוואה למה שמקובל בצורות אחרות של MG. מחקרים אפידמיולוגיים של Padua וחב' ב-Eur J Neurol משנת 2006, קבעו שאחוז גבוה יותר של מאובחנים עם MuSK-MG, היו מוגדרים כמקרים חמורים בהתאם למדרג הקליני של ה-MG Foundation of America או MGFA, זאת בהשוואה למטופלים עם DSN-MG או double serum-negative-MG. גם Pasnoor וחב' ב-Muscle Nerve משנת 2009, קבעו מדרג III-IV של MGFA ב-55% מתוך 53 מאובחנים עם MUSK-MG. גם Stickler וחב' ב-Clin Neurophysiol משנת 2005 תוך עשיית שימוש ב-שיטת המדרג הקליני QMG או quantitative MG, מצאו דרגת תחלואה גבוהה יותר משמעותית ב-20 נבדקים עם MuSK-MG, בהשוואה ל-72 נבדקים עם AChR-MG. יחד עם זאת, סקירה של Oh מהמרכז הרפואי בבירמינגהם-אלאבמה שהופיעה בשנת 2009 ב-J Clin Neurol, מצאה גם כן שתסמינים הקליניים ב-MuSK-MG חמורים יותר מאשר ב-DSN-MG, אך לא חמורים יותר מאשר ב-AChR-MG.

Thymoma נמצאת בבסיס ההבדל בין AChR-MG לבין MuSK-MG:

ברוב המכריע של מאובחנים עם MuSK-MG, לא נמצאה מעורבות של thymoma. במחקרים של Lavrenic וחב' ב-J Neurol Neurosurg Psychiatry משנת 2005, נמצאה thymoma רק ב-2 בתוך 17 בלוטות טימוס שהתקבלו ב-thymectomy, ואילו Evoli וחב' במאמרם משנת 2008 ב-Ann NY Acad Sci, גילו טימומה נודולארית קטנה ב-1 מתוך 17 מאובחנים עם MuSK-MG שעברו thymectomy. נראה אם כן ש-thymoma הוא תרחיש נדיר בסוג האחרון של MG, לעומת מצב של שגשוג של הטימוס (lymphoid hyperplasia) שהתגלה ב-19 מתוך 73 מאובחנים עם MuSK-MG המהווים 26%. Oh בסקירתו ב-J Clin Neurol משנת 2009, מדווח על אי-מציאת thymoma באף לא מקרה אחד של MuSK-MG, בהשוואה ל-3 מקרים בהם נתגלתה thymoma באלה המוגדרים כ-DSN-MG וב-13 מקרים של מאובחנים עם AChR-MG.

בניגוד ל-AChR-MG, בלוטת הטימוס ב-MuSK-MG היא בדרך כלל תקינה, או שהיא מגלה שינויים מורפולוגיים קלים. כך למשל היפרפלזיה לימפואידית אינה שכיחה כפי שכבר צוין. שני מחקרים של Lauriola וחב' ב-Neurology משנת 2005, ו-Leite וחב' ב-Ann Neurol מאותה שנה, ביצעו בירור היסטולוגי מורפומטרי ואימונוהיסטוכימי, בו השוו מטופלים עם MuSK-MG, עם אלה עם AChR-MG ו-DSN-MG וכן עם ביקורת של אנשים בריאים. שני מחקרים אלה הדגישו את החסר של ליבה גרמינאלית או של הסננה לימפוציטית לבלוטת הטימוס במקרים של MuSK-MG בניגוד לשינויים טיפוסיים אלה שמוצאים ברוב המקרים של AChR-MG ובערך ב-50% מהמקרים של DSN-MG. ממצאים אלה מצביעים על הבדלים במנגנונים הפתולוגיים בין MuSK-MG לבין AChR-MG ומרמז לכך שהרחקת הטימוס אינה עשויה לסייע בקבוצת ה-MuSK-MG אך עשויה להיות בעלת ערך במקרים של DSN-MG.

מחקרים קליניים נלווים:

ביופסית שריר של Sanders וחב' ב-Neurology משנת 2003 במקרי MuSK-MG הראתה בדרך כלל אטרופיה לא ספציפית, בדומה לממצאים של Padua וחב' ב- Eur J Neurol משנת 2006, שבנוסף לאטרופיה לא-ספציפית דיווח על שוֹנוּת מוגברת בקוטר הסיב ב-7 מתוך 11 ביופסיות של מטופלים עם MuSK-MG. השוואה יותר מפורטת בין ביופסיות שריר מ-6 מקרים של MuSK-MG של Martignago וחב' ב-Neuropathol Appl Neurobiol משנת 2009, וכן מ-7 מקרים של AChR-MG באוכלוסייה איטלקית. שינויים מיופתיים (כגון צברים מיטוכונדריאליים המוגדרים כ-ragged red fibres) היו שכיחים במקרי MuSK-MG, בעוד שאטרופיה הייתה שכיחה יותר במטופלים עם AChR-MG. לעומת זאת, Farrugia וחב' במחקרם ב-Brain משנת 2006, שכלל MRI של MuSK-MG כן מצאו אטרופיה של שרירי פנים עם מעורבות בולבארית במטופלים עם MuSK-MG כאשר אטרופיה כזו לא נמצאה במקרים של AChR-MG.

מחקר של Shirashi וחב' משנת 2005 ב-Ann Neurol באוכלוסייה ביפאן, ביצע ביופסיה של השריר הדו-ראשי (שריר הקִבּורֶת או ה-biceps) מ-8 מטופלים עם MuSK-MG, לא הצליח להראות ירידה משמעותית של AChR במתחם הבתר-סינפטי. בדומה לממצאים של Selcen וחב' ב-Neurology משנת 2004, התרבצות של אימונוגלובולינים ושל משלים הייתה דלה במתחם זה, מה שהביא את Selcen להצגת השאלה "האם נוגדנים ל-MuSK הם הגורמים העיקריים לתסמינים המיאסתניים"? ממצאים אלה מרמזים לאפשרות שהמנגנון הפתוגני של הפגם בהעברת האיתותים במתחם הנוירו-מוסקולארי ב-MuSK-MG, שונים מאלה ב-AChR-MG, ואין הם כרוכים בפגם ב-AChR בו יש מעורבות של משלים. ממצא זה יכול היה להיות צפוי לאור העובדה שהנוגדנים המעורבים ב-MuSK-MG הם מסוג IgG4 שאינו משפעל את המשלים (McConville וחב' ב-Ann Neurol משנת 2004).

== הוראות לביצוע הבדיקה ==

הבדיקה מתבצעת בשיטת radioimmunoassay בנסיוב. יש לדגום דם במבחנה כימית (פקק אדום או צהוב) ולאחר סרכוז והפרדת התאים מהנסיוב, מועדף לאחסן את מבחנת הנסיוב המופרד בקירור רגיל. אין לפסול דגימת נסיוב גם היא המוליטית, ליפמית או איקטרית ברמה גבוהה. יציבות הדגימות היא של 72 שעות בטמפרטורת החדר, ו-28 יום בקירור או בהקפאה. יש לקחת בחשבון שבאנשים המקבלים טיפול בתרופות לדיכוי מערכת החיסון, עלולה להתקבל תוצאה שלילית כזובה (false negative) במדידה של נוגדנים בנסיוב כנגד MuSK. חשוב לכן לבצע את הבדיקה האמורה לפני שמתחילים בטיפול תרופתי לדיכוי מערכת החיסון.

ProGRP

2015-07-12T08:27:41Z

בן עמי סלע:

== ProGRP ==

כינויים נוספים: Pro gastrin-releasing protein.
תחום: אבחון מבדיל בין SCLC לבין NSCLC.
טווח ערכים תקין: מתחת ל-50 פיקוגרם/מ"ל.
יוצר הערך: פרופ' בן-עמי סלע.

== בסיס פיזיולוגי ==

במדינות המתועשות, סרטן ריאות הוא גורם מוביל של תמותה ביחס לסוגי סרטן אחרים, כאשר בקהיליה האירופית לדוגמה הוא מהווה 21% מסוגי הסרטן בין גברים, ו-29% מהתמותה מסרטן בקרבם. רוב הלוקים בסרטן ריאות, מתגלים בשלב מתקדם, בלתי ניתן לניתוח מה שמתבטא בפרוגנוזה גרועה.

סרטן ריאות מתחלק היסטולוגית לשתי קבוצות: small cell lung cancer או SCLC ו-non-small cell lung cancer או NSCLC, כאשר שני סוגים אלה נבדלים ביניהם בטיפול ובפרוגנוזה. SCLC הוא גידול אגרסיבי עם קצב גידול מהיר, ונטייה מוקדמת ליצירת גרורות לקשרי הלימפה האזוריים, אך גם לאיברים מרוחקים בעת האבחון, ויחד עם זאת עם רגישות גבוהה לכימו- ולרדיותרפיה. NSCLC מורכב מ-3 תת-קבוצות היסטולוגיות: אדנוקרצינומה, קרצינומה של תאי קשקש (squamous cells)וקרצינומה של תאים גדולים. באחרונים, טיפול ניתוחי הוא הטיפול היחיד שניתן להשיג בו ריפוי אפשרי. SCLC מהווה 15% מכלל מקרי סרטן הריאות החדשים והוא נבדל מ-NSCLC בהתמיינות (דיפרנציאציה) הנוירו-אנדוקרינית שלו.

סמנים סרטניים שונים נחקרו באופן נמרץ בסרטן ריאות, אך לא התגלה סמן ספציפי לשאת זו. NSE נחקר רבות כסמן אפשרי ל-SCLC (עפ"י Jorgensen וחב' ב-Br J Cancer משנת 1996), אך רמת הספציפיות שלו לא השביעה רצון כיוון שניתן היה לגלות סמן זה מוגבר ברמתו גם בממאירויות אחרות. חולשה נוספת של סמנים פוטנציאליים של סרטן ריאות מתבטאת ברגישות נמוכה יחסית, באופן שמחייב מדידה משולבת של מספר סמנים כדי להשיג רגישות מספקת (Molina וחב' ב-Tumor Biol משנת 1994, ו-Plebani וחב' ב-Br J Cancer משנת 1995). בנוסף, חלק מהסמנים שנבדקו הופיעו בסוגי סרטן ריאות שונים, ולדוגמה CEA מוגבר משמעותית ב-adenocarinoma, וריכוזי CYFRA 21-1 מוגברים ב-squamous cell carcinoma, אך ניתן למצוא מטופלים בהם 2 הסמנים האחרונים מוגברים גם ב-SCLC (עפ"י Paone וחב' ב-Eur Respir J משנת 1995).

gastrin releasing protein:

ההורמון GRP או gastrin releasing protein, הוא פפטיד הנוצר במעי, ובודד לראשונה מקיבה של חזיר בשנת 1978, ונמצא שהוא גורם להפרשה של gastrin בכלבים שטופלו עם GRP, כפי שתואר על ידי McDonald וחב' במאמרם ב-Gut. זהו פפטיד רגולטורי שמיוחסים לו מספר תהליכים פיזיולוגיים ופתו-פיזיולוגיים. בולט בין הפעילויות של GRP תפקידו בגירוי הפרשת gastrin מתאי G בקיבה. הגן המקודד ל-GRP באדם, ממוקם על הזרוע הארוכה של כרומוזום 18, במיקום 18q21.32 (עפ"י Lebacq-Verheyded וחב' ב-Genet Somat Cell Mol משנת 1987). מולקולת האם של בצורתה הבלתי-מקוטעת, preproGRP, מכילה 148 חומצות אמינו, ומקודדת על ידי שלושה exons המופרדים על ידי שני introns, כאשר התהליך של alternative splicing מביא ליצירה של עותקים אחדים, המקודדים למספר איזופורמים של GRP.

הקולטן של GRP או GRPR, ידוע כיום כ-BB2, קשור לחלבון G, שבבני אדם מבוטא ברמה גבוהה בבלוטת הלבלב, אך גם בקיבה, בקורטקס של בלוטת האדרנל ובמוח הקולטן הוא גליקופרוטאין החוצה את ממברנת התא 7 פעמים, והוא אחראי לשפעול האנזים phospholipase C. קולטן זה בא לביטוי פגום במספר סוגי סרטן, כמו זה של הריאות, המעי הגס, ובלוטת הערמונית.

הקודמן preproGRP מכיל signal peptide העובר ביקוע על ידי peptidase ליצירה של proGRP שעובר אף הוא ביקוע פרוטאוליטי ליצירת הפפטיד הבשל GRP המכיל 27 חומצות אמינו (Merali וחב' ב-Neuropeptides משנת 1999), או ליצירת הפפטיד בעל 10 חומצות אמינו המוכר כ-neuromedin C. הפפטיד GRP מופרש על ידי הסיבים הבתר-גנגליוניים של עצב ה-vagus, המעצבב את תאי G בקיבה ומגרה אותם להפרשת gastrin. ההורמון GRP מווסת מספר פונקציות במערכת העיכול וב-CNS, כולל הפרשת הורמונים מהמעי ומהקיבה, הפרשת חומצת קיבה, כיווץ שריר חלק ותנועת מעיים, שגשוג תאי אפיתל, ואף פעילות מיטוגנית ברקמות סרטניות. GRP מעורב גם בפיזיולוגיה של השעון הביולוגי (circadian system), תוך שהוא משתתף באיתותי אור למַתְנֵד (oscillator) הצירקדיאני המרכזי הממוקם בהיפותלאמוס ב-suprachiasmatic nuclei.

ניתן למצוא GRP בסיבי העצבים ברקמת הקיבה הלא-אנטראלית, במוח, ובתאים נוירו-אנדוקריניים בריאה העוברית (Yanaihara וחב' ב-Peptide משנת 1981). כיוון ש-GRP מיוצר לעתים קרובות על ידי תאי SCLC (עפ"י Yamaguchi וחב' ב-Cancer Res משנת 1983), עלתה המחשבה שמא פפטיד זה עשוי לשמש סמן במטופלים מאובחנים עם SCLC (עפ"י Maruno וחב' ב-Cancer Res משנת 1989). אלא ש-GRP אינו יציב בדם ולכן קשה למדוד את רמתו בתרחישים קליניים. לעומתו, הרצף 31-98 של ProGRP, רצף מהקצה ה-C טרמינאלי המשותף לשלושה סוגים של ProGRP הומאני, הוא פפטיד יציב בדם ונמדד במקור בשיטת RIA, על ידי Miyake וחב' ב-Cancer Res משנת 1994, ומיד לאחר מכן פותחה שיטת ELISA נוחה יותר למדידת ProGRP על ידי Aoagi וחב' ב-Clin Chem משנת 1995.

שיטות מעבדה להערכת ProGRP:

הערכה ראשונה של שיטת ARCHITECT האוטומאטית במלואה שפותחה במעבדות Abbott ב-Wiesbaden (גרמניה), דווחה בשנת 2009 על ידי Yoshimura וחב' ב-Clin Chem Lab Med. כיוון שנמצא שבשיטת ARCHITECT היציבות של ProGRP בנסיוב נמוכה כנראה בגלל פרוטאוליזה על ידי תרומבין, מומלץ להשתמש בשיטה זו בפלזמה (Yoshimura וחב' ב-Tumor Biol משנת 2008, ו-Kim וחב' ב-J Korean Med Sci משנת 2011).

לעומת זאת, ערכת Elecsys של חברת Roche Diagnostics (ב-Penzberg, גרמניה), תוכננה לעקוף מגבלה זו, באופן שניתן יהיה לבצע את מדידת ProGRP בנסיוב ובפלזמה כאחד, זאת כיוון ש-2 הנוגדנים החד-שבטיים בערכת Elecsys נקשרים לאפיטופים של ProGRP, שהם יציבים יחסית לביקוע פרוטאוליטי (Molina וחב' ב-Tumor Biol משנת 2009, ו-Nordlund וחב' באותו כתב עת ובאותה שנה). חברת Roche הוציאה ב-18 ביולי 2013 הודעה על השקת ערכה זו לשימוש באירופה (עדיין לא בארה"ב). העיקרון של שיטת ה-chemiluminiscence של Elecsys ונתונים של חברת Roche על בחינת שיטה זו עם 185 חולי SCLC, וכן 752 חולי NSCLC, בנוסף ל-357 חולים עם ממאירויות אחרות ו-155 חולים עם מחלות ריאה שפירות, מופיעים ב-2 התרשימים להלן:

(להכניס כאן ברצף את התרשים מעליו המקרא מתחיל במילים Test principle, ומייד אחריו התרשים מעליו מופיעים המספרים N=185, N=752, n=557 ו-N=155.)

NSE כסמן ל-SCLC:

NSE או neuron specific enolase, היה עד לאחרונה הסמן המוביל באבחון SCLC, בניטור מחלה זו ובהערכה הפרוגנוסטית שלה (Niho וחב' ב-Lung Cancer משנת 2000, וכןShibayama וחב' באותו כתב עת משנת 2001 , ו-Johnson וחב' ב-Br J Cancer משנת 1993), אך רגישותו הנמוכה בפרט באלה עם מחלה מוגבלת, חייבו שימוש משולב גם בסמנים כמו CEA ו-CYFRA 21-1 שאינם ספציפיים ל-SCLC. בנוסף, רמות מוגברות באופן מתון של NSE ניתן למצוא בדגימות נסיוב ב-10-20% מהמקרים של NSCLC.

הבעיה עם NSE שהסתמן משך שנים כסמן השימושי ל-SCLC, נעוצה בספציפיות המוגבלת שלו. בהיותו צובע בבדיקה היסטו-פתולוגית עד 80% מהמקרים של NSCLC, ורמתו מוגברת משמעותית ב-20-30% מהמקרים של NSCLC (עפ"י Slodkowska וחב' ב-Int J Biol Markers משנת 2005), ואף על פי כן הוא היה הסמן המומלץ לאבחון SCLC על ידי המלצת ה-EGTM האירופי משנת 1999 ב-Anticancer Res. בנוסף, ל-NSE יש רגישות נמוכה בעיקר במטופלים עם סרטן ריאות המוגבל ל-hemithorax ipsilateral mediastinum (עפ"י Miyake וחב' ב-Cancer Res משנת 1994). כמו כן, כיוון ש-NSE נמצא באריתרוציטים ובטסיות-דם, אין אפשרות להשתמש בדגימות הימוליטיות, וחיוני ביותר לאחסן במהירת האפשרית בקירור את הדגימות.

NSE הוא הסמן המוביל באבחון SCLC, בניטור מחלה זו ובהערכה פרוגנוסטית שלה (Niho וחב' ב-Lung Cancer משנת 2000, וכן Shibayama וחב' באותו כתב-עת משנת 2001, ו-Johnson וחב' ב-Br J Cancer משנת 1993), אך רגישותו הנמוכה בפרט במטופלים עם מחלה מוגבלת במימדיה, חייבו שימוש משולב גם בסמנים כמו CEA ו-CYFRA 21-1 שאינם ספציפים ל-SCLC. בנוסף, רמות מוגברות באופן מתון של NSE ניתן למצוא בדגימות נסיוב ב- 10-20% מהמקרים של NSCLC.

ProGRP כסמן ל-SCLC:

בשנת 1999 דיווחו Stieber וחב' ב-Anticancer Res, ש-ProGRP הוא סמן שימושי לאבחון של SCLC, ובפרט הוא יעיל כסמן למעקב אחר מטופלים עם שאת במהלך הטיפולים. גם Lamy וחב' דיווחו באותו זמן ב-Lung Cancer משנת 2000 על השוואה בין ProGRP, כרומוגרנין A ו-NSE כסמנים בנסיוב ל-SCLC. הם בחנו פרוספקטיבית דגימות של 146 מטופלים תוך שימוש בערכת ELISA. על מנת לקבוע יחסי רגישות-ספציפיות כמו גם את דרגת הדיוק של כל אחד משלושת הסמנים האמורים, חוּשבו מאפייני עקומות AUC-RPC שלהם. הערכת הרגישות באוכלוסיית SCLC, והספציפיות במחלת ריאות שפירה, הראתה ש-ProGRP הראה את הרגישות הטובה ביותר כאשר נתוני AUC-ROC שלו היו גבוהים משמעותית מאלה המחושבים תוך שימוש בסמנים NSE ו-chromogranin A (עם ערכים מחושבים של 0.95, 0.89 ו-0.70, בהתאמה). ערך הסף של ProGRP שהניב את הרגישות-ספציפיות הגבוהים ביותר היה 53 פיקוגרם/מ"ל, עם רגישות של 0.80 וספציפיות של 0.96. יתרה מכך, על ידי שימוש בערך סף של 53 פיקוגרם/מ"ל, הספציפיות של ProGRP מנעה תוצאות חיוביות-כזוּבוֹת (false positive)כאשר סמן זה נבחן במקרים של NSCLC.

מחקר של Molina וחב' ב-Anticancer Res משנת 2005, בחן את הספציפיות ואת הרגישות של ProGRP ב-37 נבדקים בריאים, ב-195 נבדקים עם מחלות שפירות, וב-149 חולים במחלות ממאירות שאינן סרטן ריאות. כמו כן השווה מחקר זה בין ProGRP וסמנים אחרים המשמשים לאבחון סרטן ריאות כגון CEA, SCC, CYFRA 21-1 ו-NSE, ב-187 מטופלים עם NSCLC וכן ב-66 מטופלים עם SCLC. ערכי הסף בהם נעשה שימוש בניסוי זה היו 5 ננוגרם/מ"ל עבור CEA, 3.3 ננוגרם/מ"ל עבור CYFRA 21-1, 2 ננוגרם/מ"ל עבור SCC, 20 ננוגרם/מ"ל עבור NSE ו-50 פיקוגרם/מ"ל עבור ProGRP.

ערכי ProGRP בלתי תקינים נמצאו ב-10% של מטופלים עם מחלות שפירות, וב-13% מהמטופלים עם ממאירויות שאינן סרטן ריאות. אי-ספיקת כליות הייתה הגורם העיקרי ל-51.6% מהתוצאות החיוביות-כזובות של ProGRP. רמות מוגברות מעט של ProGRP (פחות מ-80 פיקוגרם/מ"ל) בנסיוב (ללא קשר לכשל כליות), נמצאו ב-4.1% של מטופלים של מחלות שפירות, וב-5% מהחולים במחלות ממאירות שאינן סרטן ריאות או גידולים נוירו-אנדוקריניים (120 פיקוגרם/מ"ל). תוצאות בלתי תקינות של ProGRP, NSE, CEA, CYFRA 21-1 ו-SCC, נמצאו ב-30%, 22.5%, 55.6%, 65.2% ו-26.7% של מטופלים עם NSCLC, וב-73%, 64%, 53%, 46% ו-4.5% במטופלים עם SCLC, בהתאמה. רמות הסמנים הסרטניים היו קשורות להיסטולוגיה ולדרגת הגידול הסרטני, כאשר ProGRP נמצא כסמן הרגיש ביותר ב-SCLC, כאשר CEA היה הסמן הרגיש ביותר ב-adenocarcinoma ו-CYFRA 21-1 נמצא הסמן הרגיש ביותר בגידולים של תאי קשקש. הבדיקה המשולבת הרגישה יותר (88%) לאבחון ומעקב של SCLC הייתה זו של ProGRP ו-NSE בעוד שמדידה משולבת של CEA ו-CYFRA 21-1 נתנה 82% רגישות.

Wójcik וחב' פרסמו בשנת 2008 ב-Anticancer Res את תוצאות מחקרם שנועד להשוות בין ProGRP ,NSE ו-CYFRA 21-1, לצורך אבחון של SCLC מוגבלת במימדיה, וכסמנים לניטור יעילות הטיפול בחולים עם תרחיש זה. המחקר התבצע בהשתתפות 64 חולים עם מחלה מוגבלת שלא טופלו קודם לכן. כל המטופלים קיבלו את אותו טיפול כימותרפי. מדידת רמת ProGRP, NSE ו-CYFRA 21-1 בנסיוב, התבצעה לפני כל מחזור טיפולים, וכן 3 ו-6 חודשים לאחריו. לפני הטיפול, רמות מוגברות של ProGRP, NSE ו-CYFRA 21-1, נמצאו ב-79.7%, 57.8% ו-23.4% מהמטופלים, בהתאמה. לפני מחזור הטיפולים השני, רמת שלושת הסמנים הללו ירדה משמעותית בהשוואה לרמותיהם לפני מחזור הטיפולים. יחד עם זאת, רק רמות ProGRP המשיכו לרדת במהלך מחזורי הטיפולים הבאים, בעוד שרמות NSE, ו-CYFRA 21-1, התנודדו בתוך תחומי הנורמה שלהם. אנליזה חד-משתנית (univariate analysis) הראתה קשר משמעותי בין הישרדות ללא-מחלה לבין רמות NSE ו-CYFRA 21-1 לפני התחלת הטיפולים, וכן קשר משמעותי בין ההישרדות והרמות של ProGRP ,NSEו-CYFRA 21-1 בבסיס המחלה. השינויים ברמות ProGRP נמצאו מדויקים יותר מאשר רמות NSE, ככלי ניטור ליעילות הטיפול בחולי SCLC עם מחלה מוגבלת. כן נמצא שבחולים אלה, מדידה משולבת של ProGRP ו-NSE נמצאה אופטימאלית לניבוי של הישנוּת המחלה.

מחקר של Nisman וחב' ב-Anticancer Res משנת 2009, נועד לבחון את המשמעות האבחונית והפרוגנוסטית של ProGRP במטופלים עם SCLC או עם SCLC, ולהשוות סמן זה עם סמנים מקובלים אחרים של סרטן הריאה. במחקר זה נמדדו רמות ProGRP, NSE, CEA ו-CYFRA 21-1 ב-37 מטופלים עם מחלת ריאות שפירה, ב-88 מטופלים עם NSCLC בשלב מחלה מתקדם, וב-37 מטופלים עם SCLC.

תוצאות מחקר זה היו כדלקמן: מדידת ProGRP נמצאה עדיפה על זו של NSE באבחנה מבדלת של SCLC בהשוואה לתחלואות ריאה אחרות, בעיקר ברמת ספציפיות מעל 90%. הרגישות של מדידת ProGRP ושל NSE במטופלים עם SCLC ברמת ספציפיות של 95% כנגד זו שמתקבלת במחלות ריאה שפירות, הייתה 78.4% ו-48.6%, בהתאמה. הבדל זה משמעותי סטטיסטית (p=0.001). כמו כן נמצא מתאם משמעותי בין רמות נמוכות של ProGRP לבין שאתות מסוג NSCLCבשלב מתקדם (p=0.002). אנליזה חד-משתנית הראתה מתאם משמעותי בין רמת ProGRP להישרדות ב-NSCLC וב-SCLC עם ערכי p=0.03 ו-p=0.04, בהתאמה.

(להכניס כאן את הטבלה מעליה מופיע Table II. Sensitivity of marker by histology of lung cancer).

תוך שימוש ב-ProGRP ריקומביננטי, פיתחו Yamaguchi וחב' מבחן ELISA למדידה של פפטיד זה, בו הושוותה משמעותו האבחונית של ProGRP במקרים של SCLC ביחס לסמנים אחרים כמו NSE, CEA או CYFRA 21-1. לשם כך נעשה שימוש ב-272 דגימות נסיוב של מטופלים עם קרצינומה מוכחת של הריאות, מתוכם 87 עם SCLC, ו-185 עם דגימות מאלה עם NSCLC. כקבוצת ביקורת שימשו 74 דגימות נסיוב ממטופלים עם מחלות ריאה שפירות, כמו גם של מעשנים.

נמצא שברמת ספציפיות של 95%, לשני הסמנים ProGRP ו-NSE הייתה רגישות דומה לאבחון SCLC, שנקבעה כ-47% ו-45%, בהתאמה. מדידה משולבת של 2 הסמנים הללו הוסיפה כ-20% לרגישות האבחון. לעומת זאת, בכל הקשור לאבחון NSCLC, נמצא ש-CYFRA 21-1 הוא הסמן המועדף, עם רגישות של 63%, בעוד ש-ProGRP הניב לעתים נדירות תוצאה חיובית כזובה. מסקנת חוקרים אלה היא ש-ProGRP הוא סמן בעל רגישות וספציפיות טובות לאבחון SCLC, ואף מתאים לצורך בקרה ומעקב אחר יעילות הטיפול.

בשנת 1997 פרסמו Okusaka וחב' ב-Clin Cancer Res את מחקרם בו נמדדו רמות ProGRP בשיטת ELISA, והושוו לרמות NSE ב-44 מאובחנים בלתי-מטופלים עם SCLC, וכן ב-77 מאובחנים לא מטופלים עם NSCLC. כמו כן נמדדו באופן פרוספקטיבי רמות ProGRP ו-NSE בחולים עם SCLC לאחר התחלת הטיפול עד להופעת relapse. הרגישות והספציפיות של ProGRP שנקבעו כ-70% ו-91% נמצאו דומים לאלה עבור NSE שנקבעו כ-70% ו-86%. נמצא ש-39%מבין המטופלים הגיבו באופן חלקי לטיפול ב-PVP, ב-CAV או ב-CODE, היו עדיין עם רמות מוגברות של ProGRP בשלבי הטיפול הראשונים. בהמשך המעקב, נמצא ש-94% מהמטופלים נמצאו עם רמות מוגברות של ProGRP היו בעלי רמות מוגברות של ProGRP בהופעת ה-relapse, כאשר רק כ-37% מתוכם נמצאו עם רמות מוגברות של NSE. בניסוי זה ערך סף הנורמה העליון של ProGRP נקבע כ-46 פיקוגרם/מ"ל, בעוד שסף הנורמה העליון של NSE נקבע כ-6.4 ננוגרם/מ"ל.

עוד העלה מחקר זה שרמות ProGRP גדלו כבר 35 ימים בממוצע לפני הופעת ממצאים קליניים המעידים על relapse ממשמש ובא הן בבדיקות גופניות כמו גם בבדיקות הדמיה, בה בשעה שרמות NSE גדלו באופן דומה רק 20 ימים בממוצע לאחר שהתרחשות ה-relapse כבר הייתה מתועדת קלינית (p<0.05). ערך הניבוי החיובי (ppv) של ProGRP ל-SCLC נמצא כ-82% לעומת 76% עבור NSE, ואילו ערך הניבוי השלילי (npv) ל-SCLC היה זהה עבור שני מסנים אלה ונקבע כ-84%.

הערכה עדכנית רב-מוסדית של שיטות מדידת ProGRP:

בשנת 2015 התפרסם ב-Clin Chim Acta מחקרם של Korse ,Molina וחב' בו בוצעה השוואה של ביצועי 2 שיטות למדידת ProGRP במרכזים רפואיים באמסטרדם, בון ברצלונה וכן 2 בתי חולים בבייג'ין. מדובר בשיטת ARCHITECT של חברת Abbott שהיא שיטת CMIA או chemiluminiscent microparticle immunoassay, בשיטת מדידה זו הושגו התוצאות הבאות: רמת השונות (coefficient of variance או CV ) נעה בין 2.2-6.0%, ויציבות טובה של דגימות נסיוב או פלזמה בזמני אחסון שונים שלהם. נמצא מתאם מצוין בין שיטות Elecsys ו-ARCHITECT בדגימות פלזמה (שיפוע 1.02).

בשיטת Elecsys נמצא מתאם טוב בין דגימות נסיוב ופלזמה (שיפוע 0.93), ו-CV של 0.97). סמן ה-ProGRP הבדיל בין SCLC ו-NSCLC (עם "שטח מתחת לעקומה"-AUC של 0.90 באוכלוסייה האירופית ו-0.84 באוכלוסייה הסינית) רגישות אבחון של 78.3% ו-ספציפיות של 95.0% כאשר סף הנורמה העליון נקבע כ-84.0 פיקוגרם/מ"ל. לא נמצאה כל השפעה על תוצאות מדידת ProGRP מגורמים כגון אתניות, גיל, מגדר, או עישון. התוצאות הממוצעות של רמת ProGRP היו נמוכות יחסית במחלות ריאות שפירות (38 פיקוגרם/מ"ל), בממאירויות שאינן קשורות לריאות (40 פיקוגרם/מ"ל), או ב-NSCLC (39 פיקוגרם/מ"ל). יחד עם זאת, בנבדקים עם מחלת כליות כרונית (מעל stage 3) נמדדו רמות ProGRP מעל 100 פיקוגרם/מ"ל.

(להכניס כאן את התרשים שהמקרא מתחתיו מתחיל במילים ..רמות ProGRP בתרחישים..)

בשנת 2004 פרסמו Molina וחב' ב-Clin Biochem סקירה מפורטת על יתרונות ProGRP כסמן של SCLC. בסקירה זו נקבע שערך סף הנורמה העליון של ProGRP הוא 50 פיקוגרם/מ"ל. יש להקפיד על כך שתפקוד לקוי של סינון פקעתי של הכליות, נוטה להעלות את רמת ProGRP בנסיוב, ועלול לשבש את מסקנות המדידה של סמן זה במקרים בו רמתו מוגברת באופן מתון כתוצאה ממחלת SCLC מוגבלת בהיקפה. אם לא כוללים את אלה עם תפקוד כליות מתון, רמות ProGRP לא עלו מעל 80 פיקוגרם/מ"ל במחלת ריאות שפירה (בסך הכול 3% מכלל המקרים שמעל סף הנורמה העליון), וכמו כן רמות ProGRP לא עלו מעל 120 פיקוגרם/מ"ל בממאירויות שאינם סרטן ריאות או גידולים נוירו-אנדוקרינים (בסך הכול 5% מכלל המקרים שמעל סף הנורמה העליון).

רמות ProGRP בנסיוב כרוכות באופן ברור לסרטן ריאות מסוג SCLC, בהשוואה לסרטן ריאות מסוג NSCLC. רמות ProGRP שמעל 120 פיקוגרם/מ"ל, נמצאו רק ב-4% מהנבדקים עם NSCLC. לעומת זאת, רמות לא תקינות של ProGRP, נמצאו ב-60-70% מהנבדקים עם מחלה מקומית של SCLC, וב-75-90% מאלה עם מחלה מפושטת של SCLC. על פי סקירתם של Molina וחב', ProGRP הוא סמן רגיש יותר מאשר NSE לאבחון SCLC, אם כי עד כה לא נמצא בניתוח רב משתנים (multivariate) להיות בעל משמעות פרוגנוסטית בלתי-תלויה. על פי נתוני Molina וחב' משנת 2004, נראה שהמדידה המשולבת של NSE ו-ProGRP היא המועדפת לניטור יעילות הטיפול במקרים של SCLC.

(להכניס כאן ברצף את 4 הטבלאות לפי הסדר הבא על פי המקראים שמתחת לטבלאות : א. רמות ProGRP בנסיוב בנבדקים ללא ממאירויות; ב. רמות ProGRP בנסיוב של נבדקים עם ממאירויות...;ג. רמות ProGRP ו-NSE.....; ד. רמות סמני סרטן אחדים...)

ProGRP

2015-07-12T08:25:32Z

בן עמי סלע:

== ProGRP ==

כינויים נוספים: Pro gastrin-releasing protein.
תחום: אבחון מבדיל בין SCLC לבין NSCLC.
טווח ערכים תקין: מתחת ל-50 פיקוגרם/מ"ל.
יוצר הערך: פרופ' בן-עמי סלע.

== בסיס פיזיולוגי ==

במדינות המתועשות, סרטן ריאות הוא גורם מוביל של תמותה ביחס לסוגי סרטן אחרים, כאשר בקהיליה האירופית לדוגמה הוא מהווה 21% מסוגי הסרטן בין גברים, ו-29% מהתמותה מסרטן בקרבם. רוב הלוקים בסרטן ריאות, מתגלים בשלב מתקדם, בלתי ניתן לניתוח מה שמתבטא בפרוגנוזה גרועה.

סרטן ריאות מתחלק היסטולוגית לשתי קבוצות: small cell lung cancer או SCLC ו-non-small cell lung cancer או NSCLC, כאשר שני סוגים אלה נבדלים ביניהם בטיפול ובפרוגנוזה. SCLC הוא גידול אגרסיבי עם קצב גידול מהיר, ונטייה מוקדמת ליצירת גרורות לקשרי הלימפה האזוריים, אך גם לאיברים מרוחקים בעת האבחון, ויחד עם זאת עם רגישות גבוהה לכימו- ולרדיותרפיה. NSCLC מורכב מ-3 תת-קבוצות היסטולוגיות: אדנוקרצינומה, קרצינומה של תאי קשקש (squamous cells)וקרצינומה של תאים גדולים. באחרונים, טיפול ניתוחי הוא הטיפול היחיד שניתן להשיג בו ריפוי אפשרי. SCLC מהווה 15% מכלל מקרי סרטן הריאות החדשים והוא נבדל מ-NSCLC בהתמיינות (דיפרנציאציה) הנוירו-אנדוקרינית שלו.

סמנים סרטניים שונים נחקרו באופן נמרץ בסרטן ריאות, אך לא התגלה סמן ספציפי לשאת זו. NSE נחקר רבות כסמן אפשרי ל-SCLC (עפ"י Jorgensen וחב' ב-Br J Cancer משנת 1996), אך רמת הספציפיות שלו לא השביעה רצון כיוון שניתן היה לגלות סמן זה מוגבר ברמתו גם בממאירויות אחרות. חולשה נוספת של סמנים פוטנציאליים של סרטן ריאות מתבטאת ברגישות נמוכה יחסית, באופן שמחייב מדידה משולבת של מספר סמנים כדי להשיג רגישות מספקת (Molina וחב' ב-Tumor Biol משנת 1994, ו-Plebani וחב' ב-Br J Cancer משנת 1995). בנוסף, חלק מהסמנים שנבדקו הופיעו בסוגי סרטן ריאות שונים, ולדוגמה CEA מוגבר משמעותית ב-adenocarinoma, וריכוזי CYFRA 21-1 מוגברים ב-squamous cell carcinoma, אך ניתן למצוא מטופלים בהם 2 הסמנים האחרונים מוגברים גם ב-SCLC (עפ"י Paone וחב' ב-Eur Respir J משנת 1995).

gastrin releasing protein:

ההורמון GRP או gastrin releasing protein, הוא פפטיד הנוצר במעי, ובודד לראשונה מקיבה של חזיר בשנת 1978, ונמצא שהוא גורם להפרשה של gastrin בכלבים שטופלו עם GRP, כפי שתואר על ידי McDonald וחב' במאמרם ב-Gut. זהו פפטיד רגולטורי שמיוחסים לו מספר תהליכים פיזיולוגיים ופתו-פיזיולוגיים. בולט בין הפעילויות של GRP תפקידו בגירוי הפרשת gastrin מתאי G בקיבה. הגן המקודד ל-GRP באדם, ממוקם על הזרוע הארוכה של כרומוזום 18, במיקום 18q21.32 (עפ"י Lebacq-Verheyded וחב' ב-Genet Somat Cell Mol משנת 1987). מולקולת האם של בצורתה הבלתי-מקוטעת, preproGRP, מכילה 148 חומצות אמינו, ומקודדת על ידי שלושה exons המופרדים על ידי שני introns, כאשר התהליך של alternative splicing מביא ליצירה של עותקים אחדים, המקודדים למספר איזופורמים של GRP.

הקולטן של GRP או GRPR, ידוע כיום כ-BB2, קשור לחלבון G, שבבני אדם מבוטא ברמה גבוהה בבלוטת הלבלב, אך גם בקיבה, בקורטקס של בלוטת האדרנל ובמוח הקולטן הוא גליקופרוטאין החוצה את ממברנת התא 7 פעמים, והוא אחראי לשפעול האנזים phospholipase C. קולטן זה בא לביטוי פגום במספר סוגי סרטן, כמו זה של הריאות, המעי הגס, ובלוטת הערמונית.

הקודמן preproGRP מכיל signal peptide העובר ביקוע על ידי peptidase ליצירה של proGRP שעובר אף הוא ביקוע פרוטאוליטי ליצירת הפפטיד הבשל GRP המכיל 27 חומצות אמינו (Merali וחב' ב-Neuropeptides משנת 1999), או ליצירת הפפטיד בעל 10 חומצות אמינו המוכר כ-neuromedin C. הפפטיד GRP מופרש על ידי הסיבים הבתר-גנגליוניים של עצב ה-vagus, המעצבב את תאי G בקיבה ומגרה אותם להפרשת gastrin. ההורמון GRP מווסת מספר פונקציות במערכת העיכול וב-CNS, כולל הפרשת הורמונים מהמעי ומהקיבה, הפרשת חומצת קיבה, כיווץ שריר חלק ותנועת מעיים, שגשוג תאי אפיתל, ואף פעילות מיטוגנית ברקמות סרטניות. GRP מעורב גם בפיזיולוגיה של השעון הביולוגי (circadian system), תוך שהוא משתתף באיתותי אור למַתְנֵד (oscillator) הצירקדיאני המרכזי הממוקם בהיפותלאמוס ב-suprachiasmatic nuclei.

ניתן למצוא GRP בסיבי העצבים ברקמת הקיבה הלא-אנטראלית, במוח, ובתאים נוירו-אנדוקריניים בריאה העוברית (Yanaihara וחב' ב-Peptide משנת 1981). כיוון ש-GRP מיוצר לעתים קרובות על ידי תאי SCLC (עפ"י Yamaguchi וחב' ב-Cancer Res משנת 1983), עלתה המחשבה שמא פפטיד זה עשוי לשמש סמן במטופלים מאובחנים עם SCLC (עפ"י Maruno וחב' ב-Cancer Res משנת 1989). אלא ש-GRP אינו יציב בדם ולכן קשה למדוד את רמתו בתרחישים קליניים. לעומתו, הרצף 31-98 של ProGRP, רצף מהקצה ה-C טרמינאלי המשותף לשלושה סוגים של ProGRP הומאני, הוא פפטיד יציב בדם ונמדד במקור בשיטת RIA, על ידי Miyake וחב' ב-Cancer Res משנת 1994, ומיד לאחר מכן פותחה שיטת ELISA נוחה יותר למדידת ProGRP על ידי Aoagi וחב' ב-Clin Chem משנת 1995.

שיטות מעבדה להערכת ProGRP:

הערכה ראשונה של שיטת ARCHITECT האוטומאטית במלואה שפותחה במעבדות Abbott ב-Wiesbaden (גרמניה), דווחה בשנת 2009 על ידי Yoshimura וחב' ב-Clin Chem Lab Med. כיוון שנמצא שבשיטת ARCHITECT היציבות של ProGRP בנסיוב נמוכה כנראה בגלל פרוטאוליזה על ידי תרומבין, מומלץ להשתמש בשיטה זו בפלזמה (Yoshimura וחב' ב-Tumor Biol משנת 2008, ו-Kim וחב' ב-J Korean Med Sci משנת 2011).

לעומת זאת, ערכת Elecsys של חברת Roche Diagnostics (ב-Penzberg, גרמניה), תוכננה לעקוף מגבלה זו, באופן שניתן יהיה לבצע את מדידת ProGRP בנסיוב ובפלזמה כאחד, זאת כיוון ש-2 הנוגדנים החד-שבטיים בערכת Elecsys נקשרים לאפיטופים של ProGRP, שהם יציבים יחסית לביקוע פרוטאוליטי (Molina וחב' ב-Tumor Biol משנת 2009, ו-Nordlund וחב' באותו כתב עת ובאותה שנה). חברת Roche הוציאה ב-18 ביולי 2013 הודעה על השקת ערכה זו לשימוש באירופה (עדיין לא בארה"ב). העיקרון של שיטת ה-chemiluminiscence של Elecsys ונתונים שך חברת Roche על בחינת שיטה זו עם 185 חולי SCLC, 752 חולי NSCLC, 557 חולים עם צצאירויות אחרות ו-155 חולים עם מחלות ריאה שפירות, מופיעים ב-2 התרשימים להלן:

(להכניס כאן ברצף את התרשים מעליו המקרא מתחיל במילים Test principle, ומייד אחריו התרשים מעליו מופיעים המספרים N=185, N=752, n=557 ו-N=155.)

NSE כסמן ל-SCLC:

NSE או neuron specific enolase, היה עד לאחרונה הסמן המוביל באבחון SCLC, בניטור מחלה זו ובהערכה הפרוגנוסטית שלה (Niho וחב' ב-Lung Cancer משנת 2000, וכןShibayama וחב' באותו כתב עת משנת 2001 , ו-Johnson וחב' ב-Br J Cancer משנת 1993), אך רגישותו הנמוכה בפרט באלה עם מחלה מוגבלת, חייבו שימוש משולב גם בסמנים כמו CEA ו-CYFRA 21-1 שאינם ספציפיים ל-SCLC. בנוסף, רמות מוגברות באופן מתון של NSE ניתן למצוא בדגימות נסיוב ב-10-20% מהמקרים של NSCLC.

הבעיה עם NSE שהסתמן משך שנים כסמן השימושי ל-SCLC, נעוצה בספציפיות המוגבלת שלו. בהיותו צובע בבדיקה היסטו-פתולוגית עד 80% מהמקרים של NSCLC, ורמתו מוגברת משמעותית ב-20-30% מהמקרים של NSCLC (עפ"י Slodkowska וחב' ב-Int J Biol Markers משנת 2005), ואף על פי כן הוא היה הסמן המומלץ לאבחון SCLC על ידי המלצת ה-EGTM האירופי משנת 1999 ב-Anticancer Res. בנוסף, ל-NSE יש רגישות נמוכה בעיקר במטופלים עם סרטן ריאות המוגבל ל-hemithorax ipsilateral mediastinum (עפ"י Miyake וחב' ב-Cancer Res משנת 1994). כמו כן, כיוון ש-NSE נמצא באריתרוציטים ובטסיות-דם, אין אפשרות להשתמש בדגימות הימוליטיות, וחיוני ביותר לאחסן במהירת האפשרית בקירור את הדגימות.

NSE הוא הסמן המוביל באבחון SCLC, בניטור מחלה זו ובהערכה פרוגנוסטית שלה (Niho וחב' ב-Lung Cancer משנת 2000, וכן Shibayama וחב' באותו כתב-עת משנת 2001, ו-Johnson וחב' ב-Br J Cancer משנת 1993), אך רגישותו הנמוכה בפרט במטופלים עם מחלה מוגבלת במימדיה, חייבו שימוש משולב גם בסמנים כמו CEA ו-CYFRA 21-1 שאינם ספציפים ל-SCLC. בנוסף, רמות מוגברות באופן מתון של NSE ניתן למצוא בדגימות נסיוב ב- 10-20% מהמקרים של NSCLC.

ProGRP כסמן ל-SCLC:

בשנת 1999 דיווחו Stieber וחב' ב-Anticancer Res, ש-ProGRP הוא סמן שימושי לאבחון של SCLC, ובפרט הוא יעיל כסמן למעקב אחר מטופלים עם שאת במהלך הטיפולים. גם Lamy וחב' דיווחו באותו זמן ב-Lung Cancer משנת 2000 על השוואה בין ProGRP, כרומוגרנין A ו-NSE כסמנים בנסיוב ל-SCLC. הם בחנו פרוספקטיבית דגימות של 146 מטופלים תוך שימוש בערכת ELISA. על מנת לקבוע יחסי רגישות-ספציפיות כמו גם את דרגת הדיוק של כל אחד משלושת הסמנים האמורים, חוּשבו מאפייני עקומות AUC-RPC שלהם. הערכת הרגישות באוכלוסיית SCLC, והספציפיות במחלת ריאות שפירה, הראתה ש-ProGRP הראה את הרגישות הטובה ביותר כאשר נתוני AUC-ROC שלו היו גבוהים משמעותית מאלה המחושבים תוך שימוש בסמנים NSE ו-chromogranin A (עם ערכים מחושבים של 0.95, 0.89 ו-0.70, בהתאמה). ערך הסף של ProGRP שהניב את הרגישות-ספציפיות הגבוהים ביותר היה 53 פיקוגרם/מ"ל, עם רגישות של 0.80 וספציפיות של 0.96. יתרה מכך, על ידי שימוש בערך סף של 53 פיקוגרם/מ"ל, הספציפיות של ProGRP מנעה תוצאות חיוביות-כזוּבוֹת (false positive)כאשר סמן זה נבחן במקרים של NSCLC.

מחקר של Molina וחב' ב-Anticancer Res משנת 2005, בחן את הספציפיות ואת הרגישות של ProGRP ב-37 נבדקים בריאים, ב-195 נבדקים עם מחלות שפירות, וב-149 חולים במחלות ממאירות שאינן סרטן ריאות. כמו כן השווה מחקר זה בין ProGRP וסמנים אחרים המשמשים לאבחון סרטן ריאות כגון CEA, SCC, CYFRA 21-1 ו-NSE, ב-187 מטופלים עם NSCLC וכן ב-66 מטופלים עם SCLC. ערכי הסף בהם נעשה שימוש בניסוי זה היו 5 ננוגרם/מ"ל עבור CEA, 3.3 ננוגרם/מ"ל עבור CYFRA 21-1, 2 ננוגרם/מ"ל עבור SCC, 20 ננוגרם/מ"ל עבור NSE ו-50 פיקוגרם/מ"ל עבור ProGRP.

ערכי ProGRP בלתי תקינים נמצאו ב-10% של מטופלים עם מחלות שפירות, וב-13% מהמטופלים עם ממאירויות שאינן סרטן ריאות. אי-ספיקת כליות הייתה הגורם העיקרי ל-51.6% מהתוצאות החיוביות-כזובות של ProGRP. רמות מוגברות מעט של ProGRP (פחות מ-80 פיקוגרם/מ"ל) בנסיוב (ללא קשר לכשל כליות), נמצאו ב-4.1% של מטופלים של מחלות שפירות, וב-5% מהחולים במחלות ממאירות שאינן סרטן ריאות או גידולים נוירו-אנדוקריניים (120 פיקוגרם/מ"ל). תוצאות בלתי תקינות של ProGRP, NSE, CEA, CYFRA 21-1 ו-SCC, נמצאו ב-30%, 22.5%, 55.6%, 65.2% ו-26.7% של מטופלים עם NSCLC, וב-73%, 64%, 53%, 46% ו-4.5% במטופלים עם SCLC, בהתאמה. רמות הסמנים הסרטניים היו קשורות להיסטולוגיה ולדרגת הגידול הסרטני, כאשר ProGRP נמצא כסמן הרגיש ביותר ב-SCLC, כאשר CEA היה הסמן הרגיש ביותר ב-adenocarcinoma ו-CYFRA 21-1 נמצא הסמן הרגיש ביותר בגידולים של תאי קשקש. הבדיקה המשולבת הרגישה יותר (88%) לאבחון ומעקב של SCLC הייתה זו של ProGRP ו-NSE בעוד שמדידה משולבת של CEA ו-CYFRA 21-1 נתנה 82% רגישות.

Wójcik וחב' פרסמו בשנת 2008 ב-Anticancer Res את תוצאות מחקרם שנועד להשוות בין ProGRP ,NSE ו-CYFRA 21-1, לצורך אבחון של SCLC מוגבלת במימדיה, וכסמנים לניטור יעילות הטיפול בחולים עם תרחיש זה. המחקר התבצע בהשתתפות 64 חולים עם מחלה מוגבלת שלא טופלו קודם לכן. כל המטופלים קיבלו את אותו טיפול כימותרפי. מדידת רמת ProGRP, NSE ו-CYFRA 21-1 בנסיוב, התבצעה לפני כל מחזור טיפולים, וכן 3 ו-6 חודשים לאחריו. לפני הטיפול, רמות מוגברות של ProGRP, NSE ו-CYFRA 21-1, נמצאו ב-79.7%, 57.8% ו-23.4% מהמטופלים, בהתאמה. לפני מחזור הטיפולים השני, רמת שלושת הסמנים הללו ירדה משמעותית בהשוואה לרמותיהם לפני מחזור הטיפולים. יחד עם זאת, רק רמות ProGRP המשיכו לרדת במהלך מחזורי הטיפולים הבאים, בעוד שרמות NSE, ו-CYFRA 21-1, התנודדו בתוך תחומי הנורמה שלהם. אנליזה חד-משתנית (univariate analysis) הראתה קשר משמעותי בין הישרדות ללא-מחלה לבין רמות NSE ו-CYFRA 21-1 לפני התחלת הטיפולים, וכן קשר משמעותי בין ההישרדות והרמות של ProGRP ,NSEו-CYFRA 21-1 בבסיס המחלה. השינויים ברמות ProGRP נמצאו מדויקים יותר מאשר רמות NSE, ככלי ניטור ליעילות הטיפול בחולי SCLC עם מחלה מוגבלת. כן נמצא שבחולים אלה, מדידה משולבת של ProGRP ו-NSE נמצאה אופטימאלית לניבוי של הישנוּת המחלה.

מחקר של Nisman וחב' ב-Anticancer Res משנת 2009, נועד לבחון את המשמעות האבחונית והפרוגנוסטית של ProGRP במטופלים עם SCLC או עם SCLC, ולהשוות סמן זה עם סמנים מקובלים אחרים של סרטן הריאה. במחקר זה נמדדו רמות ProGRP, NSE, CEA ו-CYFRA 21-1 ב-37 מטופלים עם מחלת ריאות שפירה, ב-88 מטופלים עם NSCLC בשלב מחלה מתקדם, וב-37 מטופלים עם SCLC.

תוצאות מחקר זה היו כדלקמן: מדידת ProGRP נמצאה עדיפה על זו של NSE באבחנה מבדלת של SCLC בהשוואה לתחלואות ריאה אחרות, בעיקר ברמת ספציפיות מעל 90%. הרגישות של מדידת ProGRP ושל NSE במטופלים עם SCLC ברמת ספציפיות של 95% כנגד זו שמתקבלת במחלות ריאה שפירות, הייתה 78.4% ו-48.6%, בהתאמה. הבדל זה משמעותי סטטיסטית (p=0.001). כמו כן נמצא מתאם משמעותי בין רמות נמוכות של ProGRP לבין שאתות מסוג NSCLCבשלב מתקדם (p=0.002). אנליזה חד-משתנית הראתה מתאם משמעותי בין רמת ProGRP להישרדות ב-NSCLC וב-SCLC עם ערכי p=0.03 ו-p=0.04, בהתאמה.

(להכניס כאן את הטבלה מעליה מופיע Table II. Sensitivity of marker by histology of lung cancer).

תוך שימוש ב-ProGRP ריקומביננטי, פיתחו Yamaguchi וחב' מבחן ELISA למדידה של פפטיד זה, בו הושוותה משמעותו האבחונית של ProGRP במקרים של SCLC ביחס לסמנים אחרים כמו NSE, CEA או CYFRA 21-1. לשם כך נעשה שימוש ב-272 דגימות נסיוב של מטופלים עם קרצינומה מוכחת של הריאות, מתוכם 87 עם SCLC, ו-185 עם דגימות מאלה עם NSCLC. כקבוצת ביקורת שימשו 74 דגימות נסיוב ממטופלים עם מחלות ריאה שפירות, כמו גם של מעשנים.

נמצא שברמת ספציפיות של 95%, לשני הסמנים ProGRP ו-NSE הייתה רגישות דומה לאבחון SCLC, שנקבעה כ-47% ו-45%, בהתאמה. מדידה משולבת של 2 הסמנים הללו הוסיפה כ-20% לרגישות האבחון. לעומת זאת, בכל הקשור לאבחון NSCLC, נמצא ש-CYFRA 21-1 הוא הסמן המועדף, עם רגישות של 63%, בעוד ש-ProGRP הניב לעתים נדירות תוצאה חיובית כזובה. מסקנת חוקרים אלה היא ש-ProGRP הוא סמן בעל רגישות וספציפיות טובות לאבחון SCLC, ואף מתאים לצורך בקרה ומעקב אחר יעילות הטיפול.

בשנת 1997 פרסמו Okusaka וחב' ב-Clin Cancer Res את מחקרם בו נמדדו רמות ProGRP בשיטת ELISA, והושוו לרמות NSE ב-44 מאובחנים בלתי-מטופלים עם SCLC, וכן ב-77 מאובחנים לא מטופלים עם NSCLC. כמו כן נמדדו באופן פרוספקטיבי רמות ProGRP ו-NSE בחולים עם SCLC לאחר התחלת הטיפול עד להופעת relapse. הרגישות והספציפיות של ProGRP שנקבעו כ-70% ו-91% נמצאו דומים לאלה עבור NSE שנקבעו כ-70% ו-86%. נמצא ש-39%מבין המטופלים הגיבו באופן חלקי לטיפול ב-PVP, ב-CAV או ב-CODE, היו עדיין עם רמות מוגברות של ProGRP בשלבי הטיפול הראשונים. בהמשך המעקב, נמצא ש-94% מהמטופלים נמצאו עם רמות מוגברות של ProGRP היו בעלי רמות מוגברות של ProGRP בהופעת ה-relapse, כאשר רק כ-37% מתוכם נמצאו עם רמות מוגברות של NSE. בניסוי זה ערך סף הנורמה העליון של ProGRP נקבע כ-46 פיקוגרם/מ"ל, בעוד שסף הנורמה העליון של NSE נקבע כ-6.4 ננוגרם/מ"ל.

עוד העלה מחקר זה שרמות ProGRP גדלו כבר 35 ימים בממוצע לפני הופעת ממצאים קליניים המעידים על relapse ממשמש ובא הן בבדיקות גופניות כמו גם בבדיקות הדמיה, בה בשעה שרמות NSE גדלו באופן דומה רק 20 ימים בממוצע לאחר שהתרחשות ה-relapse כבר הייתה מתועדת קלינית (p<0.05). ערך הניבוי החיובי (ppv) של ProGRP ל-SCLC נמצא כ-82% לעומת 76% עבור NSE, ואילו ערך הניבוי השלילי (npv) ל-SCLC היה זהה עבור שני מסנים אלה ונקבע כ-84%.

הערכה עדכנית רב-מוסדית של שיטות מדידת ProGRP:

בשנת 2015 התפרסם ב-Clin Chim Acta מחקרם של Korse ,Molina וחב' בו בוצעה השוואה של ביצועי 2 שיטות למדידת ProGRP במרכזים רפואיים באמסטרדם, בון ברצלונה וכן 2 בתי חולים בבייג'ין. מדובר בשיטת ARCHITECT של חברת Abbott שהיא שיטת CMIA או chemiluminiscent microparticle immunoassay, בשיטת מדידה זו הושגו התוצאות הבאות: רמת השונות (coefficient of variance או CV ) נעה בין 2.2-6.0%, ויציבות טובה של דגימות נסיוב או פלזמה בזמני אחסון שונים שלהם. נמצא מתאם מצוין בין שיטות Elecsys ו-ARCHITECT בדגימות פלזמה (שיפוע 1.02).

בשיטת Elecsys נמצא מתאם טוב בין דגימות נסיוב ופלזמה (שיפוע 0.93), ו-CV של 0.97). סמן ה-ProGRP הבדיל בין SCLC ו-NSCLC (עם "שטח מתחת לעקומה"-AUC של 0.90 באוכלוסייה האירופית ו-0.84 באוכלוסייה הסינית) רגישות אבחון של 78.3% ו-ספציפיות של 95.0% כאשר סף הנורמה העליון נקבע כ-84.0 פיקוגרם/מ"ל. לא נמצאה כל השפעה על תוצאות מדידת ProGRP מגורמים כגון אתניות, גיל, מגדר, או עישון. התוצאות הממוצעות של רמת ProGRP היו נמוכות יחסית במחלות ריאות שפירות (38 פיקוגרם/מ"ל), בממאירויות שאינן קשורות לריאות (40 פיקוגרם/מ"ל), או ב-NSCLC (39 פיקוגרם/מ"ל). יחד עם זאת, בנבדקים עם מחלת כליות כרונית (מעל stage 3) נמדדו רמות ProGRP מעל 100 פיקוגרם/מ"ל.

(להכניס כאן את התרשים שהמקרא מתחתיו מתחיל במילים ..רמות ProGRP בתרחישים..)

בשנת 2004 פרסמו Molina וחב' ב-Clin Biochem סקירה מפורטת על יתרונות ProGRP כסמן של SCLC. בסקירה זו נקבע שערך סף הנורמה העליון של ProGRP הוא 50 פיקוגרם/מ"ל. יש להקפיד על כך שתפקוד לקוי של סינון פקעתי של הכליות, נוטה להעלות את רמת ProGRP בנסיוב, ועלול לשבש את מסקנות המדידה של סמן זה במקרים בו רמתו מוגברת באופן מתון כתוצאה ממחלת SCLC מוגבלת בהיקפה. אם לא כוללים את אלה עם תפקוד כליות מתון, רמות ProGRP לא עלו מעל 80 פיקוגרם/מ"ל במחלת ריאות שפירה (בסך הכול 3% מכלל המקרים שמעל סף הנורמה העליון), וכמו כן רמות ProGRP לא עלו מעל 120 פיקוגרם/מ"ל בממאירויות שאינם סרטן ריאות או גידולים נוירו-אנדוקרינים (בסך הכול 5% מכלל המקרים שמעל סף הנורמה העליון).

רמות ProGRP בנסיוב כרוכות באופן ברור לסרטן ריאות מסוג SCLC, בהשוואה לסרטן ריאות מסוג NSCLC. רמות ProGRP שמעל 120 פיקוגרם/מ"ל, נמצאו רק ב-4% מהנבדקים עם NSCLC. לעומת זאת, רמות לא תקינות של ProGRP, נמצאו ב-60-70% מהנבדקים עם מחלה מקומית של SCLC, וב-75-90% מאלה עם מחלה מפושטת של SCLC. על פי סקירתם של Molina וחב', ProGRP הוא סמן רגיש יותר מאשר NSE לאבחון SCLC, אם כי עד כה לא נמצא בניתוח רב משתנים (multivariate) להיות בעל משמעות פרוגנוסטית בלתי-תלויה. על פי נתוני Molina וחב' משנת 2004, נראה שהמדידה המשולבת של NSE ו-ProGRP היא המועדפת לניטור יעילות הטיפול במקרים של SCLC.

(להכניס כאן ברצף את 4 הטבלאות לפי הסדר הבא על פי המקראים שמתחת לטבלאות : א. רמות ProGRP בנסיוב בנבדקים ללא ממאירויות; ב. רמות ProGRP בנסיוב של נבדקים עם ממאירויות...;ג. רמות ProGRP ו-NSE.....; ד. רמות סמני סרטן אחדים...)

ProGRP

2015-07-12T07:59:39Z

בן עמי סלע: יצירת דף עם התוכן "== ProGRP == כינויים נוספים: Pro gastrin-releasing protein. תחום: אבחון מבדיל בין SCLC לבין NSCLC. טווח ערכים תקי..."

== ProGRP ==

כינויים נוספים: Pro gastrin-releasing protein.
תחום: אבחון מבדיל בין SCLC לבין NSCLC.
טווח ערכים תקין: מתחת ל-50 פיקוגרם/מ"ל.
יוצר הערך: פרופ' בן-עמי סלע.

== בסיס פיזיולוגי ==

במדינות המתועשות, סרטן ריאות הוא גורם מוביל של תמותה ביחס לסוגי סרטן אחרים, כאשר בקהיליה האירופית לדוגמה הוא מהווה 21% מסוגי הסרטן בין גברים, ו-29% מהתמותה מסרטן בקרבם. רוב הלוקים בסרטן ריאות, מתגלים בשלב מתקדם, בלתי ניתן לניתוח מה שמתבטא בפרוגנוזה גרועה.

סרטן ריאות מתחלק היסטולוגית לשתי קבוצות: small cell lung cancer או SCLC ו-non-small cell lung cancer או NSCLC, כאשר שני סוגים אלה נבדלים ביניהם בטיפול ובפרוגנוזה. SCLC הוא גידול אגרסיבי עם קצב גידול מהיר, ונטייה מוקדמת ליצירת גרורות לקשרי הלימפה האזוריים, אך גם לאיברים מרוחקים בעת האבחון, ויחד עם זאת עם רגישות גבוהה לכימו- ולרדיותרפיה. NSCLC מורכב מ-3 תת-קבוצות היסטולוגיות: אדנוקרצינומה, קרצינומה של תאי קשקש (squamous cells)וקרצינומה של תאים גדולים. באחרונים, טיפול ניתוחי הוא הטיפול היחיד שניתן להשיג בו ריפוי אפשרי. SCLC מהווה 15% מכלל מקרי סרטן הריאות החדשים והוא נבדל מ-NSCLC בהתמיינות (דיפרנציאציה) הנוירו-אנדוקרינית שלו.

סמנים סרטניים שונים נחקרו באופן נמרץ בסרטן ריאות, אך לא התגלה סמן ספציפי לשאת זו. NSE נחקר רבות כסמן אפשרי ל-SCLC (עפ"י Jorgensen וחב' ב-Br J Cancer משנת 1996), אך רמת הספציפיות שלו לא השביעה רצון כיוון שניתן היה לגלות סמן זה מוגבר ברמתו גם בממאירויות אחרות. חולשה נוספת של סמנים פוטנציאליים של סרטן ריאות מתבטאת ברגישות נמוכה יחסית, באופן שמחייב מדידה משולבת של מספר סמנים כדי להשיג רגישות מספקת (Molina וחב' ב-Tumor Biol משנת 1994, ו-Plebani וחב' ב-Br J Cancer משנת 1995). בנוסף, חלק מהסמנים שנבדקו הופיעו בסוגי סרטן ריאות שונים, ולדוגמה CEA מוגבר משמעותית ב-adenocarinoma, וריכוזי CYFRA 21-1 מוגברים ב-squamous cell carcinoma, אך ניתן למצוא מטופלים בהם 2 הסמנים האחרונים מוגברים גם ב-SCLC (עפ"י Paone וחב' ב-Eur Respir J משנת 1995).

gastrin releasing protein:

ההורמון GRP או gastrin releasing protein, הוא פפטיד הנוצר במעי, ובודד לראשונה מקיבה של חזיר בשנת 1978, ונמצא שהוא גורם להפרשה של gastrin בכלבים שטופלו עם GRP, כפי שתואר על ידי McDonald וחב' במאמרם ב-Gut. זהו פפטיד רגולטורי שמיוחסים לו מספר תהליכים פיזיולוגיים ופתו-פיזיולוגיים. בולט בין הפעילויות של GRP תפקידו בגירוי הפרשת gastrin מתאי G בקיבה. הגן המקודד ל-GRP באדם, ממוקם על הזרוע הארוכה של כרומוזום 18, במיקום 18q21.32 (עפ"י Lebacq-Verheyded וחב' ב-Genet Somat Cell Mol משנת 1987). מולקולת האם של בצורתה הבלתי-מקוטעת, preproGRP, מכילה 148 חומצות אמינו, ומקודדת על ידי שלושה exons המופרדים על ידי שני introns, כאשר התהליך של alternative splicing מביא ליצירה של עותקים אחדים, המקודדים למספר איזופורמים של GRP.

הקולטן של GRP או GRPR, ידוע כיום כ-BB2, קשור לחלבון G, שבבני אדם מבוטא ברמה גבוהה בבלוטת הלבלב, אך גם בקיבה, בקורטקס של בלוטת האדרנל ובמוח הקולטן הוא גליקופרוטאין החוצה את ממברנת התא 7 פעמים, והוא אחראי לשפעול האנזים phospholipase C. קולטן זה בא לביטוי פגום במספר סוגי סרטן, כמו זה של הריאות, המעי הגס, ובלוטת הערמונית.

הקודמן preproGRP מכיל signal peptide העובר ביקוע על ידי peptidase ליצירה של proGRP שעובר אף הוא ביקוע פרוטאוליטי ליצירת הפפטיד הבשל GRP המכיל 27 חומצות אמינו (Merali וחב' ב-Neuropeptides משנת 1999), או ליצירת הפפטיד בעל 10 חומצות אמינו המוכר כ-neuromedin C. הפפטיד GRP מופרש על ידי הסיבים הבתר-גנגליוניים של עצב ה-vagus, המעצבב את תאי G בקיבה ומגרה אותם להפרשת gastrin. ההורמון GRP מווסת מספר פונקציות במערכת העיכול וב-CNS, כולל הפרשת הורמונים מהמעי ומהקיבה, הפרשת חומצת קיבה, כיווץ שריר חלק ותנועת מעיים, שגשוג תאי אפיתל, ואף פעילות מיטוגנית ברקמות סרטניות. GRP מעורב גם בפיזיולוגיה של השעון הביולוגי (circadian system), תוך שהוא משתתף באיתותי אור למַתְנֵד (oscillator) הצירקדיאני המרכזי הממוקם בהיפותלאמוס ב-suprachiasmatic nuclei.

ניתן למצוא GRP בסיבי העצבים ברקמת הקיבה הלא-אנטראלית, במוח, ובתאים נוירו-אנדוקריניים בריאה העוברית (Yanaihara וחב' ב-Peptide משנת 1981). כיוון ש-GRP מיוצר לעתים קרובות על ידי תאי SCLC (עפ"י Yamaguchi וחב' ב-Cancer Res משנת 1983), עלתה המחשבה שמא פפטיד זה עשוי לשמש סמן במטופלים מאובחנים עם SCLC (עפ"י Maruno וחב' ב-Cancer Res משנת 1989). אלא ש-GRP אינו יציב בדם ולכן קשה למדוד את רמתו בתרחישים קליניים. לעומתו, הרצף 31-98 של ProGRP, רצף מהקצה ה-C טרמינאלי המשותף לשלושה סוגים של ProGRP הומאני, הוא פפטיד יציב בדם ונמדד במקור בשיטת RIA, על ידי Miyake וחב' ב-Cancer Res משנת 1994, ומיד לאחר מכן פותחה שיטת ELISA נוחה יותר למדידת ProGRP על ידי Aoagi וחב' ב-Clin Chem משנת 1995.

שיטות מעבדה להערכת ProGRP:

הערכה ראשונה של שיטת ARCHITECT האוטומאטית במלואה שפותחה במעבדות Abbott ב-Wiesbaden (גרמניה), דווחה בשנת 2009 על ידי Yoshimura וחב' ב-Clin Chem Lab Med. כיוון שנמצא שבשיטת ARCHITECT היציבות של ProGRP בנסיוב נמוכה כנראה בגלל פרוטאוליזה על ידי תרומבין, מומלץ להשתמש בשיטה זו בפלזמה (Yoshimura וחב' ב-Tumor Biol משנת 2008, ו-Kim וחב' ב-J Korean Med Sci משנת 2011).

לעומת זאת, ערכת Elecsys של חברת Roche Diagnostics (ב-Penzberg, גרמניה), תוכננה לעקוף מגבלה זו, באופן שניתן יהיה לבצע את מדידת ProGRP בנסיוב ובפלזמה כאחד, זאת כיוון ש-2 הנוגדנים החד-שבטיים בערכת Elecsys נקשרים לאפיטופים של ProGRP, שהם יציבים יחסית לביקוע פרוטאוליטי (Molina וחב' ב-Tumor Biol משנת 2009, ו-Nordlund וחב' באותו כתב עת ובאותה שנה). חברת Roche הוציאה ב-18 ביולי 2013 הודעה על השקת ערכה זו לשימוש באירופה (עדיין לא בארה"ב).

NSE כסמן ל-SCLC:

NSE או neuron specific enolase, היה עד לאחרונה הסמן המוביל באבחון SCLC, בניטור מחלה זו ובהערכה הפרוגנוסטית שלה (Niho וחב' ב-Lung Cancer משנת 2000, וכןShibayama וחב' באותו כתב עת משנת 2001 , ו-Johnson וחב' ב-Br J Cancer משנת 1993), אך רגישותו הנמוכה בפרט באלה עם מחלה מוגבלת, חייבו שימוש משולב גם בסמנים כמו CEA ו-CYFRA 21-1 שאינם ספציפיים ל-SCLC. בנוסף, רמות מוגברות באופן מתון של NSE ניתן למצוא בדגימות נסיוב ב-10-20% מהמקרים של NSCLC.

הבעיה עם NSE שהסתמן משך שנים כסמן השימושי ל-SCLC, נעוצה בספציפיות המוגבלת שלו. בהיותו צובע בבדיקה היסטו-פתולוגית עד 80% מהמקרים של NSCLC, ורמתו מוגברת משמעותית ב-20-30% מהמקרים של NSCLC (עפ"י Slodkowska וחב' ב-Int J Biol Markers משנת 2005), ואף על פי כן הוא היה הסמן המומלץ לאבחון SCLC על ידי המלצת ה-EGTM האירופי משנת 1999 ב-Anticancer Res. בנוסף, ל-NSE יש רגישות נמוכה בעיקר במטופלים עם סרטן ריאות המוגבל ל-hemithorax ipsilateral mediastinum (עפ"י Miyake וחב' ב-Cancer Res משנת 1994). כמו כן, כיוון ש-NSE נמצא באריתרוציטים ובטסיות-דם, אין אפשרות להשתמש בדגימות הימוליטיות, וחיוני ביותר לאחסן במהירת האפשרית בקירור את הדגימות.

NSE הוא הסמן המוביל באבחון SCLC, בניטור מחלה זו ובהערכה פרוגנוסטית שלה (Niho וחב' ב-Lung Cancer משנת 2000, וכן Shibayama וחב' באותו כתב-עת משנת 2001, ו-Johnson וחב' ב-Br J Cancer משנת 1993), אך רגישותו הנמוכה בפרט במטופלים עם מחלה מוגבלת במימדיה, חייבו שימוש משולב גם בסמנים כמו CEA ו-CYFRA 21-1 שאינם ספציפים ל-SCLC. בנוסף, רמות מוגברות באופן מתון של NSE ניתן למצוא בדגימות נסיוב ב- 10-20% מהמקרים של NSCLC.

ProGRP כסמן ל-SCLC:

בשנת 1999 דיווחו Stieber וחב' ב-Anticancer Res, ש-ProGRP הוא סמן שימושי לאבחון של SCLC, ובפרט הוא יעיל כסמן למעקב אחר מטופלים עם שאת במהלך הטיפולים. גם Lamy וחב' דיווחו באותו זמן ב-Lung Cancer משנת 2000 על השוואה בין ProGRP, כרומוגרנין A ו-NSE כסמנים בנסיוב ל-SCLC. הם בחנו פרוספקטיבית דגימות של 146 מטופלים תוך שימוש בערכת ELISA. על מנת לקבוע יחסי רגישות-ספציפיות כמו גם את דרגת הדיוק של כל אחד משלושת הסמנים האמורים, חוּשבו מאפייני עקומות AUC-RPC שלהם. הערכת הרגישות באוכלוסיית SCLC, והספציפיות במחלת ריאות שפירה, הראתה ש-ProGRP הראה את הרגישות הטובה ביותר כאשר נתוני AUC-ROC שלו היו גבוהים משמעותית מאלה המחושבים תוך שימוש בסמנים NSE ו-chromogranin A (עם ערכים מחושבים של 0.95, 0.89 ו-0.70, בהתאמה). ערך הסף של ProGRP שהניב את הרגישות-ספציפיות הגבוהים ביותר היה 53 פיקוגרם/מ"ל, עם רגישות של 0.80 וספציפיות של 0.96. יתרה מכך, על ידי שימוש בערך סף של 53 פיקוגרם/מ"ל, הספציפיות של ProGRP מנעה תוצאות חיוביות-כזוּבוֹת (false positive)כאשר סמן זה נבחן במקרים של NSCLC.

מחקר של Molina וחב' ב-Anticancer Res משנת 2005, בחן את הספציפיות ואת הרגישות של ProGRP ב-37 נבדקים בריאים, ב-195 נבדקים עם מחלות שפירות, וב-149 חולים במחלות ממאירות שאינן סרטן ריאות. כמו כן השווה מחקר זה בין ProGRP וסמנים אחרים המשמשים לאבחון סרטן ריאות כגון CEA, SCC, CYFRA 21-1 ו-NSE, ב-187 מטופלים עם NSCLC וכן ב-66 מטופלים עם SCLC. ערכי הסף בהם נעשה שימוש בניסוי זה היו 5 ננוגרם/מ"ל עבור CEA, 3.3 ננוגרם/מ"ל עבור CYFRA 21-1, 2 ננוגרם/מ"ל עבור SCC, 20 ננוגרם/מ"ל עבור NSE ו-50 פיקוגרם/מ"ל עבור ProGRP.

ערכי ProGRP בלתי תקינים נמצאו ב-10% של מטופלים עם מחלות שפירות, וב-13% מהמטופלים עם ממאירויות שאינן סרטן ריאות. אי-ספיקת כליות הייתה הגורם העיקרי ל-51.6% מהתוצאות החיוביות-כזובות של ProGRP. רמות מוגברות מעט של ProGRP (פחות מ-80 פיקוגרם/מ"ל) בנסיוב (ללא קשר לכשל כליות), נמצאו ב-4.1% של מטופלים של מחלות שפירות, וב-5% מהחולים במחלות ממאירות שאינן סרטן ריאות או גידולים נוירו-אנדוקריניים (120 פיקוגרם/מ"ל). תוצאות בלתי תקינות של ProGRP, NSE, CEA, CYFRA 21-1 ו-SCC, נמצאו ב-30%, 22.5%, 55.6%, 65.2% ו-26.7% של מטופלים עם NSCLC, וב-73%, 64%, 53%, 46% ו-4.5% במטופלים עם SCLC, בהתאמה. רמות הסמנים הסרטניים היו קשורות להיסטולוגיה ולדרגת הגידול הסרטני, כאשר ProGRP נמצא כסמן הרגיש ביותר ב-SCLC, כאשר CEA היה הסמן הרגיש ביותר ב-adenocarcinoma ו-CYFRA 21-1 נמצא הסמן הרגיש ביותר בגידולים של תאי קשקש. הבדיקה המשולבת הרגישה יותר (88%) לאבחון ומעקב של SCLC הייתה זו של ProGRP ו-NSE בעוד שמדידה משולבת של CEA ו-CYFRA 21-1 נתנה 82% רגישות.

Wójcik וחב' פרסמו בשנת 2008 ב-Anticancer Res את תוצאות מחקרם שנועד להשוות בין ProGRP ,NSE ו-CYFRA 21-1, לצורך אבחון של SCLC מוגבלת במימדיה, וכסמנים לניטור יעילות הטיפול בחולים עם תרחיש זה. המחקר התבצע בהשתתפות 64 חולים עם מחלה מוגבלת שלא טופלו קודם לכן. כל המטופלים קיבלו את אותו טיפול כימותרפי. מדידת רמת ProGRP, NSE ו-CYFRA 21-1 בנסיוב, התבצעה לפני כל מחזור טיפולים, וכן 3 ו-6 חודשים לאחריו. לפני הטיפול, רמות מוגברות של ProGRP, NSE ו-CYFRA 21-1, נמצאו ב-79.7%, 57.8% ו-23.4% מהמטופלים, בהתאמה. לפני מחזור הטיפולים השני, רמת שלושת הסמנים הללו ירדה משמעותית בהשוואה לרמותיהם לפני מחזור הטיפולים. יחד עם זאת, רק רמות ProGRP המשיכו לרדת במהלך מחזורי הטיפולים הבאים, בעוד שרמות NSE, ו-CYFRA 21-1, התנודדו בתוך תחומי הנורמה שלהם. אנליזה חד-משתנית (univariate analysis) הראתה קשר משמעותי בין הישרדות ללא-מחלה לבין רמות NSE ו-CYFRA 21-1 לפני התחלת הטיפולים, וכן קשר משמעותי בין ההישרדות והרמות של ProGRP ,NSEו-CYFRA 21-1 בבסיס המחלה. השינויים ברמות ProGRP נמצאו מדויקים יותר מאשר רמות NSE, ככלי ניטור ליעילות הטיפול בחולי SCLC עם מחלה מוגבלת. כן נמצא שבחולים אלה, מדידה משולבת של ProGRP ו-NSE נמצאה אופטימאלית לניבוי של הישנוּת המחלה.

מחקר של Nisman וחב' ב-Anticancer Res משנת 2009, נועד לבחון את המשמעות האבחונית והפרוגנוסטית של ProGRP במטופלים עם SCLC או עם SCLC, ולהשוות סמן זה עם סמנים מקובלים אחרים של סרטן הריאה. במחקר זה נמדדו רמות ProGRP, NSE, CEA ו-CYFRA 21-1 ב-37 מטופלים עם מחלת ריאות שפירה, ב-88 מטופלים עם NSCLC בשלב מחלה מתקדם, וב-37 מטופלים עם SCLC.

תוצאות מחקר זה היו כדלקמן: מדידת ProGRP נמצאה עדיפה על זו של NSE באבחנה מבדלת של SCLC בהשוואה לתחלואות ריאה אחרות, בעיקר ברמת ספציפיות מעל 90%. הרגישות של מדידת ProGRP ושל NSE במטופלים עם SCLC ברמת ספציפיות של 95% כנגד זו שמתקבלת במחלות ריאה שפירות, הייתה 78.4% ו-48.6%, בהתאמה. הבדל זה משמעותי סטטיסטית (p=0.001). כמו כן נמצא מתאם משמעותי בין רמות נמוכות של ProGRP לבין שאתות מסוג NSCLCבשלב מתקדם (p=0.002). אנליזה חד-משתנית הראתה מתאם משמעותי בין רמת ProGRP להישרדות ב-NSCLC וב-SCLC עם ערכי p=0.03 ו-p=0.04, בהתאמה.

(להכניס כאן את הטבלה מעליה מופיע Table II. Sensitivity of marker by histology of lung cancer).

תוך שימוש ב-ProGRP ריקומביננטי, פיתחו Yamaguchi וחב' מבחן ELISA למדידה של פפטיד זה, בו הושוותה משמעותו האבחונית של ProGRP במקרים של SCLC ביחס לסמנים אחרים כמו NSE, CEA או CYFRA 21-1. לשם כך נעשה שימוש ב-272 דגימות נסיוב של מטופלים עם קרצינומה מוכחת של הריאות, מתוכם 87 עם SCLC, ו-185 עם דגימות מאלה עם NSCLC. כקבוצת ביקורת שימשו 74 דגימות נסיוב ממטופלים עם מחלות ריאה שפירות, כמו גם של מעשנים.

נמצא שברמת ספציפיות של 95%, לשני הסמנים ProGRP ו-NSE הייתה רגישות דומה לאבחון SCLC, שנקבעה כ-47% ו-45%, בהתאמה. מדידה משולבת של 2 הסמנים הללו הוסיפה כ-20% לרגישות האבחון. לעומת זאת, בכל הקשור לאבחון NSCLC, נמצא ש-CYFRA 21-1 הוא הסמן המועדף, עם רגישות של 63%, בעוד ש-ProGRP הניב לעתים נדירות תוצאה חיובית כזובה. מסקנת חוקרים אלה היא ש-ProGRP הוא סמן בעל רגישות וספציפיות טובות לאבחון SCLC, ואף מתאים לצורך בקרה ומעקב אחר יעילות הטיפול.

בשנת 1997 פרסמו Okusaka וחב' ב-Clin Cancer Res את מחקרם בו נמדדו רמות ProGRP בשיטת ELISA, והושוו לרמות NSE ב-44 מאובחנים בלתי-מטופלים עם SCLC, וכן ב-77 מאובחנים לא מטופלים עם NSCLC. כמו כן נמדדו באופן פרוספקטיבי רמות ProGRP ו-NSE בחולים עם SCLC לאחר התחלת הטיפול עד להופעת relapse. הרגישות והספציפיות של ProGRP שנקבעו כ-70% ו-91% נמצאו דומים לאלה עבור NSE שנקבעו כ-70% ו-86%. נמצא ש-39%מבין המטופלים הגיבו באופן חלקי לטיפול ב-PVP, ב-CAV או ב-CODE, היו עדיין עם רמות מוגברות של ProGRP בשלבי הטיפול הראשונים. בהמשך המעקב, נמצא ש-94% מהמטופלים נמצאו עם רמות מוגברות של ProGRP היו בעלי רמות מוגברות של ProGRP בהופעת ה-relapse, כאשר רק כ-37% מתוכם נמצאו עם רמות מוגברות של NSE. בניסוי זה ערך סף הנורמה העליון של ProGRP נקבע כ-46 פיקוגרם/מ"ל, בעוד שסף הנורמה העליון של NSE נקבע כ-6.4 ננוגרם/מ"ל.

עוד העלה מחקר זה שרמות ProGRP גדלו כבר 35 ימים בממוצע לפני הופעת ממצאים קליניים המעידים על relapse ממשמש ובא הן בבדיקות גופניות כמו גם בבדיקות הדמיה, בה בשעה שרמות NSE גדלו באופן דומה רק 20 ימים בממוצע לאחר שהתרחשות ה-relapse כבר הייתה מתועדת קלינית (p<0.05). ערך הניבוי החיובי (ppv) של ProGRP ל-SCLC נמצא כ-82% לעומת 76% עבור NSE, ואילו ערך הניבוי השלילי (npv) ל-SCLC היה זהה עבור שני מסנים אלה ונקבע כ-84%.

הערכה עדכנית רב-מוסדית של שיטות מדידת ProGRP:

בשנת 2015 התפרסם ב-Clin Chim Acta מחקרם של Korse ,Molina וחב' בו בוצעה השוואה של ביצועי 2 שיטות למדידת ProGRP במרכזים רפואיים באמסטרדם, בון ברצלונה וכן 2 בתי חולים בבייג'ין. מדובר בשיטת ARCHITECT של חברת Abbott שהיא שיטת CMIA או chemiluminiscent microparticle immunoassay, בשיטת מדידה זו הושגו התוצאות הבאות: רמת השונות (coefficient of variance או CV ) נעה בין 2.2-6.0%, ויציבות טובה של דגימות נסיוב או פלזמה בזמני אחסון שונים שלהם. נמצא מתאם מצוין בין שיטות Elecsys ו-ARCHITECT בדגימות פלזמה (שיפוע 1.02).

בשיטת Elecsys נמצא מתאם טוב בין דגימות נסיוב ופלזמה (שיפוע 0.93), ו-CV של 0.97). סמן ה-ProGRP הבדיל בין SCLC ו-NSCLC (עם "שטח מתחת לעקומה"-AUC של 0.90 באוכלוסייה האירופית ו-0.84 באוכלוסייה הסינית) רגישות אבחון של 78.3% ו-ספציפיות של 95.0% כאשר סף הנורמה העליון נקבע כ-84.0 פיקוגרם/מ"ל. לא נמצאה כל השפעה על תוצאות מדידת ProGRP מגורמים כגון אתניות, גיל, מגדר, או עישון. התוצאות הממוצעות של רמת ProGRP היו נמוכות יחסית במחלות ריאות שפירות (38 פיקוגרם/מ"ל), בממאירויות שאינן קשורות לריאות (40 פיקוגרם/מ"ל), או ב-NSCLC (39 פיקוגרם/מ"ל). יחד עם זאת, בנבדקים עם מחלת כליות כרונית (מעל stage 3) נמדדו רמות ProGRP מעל 100 פיקוגרם/מ"ל.

(להכניס כאן את התרשים שהמקרא מתחתיו מתחיל במילים ..רמות ProGRP בתרחישים..)

בשנת 2004 פרסמו Molina וחב' ב-Clin Biochem סקירה מפורטת על יתרונות ProGRP כסמן של SCLC. בסקירה זו נקבע שערך סף הנורמה העליון של ProGRP הוא 50 פיקוגרם/מ"ל. יש להקפיד על כך שתפקוד לקוי של סינון פקעתי של הכליות, נוטה להעלות את רמת ProGRP בנסיוב, ועלול לשבש את מסקנות המדידה של סמן זה במקרים בו רמתו מוגברת באופן מתון כתוצאה ממחלת SCLC מוגבלת בהיקפה. אם לא כוללים את אלה עם תפקוד כליות מתון, רמות ProGRP לא עלו מעל 80 פיקוגרם/מ"ל במחלת ריאות שפירה (בסך הכול 3% מכלל המקרים שמעל סף הנורמה העליון), וכמו כן רמות ProGRP לא עלו מעל 120 פיקוגרם/מ"ל בממאירויות שאינם סרטן ריאות או גידולים נוירו-אנדוקרינים (בסך הכול 5% מכלל המקרים שמעל סף הנורמה העליון).

רמות ProGRP בנסיוב כרוכות באופן ברור לסרטן ריאות מסוג SCLC, בהשוואה לסרטן ריאות מסוג NSCLC. רמות ProGRP שמעל 120 פיקוגרם/מ"ל, נמצאו רק ב-4% מהנבדקים עם NSCLC. לעומת זאת, רמות לא תקינות של ProGRP, נמצאו ב-60-70% מהנבדקים עם מחלה מקומית של SCLC, וב-75-90% מאלה עם מחלה מפושטת של SCLC. על פי סקירתם של Molina וחב', ProGRP הוא סמן רגיש יותר מאשר NSE לאבחון SCLC, אם כי עד כה לא נמצא בניתוח רב משתנים (multivariate) להיות בעל משמעות פרוגנוסטית בלתי-תלויה. על פי נתוני Molina וחב' משנת 2004, נראה שהמדידה המשולבת של NSE ו-ProGRP היא המועדפת לניטור יעילות הטיפול במקרים של SCLC.

(להכניס כאן ברצף את 4 הטבלאות לפי הסדר הבא על פי המקראים שמתחת לטבלאות : א. רמות ProGRP בנסיוב בנבדקים ללא ממאירויות; ב. רמות ProGRP בנסיוב של נבדקים עם ממאירויות...;ג. רמות ProGRP ו-NSE.....; ד. רמות סמני סרטן אחדים...)

נוגדנים כנגד DFS70

2015-07-07T07:57:34Z

בן עמי סלע: יצירת דף עם התוכן "== נוגדנים כנגד DFS70 == כינויים נוספים: DFS70; LEDGFp75. תחום: בדיקת reflux למבחן ANA לאישוש או שלילת מחל..."

== נוגדנים כנגד DFS70 ==

כינויים נוספים: DFS70; LEDGFp75.
תחום: בדיקת reflux למבחן ANA לאישוש או שלילת מחלת ריאומטית אוטו-אימונית סיסטמית.
יוצר הערך: פרופ' בן-עמי סלע.

נוכחותם של נוגדנים עצמיים כנגד אנטיגנים תוך-תאיים, ובעיקר נוגדנים כנגד מרכיבי גרעין התא, anti nuclear antibodies או ANA, הפך למעין נקודת ציון של מחלות אוטואימוניות ריאומטיות (Mahler ו-Fritzler ב-Ann NY Adad Sci משנת 2010). ב-1958 היה זה Friou שתאר לראשונה ב- Immunol צביעה אימונו-פלואורסצנטית בלתי ישירה לגילוי ANA, כאשר עד היום ברוב המעבדות משתמשים בתאי HEp-2 בתרבית. תאים אלה הם שורת תאים (cell line) שיוצרו בשנת 1952 על ידי Moore וחב' והתפרסמו בשנת 1955 ב-Cancer Res, ממקור של גידול בחולדות יונקות, שנוצר מהזרקת רקמת קרצינומה אפידרמאלית בגבר בן 56 שנה, גידול שטופל בקורטיזון ועבר הקרנות. תא HEp-2 מכיל מאות רבות של אוטו-אנטיגנים פוטנציאליים, והוא הפך מצע אידיאלי לגילוי ANA המומלץ על ידי Am College of Rheumatology (עפ"י Meroni ו-Shure ב-Ann Rheumat Dis משנת 2010). למעלה מיובל שנים מהכנת תאי HEp-2 לשגרת המעבדה הדיאגנוסטית, והוא עדיין משמש כמצע הנבחר לזיהוי ANA לצורך אבחון מחלות סיסטמיות אוטואימוניות ראומטיות, בעיקר SLE ו-systemic sclerosis.

אכן, נוגדנים כנגד ANA נמצאו בנסיוב של מטופלים עם מחלות סיסטמיות אוטו-אימוניות שונות, אך גם בנסיוב של נבדקים בריאים (Fritzler וחב' ב-Clin Immunol Immunopathol משנת 1985, וכן Ruffatti וחב' ב-Gerontology משנת 1990, ו-Vlam וחב' ב-Clin Exp Rheumatol משנת 1993).

ממחקרים עדכניים יותר אלא מתברר שבערך ב-20% מהמקרים של דגימות נסיוב מנבדקים בריאים לחלוטין, מתקבלת תוצאת ANA חיובית (Op De וחב' ב-Autoimmun Rev משנת 2011, וכן Pisetsky ב-Arthritis Res Ther משנת 2011 ו-Watanabe וחב' ב-Arthritis Rheum משנת 2004), כאשר רוב הנוגדנים העצמיים ל-ANA האחראיים לתשובה החיובית-כזובה (false positive) מכוונים כנגד אנטיגן המכונה DFS70 או dense fine speckles 70 (עפ"י Fritzler ב-Arthritis Rheum משנת 2011). האנטיגן DFS70 מכונה גם lens epithelium-derived growth factor או LEDGF. לראשונה התגלו נוגדנים כנגד DFS70 במטופל עם interstitial cystitis על ידי Ochs וחב' ב-J Urology משנת 1994, ובהמשך גילו Ochs וחב' ריבוי מקרים של מציאות נוגדנים ל-DFS70 בעיקר במקרים של atopic dermatitis (ב-J Allergy Clin Immunol משנת 2000).

מחקר של Kang ו-Lee ב-Korean J Lab Med משנת 2009 על המשמעות הקלינית של תבנית DFS במבחן ANA במחלות דלקתיות כרוניות כמו גם באנשים בריאים, העלה את הנתונים הבאים: בניסוי נעשה שימוש בערכת HEp-2 של חברת Bio-Rad, ונכללו בו 2,654 משתתפים. נמצא ש-ANA היה חיובי ב-352 נבדקים המהווים 13.3% מהמדגם הכולל: תבנית הצביעה של DFS נמצאה ב-101 מקרים מתוך כלל 2,654 הדגימות (3.8%), והיא נמצאה ב -28.7% מתוך 352 הדגימות החיוביות למבחן ANA. השכיחות של תבנית הצביעה של DFS הייתה גבוהה יחסית באלו עם seborrheic dermatitis בהם 14.3% מהדגימות נמצאו חיוביות, כאשר 15.4% מהדגימות נמצאו חיוביות ל-DFS ב-SLE, בעוד 11.1% של herpes zoster היו חיוביות ל-DFS, כמו גם 16.9% מהדגימות של rheumatoid arthritis, וכן 14.3% מהדגימות של Sjogren syndrome.

מסקנת החוקרים במחקר הקוריאני היא תבנית DFS שכיחה יחסית ומהווה כ-28% מכלל המקרים החיוביים במבחן ANA בשיטת הצביעה הפלואורסצנטית הבלתי-ישירה. שכיחות גבוהה יחסית של תבנית DFS נמצאה במחלות אוטואימוניות, בניגוד לממצא זה במחקרים אחרים.

מחקר של Mahler וחב' ב-J Rheumatol משנת 2012 נועד לבחון את שכיחותם של נוגדנים כנגד DFS70 באנשים בריאים לעומת מאובחנים עם מחלות ריאומטיות אוטואימוניות סיסטמיות. במחקר זה נכללו 3,263 משתתפים מתוכם 251 דגימות של מאובחנים עם SLE, כאשר תבנית DFS נבחנה הן בשיטת ELISA וכן בערכת chemiluminescence assay או CLA, שתיהן של חברת QUANTA.

תוצאות מחקר זה היו כדלקמן: סך הכול ב-1.62% מכלל הדגימות התקבלה תגובה חיובית של נוגדנים כנגד DFS70. שכיחות נוגדנים אלה שהתגלו בשיטת CLA בקבוצות הנבדקים השונות הייתה כדלקמן: 8.9% בקרב אנשים בריאים, 2.8% באלה עם SLE, בעוד שב-rheumatoid arthritis נמצאו 2.6% דגימות חיוביות, 4.0% דגימות חיוביות ל-DFS70 נמצאו באסתמה, 5.0% נמצאו חיוביות ב-interstitial cystitis, וכן 1.7% מהדגימות של מאובחנים עם מחלת Graves, 7% מאלה עם תסמונת Sjögren ו-6.0% מאלה עם Hashimoto's thyroiditis נמצאו גם כן חיוביות לנוגדנים כנגד DFS70.

שכיחות גבוהה יחסית של תבנית הצביעה של DFS70 בבדיקות המעבדה:

כאמור נוגדנים עצמיים כנגד DFS70 אחראיים לכ-12% מהתוצאות החיוביות של HEp-2 בבדיקות שגרה. שכיחות גבוהה יחסית זו משקפת תדירות מוגברת של נוגדן עצמי זה באוכלוסיה הכללית, ועפ"י Watanabe וחב' נוגדנים עצמיים ל-DFS70 מייצגים 54% מהתגובה החיובית של ANA באנשים בריאים עם תוצאות ANA חיוביות. ראוי לציין שהשכיחות של נוגדנים כנגד DFS70 נמצאה גבוהה משמעותית בנבדקים בריאים בהשוואה לנבדקים עם מחלות אוטואימוניות ריאומטיות סיסטמיות (p=0.00085). במדגם של מאובחנים עם SLE, נוגדנים עצמיים ל-DFS70 לא היו כרוכים משמעותית עם מאפייני המחלה או עם מציאותם של נוגדנים עצמיים אחרים שנמצאו ב-SLE. רק באחד מתוך שבע דגימות של SLE, נמצאו נוגדנים כנגד DFS70, אך ללא פעילות אחרת של נוגדנים עצמיים.

Watanabe וחב' פרסמו בשנת 2004 ב-Arthritis & Rheumatism את נתוני מחקר שערכו בקרב 597 עובדי מערכת הבריאות ביפאן, כולם מתנדבים בבריאות טובה, לנוכחות נוגדנים ל-DFS70. דגימות נסיוב של 142 גברים ו-455 נשים נבחנו לנוגדנים ל-ANA ול-DFS70 בשיטת אימונו-פלואורסצנציה ישירה, ותאי HEp-2 כמצע, וכן בשיטת immunoblotting תוך שימוש ב-DFS70 ריקומביננטי, ותמצית תאי HeLa. תוצאות מחקר זה היו כדלקמן: נוגדנים ל-ANA נמצאו ב-20% מכלל משתתפי המחקר. כמו כן נמצאו 64 נבדקים חיוביים לנוגדנים ל-DFS70, המהווים 11% מכלל הנבדקים במחקר זה, ו-54% מכלל אלה שנמצאו חיוביים ל-ANA. השכיחות של דגימות חיוביות לנוגדנים כנגד DFS70 ירדה ככל שהגיל התקדם (p=0.0017).

מסקנת המחקר הייתה שאם לוקחים בחשבון שממצא חיובי לנוגדני DFS70 הוא נדיר יחסית בנבדקים עם מחלה סיסטמית ריאומטית אוטואימונית (SARD), הכנסת הבדיקה למציאות הנוגדנים האחרונים לשגרת הבדיקות של אלה שנמצאו חיוביים ל-ANA, עשויה לשמש לשלילת SARD, ולמניעת בדיקות המשך וטיפולים מיותרים. בנוסף, מבדק לנוגדנים ל-DFS70, יכול לאתר תת-אוכלוסיה של אנשים בריאים בהם מעקב ממושך עלול לאתר תרחישים קליניים, שכן מציאות נוגדנים ל-DFS70 נכרכה במספר תחלואות.

(להכניס כאן את הטבלה מעליה מופיעה הכותרת: Anti-dense fine speckles 70…..).ׁ

המשמעות של הסמן anti-DFS70 בפירוש של תוצאות ANA HEp-2 חיוביות:

מבדק ANA בשיטה אימונו-פלואורסצנטית בלתי-ישירה, יכול להניב תוצאות חיוביות הנגרמות על ידי נוגדנים עצמיים רבים, כולל נוגדנים anti-DFS70 שאין להם קשר ידוע למחלות אוטואימוניות ריאומטיות סיסטמיות. כאשר מתקבלת תוצאה חיובית עם הנוגדן העצמי כנגד DFS70, יכולה להיגרם דאגה בלתי מוצדקת אצל הנבדקים ומטפליהם, כמו גם נקיטה בטיפולים ובדיקות המשך מיותרות. בשנים האחרונות התרבו הראיות לכך שנוגדנים עצמיים מבודדים כנגד DFS70 אינם קשורים למחלות אוטואימוניות ריאומטיות סיסטמיות (Dellavance וחב' ב-J Rheum משנת 2005, כאשר למסקנה דומה הגיעו גם Muro וחב' ב-Lupus שנת 2008, וכן Watanabe וחב' ב-Arthritis Rheum משנת 2004 ו-Mariz חב' ב-Arthritis Rheum משנת 2011). כמו כן הראו Miyara וחב' שמציאות נוגדנים כנגד DFS70, אחראית לתוצאה המתקבלת חיובית ב-12% מהתוצאות החיוביות של HEp-2 בבדיקות שגרה ב-Clin and Develop Immun משנת 2013. על פי Mahler וחב' ב-Autoimmune rev משנת 2012, בדיקת נוגדנים מבודדים כנגד DFS70 עשויה להיות בדיקה אקסקלוסיבית כיכולה לשמש סמן של מחלות אוטואימוניות ריאומטיות סיסטמיות (SARD).

מהו תפקידו של החלבון DFS70?

במקור שם החלבון נקרא על בסיס התבנית האופיינית, כאשר אנטיגן היעד לנוגדן DFS70 הוא משפעל השעתוק הגרעיני p75 הידוע גם כ-lens epithelium growth factor או LEDGF (עפ"י Shinohara וחב' ב- Prog Retin Eye Res משנת 2002. החלבון LEDGF קושר DNA ומעודד גדילה ועמידות לאפופטוזיס המושרית על ידי גורמים סביבתיים כגון עקה חמצונית ו-heat shock. תבנית DFS אופיינית לתאי HEp-2 נחים. כיוון ש-LEDGF הוא חלבון-קושר-DNA, הפיזור הצביעה האופיינית המוגדרת כ-dense fine speckling מוסברת על ידי הפיזור הדחוס של צביעת הנוגדן העצמי בשלבי ה-interphase ו-mteaphase בנוקלאו-פלזמה.

(להכניס כאן את התמונה מתחתיה מופיע המקרא המתחיל במילים ...תבנית של dense fine speckled..)

מהי התמונה הקלינית של נבדקים עם נוגדנים עצמיים ל-DFS70?

מוצאים נוגדנים אלה במגוון רחב של תרחישים כמו תסמונת Vogt-Harada, אסתמה, דרמטיטיס אטופית, interstitial cystitis ו-Hashimoto's thyroditis. לעומת זאת נוגדנים עצמיים מבודדים כנגד DFS70 נדירים ביותר במחלות אוטואימוניות ריאומטיות סיסטמיות (SARD). במדגם גדול של 251 מאובחנים עם SLE, נמצא רק מקרה אחד עם תוצאה חיובית מבודדת של נוגדנים עצמיים כנגד DFS70.

בחינה של למעלה מ-10,000 דגימות שנמצאו חיוביות ל-ANA במבחן אימונו-פלואורסצנטי בלתי ישיר כמו גם במבדק של immunoblot, העלתה שנוכחות של נוגדנים עצמיים כנגד DFS70 הייתה שכיחה בין נבדקים עם ANA חיובי ללא כל ראיות של מחלה אוטואימונית ריאומטית סיסטמית. אך למרות שאין כל הקשר קליני מדווח במציאות נוגדנים אלה, מומלץ לבצע בדיקת נוגדנים כנגד DFS70 בתור סמן עזר לשלילה של נוכחות מחלה אוטואימונית ריאומטית סיסטמית. המלצה זו מבוססת על התצפית שנבדקים שנמצאו חיוביים למבדק DFS70, לא פיתחו מחלה אוטואימונית ריאומטית סיסטמית אף לאחר מעקב קליני של 4 שנים (Mariz וחב' ב-Arthritis Rheum משנת 2011).

מבחן לנוכחות נוגדנים ל-DFS70 באוכלוסיה אמריקנית:

מחקר של Rawat חב' ב-Arthritis Rheumatol משנת 2011, בחן מאפיינים קליניים של נוכחות נוגדנים כנגד DFS70. דגימות נבדקו ל-ANA על ידי שיטה בלתי ישירה עם תאי HEp-2 וחלקיקים (beads) מצופים בנוגדנים. 110 דגימות נסיוב עם תוצאת ANA חיובית אך כאלו שנמצאו שליליות לתת-קבוצות של ANA, זוהו, ונבחנו בעזרת ערכת ELISA לנוכחות נוגדנים כנגד DFS70, מתוכן 26 דגימות המהוות 24% ממדגם זה נמצאו חיוביות. לגבי 10מתוך 26 דגימות הנסיוב האחרונות היו נתונים קליניים: חמש מתוך 10 דגימות אלו הופנו בדיעבד למרפאה ריאומטולוגית.

התמונה שהתקבלה לגבי צביעה אימונופלואורצנטית ל-ANA הייתה בעיקר תמונה מנומרת (speckled) מעורבת ב-7 מתוך 10 הדגימות. ב-3 דגימות הייתה צביעת ABA הומוגנית בלבד. בדגימה אחת נמדד כייל של 1:40 לגבי ANA, ב-3 דגימות נמצא כייל של 1:80 לגבי ANA, ב-2 דגימות נמצא כייל ANA של 1:60 וב-2 דגימות נמדד כייל ANA של 1:320. באחת מהדגימות נמצא נוגדן כנגד RNP אך לא נמצאו בה אי-סדירויות סרולוגיות אחרות של ENA או extractable nuclear antigens כגון Ro ,La ,Sm ,Scl-70 ,Jo1. התסמונות הקליניות השכיחות היו כאבי מפרקים (arthralgia) ב-6 מתוך 10 נבדקים וכאבי שרירים (myalgia) ב-3 מקרים עם תוצאות נורמאליות של האנזים creatine kinase. בנבדק אחד אובחנה synovitis. לא אובחנו תסמינים של מחלת רקמת חיבור ב-10 הנבדקים.

משמעות צביעה חיובית ל-DFS70 בדגימות חיוביות ל-ANA:

Mahler וחב' דיווחו בשנת 2013 בסימפוזיון Dresden בנושא אוטואימוניות, על מחקר שכלל 142 דגימות נסיוב שהתבססו על צביעה חיובית ל-ANA ולכרומטין של תאים מתחלקים, אך עם צביעה שלילית של נוגדנים כנגד dsDNA. דגימות שנלקחו מ-24 נבדקים מאובחנים עם systemic sclerosis, ומ-26 מאובחנים עם SLE שמשו כקבוצת ביקורת. כל הדגימות נבדקו לנוכחות נוגדנים ל-DFS70 בעזרת ערכת QUANTA Flash DFS70 בשיטתchemiluminescent immunoassay.

בין 142 דגימות עם מתווה DFS, 28.1% נמצאו חיוביות ל-anti-DFS70, בעוד שרק 2% מהדגימות עם systemic sclerosis ו-SLE נמצאו חיוביות (p<0.0001). הכייל של נוגדנים כנגד DFS70 היה גבוה משמעותית בדגימות עם מתווה DFS (בממוצע CU43.9 לעומת CU 5.5, עם p<0.0001). המלצת חוקרים אלה היא שספיחה של נוגדנים כנגד DFS70 קודם לביצוע מבחן צביעה אימונו-פלואורסצנטית בלתי-ישירה ל-ANA, עשוייה לזהות דגימות נסיוב המכילות נוגדנים ל-DFS70, ועל ידי כך להתגבר על אחת המגבלות המשמעותיות ביותר של קבלת תוצאות חיוביות-כזובות באנשים בריאים במבחן ANA עם תאי HEp-2.

מרשם זרימה של ממצאי מעבדה בצביעה אימונו-פלואורסצנטית בלתי-ישירה של ANA ו-DFs70:

להכניס כאן את התרשים מתחתיו מתחיל המקרא במילים.... צביעה אופיינית, אלגוריתם מוצע... )

פפטיד דמוי הורמון פאראתירואידי - Parathyroid hormone-related protein

2015-06-29T05:54:13Z

בן עמי סלע:

==פפטיד דמוי הורמון פאראתירואידי - Parathyroid hormone-related protein ==

כינויים נוספים: PTHrP; PTH Related Peptide.
תחום: גורם הורמונאלי מרכזי במטבוליזם של סידן בגוף.
טווח ערכים תקין: פחות מ-2 פיקומול' למ"ל, או 14-27 פיקוגרם למ"ל.
יוצר הערך: פרופ' בן-עמי סלע.

== מטרת הבדיקה ==

אבחון מטופלים החשודים לתרחיש של היפר-קלצמיה של ממאירות (HHM או humoral hypercalcemia of malignancy), או אבחון של מטופלים עם היפר-קלצמיה מסיבה לא ידועה). רמת PTHrP יכולה לשמש גם לניטור יעילות הטיפול האנטי-סרטני.

== בסיס פיזיולוגי ==
PTHrP הוא חלבון חבר במשפחת ההורמון PTH. הוא מופרש על ידי תאים סרטניים אך יש לו גם תפקידים בפיזיולוגיה התקינה של גוף האדם. PTHrP בא לביטוי באתרים רבים בגוף, ויש לו פעילות אנדוקרינית, פאראקרינית ואינטרה-קרינית, ובכך הוא משפיע על מגוון של תרחישים פיזיולוגיים ופתולוגיים, בנוסף לתפקידיו בבניית איברים (Wysolmerski ב-J Clin Endocrinol Metabol משנת 2012, ו-McCauley ו-Marin ב-J Bone Miner Res משנת 2012).

(להכניס כאן את התרשים שהמקרא תחתיו מתחיל במילים...תפקידיו הפיזיולוגיים של PTHrP)

(להכניס כאן את התרשים שהמקרא שלו מתחיל במילים ... הפעילויות הפאראקריניות של PTHrP...)

PTHrP הוא פפטיד מונומרי הקיים במספר איזופורמים, שגודלם נע בין 60 חומצות אמינו ועד 173 חומצות אמינו, הנוצרים על ידי תהליך splicing דיפרנציאלי, ומעורבות של האנזים prohormone convertase. החלבון PTHrP מיוצר בריכוזים נמוכים על ידי כל רקמות הגוף. תפקידיו הפיזיולוגיים אינם ברורים באופן מוחלט, וניתן לחלקם לארבע קטגוריות, שלא כולן באות לביטוי על ידי כל אחד מהאיזופורמים ולבטח לא כולם באים לביטוי בכל הרקמות: א. טרנספורט של סידן משני צידי האפיתל בעיקר בכליות וברקמת השד; ב. הרפיה של שריר חלק ברחם, בשלפוחית השתן, במערכת העיכול, ובדופן העורקים; ג. וויסות של שגשוג תאים; ד. התמיינות (דיפרנציאציה) של תאים ואפופטוזיס במגוון רקמות. כיוון ש-PTHrP הוא מרכיב חיוני של הריון תקין והתפתחות עוברית, חסר או פגם של חלבון זה קטלני בעוברי יונקים.

עניין רב ומחקר רחב ממדים מתחילת שנות ה-90, הם תולדה של הממצאים על היות PTHrP מיוצר באופן נורמאלי ברקמות רבות בהן הוא פועל באופן פאראקריני. ישנם רק שלושה מצבים, בהם PTHrP מופיע בצירקולציה ופועל באופן אנדוקריני: א) התסמונת ההיפרקצמית של ממאירות (HHM) בה מיוצר PTHrP על ידי השאתות ונודד דרך הדם לרקמת העצם וגורם לספיגת עצם (Burtis וחב' ב-J Clin Endocrinol Metabol משנת 1992, ו-Grill וחב' באותו כתב עת משנת 1991); ב) תהליך ההנקה (lactation) בו PTHrP נוצר בבלוטות החלב בשד ומגיע לצירקולציה (Grill וחב' ב-Clin Endocrinol משנת 1992); ג) החיים העובריים, בהם PTHrP מווסת את הטרנספורט של סידן מהאם לעובר דרך השליה (Kovacs וחב' ב-Proc Natl Acad Sci USA משנת 1996).

PTHrP זוהה כגורם להיפרקלצמיה של מצבי ממאירות בשנת 1987, על ידי Martin וחב' במלבורן על ידי שבודדו אותו משורת תאים של סרטן ריאה באדם (Proc Natl Acad Sci USA משנת 1987). באותה עת זיהו Rodan וחב' (J Clin Invest משנת 1983) חלבון זה המופרש מתאים אוסטאובלסטים, וכן זיהו Burtis וחב' (J Biol Chem משנת 1987) תאים שמקורם בסרטן שד חלבון שמשקלו המולקולארי 17,000 דלטון בעל פעילות מעודדת את האנזים adenylate cyclase), ואילו Strewler וחב' משנת 1987 ב-J Clin Invest, בודדו משורת תאים של סרטן כליה את החלבון שבדיעבד זוהה כ-PTHrP. לאחר מכן הראו Miao וחב' על ידי פגיעה בעכברים בגן המקודד ל-PTHrP שהדבר קטלני בעכברים אלה על ידי פגיעה במערכת העצמות, על ידי מניעת צמיחת העצם הטרבקולארית (Endocrinology משנת 2004).

ממצא אחרון זה הצביע על החשיבות הפיזיולוגית הניכרת של PTHrP. בשנים שחלפו מאז נמצא ש-PTHrP ו-PTH מקודדים על ידי גנים הקשורים זה לזה המהווים חלק ממשפחת גדולה יותר של ה-PTH gene. הקשר האבולוציוני הזה, מאפשר ל-חלבונים אלה להיקשר לאותו קולטן הידוע כ-type 1 PTH/PTHrP Receptor, מה שמסביר מדוע היפרקלצמיה של הממאירות דומה לזו הופיעה בהיפר-פארא-תירואידיזם. במקור, היו סבורים ש-PTHrP קשור בעיקר בתסמונת פארא-נאופלסטית, אך כיום כבר ברור ש-PTHrP קשור לתרחישים של אוסטאופורוזיס, אוסטאו-ארתריטיס, וסרטן השד, ואף נמצא ש-PTHrPעצמו עשוי לשמש כתרפיה של אוסטאופורוזיס וסוכרת.

כיום קיימת כבר ההכרה בדבר הפיזור הרחב של PTHrP ברקמות נרחבות בגוף, ולפעילויות האנדוקרינית, הפאראקרינית והאינטרה-קרינית, המניעות מספר תרחישים פיזיולוגיים ופתולוגיים, וכן בדבר תפקידו המרכזי ב-organogenesis. במחקר חלוצי קלאסי של מטופל עם קרצינומה של הכליות והיפרקלצמיה משנת 1941 ב-N Eng J Med, העלה Fuller Albright את ההשערה שמספר גידולים סרטניים יכולים לגרום להיפרקלצמיה, על ידי הפרשה של PTH או של "חלבון מאוד דומה ל-PTH". אכן בתרחיש של "היפרקלצמיה של ממאירות" יש ל-PTHrP פעילות דומה לזו של PTH, וכאשר שאת סרטנית מפרישה PTHrP הדבר גורם ישירות להיפרקלצמיה (Broadus וחב' ב-N Eng J Med משנת 1988). כיוון שהיפרקלצמיה הנגרמת על ישי PTHrP היא לעתים הסימן המוקדם של ממאירות, היא נחשבת כתופעה פארא-נאופלסטית.

הסינתזה והמבנה של PTHrP:

PTHrP של אדם מקודד על ידי גן בודד (PTHLH) הנמצא על הזרוע הקצרה של כרומוזום 12 (עפ"י Strewler וחב' ב-J Clin Invest משנת 1987, ו-Suvaוחב' ב-Science משנת 1987). על ידי splicing חלופי, נוצר מגוון של סוגי mRNA, המקודדים ל-3 איזופורמים של PTHrP בעלי 139, 141 ו-173 חומצות אמינו. כבר מהתחלת המחקר הייתה הכרה שהגנים PTHLH ו-PTH קשורים זה לזה, כאשר ה-exon/intron של המקטע ב-2 גנים אלה המקודד לרצפי pre-pro שלהם, והחלק ההתחלתי של 2 הפפטידים הבשלים זהה לחלוטין. יתרה מכך, הקטעים של 2 הגנים המקודדים את הקצה ה-N טרמינאלי של PTH ו-PTHrP המופרשים לצירקולציה, הם בעלי הומולוגיה ניכרת, הבאה לביטוי בהיותם זהים ב-8 מתוך 13 חומצות האמינו (עפ"י Mangin וחב' ב-Proc Natl Acad Sci USA משנת 1988), וכן בהיותם בעלי מבנה שניוני דומה לאורך 21 חומצות האמינו הבאות.

ממצא אחר של Kemp וחב' שהופיע ב-Science בשנת 1987, היה שבדומה למה שידוע לגבי PTH גם במקרה של PTHrP כל פעילותו הביולוגית נכללת ב-34 חומצות האמינו בקצה ה-N טרמינאלי. רצפים הומולוגיים אלה, מאפשרים לשני הפפטידים להיקשר לאותו קולטן ולשפעל אותו, מה שעשוי להסביר מדוע PTHrP גורם להיפרקלצמיה של ממאירות. כל החברים במשפחת הגן PTH, הופיעו במקביל לאבולוציה של בעלי החוליות, כנראה כתוצאה מדופליקציה של גן קדמון בודד. בין כל חברי משפחת הגן PTH, הגן PTHLH הוא בעל המבנה הגנומי המורכב ביותר ואת השוֹנוּת הרבה ביותר בין מיני בעלי חיים שונים, מה שמשקף כנראה את המגוון הגדול של תפקודי PTHrP ברקמות השונות. אכן, המגוון הגדול של פעילויות פיזיולוגיות של PTHrP בא לביטוי בכך שהרכב חומצות האמינו של חלבון זה השתמר באופן בולט באדם, חולדה, עכבר, תרנגולת, ובכלב עד לחומצת אמינו 111. מעניין לציין שאפילו PTHrP של דג fugu הוא בעל הומולוגיה של 53% עם PTHrP של האדם.

(להכניס כאן את התמונה שהמקרא מתחתיה מתחיל במלים ...מולקולת האם של PTHrP מכילה בקצה...)

הפפטידים של PTHrP והקולטנים שלו:

הפפטיד PTHrP 1-36 מופרש ממספר סוגי תאים כמו תאי לב, מוח, שריר השלד, שלפוחית השתן, צינורות המרה, מערכת החיסון, כבד, רחם ואשכים, כמו גם איברים אנדוקריניים הכוללים את בלוטת יותרת המוח ותאי C בבלוטת התריס (Orloff וחב' ב-Endocr Rev משנת 1994 ו-Ureña וחב' ב-Endocrinology משנת 1993), אך הצורות הארוכות יותר של הפפטידים בקצה האמיני של PTHrP, מופרשות גם מקרטינוציטים ומתאי אפיתל של בלוטות השד, במקרים של סרטן העור ובתקופת הנקה (Burtis וחב' ב-N Eng J Med משנת 1990, וכן Sowers וחב' ב-JAMA משנת 1996 ו-VanHouten וחב' ב-J Clin Invest משנת 2003).

ההפרשה של הפפטידים המוגדרים כ-midregion כולל חומצות אמינו 38-94, 39-95 ו-38-101 תוארה גם כן (Soifer וחב' ב-J Biol Chem משנת 1992), אם כי הביולוגיה של פפטידים האחרונים אינה ברורה, פרט לעובדה שה-mid-region של PTHrP מעודד טרנספורט של סידן בשִליָה וקשור למודולציה של ביקרבונאט בכליות. כמו כן, המקטעים ה-C טרמינאלים של PTHrP המורכבים מחומצות אמינו 107-138 ו-109-138 תוארו ותפקידם הוא בעיכוב יצירת אוסטאוקלסטים ובעידוד השגשוג של אוסטאובלסטים (Philbrick וחב' ב-Physiol Rev משנת 1996).

בשנת 1991 התפרסם ב-Science מחקרם של Juppner וחב', בו תואר בידודו של הקולטן של PTHrP, כאשר מחקרים בעכברי knock out עם פגיעה בקולטן זה, הדגימו את החשיבות של PTHrP (עפ"י Lanske וחב' ב-Science משנת 1996) אותה קבוצת חוקרים אף הדגימה במאמר משנת 1998 ב-Endocrinology, שאותו קולטן יכול לשמש את 2 הליגנדים, PTH ו-PTHrP. כמעט 20 שנה חלפו עד לפרסום של Miao וחב' משנת 2005 ב-J Clin Invest בו הודגמה חשיבותו של PTHrP המופרש מאוסטאובלסטים, כגורם אנאבולי פוטנטי בכל הקשור ליצירת עצם.

הפעילות התוך גרעינית של PTHrP ופעילותו כ-intracrine factor:

בנוסף לפעילויות האנדוקריניות והפאראקריניות של PTHrP המופרש מרקמות שונות, יש ראיות מוצקות לכך שצורה מסוימת של PTHrP אינה מופרשת, ועל ידי הכוונתו של הורמון זה לגרעין תאים יש לו שם פעילות גרעינית כגון זו הקשורה למודולציה של אפופטוזיס בתאים אלה. בין היתר, שעתוק של הגן PTHLH יכול להשפיע עת מניעת ההפרשה של PTHrP אל מחוץ לתאים, והכוונתו לגרעין התאים (Fiaschi-Taesch וחב' ב-Endocrinology משנת 2003). תנועת PTHrP לתוך גרעין התא מושפעת מרצף של חומצות אמינו בין עמדות 84 ו-93 המשפיע על התנועה הדו-כיוונית של PTHrP אל תוך הגרעין, והחוצה ממנו (Roth וחב' ב-J Biol Chem משנת 2011). נראה שהזרחון של PTHrP בעמדה Thr85 על ידי cyclin-dependent kinase p34cdc2, משחקת תפקיד בהחדרת PTHrP לגרעין התא.

לא הרבה ידוע על הפעילות התוך-גרעינית של PTHrP. ידוע שהוא נקשר ל-RNA ובמספר תאים הוא ממוקם בגרעינון (nucleolus), מה שמרמז לכך ש-PTHrP קשור לוויסות התנועה של RNA, לדינאמיקה של ריבוזומים ואף לתרגום של חלבונים. בתאים בתרבית נמצא ש-PTHrP גרעיני, משפיע על שגשוג תאים, אך גם על אפופטוזיס, ולעתים הוא פועל לנטרול פעילותו של THrP המופרש מתאים. בתאי סרטן השד, המעי הגס והערמונית, נראה ש-PTHrP מעודד שגשוגם של תאים אלה, מגן עליהם מפני אפופטוזיס, ומעודד את כושר נדידתם, בה בשעה ש-PTHrP המופרש מתאים אלה, מעכב את שגשוג התאים הללו ומעודד בהם אפופטוזיס (Park וחב' ב-Endocr Related Cancer משנת 2012, ו-Shen וחב' ב-Exp Cell Res משנת 2004).

PTHrP גרעיני נמצא גם כמעודד את השגשוג של תאי שריר חלק וסקולאריים in vitro ו-in vivo על ידי השריית הביטוי של c-myc ושל skp2, שבתגובה מפחיתים את רמות מעכב מחזור חלוקת התא, p27. לעומת זאת ל-PTHrP המופרש מהתא יש השפעות מנוגדות.

תפקיד PTHrP במערכת העצם והשלד:

החשיבות הפיזיולוגית של PTHrP במערכת השלד הייתה מוכרת מאז שהתברר שפגיעה ביצירת הורמון זה בעכברים מייד לאחר הלידה גרמה למותם כתוצאה מכשל נשימתי, מה שיוחס לפגם ביצירת קופסת הצלעות שלהם (Karaplis וחב' ב-Genes Dev משנת 1994). תרחיש זה מבליט את ההבדל בין PTHrP לבין PTH שפגיעה בגן שלו הייתה פחות דרמטית בעכברים יילודים (Miao וחב' ב-J Clin Invest משנת 2002). החשיבות של PTHrP בהתפתחות השלד מבחינת הפגמים ביצירתו הנגרמים בחסרים של הורמון זה chondrodysplasia ו-premature epiphyseal closure, הודגמה בעוברי עכברים על ידי Amizuka וחב' ב-J Cell Biol משנת 1994, העיקר לגבי יצירת סחוס אפיפיזיאלי בלתי תקין ושינויים ביצירת עצם אנדוכונדראלית.

נמצא שעכברי PTHrP(+/-) עם חסר חלקי של PTHrP, נורמאליים פנוטיפית בלידה, אך לאחר 3 חודשים הם בעלי מסת עצם נמוכה, עם ירידה בולטת בעובי העצם הטרבקולארית, ועלייה ניכרת במספר האדיפוציטים במח העצם (Amizuka וחב' ב-Dev Biol משנת 1996). חוקרים אלה מצאו שעכברים עם גנוטיפ PTHrP(+/-), לוקים בגיוס של precursors של מח העצם, וכן יש באוסטאובלסטים שלהם רמת אפופטוזיס גבוהה בהשוואה לעכברים תקינים. עכברים פגומים לגבי יצירת PTHrP נמצאו גם בעלי יצירה מופחתת של אוסטאוקלסטים.

במודלים של בעלי-חיים נמצא שביטוי-יתר או ביטוי-חסר של PTHrP, נקבע על ידי האופן בו מגיב הקצה ה-N טרמינאלי של ההורמון עם הקולטן PTRH1 על מנת לסנכרן את קצב ההתמיינות של הכונדרוציט, ולשמור על גידול סדיר של עצמות ארוכות (Kronenberg ב-Ann NY Acad Sci משנת 2006). פלטת הגדילה מורכבת מעמודות של כונדרוציטים מתחלקים ומתמיינים הגדלים בהדרגה לשלב של כונדרוציטים קדם-היפרטרופיים ולאחר מכן לכונדרוציטים היפרטרופיים. PTHrP מופרש בעיקר על ידי בונדרוציטים לא-בשלים בקצות העמודות המתוארות, בתגובה למולקולה אחרת הידועה כ-IHH או Indian hedgehog, המיוצרת על ידי כונדרוציטים היפרטופיים מתמיינים. בתגובה, PTHrP משפעל את הקולטן PTHR1 הממוקם על פני תאים מתחלקים וקדם-היפרטרופיים כדי לשמר את קצב החלוקות שלהם ולהאט את קצב ההתמיינות שלהם לתאים היפרטרופיים. באופן זה, IHH ו-PTHrP פועלים במין לולאת משוב שלילית כדי לווסת את קצב ההתמיינות של כונדרוציטים.

לאחרונה התגלו פרטים רבים על מארג האיתותים דרכם מפעיל PTHrP את השפעתו על התמיינותם של כונדרוציטים. שתי קבוצות מחקר הראו ש-IHH מגביר את ביטויו של PTHrP בפלטת הגדילה על ידי החלשת הפעילות של גורם השיעתוק Gli3 (עפ"י Koziel וחב'ב-Development משנת 2005). הדרך בה פועל PTHrP על כונדרוציטים דרך הקולטן PTHR1, נעשית על ידי השפעול של Gα3, על ידי יצירת cAMP ועל ידי פעילות האנזים protein kinase A, כאשר בתגובה משתתפים בסדרת אירועים הכוללים זרחון של SOX9, עיכוב ביטויו של p57, והשריית הפעילות של Gli3, Bcl-2 ו-cyclin D1. בדיעבד פעילות PTHrP מזרחנת ופוגעת בשני גורמי השעתוק Runx2 ו-Runks3, החיוניים להתמיינות של כונדרוציטים (Marino ב-Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes ).

לאחרונה הודגם ש-PTHrP יכול להשתתף במודולציה של התמיינות כונדרוציטים על ידי וויסות התנועה של histone deacetylase לתוך גרעין התא, מה שגורם לוויסות פעילותם של גורמי השעתוק Zfp521, MEF2, ו-Runks2 (עפ"י Correa וחב' ב-Dev Cell משנת 2010 ו-Seriwatanachai וחב' ב-FASEB Jמשנת 2011). מסלול זה נדרש לפעילות PTHrP. יתרה מכך, הוכר לאחרונה שמוטציות בגנים של PTHrP ושל HDAC4 גורמות לצורה של chondrodysplasia type E הידועה גם כ-brachydactyly type E, המזכירה אי-סדירויות במטופלים עם מוטציות בגן GNAS, מה שמרמז שכל שלושת הגנים נמצאים על אותו מסלול גנטי (Williams וחב' ב-Am J Hum Genet משנת 2010). מחקר עדכני של Hirai וחב' משנת 2011 ב-Proc Natl Acad Sci USA, בו השתמשו בגישה גנטית לפגיעה בגן של PTHrP בכונדרוציטים במהלך התקופה שלאחר הלידה של עכברים, מצא ש-PTHrP מווסת גם את ההתמיינות של כונדרוציטים ומשמר אותם בפלטת הגדילה הבשלה. הדבר מרמז על האפשרות שאובדן האיתות של PTHrP יכול לגרום ל"סגירה" של פלטת הגדילה, בשלב ההתבגרות (Wang וחב' ב-J Bone Miner Res משנת 2011).

PTHrP מיוצר גם באתרים סחוסיים אחרים כמו ב-perichondrium המקיף את רצועות ה-hyaline המשמשות להארכת הצלעות ותורמות לאלסטיות של קירות בית החזה, והידועות כ-costal cartilages, וכן מקיף את הכונדרוציטים הסוּב-ארטיקולאריים. PTHrP מבוטא גם באופן בולט בנקודות הנעיצה של רצועות וגידים לתוך העצם, ותורם לבניית מכלולים אלה בעת תהליך גדילת השלד.

ל-PTHrP יש תפקידים אנאבוליים חשובים בעצם, ומתוך לימוד מעורבותו של חלבון זה בביולוגיה התקינה של רקמות סחוס ועצם, אין הדבר מפתיע ששינויים בתפקוד PTHrP קשורים למפגעי שלד. הדוגמה הבולטת ביותר היא HHM בו PTHrP בצירקולציה המגיב עם הקולטן PTHR1 בשלד גורם לתהליך ספיגת עצם ושחרור סידן להופעת היפרקלצמיה. מוטציות loss-of-function בגן של PTHR1 גורמות ל-Blomstrand's chondrodysplasia הגורמת למות העובר ברחם (Nissenson ב-Endocrinology משנת 1998). בנוסף, מוטציות loss-of-function בגן של PTHLH גורמות לתסמונת הכוללת קומה נמוכה, עצמות מטקרפליות קצרות בידים, גרורות סרטניות, וקשיי לימודים. נראה שהפעילות האנאבּולית של PTHrP בעצם עשויה להיות שימושית בטיפול באוסטאופורוזיס (Horwitz וחב' ב-J Clin Endocrinol Metabol משנת 2010).

השפעול של PPR שהוא הקולטן המשותף של PTH/PTHrP, מגרה 2 חלבוני G הטרודימריים, Gs ו-Gq. אנליזה גנטית מראה שהשפעול של Gs מתווך בפעילות PTHrP לשמור על כונדרוציטים שיתחלקו וישגשגו, ואילו השפעול של Gq נוגד את הפעילות האחרונה. כאשר משופעל Gs, יש פעילות במסלול התוך-תאי בו חל דיכוי סינתזה של p57 שהוא מעכב של cyclin-CDK, וכתוצאה מכך יש שגשוג של כונדרוציטים.

לעומת זאת, ל-PTHrP יש גם פעילות להאטה של תהליכי התמיינות בכונדרוציטים, מה שמתבצע על ידי זרחון של גורם השעתוק SOX9, וכן על ידי דיכוי הסינתזה של mRNA המקודד לגורם השעתוק Runx2. מסלולים אלה וודאי אחרים שעדיין לא התגלו, חוברים על מנת לווסת את קצב ההתמיינות של כונדרוציטים בפלטת הגדילה בתגובה ל-PTHrP.

לקצה ה-N טרמינאלי של PTHrP יש הומולוגיה עם קצה זה ב-PTH, לכן שני חלבונים אלה יכולים להיקשר לאותו קולטן, הידוע כ-type 1 PTH receptorאו PTHR1. אך בניגוד ל-PTH המסוגל להיקשר רק לסוג קולטנים יחיד, PTHrP מסוגל להיקשר למגוון גדול יותר של קולטים. אכן, PTHrP יכול לגרות את רוב הפעילויות שמשרה PTH, כולל הגברת ספיגת עצם, והגברת הספיגה מחדש בקצה הרחיקני (דיסטאלי) של אבוביות הכליה, ועיכוב הטרנספורט של פוספאט באבוביות הקריבניות (פרוקסימאליות). יחד עם זאת, הסבירות של PTHrP לגרות יצירת קלציטריול (1,25dihydroxy vitamin D) נמוכה יותר מזו של PTH. לכן, PTHrP אינו מגביר ספיגת סידן במעי.

תפקיד PTHrP בהתפתחות בלוטות החלב בשד:

מחקרים על PTHrP ועל הקולטן PTHR1 בעכברי knock-out, העלו שאיתות על ידי הורמון זה נחוץ ליצירת ה-mammary glands העובריים (Hens וחב' ב-Breast Cancer Res משנת 2007). עוברי אדם הלוקים ב-Blomstrad's chondrodysplasia חסרים אף הם רקמת שד, מה שמוכיח שאיתות של PTHrP חיוני להתפתחות השד גם באדם (Wysolmerski וחב' ב-J Clin Endocrinol Metabol משנת 2001). בלוטות השד נוצרות בעובר בתהליך של שקיעה פנימה (invagination) של תאים אפידרמליים אל תוך סטרומה שומנית מתפתחת, באופן היוצר מעין צינורית שמתפתחת בהמשך למערכת ה-mammary ducts (עפ"י Robinson ב-Nat Rev Genet משנת 2007).

בעוברים של עכבר ואדם, תאי אפיתל בנבט של רקמת השד מייצרים PTHrP, אשר מגיב עם קולטני PTHR1 המופיעים על פני התאים המזנכימאלים המקיפים. אינטראקציה זו חיונית להתמיינות תקינה של התאים המזנכימאלים, אשר בתגובה מעודדים את הצמיחה של הצינורות (ducts) האפיתליאלים. איבוד האיתות של PTHrP מונע את ה"דו-שיח" החיוני בין תאי האפיתל והתאים המזנכימאלים, מה שעוצר את התפתחות רקמת השד כבר בשלב הנבט. PTHrPגורם למודולציה של איתותי Wnt ו-BMP, כמו גם לביטוי במזנכימה של מספר גורמי שעתוק, כולל הקולטן לאנדרוגנים, Max2 ו-Lef1, כאשר כל אלה תורמים לצמיחה של ציורות עובריים ברקמת השד (Hens וחב' ב-Dev Dyn משנת 2009).

לאחר הלידה, ממשיך PTHrP להיות מבוטא ברמה נמוכה בתאים מיו-אפיתליאלים, כאשר הקולטן PTHR1 מבוטא בתוך הסטרומה מסביב לצינוריות השד. בתקופה הבוגרת, PTHrP מבוטא באופן ניכר על ידי תאי אפיתל בשד בתקופת ההנקה, וכמויות ניכרות שלו מופרשות לחלב (Budayr וחב' ב-Proc Natl Acad Sci USA משנת 1989), אך תפקידו בחלב אינו ברור. יחד עם זאת, PTHrP מופרש גם מרקמת השד לצירקולציה, והוא משתתף בוויסות הסיסטמי של סידן והמטבוליזם של העצם בעת ההנקה. רקמת העצם של האם משמשת כמקור סידן ליצירת חלב, וידוע שבנשים מניקות יש איבוד מהיר של רקמת עצם.

רמות מוגברות של PTHrP בצירקולציה, תואמות איבוד רקמת עצם באדם, כאשר CaSR או calcium-sensing receptor, שהוא קולטן הקשור ל-G-protein type C, ה"חש" בריכוזים חוץ-תאיים של יון הסידן, ומדכא את הפרשת PTHrP מתאי השד (VanHouten וחב' ב-J Clin Invest משנת 2004). תהליך זה מבטא באופן קלאסי לולאת משוב שלילי אנדוקרינית, בה PTHrP מגייס סידן מעצם השלד, כאשר בתגובה מעוכבת הפרשת PTHrP מרקמת השד. מהבנת תפקידו של PTHrP בהגברת ספיגת העצם בעת הנקה, אין זה מפתיע ש-PTHrP תורם גם להמסת רקמת עצם (osteolysis) בתהליך יצירת גרורות לעצם. אי לכך, תאי סרטן שד גרורתיים לעצם מייצרים יותר PTHrP מאשר תאי הגידול הראשוני (Akhtari וחב' ב-Cancer Biol The משנת 2008).

נמצא ש-TGF-β המופרש באזורי ספיגת עצם, מגביר את יצירת PTHrP על ידי מסלול איתותים אליו קשור גורם השעתוק Gli2 (עפ"י Johnson וחב' ב-Cancer Res משנת 2011). בתגובה, מגביר PTHrP את קישורו של גורם השעתוק NF-κB לקולטנו, ומפחית את היצור של osteoprotegerin ובכך מגדיל את כמות התאים האוסטאוקלסטים ואת פעילותם האוסטאוליטית. בנוסף, בניגוד למתרחש בתאי שד תקינים, איתות של CaSR בתאי סרטן שד מגרה בהם את יצירת PTHrP. במחקרם של Henderson וחב' ב-Cancer Res משנת 2006, נחקרו 526 מקרים של סרטן שד בהם נמצא שביטוי של PTHrP היה מנבא בלתי-תלוי למהלך קליני יותר שפיר. גם Li וחב' במחקרם בעכברים שהופיע ב- J Clin Invest משנת 2011, הראו שפגיעה בגן ל-PTHLH האריכה באופן דרמטי את הלטנטיות של סרטן השד והאטה את התפתחות השאת.

תפקיד PTHrP בטרנספורט של סידן בשלייה:

סידן מועבר דרך השלייה מהאם לעובר (Kovacs ב-J Clin Endocrinol Metabol משנת 2001), כאשר השלייה מייצרת PTHrP שמסייע לשמור על רמת סידן תקינה בעובר. הראשונים שהדגימו את פעילות PTHrP במעבר סידן דרך דופן השלייה היו Rodda וחב' ב-J Endocrinol משנת 1998. בשנת 1990 פרסמו Care וחב' ב-Exp Physiol, ולאחר מכן Wu וחב' ב-J Biol Chem משנת 1996, שדווקא הפפטידים "הפנימיים" ב-PTHrP, דהיינו 67-86 ו-38-94 הם הפפטידים הפעילים ביותר בתחום זה, כאשר לחומצות האמינו בקצה ה-N טרמינאלי של PTHrP אין פעילות דומה. נתון זה רומזים לכך שיש בשלייה קולטנים ספציפיים ל-mid-region של PTHrP. ניסויים בעכברים של Simmonds וחב', בהם נעשתה מניפולציה גנטית אישרו שאמנם ל-PTHrP יש תפקיד בוויסות של הטרנספורט של סידן בשלייה, שחיוני לתהליך המינרליזציה של השלד בעובר (Crit Rev Eukaryot Gene Expr משנת 2012).

תפקיד PTHrP בהרפיה של שריר חלק:

דוגמה לפעילות הפאראקרינית של PTHrP ניתן למצוא בהשפעתו על תאי שריר חלק בדופן כלי-דם. PTHrP מופרש משריר חלק באיברים רבים, בדרך כלל בתגובה ל-stretching המופעל על שריר זה. כבר משנות ה-20 היה ידוע שהזרקה של תמצית של יותרת בלוטת התריס גרמה בחיות להגברה בזרימת הדם ולהפחתת לחץ הדם (Charbon וחב' ב-Eur J Pharmacol משנת 1968, וכן Wang וחב' באותו כתב עת משנת 1984 ו-Mok וחב' ב-Endocr Rev משנת 1989). אך כאשר התגלה PTHrP, התברר שפעילות זו של הרפיית כלי-דם אינה תפקידו של PTH, אלא היא נובעת מהשפעה פיזיולוגית מקומית של PTHrP המשפיעה גם על שריר חלק בקיבה, במעי, ברחם, בשלפוחית השתן וכן בדופן העורקית (עפ"י Philbrick וחב' ב-Physiol Rev משנת 1996, וכן Qian וחב' ב-Endocrinology משנת 1999, ו-Martin וחב' ב-J Endocrinol משנת 1997).

בשנת 1991 הראו Roca-Cusache וחב' ב-J Pharmacol Exp Ther, ש-PTHrP הבא לביטוי בשריר חלק פועל באופן מהיר להרחבת כלי הדם במנגנון שאינו תלוי באנדותל, כאשר מכווץ כלי דם כמו angiotensin II, משרה עלייה מהירה ביצירת PTHrP (עפ"י Pirola וחב' ב-J Biol Chem משנת 1993). נראה שדווקא ה-PTHrP של גרעין התא, חיוני במיוחד בוויסות השגשוג של תאי שריר חלק בדופן כלי הדם. ל-PTHrP עלולה להיות גם השפעה שלילית, ונמצא שלאחר פרוצדורה אנגיופלסטית של פתיחת כלי דם עם בלון, יש הגברה ביצירת PTHrP, מה שעלול להגביר שגשוג תאי שריר חלק, מה שיכול לעבות את שכבת ה-neointima (עפ"י Fiaschi-Taesch וחב' ב-Circulation משנת 2004, ו-Sicari וחב' ב-J Endocrinology משנת 2012).

תפקיד PTHrP בבלוטת הלבלב:

בפנקריאס, תאי האיים נמצאו מייצרים PTHrP וכן נושאים את הקולטנים ל-PTH ול-PTHrP, כאשר השפעת PTHrP היא בהגברה משמעותית ברמת סידן בתוך תאי β (עפ"י Vascavada וחב' ב-J Biol Chem משנת 1996) ובשפעול של האנזים phospholipase C (עפ"י Vasvada וחב' ב-Diabetes משנת 2007). מחקרם של Drucker וחב' ב-Mol Endocrinol משנת 2011, הראה שכל ארבעת הסוגים של תאי בלוטת הלבלב, α, β, δ ו-pancreatic polypeptide cells, מייצרים PTHrP. יצירת-יתר של PTHrP כמו גם החדרה של הפפטיד ה-N טרמינאלי 1-36 של חלבון זה לעכברים, מגבירה את יצירת תאי β (עפ"י Gutalu וחב' ב-Diabetes משנת 2010) ומפחית תהליכי אפופטוזיס של תאים אלה, מה שגורם להיפוגליקמיה המושרית על ידי יצירת עודף של אינסולין (Cebrian וחב' ב-Diabetes משנת 2002). ניסויים עדכניים בעכברים, הראו שהזרקות תת-עוריות יומיות של PTHrP 1-36, מגבירות את שגשוגם של תאי β, משפרות את ה-glucose tolerance, ויכולות להילקח בחשבון כטיפול פוטנציאלי בסוכרת (Williams וחב' ב-Diabetologia משנת 2011).

החלבון PTHrP והשן:

שיניים מתפתחות מוקפות על ידי עצם והן חייבות לפרוץ דרך הכיסוי של הקריפטה הדנטאלית כדי להופיע בחלל הפה. בקיעת שיניים (tooth eruption) דורשת קואורדינציה מרחבית של עצמות הלסת, כאשר אוסטאוקלסטים חייבים לספוג את רקמת העצם המכסה את כתר השן על מנת לאפשר לה לבקוע ולהופיע, ואילו אוסטאובלסטים אמורים ליצור עצם בבסיס השן, כדי לאפשר לה להידחף אל מחוץ לקריפטה. PTHrP מיוצר באופן נורמאלי על ידי תאי ה-stellate reticulum שהם מארג של תאים אפיתליאלים במרכז ה-enamel האפיתליאלי (Beck וחב' ב-Cell Tissue Res משנת 1995, וכן Ouyang וחב' ב-J Bone Miner Res משנת 2000 ו-Tenorio ו-Hughes ב-Arch Oral Biol משנת 1996).

בשנת 1998 פרסמו Philbrick וחב' ב-Proc Natl Acad Sci USA שעל ידי שימוש ב-cytokeratin שהוא טרנסגן של K14-PTHrP, ניתן היה להראות שהחלפת PTHrP באפיתליום של ה-enamel, החזירה לתקינות את פעולת בקיעת השיניים. כיוון שאוסטאוקלסטים אינם מכילים קולטנים מסוג PPR, הממצא הזה תומך בתפקיד ההתפתחותי של PTHrP בהשפעה על אוסטאוקלסטים לפלס דרך לבקיעת השן. תפקידו של PTHrP הוא לאותת לתאי הזקיק הדנטאלי לעודד את יצירת האוסטאוקלסטים מעל הקריפטה. בהיעדר PTHrP לא נוצרים אוסטאוקלסטים אלה, ולא מתרחשת בקיעת השיניים הצעירות.
מגבלות הבדיקה:

אין לבצע בדיקה זו כדי לשלול ממאירות או על מנת לבחון חולי סרטן לתרחיש של היפר-קלצמיה של ממאירות. PTHrP יכול להיות מוגבר בנשים הרות או מניקות כמו גם ביילודים. תרחישים לא ממאירים שתוארו בהקשר של רמות מוגברות של PTHrP בפלזמה, כוללים systemic lupus erythematosus, לימפאדנופתיה הקשורה ל-HIV, מצב של lymphedema של החזה, וכן במקרה שלך גידולים שפירים של השחלות, הכליות, ושל המערכת הנוירואנדוקרינית (Burtis ב-Clin Chem משנת 1992).

בגלל המוּרכּבוּת של האיזופורמים של PTHrP, ההבדלים בשיטות המדידה השונות של PTHrP והמחסור בסטנדרט כיול אחיד, קיים קושי בהשוואה של רמות הורמון זה או של האיזופורמים שלו בתרחישים שונים. תערובת של האיזופורמים יכולה לפגוע בלינאריות של תוצאות הבדיקה בדגימות פלזמה של מטופלים, ולמנוע קביעה מדויקת של ריכוזי PTHrP (עפ"י Wu וחב' ב-Mayo Clin Proc משנת 1997).

המשמעות של תוצאות תקינות ובלתי-תקינות של PTHrP:

ריכוזים נמוכים ביותר שלPTHrP עד כדי כאלה שלא ניתן לגלותם הן תוצאות נורמאליות. בנשים מיניקות ניתן לגלות את PTHrP. רמות מוגברות של PTHrP עם רמות מוגברות של סידן בדם, נגרמות בדרך כלל על ידי תהליכים סרטניים. PTHrP יכול להיווצר על ידי סוגי סרטן שונים, כולל סרטן ריאות, שד, ראש וצוואר, מערכת העיכול, שלפוחית השתן והשחלות כמו גם בלויקמיה ובלימפומה. בתלות באוכלוסייה הנבדקת, עד 80% מהנבדקים עם שאתות ממאירות והיפרקלצמיה, יסבלו מ-HHM או humoral hypercalcemia of malignancy. רמה גבוהה של PTHrP היא הסיבה להיפרקלצמיה בערך ב-2/3של חולי הסרטן. בנבדקים אלה בנוסף להיפרקלצמיה ניתן יהיה לגלות גם היפו-פוספטמיה, hypercalciuria, רמות מוגברות של פוספטאזה בסיסית בנסיוב ו-hyperphosphaturia. רמות מוגברות של PTHrP מוצאים גם בנבדקים עם מחלת כליות.

במטופלים עם ממצאים ביוכימיים המרמזים, אם כי לא מוכיחים מצב של היפר-פאראתירואידיזם ראשוני (דהיינו היפרקלצמיה, אך רמות נורמאליות או קרובות לנורמה של פוספאט ושל PTH, כאשר רמת האחרון היא בתחום הנורמה (אם כי מעל 30 פיקוגרם/מ"ל), ניתן לקחת בחשבון אפשרות של HHM, בעיקר אם המטופל קשיש, ובעל היסטוריה של ממאירות, או של גורמי סיכון לממאירות. רמות מוגברות של PTHrP במטופל האחרון, מצביעים על HHM כסיבה להיפרקלצמיה.

== הוראות לביצוע הבדיקה ==

ברוב ערכות הבדיקה יש העדפה לנטילת דם במבחנות EDTA (פקק סגלגל) לאחר צום של 8 שעות. הסרכוז נעשה בצנטריפוגה מקוררת, ויש לפסול דגימות המוליטיות באופן בולט. הפלזמה המופרדת יציבה לצורך הבדיקה עד 7 ימים בטמפרטורת החדר, עד 30 יום בקירור, ועד שנה בהקפאה. יש מעבדות המבצעות את הבדיקה בפלזמה שנלקחה במבחנת הפארין (פקק ירוק), אלא שאז יציבות הדגימה שונה: 7 ימים בטמפרטורת החדר או בקירור, וחודש בהקפאה. רצוי לכלול במבחנת נטילת הדם מעכב פרוטאזות דוגמת aprotinin או leupeptin, ויש המשתמשים במעכב הפרוטאזות PPACK או Phe-Pro-Arg-chlomethylketone.

שיטות המדידה: ניתן למדוד רמת PTHrP או על ידי שילוב של שיטת HPLC ו- Tandem Mass Spectrometry, או בשיטת ICMA או immunochemiluminometric assay, תוך שימוש ב-2 נוגדנים שנוקו על ידי כרומטוגרפיית-זיקה מנסיוב של עז מחוסנת כנגד המקטע 1-86 של PTHrP. אחד מ-2 הנוגדנים מסומן עם acridinium ester כנוגדן גלאי (tracer), כאשר הנוגדן השני מקובע על פני כדורונים זעירים (beads). כאשר הפלזמה מכילה PTHrP נוגדן ה-tracer נקשר אל ה-beads וניתן לגילוי וכימות (עפ"י Wu וחב' ב-Ann Clin Lab Sci משנת 1997).

(להכניס כאן את התרשים מתחתיו המקרא הוא.... מסלול זרימה של בדיקת מעבדה לרמת PTHrP)

פפטיד דמוי הורמון פאראתירואידי - Parathyroid hormone-related protein

2015-06-29T05:53:30Z

בן עמי סלע:

==פפטיד דמוי הורמון פאראתירואיד - Parathyroid hormone-related protein ==

כינויים נוספים: PTHrP; PTH Related Peptide.
תחום: גורם הורמונאלי מרכזי במטבוליזם של סידן בגוף.
טווח ערכים תקין: פחות מ-2 פיקומול' למ"ל, או 14-27 פיקוגרם למ"ל.
יוצר הערך: פרופ' בן-עמי סלע.

== מטרת הבדיקה ==

אבחון מטופלים החשודים לתרחיש של היפר-קלצמיה של ממאירות (HHM או humoral hypercalcemia of malignancy), או אבחון של מטופלים עם היפר-קלצמיה מסיבה לא ידועה). רמת PTHrP יכולה לשמש גם לניטור יעילות הטיפול האנטי-סרטני.

== בסיס פיזיולוגי ==
PTHrP הוא חלבון חבר במשפחת ההורמון PTH. הוא מופרש על ידי תאים סרטניים אך יש לו גם תפקידים בפיזיולוגיה התקינה של גוף האדם. PTHrP בא לביטוי באתרים רבים בגוף, ויש לו פעילות אנדוקרינית, פאראקרינית ואינטרה-קרינית, ובכך הוא משפיע על מגוון של תרחישים פיזיולוגיים ופתולוגיים, בנוסף לתפקידיו בבניית איברים (Wysolmerski ב-J Clin Endocrinol Metabol משנת 2012, ו-McCauley ו-Marin ב-J Bone Miner Res משנת 2012).

(להכניס כאן את התרשים שהמקרא תחתיו מתחיל במילים...תפקידיו הפיזיולוגיים של PTHrP)

(להכניס כאן את התרשים שהמקרא שלו מתחיל במילים ... הפעילויות הפאראקריניות של PTHrP...)

PTHrP הוא פפטיד מונומרי הקיים במספר איזופורמים, שגודלם נע בין 60 חומצות אמינו ועד 173 חומצות אמינו, הנוצרים על ידי תהליך splicing דיפרנציאלי, ומעורבות של האנזים prohormone convertase. החלבון PTHrP מיוצר בריכוזים נמוכים על ידי כל רקמות הגוף. תפקידיו הפיזיולוגיים אינם ברורים באופן מוחלט, וניתן לחלקם לארבע קטגוריות, שלא כולן באות לביטוי על ידי כל אחד מהאיזופורמים ולבטח לא כולם באים לביטוי בכל הרקמות: א. טרנספורט של סידן משני צידי האפיתל בעיקר בכליות וברקמת השד; ב. הרפיה של שריר חלק ברחם, בשלפוחית השתן, במערכת העיכול, ובדופן העורקים; ג. וויסות של שגשוג תאים; ד. התמיינות (דיפרנציאציה) של תאים ואפופטוזיס במגוון רקמות. כיוון ש-PTHrP הוא מרכיב חיוני של הריון תקין והתפתחות עוברית, חסר או פגם של חלבון זה קטלני בעוברי יונקים.

עניין רב ומחקר רחב ממדים מתחילת שנות ה-90, הם תולדה של הממצאים על היות PTHrP מיוצר באופן נורמאלי ברקמות רבות בהן הוא פועל באופן פאראקריני. ישנם רק שלושה מצבים, בהם PTHrP מופיע בצירקולציה ופועל באופן אנדוקריני: א) התסמונת ההיפרקצמית של ממאירות (HHM) בה מיוצר PTHrP על ידי השאתות ונודד דרך הדם לרקמת העצם וגורם לספיגת עצם (Burtis וחב' ב-J Clin Endocrinol Metabol משנת 1992, ו-Grill וחב' באותו כתב עת משנת 1991); ב) תהליך ההנקה (lactation) בו PTHrP נוצר בבלוטות החלב בשד ומגיע לצירקולציה (Grill וחב' ב-Clin Endocrinol משנת 1992); ג) החיים העובריים, בהם PTHrP מווסת את הטרנספורט של סידן מהאם לעובר דרך השליה (Kovacs וחב' ב-Proc Natl Acad Sci USA משנת 1996).

PTHrP זוהה כגורם להיפרקלצמיה של מצבי ממאירות בשנת 1987, על ידי Martin וחב' במלבורן על ידי שבודדו אותו משורת תאים של סרטן ריאה באדם (Proc Natl Acad Sci USA משנת 1987). באותה עת זיהו Rodan וחב' (J Clin Invest משנת 1983) חלבון זה המופרש מתאים אוסטאובלסטים, וכן זיהו Burtis וחב' (J Biol Chem משנת 1987) תאים שמקורם בסרטן שד חלבון שמשקלו המולקולארי 17,000 דלטון בעל פעילות מעודדת את האנזים adenylate cyclase), ואילו Strewler וחב' משנת 1987 ב-J Clin Invest, בודדו משורת תאים של סרטן כליה את החלבון שבדיעבד זוהה כ-PTHrP. לאחר מכן הראו Miao וחב' על ידי פגיעה בעכברים בגן המקודד ל-PTHrP שהדבר קטלני בעכברים אלה על ידי פגיעה במערכת העצמות, על ידי מניעת צמיחת העצם הטרבקולארית (Endocrinology משנת 2004).

ממצא אחרון זה הצביע על החשיבות הפיזיולוגית הניכרת של PTHrP. בשנים שחלפו מאז נמצא ש-PTHrP ו-PTH מקודדים על ידי גנים הקשורים זה לזה המהווים חלק ממשפחת גדולה יותר של ה-PTH gene. הקשר האבולוציוני הזה, מאפשר ל-חלבונים אלה להיקשר לאותו קולטן הידוע כ-type 1 PTH/PTHrP Receptor, מה שמסביר מדוע היפרקלצמיה של הממאירות דומה לזו הופיעה בהיפר-פארא-תירואידיזם. במקור, היו סבורים ש-PTHrP קשור בעיקר בתסמונת פארא-נאופלסטית, אך כיום כבר ברור ש-PTHrP קשור לתרחישים של אוסטאופורוזיס, אוסטאו-ארתריטיס, וסרטן השד, ואף נמצא ש-PTHrPעצמו עשוי לשמש כתרפיה של אוסטאופורוזיס וסוכרת.

כיום קיימת כבר ההכרה בדבר הפיזור הרחב של PTHrP ברקמות נרחבות בגוף, ולפעילויות האנדוקרינית, הפאראקרינית והאינטרה-קרינית, המניעות מספר תרחישים פיזיולוגיים ופתולוגיים, וכן בדבר תפקידו המרכזי ב-organogenesis. במחקר חלוצי קלאסי של מטופל עם קרצינומה של הכליות והיפרקלצמיה משנת 1941 ב-N Eng J Med, העלה Fuller Albright את ההשערה שמספר גידולים סרטניים יכולים לגרום להיפרקלצמיה, על ידי הפרשה של PTH או של "חלבון מאוד דומה ל-PTH". אכן בתרחיש של "היפרקלצמיה של ממאירות" יש ל-PTHrP פעילות דומה לזו של PTH, וכאשר שאת סרטנית מפרישה PTHrP הדבר גורם ישירות להיפרקלצמיה (Broadus וחב' ב-N Eng J Med משנת 1988). כיוון שהיפרקלצמיה הנגרמת על ישי PTHrP היא לעתים הסימן המוקדם של ממאירות, היא נחשבת כתופעה פארא-נאופלסטית.

הסינתזה והמבנה של PTHrP:

PTHrP של אדם מקודד על ידי גן בודד (PTHLH) הנמצא על הזרוע הקצרה של כרומוזום 12 (עפ"י Strewler וחב' ב-J Clin Invest משנת 1987, ו-Suvaוחב' ב-Science משנת 1987). על ידי splicing חלופי, נוצר מגוון של סוגי mRNA, המקודדים ל-3 איזופורמים של PTHrP בעלי 139, 141 ו-173 חומצות אמינו. כבר מהתחלת המחקר הייתה הכרה שהגנים PTHLH ו-PTH קשורים זה לזה, כאשר ה-exon/intron של המקטע ב-2 גנים אלה המקודד לרצפי pre-pro שלהם, והחלק ההתחלתי של 2 הפפטידים הבשלים זהה לחלוטין. יתרה מכך, הקטעים של 2 הגנים המקודדים את הקצה ה-N טרמינאלי של PTH ו-PTHrP המופרשים לצירקולציה, הם בעלי הומולוגיה ניכרת, הבאה לביטוי בהיותם זהים ב-8 מתוך 13 חומצות האמינו (עפ"י Mangin וחב' ב-Proc Natl Acad Sci USA משנת 1988), וכן בהיותם בעלי מבנה שניוני דומה לאורך 21 חומצות האמינו הבאות.

ממצא אחר של Kemp וחב' שהופיע ב-Science בשנת 1987, היה שבדומה למה שידוע לגבי PTH גם במקרה של PTHrP כל פעילותו הביולוגית נכללת ב-34 חומצות האמינו בקצה ה-N טרמינאלי. רצפים הומולוגיים אלה, מאפשרים לשני הפפטידים להיקשר לאותו קולטן ולשפעל אותו, מה שעשוי להסביר מדוע PTHrP גורם להיפרקלצמיה של ממאירות. כל החברים במשפחת הגן PTH, הופיעו במקביל לאבולוציה של בעלי החוליות, כנראה כתוצאה מדופליקציה של גן קדמון בודד. בין כל חברי משפחת הגן PTH, הגן PTHLH הוא בעל המבנה הגנומי המורכב ביותר ואת השוֹנוּת הרבה ביותר בין מיני בעלי חיים שונים, מה שמשקף כנראה את המגוון הגדול של תפקודי PTHrP ברקמות השונות. אכן, המגוון הגדול של פעילויות פיזיולוגיות של PTHrP בא לביטוי בכך שהרכב חומצות האמינו של חלבון זה השתמר באופן בולט באדם, חולדה, עכבר, תרנגולת, ובכלב עד לחומצת אמינו 111. מעניין לציין שאפילו PTHrP של דג fugu הוא בעל הומולוגיה של 53% עם PTHrP של האדם.

(להכניס כאן את התמונה שהמקרא מתחתיה מתחיל במלים ...מולקולת האם של PTHrP מכילה בקצה...)

הפפטידים של PTHrP והקולטנים שלו:

הפפטיד PTHrP 1-36 מופרש ממספר סוגי תאים כמו תאי לב, מוח, שריר השלד, שלפוחית השתן, צינורות המרה, מערכת החיסון, כבד, רחם ואשכים, כמו גם איברים אנדוקריניים הכוללים את בלוטת יותרת המוח ותאי C בבלוטת התריס (Orloff וחב' ב-Endocr Rev משנת 1994 ו-Ureña וחב' ב-Endocrinology משנת 1993), אך הצורות הארוכות יותר של הפפטידים בקצה האמיני של PTHrP, מופרשות גם מקרטינוציטים ומתאי אפיתל של בלוטות השד, במקרים של סרטן העור ובתקופת הנקה (Burtis וחב' ב-N Eng J Med משנת 1990, וכן Sowers וחב' ב-JAMA משנת 1996 ו-VanHouten וחב' ב-J Clin Invest משנת 2003).

ההפרשה של הפפטידים המוגדרים כ-midregion כולל חומצות אמינו 38-94, 39-95 ו-38-101 תוארה גם כן (Soifer וחב' ב-J Biol Chem משנת 1992), אם כי הביולוגיה של פפטידים האחרונים אינה ברורה, פרט לעובדה שה-mid-region של PTHrP מעודד טרנספורט של סידן בשִליָה וקשור למודולציה של ביקרבונאט בכליות. כמו כן, המקטעים ה-C טרמינאלים של PTHrP המורכבים מחומצות אמינו 107-138 ו-109-138 תוארו ותפקידם הוא בעיכוב יצירת אוסטאוקלסטים ובעידוד השגשוג של אוסטאובלסטים (Philbrick וחב' ב-Physiol Rev משנת 1996).

בשנת 1991 התפרסם ב-Science מחקרם של Juppner וחב', בו תואר בידודו של הקולטן של PTHrP, כאשר מחקרים בעכברי knock out עם פגיעה בקולטן זה, הדגימו את החשיבות של PTHrP (עפ"י Lanske וחב' ב-Science משנת 1996) אותה קבוצת חוקרים אף הדגימה במאמר משנת 1998 ב-Endocrinology, שאותו קולטן יכול לשמש את 2 הליגנדים, PTH ו-PTHrP. כמעט 20 שנה חלפו עד לפרסום של Miao וחב' משנת 2005 ב-J Clin Invest בו הודגמה חשיבותו של PTHrP המופרש מאוסטאובלסטים, כגורם אנאבולי פוטנטי בכל הקשור ליצירת עצם.

הפעילות התוך גרעינית של PTHrP ופעילותו כ-intracrine factor:

בנוסף לפעילויות האנדוקריניות והפאראקריניות של PTHrP המופרש מרקמות שונות, יש ראיות מוצקות לכך שצורה מסוימת של PTHrP אינה מופרשת, ועל ידי הכוונתו של הורמון זה לגרעין תאים יש לו שם פעילות גרעינית כגון זו הקשורה למודולציה של אפופטוזיס בתאים אלה. בין היתר, שעתוק של הגן PTHLH יכול להשפיע עת מניעת ההפרשה של PTHrP אל מחוץ לתאים, והכוונתו לגרעין התאים (Fiaschi-Taesch וחב' ב-Endocrinology משנת 2003). תנועת PTHrP לתוך גרעין התא מושפעת מרצף של חומצות אמינו בין עמדות 84 ו-93 המשפיע על התנועה הדו-כיוונית של PTHrP אל תוך הגרעין, והחוצה ממנו (Roth וחב' ב-J Biol Chem משנת 2011). נראה שהזרחון של PTHrP בעמדה Thr85 על ידי cyclin-dependent kinase p34cdc2, משחקת תפקיד בהחדרת PTHrP לגרעין התא.

לא הרבה ידוע על הפעילות התוך-גרעינית של PTHrP. ידוע שהוא נקשר ל-RNA ובמספר תאים הוא ממוקם בגרעינון (nucleolus), מה שמרמז לכך ש-PTHrP קשור לוויסות התנועה של RNA, לדינאמיקה של ריבוזומים ואף לתרגום של חלבונים. בתאים בתרבית נמצא ש-PTHrP גרעיני, משפיע על שגשוג תאים, אך גם על אפופטוזיס, ולעתים הוא פועל לנטרול פעילותו של THrP המופרש מתאים. בתאי סרטן השד, המעי הגס והערמונית, נראה ש-PTHrP מעודד שגשוגם של תאים אלה, מגן עליהם מפני אפופטוזיס, ומעודד את כושר נדידתם, בה בשעה ש-PTHrP המופרש מתאים אלה, מעכב את שגשוג התאים הללו ומעודד בהם אפופטוזיס (Park וחב' ב-Endocr Related Cancer משנת 2012, ו-Shen וחב' ב-Exp Cell Res משנת 2004).

PTHrP גרעיני נמצא גם כמעודד את השגשוג של תאי שריר חלק וסקולאריים in vitro ו-in vivo על ידי השריית הביטוי של c-myc ושל skp2, שבתגובה מפחיתים את רמות מעכב מחזור חלוקת התא, p27. לעומת זאת ל-PTHrP המופרש מהתא יש השפעות מנוגדות.

תפקיד PTHrP במערכת העצם והשלד:

החשיבות הפיזיולוגית של PTHrP במערכת השלד הייתה מוכרת מאז שהתברר שפגיעה ביצירת הורמון זה בעכברים מייד לאחר הלידה גרמה למותם כתוצאה מכשל נשימתי, מה שיוחס לפגם ביצירת קופסת הצלעות שלהם (Karaplis וחב' ב-Genes Dev משנת 1994). תרחיש זה מבליט את ההבדל בין PTHrP לבין PTH שפגיעה בגן שלו הייתה פחות דרמטית בעכברים יילודים (Miao וחב' ב-J Clin Invest משנת 2002). החשיבות של PTHrP בהתפתחות השלד מבחינת הפגמים ביצירתו הנגרמים בחסרים של הורמון זה chondrodysplasia ו-premature epiphyseal closure, הודגמה בעוברי עכברים על ידי Amizuka וחב' ב-J Cell Biol משנת 1994, העיקר לגבי יצירת סחוס אפיפיזיאלי בלתי תקין ושינויים ביצירת עצם אנדוכונדראלית.

נמצא שעכברי PTHrP(+/-) עם חסר חלקי של PTHrP, נורמאליים פנוטיפית בלידה, אך לאחר 3 חודשים הם בעלי מסת עצם נמוכה, עם ירידה בולטת בעובי העצם הטרבקולארית, ועלייה ניכרת במספר האדיפוציטים במח העצם (Amizuka וחב' ב-Dev Biol משנת 1996). חוקרים אלה מצאו שעכברים עם גנוטיפ PTHrP(+/-), לוקים בגיוס של precursors של מח העצם, וכן יש באוסטאובלסטים שלהם רמת אפופטוזיס גבוהה בהשוואה לעכברים תקינים. עכברים פגומים לגבי יצירת PTHrP נמצאו גם בעלי יצירה מופחתת של אוסטאוקלסטים.

במודלים של בעלי-חיים נמצא שביטוי-יתר או ביטוי-חסר של PTHrP, נקבע על ידי האופן בו מגיב הקצה ה-N טרמינאלי של ההורמון עם הקולטן PTRH1 על מנת לסנכרן את קצב ההתמיינות של הכונדרוציט, ולשמור על גידול סדיר של עצמות ארוכות (Kronenberg ב-Ann NY Acad Sci משנת 2006). פלטת הגדילה מורכבת מעמודות של כונדרוציטים מתחלקים ומתמיינים הגדלים בהדרגה לשלב של כונדרוציטים קדם-היפרטרופיים ולאחר מכן לכונדרוציטים היפרטרופיים. PTHrP מופרש בעיקר על ידי בונדרוציטים לא-בשלים בקצות העמודות המתוארות, בתגובה למולקולה אחרת הידועה כ-IHH או Indian hedgehog, המיוצרת על ידי כונדרוציטים היפרטופיים מתמיינים. בתגובה, PTHrP משפעל את הקולטן PTHR1 הממוקם על פני תאים מתחלקים וקדם-היפרטרופיים כדי לשמר את קצב החלוקות שלהם ולהאט את קצב ההתמיינות שלהם לתאים היפרטרופיים. באופן זה, IHH ו-PTHrP פועלים במין לולאת משוב שלילית כדי לווסת את קצב ההתמיינות של כונדרוציטים.

לאחרונה התגלו פרטים רבים על מארג האיתותים דרכם מפעיל PTHrP את השפעתו על התמיינותם של כונדרוציטים. שתי קבוצות מחקר הראו ש-IHH מגביר את ביטויו של PTHrP בפלטת הגדילה על ידי החלשת הפעילות של גורם השיעתוק Gli3 (עפ"י Koziel וחב'ב-Development משנת 2005). הדרך בה פועל PTHrP על כונדרוציטים דרך הקולטן PTHR1, נעשית על ידי השפעול של Gα3, על ידי יצירת cAMP ועל ידי פעילות האנזים protein kinase A, כאשר בתגובה משתתפים בסדרת אירועים הכוללים זרחון של SOX9, עיכוב ביטויו של p57, והשריית הפעילות של Gli3, Bcl-2 ו-cyclin D1. בדיעבד פעילות PTHrP מזרחנת ופוגעת בשני גורמי השעתוק Runx2 ו-Runks3, החיוניים להתמיינות של כונדרוציטים (Marino ב-Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes ).

לאחרונה הודגם ש-PTHrP יכול להשתתף במודולציה של התמיינות כונדרוציטים על ידי וויסות התנועה של histone deacetylase לתוך גרעין התא, מה שגורם לוויסות פעילותם של גורמי השעתוק Zfp521, MEF2, ו-Runks2 (עפ"י Correa וחב' ב-Dev Cell משנת 2010 ו-Seriwatanachai וחב' ב-FASEB Jמשנת 2011). מסלול זה נדרש לפעילות PTHrP. יתרה מכך, הוכר לאחרונה שמוטציות בגנים של PTHrP ושל HDAC4 גורמות לצורה של chondrodysplasia type E הידועה גם כ-brachydactyly type E, המזכירה אי-סדירויות במטופלים עם מוטציות בגן GNAS, מה שמרמז שכל שלושת הגנים נמצאים על אותו מסלול גנטי (Williams וחב' ב-Am J Hum Genet משנת 2010). מחקר עדכני של Hirai וחב' משנת 2011 ב-Proc Natl Acad Sci USA, בו השתמשו בגישה גנטית לפגיעה בגן של PTHrP בכונדרוציטים במהלך התקופה שלאחר הלידה של עכברים, מצא ש-PTHrP מווסת גם את ההתמיינות של כונדרוציטים ומשמר אותם בפלטת הגדילה הבשלה. הדבר מרמז על האפשרות שאובדן האיתות של PTHrP יכול לגרום ל"סגירה" של פלטת הגדילה, בשלב ההתבגרות (Wang וחב' ב-J Bone Miner Res משנת 2011).

PTHrP מיוצר גם באתרים סחוסיים אחרים כמו ב-perichondrium המקיף את רצועות ה-hyaline המשמשות להארכת הצלעות ותורמות לאלסטיות של קירות בית החזה, והידועות כ-costal cartilages, וכן מקיף את הכונדרוציטים הסוּב-ארטיקולאריים. PTHrP מבוטא גם באופן בולט בנקודות הנעיצה של רצועות וגידים לתוך העצם, ותורם לבניית מכלולים אלה בעת תהליך גדילת השלד.

ל-PTHrP יש תפקידים אנאבוליים חשובים בעצם, ומתוך לימוד מעורבותו של חלבון זה בביולוגיה התקינה של רקמות סחוס ועצם, אין הדבר מפתיע ששינויים בתפקוד PTHrP קשורים למפגעי שלד. הדוגמה הבולטת ביותר היא HHM בו PTHrP בצירקולציה המגיב עם הקולטן PTHR1 בשלד גורם לתהליך ספיגת עצם ושחרור סידן להופעת היפרקלצמיה. מוטציות loss-of-function בגן של PTHR1 גורמות ל-Blomstrand's chondrodysplasia הגורמת למות העובר ברחם (Nissenson ב-Endocrinology משנת 1998). בנוסף, מוטציות loss-of-function בגן של PTHLH גורמות לתסמונת הכוללת קומה נמוכה, עצמות מטקרפליות קצרות בידים, גרורות סרטניות, וקשיי לימודים. נראה שהפעילות האנאבּולית של PTHrP בעצם עשויה להיות שימושית בטיפול באוסטאופורוזיס (Horwitz וחב' ב-J Clin Endocrinol Metabol משנת 2010).

השפעול של PPR שהוא הקולטן המשותף של PTH/PTHrP, מגרה 2 חלבוני G הטרודימריים, Gs ו-Gq. אנליזה גנטית מראה שהשפעול של Gs מתווך בפעילות PTHrP לשמור על כונדרוציטים שיתחלקו וישגשגו, ואילו השפעול של Gq נוגד את הפעילות האחרונה. כאשר משופעל Gs, יש פעילות במסלול התוך-תאי בו חל דיכוי סינתזה של p57 שהוא מעכב של cyclin-CDK, וכתוצאה מכך יש שגשוג של כונדרוציטים.

לעומת זאת, ל-PTHrP יש גם פעילות להאטה של תהליכי התמיינות בכונדרוציטים, מה שמתבצע על ידי זרחון של גורם השעתוק SOX9, וכן על ידי דיכוי הסינתזה של mRNA המקודד לגורם השעתוק Runx2. מסלולים אלה וודאי אחרים שעדיין לא התגלו, חוברים על מנת לווסת את קצב ההתמיינות של כונדרוציטים בפלטת הגדילה בתגובה ל-PTHrP.

לקצה ה-N טרמינאלי של PTHrP יש הומולוגיה עם קצה זה ב-PTH, לכן שני חלבונים אלה יכולים להיקשר לאותו קולטן, הידוע כ-type 1 PTH receptorאו PTHR1. אך בניגוד ל-PTH המסוגל להיקשר רק לסוג קולטנים יחיד, PTHrP מסוגל להיקשר למגוון גדול יותר של קולטים. אכן, PTHrP יכול לגרות את רוב הפעילויות שמשרה PTH, כולל הגברת ספיגת עצם, והגברת הספיגה מחדש בקצה הרחיקני (דיסטאלי) של אבוביות הכליה, ועיכוב הטרנספורט של פוספאט באבוביות הקריבניות (פרוקסימאליות). יחד עם זאת, הסבירות של PTHrP לגרות יצירת קלציטריול (1,25dihydroxy vitamin D) נמוכה יותר מזו של PTH. לכן, PTHrP אינו מגביר ספיגת סידן במעי.

תפקיד PTHrP בהתפתחות בלוטות החלב בשד:

מחקרים על PTHrP ועל הקולטן PTHR1 בעכברי knock-out, העלו שאיתות על ידי הורמון זה נחוץ ליצירת ה-mammary glands העובריים (Hens וחב' ב-Breast Cancer Res משנת 2007). עוברי אדם הלוקים ב-Blomstrad's chondrodysplasia חסרים אף הם רקמת שד, מה שמוכיח שאיתות של PTHrP חיוני להתפתחות השד גם באדם (Wysolmerski וחב' ב-J Clin Endocrinol Metabol משנת 2001). בלוטות השד נוצרות בעובר בתהליך של שקיעה פנימה (invagination) של תאים אפידרמליים אל תוך סטרומה שומנית מתפתחת, באופן היוצר מעין צינורית שמתפתחת בהמשך למערכת ה-mammary ducts (עפ"י Robinson ב-Nat Rev Genet משנת 2007).

בעוברים של עכבר ואדם, תאי אפיתל בנבט של רקמת השד מייצרים PTHrP, אשר מגיב עם קולטני PTHR1 המופיעים על פני התאים המזנכימאלים המקיפים. אינטראקציה זו חיונית להתמיינות תקינה של התאים המזנכימאלים, אשר בתגובה מעודדים את הצמיחה של הצינורות (ducts) האפיתליאלים. איבוד האיתות של PTHrP מונע את ה"דו-שיח" החיוני בין תאי האפיתל והתאים המזנכימאלים, מה שעוצר את התפתחות רקמת השד כבר בשלב הנבט. PTHrPגורם למודולציה של איתותי Wnt ו-BMP, כמו גם לביטוי במזנכימה של מספר גורמי שעתוק, כולל הקולטן לאנדרוגנים, Max2 ו-Lef1, כאשר כל אלה תורמים לצמיחה של ציורות עובריים ברקמת השד (Hens וחב' ב-Dev Dyn משנת 2009).

לאחר הלידה, ממשיך PTHrP להיות מבוטא ברמה נמוכה בתאים מיו-אפיתליאלים, כאשר הקולטן PTHR1 מבוטא בתוך הסטרומה מסביב לצינוריות השד. בתקופה הבוגרת, PTHrP מבוטא באופן ניכר על ידי תאי אפיתל בשד בתקופת ההנקה, וכמויות ניכרות שלו מופרשות לחלב (Budayr וחב' ב-Proc Natl Acad Sci USA משנת 1989), אך תפקידו בחלב אינו ברור. יחד עם זאת, PTHrP מופרש גם מרקמת השד לצירקולציה, והוא משתתף בוויסות הסיסטמי של סידן והמטבוליזם של העצם בעת ההנקה. רקמת העצם של האם משמשת כמקור סידן ליצירת חלב, וידוע שבנשים מניקות יש איבוד מהיר של רקמת עצם.

רמות מוגברות של PTHrP בצירקולציה, תואמות איבוד רקמת עצם באדם, כאשר CaSR או calcium-sensing receptor, שהוא קולטן הקשור ל-G-protein type C, ה"חש" בריכוזים חוץ-תאיים של יון הסידן, ומדכא את הפרשת PTHrP מתאי השד (VanHouten וחב' ב-J Clin Invest משנת 2004). תהליך זה מבטא באופן קלאסי לולאת משוב שלילי אנדוקרינית, בה PTHrP מגייס סידן מעצם השלד, כאשר בתגובה מעוכבת הפרשת PTHrP מרקמת השד. מהבנת תפקידו של PTHrP בהגברת ספיגת העצם בעת הנקה, אין זה מפתיע ש-PTHrP תורם גם להמסת רקמת עצם (osteolysis) בתהליך יצירת גרורות לעצם. אי לכך, תאי סרטן שד גרורתיים לעצם מייצרים יותר PTHrP מאשר תאי הגידול הראשוני (Akhtari וחב' ב-Cancer Biol The משנת 2008).

נמצא ש-TGF-β המופרש באזורי ספיגת עצם, מגביר את יצירת PTHrP על ידי מסלול איתותים אליו קשור גורם השעתוק Gli2 (עפ"י Johnson וחב' ב-Cancer Res משנת 2011). בתגובה, מגביר PTHrP את קישורו של גורם השעתוק NF-κB לקולטנו, ומפחית את היצור של osteoprotegerin ובכך מגדיל את כמות התאים האוסטאוקלסטים ואת פעילותם האוסטאוליטית. בנוסף, בניגוד למתרחש בתאי שד תקינים, איתות של CaSR בתאי סרטן שד מגרה בהם את יצירת PTHrP. במחקרם של Henderson וחב' ב-Cancer Res משנת 2006, נחקרו 526 מקרים של סרטן שד בהם נמצא שביטוי של PTHrP היה מנבא בלתי-תלוי למהלך קליני יותר שפיר. גם Li וחב' במחקרם בעכברים שהופיע ב- J Clin Invest משנת 2011, הראו שפגיעה בגן ל-PTHLH האריכה באופן דרמטי את הלטנטיות של סרטן השד והאטה את התפתחות השאת.

תפקיד PTHrP בטרנספורט של סידן בשלייה:

סידן מועבר דרך השלייה מהאם לעובר (Kovacs ב-J Clin Endocrinol Metabol משנת 2001), כאשר השלייה מייצרת PTHrP שמסייע לשמור על רמת סידן תקינה בעובר. הראשונים שהדגימו את פעילות PTHrP במעבר סידן דרך דופן השלייה היו Rodda וחב' ב-J Endocrinol משנת 1998. בשנת 1990 פרסמו Care וחב' ב-Exp Physiol, ולאחר מכן Wu וחב' ב-J Biol Chem משנת 1996, שדווקא הפפטידים "הפנימיים" ב-PTHrP, דהיינו 67-86 ו-38-94 הם הפפטידים הפעילים ביותר בתחום זה, כאשר לחומצות האמינו בקצה ה-N טרמינאלי של PTHrP אין פעילות דומה. נתון זה רומזים לכך שיש בשלייה קולטנים ספציפיים ל-mid-region של PTHrP. ניסויים בעכברים של Simmonds וחב', בהם נעשתה מניפולציה גנטית אישרו שאמנם ל-PTHrP יש תפקיד בוויסות של הטרנספורט של סידן בשלייה, שחיוני לתהליך המינרליזציה של השלד בעובר (Crit Rev Eukaryot Gene Expr משנת 2012).

תפקיד PTHrP בהרפיה של שריר חלק:

דוגמה לפעילות הפאראקרינית של PTHrP ניתן למצוא בהשפעתו על תאי שריר חלק בדופן כלי-דם. PTHrP מופרש משריר חלק באיברים רבים, בדרך כלל בתגובה ל-stretching המופעל על שריר זה. כבר משנות ה-20 היה ידוע שהזרקה של תמצית של יותרת בלוטת התריס גרמה בחיות להגברה בזרימת הדם ולהפחתת לחץ הדם (Charbon וחב' ב-Eur J Pharmacol משנת 1968, וכן Wang וחב' באותו כתב עת משנת 1984 ו-Mok וחב' ב-Endocr Rev משנת 1989). אך כאשר התגלה PTHrP, התברר שפעילות זו של הרפיית כלי-דם אינה תפקידו של PTH, אלא היא נובעת מהשפעה פיזיולוגית מקומית של PTHrP המשפיעה גם על שריר חלק בקיבה, במעי, ברחם, בשלפוחית השתן וכן בדופן העורקית (עפ"י Philbrick וחב' ב-Physiol Rev משנת 1996, וכן Qian וחב' ב-Endocrinology משנת 1999, ו-Martin וחב' ב-J Endocrinol משנת 1997).

בשנת 1991 הראו Roca-Cusache וחב' ב-J Pharmacol Exp Ther, ש-PTHrP הבא לביטוי בשריר חלק פועל באופן מהיר להרחבת כלי הדם במנגנון שאינו תלוי באנדותל, כאשר מכווץ כלי דם כמו angiotensin II, משרה עלייה מהירה ביצירת PTHrP (עפ"י Pirola וחב' ב-J Biol Chem משנת 1993). נראה שדווקא ה-PTHrP של גרעין התא, חיוני במיוחד בוויסות השגשוג של תאי שריר חלק בדופן כלי הדם. ל-PTHrP עלולה להיות גם השפעה שלילית, ונמצא שלאחר פרוצדורה אנגיופלסטית של פתיחת כלי דם עם בלון, יש הגברה ביצירת PTHrP, מה שעלול להגביר שגשוג תאי שריר חלק, מה שיכול לעבות את שכבת ה-neointima (עפ"י Fiaschi-Taesch וחב' ב-Circulation משנת 2004, ו-Sicari וחב' ב-J Endocrinology משנת 2012).

תפקיד PTHrP בבלוטת הלבלב:

בפנקריאס, תאי האיים נמצאו מייצרים PTHrP וכן נושאים את הקולטנים ל-PTH ול-PTHrP, כאשר השפעת PTHrP היא בהגברה משמעותית ברמת סידן בתוך תאי β (עפ"י Vascavada וחב' ב-J Biol Chem משנת 1996) ובשפעול של האנזים phospholipase C (עפ"י Vasvada וחב' ב-Diabetes משנת 2007). מחקרם של Drucker וחב' ב-Mol Endocrinol משנת 2011, הראה שכל ארבעת הסוגים של תאי בלוטת הלבלב, α, β, δ ו-pancreatic polypeptide cells, מייצרים PTHrP. יצירת-יתר של PTHrP כמו גם החדרה של הפפטיד ה-N טרמינאלי 1-36 של חלבון זה לעכברים, מגבירה את יצירת תאי β (עפ"י Gutalu וחב' ב-Diabetes משנת 2010) ומפחית תהליכי אפופטוזיס של תאים אלה, מה שגורם להיפוגליקמיה המושרית על ידי יצירת עודף של אינסולין (Cebrian וחב' ב-Diabetes משנת 2002). ניסויים עדכניים בעכברים, הראו שהזרקות תת-עוריות יומיות של PTHrP 1-36, מגבירות את שגשוגם של תאי β, משפרות את ה-glucose tolerance, ויכולות להילקח בחשבון כטיפול פוטנציאלי בסוכרת (Williams וחב' ב-Diabetologia משנת 2011).

החלבון PTHrP והשן:

שיניים מתפתחות מוקפות על ידי עצם והן חייבות לפרוץ דרך הכיסוי של הקריפטה הדנטאלית כדי להופיע בחלל הפה. בקיעת שיניים (tooth eruption) דורשת קואורדינציה מרחבית של עצמות הלסת, כאשר אוסטאוקלסטים חייבים לספוג את רקמת העצם המכסה את כתר השן על מנת לאפשר לה לבקוע ולהופיע, ואילו אוסטאובלסטים אמורים ליצור עצם בבסיס השן, כדי לאפשר לה להידחף אל מחוץ לקריפטה. PTHrP מיוצר באופן נורמאלי על ידי תאי ה-stellate reticulum שהם מארג של תאים אפיתליאלים במרכז ה-enamel האפיתליאלי (Beck וחב' ב-Cell Tissue Res משנת 1995, וכן Ouyang וחב' ב-J Bone Miner Res משנת 2000 ו-Tenorio ו-Hughes ב-Arch Oral Biol משנת 1996).

בשנת 1998 פרסמו Philbrick וחב' ב-Proc Natl Acad Sci USA שעל ידי שימוש ב-cytokeratin שהוא טרנסגן של K14-PTHrP, ניתן היה להראות שהחלפת PTHrP באפיתליום של ה-enamel, החזירה לתקינות את פעולת בקיעת השיניים. כיוון שאוסטאוקלסטים אינם מכילים קולטנים מסוג PPR, הממצא הזה תומך בתפקיד ההתפתחותי של PTHrP בהשפעה על אוסטאוקלסטים לפלס דרך לבקיעת השן. תפקידו של PTHrP הוא לאותת לתאי הזקיק הדנטאלי לעודד את יצירת האוסטאוקלסטים מעל הקריפטה. בהיעדר PTHrP לא נוצרים אוסטאוקלסטים אלה, ולא מתרחשת בקיעת השיניים הצעירות.
מגבלות הבדיקה:

אין לבצע בדיקה זו כדי לשלול ממאירות או על מנת לבחון חולי סרטן לתרחיש של היפר-קלצמיה של ממאירות. PTHrP יכול להיות מוגבר בנשים הרות או מניקות כמו גם ביילודים. תרחישים לא ממאירים שתוארו בהקשר של רמות מוגברות של PTHrP בפלזמה, כוללים systemic lupus erythematosus, לימפאדנופתיה הקשורה ל-HIV, מצב של lymphedema של החזה, וכן במקרה שלך גידולים שפירים של השחלות, הכליות, ושל המערכת הנוירואנדוקרינית (Burtis ב-Clin Chem משנת 1992).

בגלל המוּרכּבוּת של האיזופורמים של PTHrP, ההבדלים בשיטות המדידה השונות של PTHrP והמחסור בסטנדרט כיול אחיד, קיים קושי בהשוואה של רמות הורמון זה או של האיזופורמים שלו בתרחישים שונים. תערובת של האיזופורמים יכולה לפגוע בלינאריות של תוצאות הבדיקה בדגימות פלזמה של מטופלים, ולמנוע קביעה מדויקת של ריכוזי PTHrP (עפ"י Wu וחב' ב-Mayo Clin Proc משנת 1997).

המשמעות של תוצאות תקינות ובלתי-תקינות של PTHrP:

ריכוזים נמוכים ביותר שלPTHrP עד כדי כאלה שלא ניתן לגלותם הן תוצאות נורמאליות. בנשים מיניקות ניתן לגלות את PTHrP. רמות מוגברות של PTHrP עם רמות מוגברות של סידן בדם, נגרמות בדרך כלל על ידי תהליכים סרטניים. PTHrP יכול להיווצר על ידי סוגי סרטן שונים, כולל סרטן ריאות, שד, ראש וצוואר, מערכת העיכול, שלפוחית השתן והשחלות כמו גם בלויקמיה ובלימפומה. בתלות באוכלוסייה הנבדקת, עד 80% מהנבדקים עם שאתות ממאירות והיפרקלצמיה, יסבלו מ-HHM או humoral hypercalcemia of malignancy. רמה גבוהה של PTHrP היא הסיבה להיפרקלצמיה בערך ב-2/3של חולי הסרטן. בנבדקים אלה בנוסף להיפרקלצמיה ניתן יהיה לגלות גם היפו-פוספטמיה, hypercalciuria, רמות מוגברות של פוספטאזה בסיסית בנסיוב ו-hyperphosphaturia. רמות מוגברות של PTHrP מוצאים גם בנבדקים עם מחלת כליות.

במטופלים עם ממצאים ביוכימיים המרמזים, אם כי לא מוכיחים מצב של היפר-פאראתירואידיזם ראשוני (דהיינו היפרקלצמיה, אך רמות נורמאליות או קרובות לנורמה של פוספאט ושל PTH, כאשר רמת האחרון היא בתחום הנורמה (אם כי מעל 30 פיקוגרם/מ"ל), ניתן לקחת בחשבון אפשרות של HHM, בעיקר אם המטופל קשיש, ובעל היסטוריה של ממאירות, או של גורמי סיכון לממאירות. רמות מוגברות של PTHrP במטופל האחרון, מצביעים על HHM כסיבה להיפרקלצמיה.

== הוראות לביצוע הבדיקה ==

ברוב ערכות הבדיקה יש העדפה לנטילת דם במבחנות EDTA (פקק סגלגל) לאחר צום של 8 שעות. הסרכוז נעשה בצנטריפוגה מקוררת, ויש לפסול דגימות המוליטיות באופן בולט. הפלזמה המופרדת יציבה לצורך הבדיקה עד 7 ימים בטמפרטורת החדר, עד 30 יום בקירור, ועד שנה בהקפאה. יש מעבדות המבצעות את הבדיקה בפלזמה שנלקחה במבחנת הפארין (פקק ירוק), אלא שאז יציבות הדגימה שונה: 7 ימים בטמפרטורת החדר או בקירור, וחודש בהקפאה. רצוי לכלול במבחנת נטילת הדם מעכב פרוטאזות דוגמת aprotinin או leupeptin, ויש המשתמשים במעכב הפרוטאזות PPACK או Phe-Pro-Arg-chlomethylketone.

שיטות המדידה: ניתן למדוד רמת PTHrP או על ידי שילוב של שיטת HPLC ו- Tandem Mass Spectrometry, או בשיטת ICMA או immunochemiluminometric assay, תוך שימוש ב-2 נוגדנים שנוקו על ידי כרומטוגרפיית-זיקה מנסיוב של עז מחוסנת כנגד המקטע 1-86 של PTHrP. אחד מ-2 הנוגדנים מסומן עם acridinium ester כנוגדן גלאי (tracer), כאשר הנוגדן השני מקובע על פני כדורונים זעירים (beads). כאשר הפלזמה מכילה PTHrP נוגדן ה-tracer נקשר אל ה-beads וניתן לגילוי וכימות (עפ"י Wu וחב' ב-Ann Clin Lab Sci משנת 1997).

(להכניס כאן את התרשים מתחתיו המקרא הוא.... מסלול זרימה של בדיקת מעבדה לרמת PTHrP)

פפטיד דמוי הורמון פאראתירואידי - Parathyroid hormone-related protein

2015-06-28T10:06:44Z

בן עמי סלע:

== Parathyroid hormone-related protein ==

כינויים נוספים: PTHrP; PTH Related Peptide.
תחום: גורם הורמונאלי מרכזי במטבוליזם של סידן בגוף.
טווח ערכים תקין: פחות מ-2 פיקומול' למ"ל, או 14-27 פיקוגרם למ"ל.
יוצר הערך: פרופ' בן-עמי סלע.

== מטרת הבדיקה ==

אבחון מטופלים החשודים לתרחיש של היפר-קלצמיה של ממאירות (HHM או humoral hypercalcemia of malignancy), או אבחון של מטופלים עם היפר-קלצמיה מסיבה לא ידועה). רמת PTHrP יכולה לשמש גם לניטור יעילות הטיפול האנטי-סרטני.

== בסיס פיזיולוגי ==
PTHrP הוא חלבון חבר במשפחת ההורמון PTH. הוא מופרש על ידי תאים סרטניים אך יש לו גם תפקידים בפיזיולוגיה התקינה של גוף האדם. PTHrP בא לביטוי באתרים רבים בגוף, ויש לו פעילות אנדוקרינית, פאראקרינית ואינטרה-קרינית, ובכך הוא משפיע על מגוון של תרחישים פיזיולוגיים ופתולוגיים, בנוסף לתפקידיו בבניית איברים (Wysolmerski ב-J Clin Endocrinol Metabol משנת 2012, ו-McCauley ו-Marin ב-J Bone Miner Res משנת 2012).

(להכניס כאן את התרשים שהמקרא תחתיו מתחיל במילים...תפקידיו הפיזיולוגיים של PTHrP)

(להכניס כאן את התרשים שהמקרא שלו מתחיל במילים ... הפעילויות הפאראקריניות של PTHrP...)

PTHrP הוא פפטיד מונומרי הקיים במספר איזופורמים, שגודלם נע בין 60 חומצות אמינו ועד 173 חומצות אמינו, הנוצרים על ידי תהליך splicing דיפרנציאלי, ומעורבות של האנזים prohormone convertase. החלבון PTHrP מיוצר בריכוזים נמוכים על ידי כל רקמות הגוף. תפקידיו הפיזיולוגיים אינם ברורים באופן מוחלט, וניתן לחלקם לארבע קטגוריות, שלא כולן באות לביטוי על ידי כל אחד מהאיזופורמים ולבטח לא כולם באים לביטוי בכל הרקמות: א. טרנספורט של סידן משני צידי האפיתל בעיקר בכליות וברקמת השד; ב. הרפיה של שריר חלק ברחם, בשלפוחית השתן, במערכת העיכול, ובדופן העורקים; ג. וויסות של שגשוג תאים; ד. התמיינות (דיפרנציאציה) של תאים ואפופטוזיס במגוון רקמות. כיוון ש-PTHrP הוא מרכיב חיוני של הריון תקין והתפתחות עוברית, חסר או פגם של חלבון זה קטלני בעוברי יונקים.

עניין רב ומחקר רחב ממדים מתחילת שנות ה-90, הם תולדה של הממצאים על היות PTHrP מיוצר באופן נורמאלי ברקמות רבות בהן הוא פועל באופן פאראקריני. ישנם רק שלושה מצבים, בהם PTHrP מופיע בצירקולציה ופועל באופן אנדוקריני: א) התסמונת ההיפרקצמית של ממאירות (HHM) בה מיוצר PTHrP על ידי השאתות ונודד דרך הדם לרקמת העצם וגורם לספיגת עצם (Burtis וחב' ב-J Clin Endocrinol Metabol משנת 1992, ו-Grill וחב' באותו כתב עת משנת 1991); ב) תהליך ההנקה (lactation) בו PTHrP נוצר בבלוטות החלב בשד ומגיע לצירקולציה (Grill וחב' ב-Clin Endocrinol משנת 1992); ג) החיים העובריים, בהם PTHrP מווסת את הטרנספורט של סידן מהאם לעובר דרך השליה (Kovacs וחב' ב-Proc Natl Acad Sci USA משנת 1996).

PTHrP זוהה כגורם להיפרקלצמיה של מצבי ממאירות בשנת 1987, על ידי Martin וחב' במלבורן על ידי שבודדו אותו משורת תאים של סרטן ריאה באדם (Proc Natl Acad Sci USA משנת 1987). באותה עת זיהו Rodan וחב' (J Clin Invest משנת 1983) חלבון זה המופרש מתאים אוסטאובלסטים, וכן זיהו Burtis וחב' (J Biol Chem משנת 1987) תאים שמקורם בסרטן שד חלבון שמשקלו המולקולארי 17,000 דלטון בעל פעילות מעודדת את האנזים adenylate cyclase), ואילו Strewler וחב' משנת 1987 ב-J Clin Invest, בודדו משורת תאים של סרטן כליה את החלבון שבדיעבד זוהה כ-PTHrP. לאחר מכן הראו Miao וחב' על ידי פגיעה בעכברים בגן המקודד ל-PTHrP שהדבר קטלני בעכברים אלה על ידי פגיעה במערכת העצמות, על ידי מניעת צמיחת העצם הטרבקולארית (Endocrinology משנת 2004).

ממצא אחרון זה הצביע על החשיבות הפיזיולוגית הניכרת של PTHrP. בשנים שחלפו מאז נמצא ש-PTHrP ו-PTH מקודדים על ידי גנים הקשורים זה לזה המהווים חלק ממשפחת גדולה יותר של ה-PTH gene. הקשר האבולוציוני הזה, מאפשר ל-חלבונים אלה להיקשר לאותו קולטן הידוע כ-type 1 PTH/PTHrP Receptor, מה שמסביר מדוע היפרקלצמיה של הממאירות דומה לזו הופיעה בהיפר-פארא-תירואידיזם. במקור, היו סבורים ש-PTHrP קשור בעיקר בתסמונת פארא-נאופלסטית, אך כיום כבר ברור ש-PTHrP קשור לתרחישים של אוסטאופורוזיס, אוסטאו-ארתריטיס, וסרטן השד, ואף נמצא ש-PTHrPעצמו עשוי לשמש כתרפיה של אוסטאופורוזיס וסוכרת.

כיום קיימת כבר ההכרה בדבר הפיזור הרחב של PTHrP ברקמות נרחבות בגוף, ולפעילויות האנדוקרינית, הפאראקרינית והאינטרה-קרינית, המניעות מספר תרחישים פיזיולוגיים ופתולוגיים, וכן בדבר תפקידו המרכזי ב-organogenesis. במחקר חלוצי קלאסי של מטופל עם קרצינומה של הכליות והיפרקלצמיה משנת 1941 ב-N Eng J Med, העלה Fuller Albright את ההשערה שמספר גידולים סרטניים יכולים לגרום להיפרקלצמיה, על ידי הפרשה של PTH או של "חלבון מאוד דומה ל-PTH". אכן בתרחיש של "היפרקלצמיה של ממאירות" יש ל-PTHrP פעילות דומה לזו של PTH, וכאשר שאת סרטנית מפרישה PTHrP הדבר גורם ישירות להיפרקלצמיה (Broadus וחב' ב-N Eng J Med משנת 1988). כיוון שהיפרקלצמיה הנגרמת על ישי PTHrP היא לעתים הסימן המוקדם של ממאירות, היא נחשבת כתופעה פארא-נאופלסטית.

הסינתזה והמבנה של PTHrP:

PTHrP של אדם מקודד על ידי גן בודד (PTHLH) הנמצא על הזרוע הקצרה של כרומוזום 12 (עפ"י Strewler וחב' ב-J Clin Invest משנת 1987, ו-Suvaוחב' ב-Science משנת 1987). על ידי splicing חלופי, נוצר מגוון של סוגי mRNA, המקודדים ל-3 איזופורמים של PTHrP בעלי 139, 141 ו-173 חומצות אמינו. כבר מהתחלת המחקר הייתה הכרה שהגנים PTHLH ו-PTH קשורים זה לזה, כאשר ה-exon/intron של המקטע ב-2 גנים אלה המקודד לרצפי pre-pro שלהם, והחלק ההתחלתי של 2 הפפטידים הבשלים זהה לחלוטין. יתרה מכך, הקטעים של 2 הגנים המקודדים את הקצה ה-N טרמינאלי של PTH ו-PTHrP המופרשים לצירקולציה, הם בעלי הומולוגיה ניכרת, הבאה לביטוי בהיותם זהים ב-8 מתוך 13 חומצות האמינו (עפ"י Mangin וחב' ב-Proc Natl Acad Sci USA משנת 1988), וכן בהיותם בעלי מבנה שניוני דומה לאורך 21 חומצות האמינו הבאות.

ממצא אחר של Kemp וחב' שהופיע ב-Science בשנת 1987, היה שבדומה למה שידוע לגבי PTH גם במקרה של PTHrP כל פעילותו הביולוגית נכללת ב-34 חומצות האמינו בקצה ה-N טרמינאלי. רצפים הומולוגיים אלה, מאפשרים לשני הפפטידים להיקשר לאותו קולטן ולשפעל אותו, מה שעשוי להסביר מדוע PTHrP גורם להיפרקלצמיה של ממאירות. כל החברים במשפחת הגן PTH, הופיעו במקביל לאבולוציה של בעלי החוליות, כנראה כתוצאה מדופליקציה של גן קדמון בודד. בין כל חברי משפחת הגן PTH, הגן PTHLH הוא בעל המבנה הגנומי המורכב ביותר ואת השוֹנוּת הרבה ביותר בין מיני בעלי חיים שונים, מה שמשקף כנראה את המגוון הגדול של תפקודי PTHrP ברקמות השונות. אכן, המגוון הגדול של פעילויות פיזיולוגיות של PTHrP בא לביטוי בכך שהרכב חומצות האמינו של חלבון זה השתמר באופן בולט באדם, חולדה, עכבר, תרנגולת, ובכלב עד לחומצת אמינו 111. מעניין לציין שאפילו PTHrP של דג fugu הוא בעל הומולוגיה של 53% עם PTHrP של האדם.

(להכניס כאן את התמונה שהמקרא מתחתיה מתחיל במלים ...מולקולת האם של PTHrP מכילה בקצה...)

הפפטידים של PTHrP והקולטנים שלו:

הפפטיד PTHrP 1-36 מופרש ממספר סוגי תאים כמו תאי לב, מוח, שריר השלד, שלפוחית השתן, צינורות המרה, מערכת החיסון, כבד, רחם ואשכים, כמו גם איברים אנדוקריניים הכוללים את בלוטת יותרת המוח ותאי C בבלוטת התריס (Orloff וחב' ב-Endocr Rev משנת 1994 ו-Ureña וחב' ב-Endocrinology משנת 1993), אך הצורות הארוכות יותר של הפפטידים בקצה האמיני של PTHrP, מופרשות גם מקרטינוציטים ומתאי אפיתל של בלוטות השד, במקרים של סרטן העור ובתקופת הנקה (Burtis וחב' ב-N Eng J Med משנת 1990, וכן Sowers וחב' ב-JAMA משנת 1996 ו-VanHouten וחב' ב-J Clin Invest משנת 2003).

ההפרשה של הפפטידים המוגדרים כ-midregion כולל חומצות אמינו 38-94, 39-95 ו-38-101 תוארה גם כן (Soifer וחב' ב-J Biol Chem משנת 1992), אם כי הביולוגיה של פפטידים האחרונים אינה ברורה, פרט לעובדה שה-mid-region של PTHrP מעודד טרנספורט של סידן בשִליָה וקשור למודולציה של ביקרבונאט בכליות. כמו כן, המקטעים ה-C טרמינאלים של PTHrP המורכבים מחומצות אמינו 107-138 ו-109-138 תוארו ותפקידם הוא בעיכוב יצירת אוסטאוקלסטים ובעידוד השגשוג של אוסטאובלסטים (Philbrick וחב' ב-Physiol Rev משנת 1996).

בשנת 1991 התפרסם ב-Science מחקרם של Juppner וחב', בו תואר בידודו של הקולטן של PTHrP, כאשר מחקרים בעכברי knock out עם פגיעה בקולטן זה, הדגימו את החשיבות של PTHrP (עפ"י Lanske וחב' ב-Science משנת 1996) אותה קבוצת חוקרים אף הדגימה במאמר משנת 1998 ב-Endocrinology, שאותו קולטן יכול לשמש את 2 הליגנדים, PTH ו-PTHrP. כמעט 20 שנה חלפו עד לפרסום של Miao וחב' משנת 2005 ב-J Clin Invest בו הודגמה חשיבותו של PTHrP המופרש מאוסטאובלסטים, כגורם אנאבולי פוטנטי בכל הקשור ליצירת עצם.

הפעילות התוך גרעינית של PTHrP ופעילותו כ-intracrine factor:

בנוסף לפעילויות האנדוקריניות והפאראקריניות של PTHrP המופרש מרקמות שונות, יש ראיות מוצקות לכך שצורה מסוימת של PTHrP אינה מופרשת, ועל ידי הכוונתו של הורמון זה לגרעין תאים יש לו שם פעילות גרעינית כגון זו הקשורה למודולציה של אפופטוזיס בתאים אלה. בין היתר, שעתוק של הגן PTHLH יכול להשפיע עת מניעת ההפרשה של PTHrP אל מחוץ לתאים, והכוונתו לגרעין התאים (Fiaschi-Taesch וחב' ב-Endocrinology משנת 2003). תנועת PTHrP לתוך גרעין התא מושפעת מרצף של חומצות אמינו בין עמדות 84 ו-93 המשפיע על התנועה הדו-כיוונית של PTHrP אל תוך הגרעין, והחוצה ממנו (Roth וחב' ב-J Biol Chem משנת 2011). נראה שהזרחון של PTHrP בעמדה Thr85 על ידי cyclin-dependent kinase p34cdc2, משחקת תפקיד בהחדרת PTHrP לגרעין התא.

לא הרבה ידוע על הפעילות התוך-גרעינית של PTHrP. ידוע שהוא נקשר ל-RNA ובמספר תאים הוא ממוקם בגרעינון (nucleolus), מה שמרמז לכך ש-PTHrP קשור לוויסות התנועה של RNA, לדינאמיקה של ריבוזומים ואף לתרגום של חלבונים. בתאים בתרבית נמצא ש-PTHrP גרעיני, משפיע על שגשוג תאים, אך גם על אפופטוזיס, ולעתים הוא פועל לנטרול פעילותו של THrP המופרש מתאים. בתאי סרטן השד, המעי הגס והערמונית, נראה ש-PTHrP מעודד שגשוגם של תאים אלה, מגן עליהם מפני אפופטוזיס, ומעודד את כושר נדידתם, בה בשעה ש-PTHrP המופרש מתאים אלה, מעכב את שגשוג התאים הללו ומעודד בהם אפופטוזיס (Park וחב' ב-Endocr Related Cancer משנת 2012, ו-Shen וחב' ב-Exp Cell Res משנת 2004).

PTHrP גרעיני נמצא גם כמעודד את השגשוג של תאי שריר חלק וסקולאריים in vitro ו-in vivo על ידי השריית הביטוי של c-myc ושל skp2, שבתגובה מפחיתים את רמות מעכב מחזור חלוקת התא, p27. לעומת זאת ל-PTHrP המופרש מהתא יש השפעות מנוגדות.

תפקיד PTHrP במערכת העצם והשלד:

החשיבות הפיזיולוגית של PTHrP במערכת השלד הייתה מוכרת מאז שהתברר שפגיעה ביצירת הורמון זה בעכברים מייד לאחר הלידה גרמה למותם כתוצאה מכשל נשימתי, מה שיוחס לפגם ביצירת קופסת הצלעות שלהם (Karaplis וחב' ב-Genes Dev משנת 1994). תרחיש זה מבליט את ההבדל בין PTHrP לבין PTH שפגיעה בגן שלו הייתה פחות דרמטית בעכברים יילודים (Miao וחב' ב-J Clin Invest משנת 2002). החשיבות של PTHrP בהתפתחות השלד מבחינת הפגמים ביצירתו הנגרמים בחסרים של הורמון זה chondrodysplasia ו-premature epiphyseal closure, הודגמה בעוברי עכברים על ידי Amizuka וחב' ב-J Cell Biol משנת 1994, העיקר לגבי יצירת סחוס אפיפיזיאלי בלתי תקין ושינויים ביצירת עצם אנדוכונדראלית.

נמצא שעכברי PTHrP(+/-) עם חסר חלקי של PTHrP, נורמאליים פנוטיפית בלידה, אך לאחר 3 חודשים הם בעלי מסת עצם נמוכה, עם ירידה בולטת בעובי העצם הטרבקולארית, ועלייה ניכרת במספר האדיפוציטים במח העצם (Amizuka וחב' ב-Dev Biol משנת 1996). חוקרים אלה מצאו שעכברים עם גנוטיפ PTHrP(+/-), לוקים בגיוס של precursors של מח העצם, וכן יש באוסטאובלסטים שלהם רמת אפופטוזיס גבוהה בהשוואה לעכברים תקינים. עכברים פגומים לגבי יצירת PTHrP נמצאו גם בעלי יצירה מופחתת של אוסטאוקלסטים.

במודלים של בעלי-חיים נמצא שביטוי-יתר או ביטוי-חסר של PTHrP, נקבע על ידי האופן בו מגיב הקצה ה-N טרמינאלי של ההורמון עם הקולטן PTRH1 על מנת לסנכרן את קצב ההתמיינות של הכונדרוציט, ולשמור על גידול סדיר של עצמות ארוכות (Kronenberg ב-Ann NY Acad Sci משנת 2006). פלטת הגדילה מורכבת מעמודות של כונדרוציטים מתחלקים ומתמיינים הגדלים בהדרגה לשלב של כונדרוציטים קדם-היפרטרופיים ולאחר מכן לכונדרוציטים היפרטרופיים. PTHrP מופרש בעיקר על ידי בונדרוציטים לא-בשלים בקצות העמודות המתוארות, בתגובה למולקולה אחרת הידועה כ-IHH או Indian hedgehog, המיוצרת על ידי כונדרוציטים היפרטופיים מתמיינים. בתגובה, PTHrP משפעל את הקולטן PTHR1 הממוקם על פני תאים מתחלקים וקדם-היפרטרופיים כדי לשמר את קצב החלוקות שלהם ולהאט את קצב ההתמיינות שלהם לתאים היפרטרופיים. באופן זה, IHH ו-PTHrP פועלים במין לולאת משוב שלילית כדי לווסת את קצב ההתמיינות של כונדרוציטים.

לאחרונה התגלו פרטים רבים על מארג האיתותים דרכם מפעיל PTHrP את השפעתו על התמיינותם של כונדרוציטים. שתי קבוצות מחקר הראו ש-IHH מגביר את ביטויו של PTHrP בפלטת הגדילה על ידי החלשת הפעילות של גורם השיעתוק Gli3 (עפ"י Koziel וחב'ב-Development משנת 2005). הדרך בה פועל PTHrP על כונדרוציטים דרך הקולטן PTHR1, נעשית על ידי השפעול של Gα3, על ידי יצירת cAMP ועל ידי פעילות האנזים protein kinase A, כאשר בתגובה משתתפים בסדרת אירועים הכוללים זרחון של SOX9, עיכוב ביטויו של p57, והשריית הפעילות של Gli3, Bcl-2 ו-cyclin D1. בדיעבד פעילות PTHrP מזרחנת ופוגעת בשני גורמי השעתוק Runx2 ו-Runks3, החיוניים להתמיינות של כונדרוציטים (Marino ב-Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes ).

לאחרונה הודגם ש-PTHrP יכול להשתתף במודולציה של התמיינות כונדרוציטים על ידי וויסות התנועה של histone deacetylase לתוך גרעין התא, מה שגורם לוויסות פעילותם של גורמי השעתוק Zfp521, MEF2, ו-Runks2 (עפ"י Correa וחב' ב-Dev Cell משנת 2010 ו-Seriwatanachai וחב' ב-FASEB Jמשנת 2011). מסלול זה נדרש לפעילות PTHrP. יתרה מכך, הוכר לאחרונה שמוטציות בגנים של PTHrP ושל HDAC4 גורמות לצורה של chondrodysplasia type E הידועה גם כ-brachydactyly type E, המזכירה אי-סדירויות במטופלים עם מוטציות בגן GNAS, מה שמרמז שכל שלושת הגנים נמצאים על אותו מסלול גנטי (Williams וחב' ב-Am J Hum Genet משנת 2010). מחקר עדכני של Hirai וחב' משנת 2011 ב-Proc Natl Acad Sci USA, בו השתמשו בגישה גנטית לפגיעה בגן של PTHrP בכונדרוציטים במהלך התקופה שלאחר הלידה של עכברים, מצא ש-PTHrP מווסת גם את ההתמיינות של כונדרוציטים ומשמר אותם בפלטת הגדילה הבשלה. הדבר מרמז על האפשרות שאובדן האיתות של PTHrP יכול לגרום ל"סגירה" של פלטת הגדילה, בשלב ההתבגרות (Wang וחב' ב-J Bone Miner Res משנת 2011).

PTHrP מיוצר גם באתרים סחוסיים אחרים כמו ב-perichondrium המקיף את רצועות ה-hyaline המשמשות להארכת הצלעות ותורמות לאלסטיות של קירות בית החזה, והידועות כ-costal cartilages, וכן מקיף את הכונדרוציטים הסוּב-ארטיקולאריים. PTHrP מבוטא גם באופן בולט בנקודות הנעיצה של רצועות וגידים לתוך העצם, ותורם לבניית מכלולים אלה בעת תהליך גדילת השלד.

ל-PTHrP יש תפקידים אנאבוליים חשובים בעצם, ומתוך לימוד מעורבותו של חלבון זה בביולוגיה התקינה של רקמות סחוס ועצם, אין הדבר מפתיע ששינויים בתפקוד PTHrP קשורים למפגעי שלד. הדוגמה הבולטת ביותר היא HHM בו PTHrP בצירקולציה המגיב עם הקולטן PTHR1 בשלד גורם לתהליך ספיגת עצם ושחרור סידן להופעת היפרקלצמיה. מוטציות loss-of-function בגן של PTHR1 גורמות ל-Blomstrand's chondrodysplasia הגורמת למות העובר ברחם (Nissenson ב-Endocrinology משנת 1998). בנוסף, מוטציות loss-of-function בגן של PTHLH גורמות לתסמונת הכוללת קומה נמוכה, עצמות מטקרפליות קצרות בידים, גרורות סרטניות, וקשיי לימודים. נראה שהפעילות האנאבּולית של PTHrP בעצם עשויה להיות שימושית בטיפול באוסטאופורוזיס (Horwitz וחב' ב-J Clin Endocrinol Metabol משנת 2010).

השפעול של PPR שהוא הקולטן המשותף של PTH/PTHrP, מגרה 2 חלבוני G הטרודימריים, Gs ו-Gq. אנליזה גנטית מראה שהשפעול של Gs מתווך בפעילות PTHrP לשמור על כונדרוציטים שיתחלקו וישגשגו, ואילו השפעול של Gq נוגד את הפעילות האחרונה. כאשר משופעל Gs, יש פעילות במסלול התוך-תאי בו חל דיכוי סינתזה של p57 שהוא מעכב של cyclin-CDK, וכתוצאה מכך יש שגשוג של כונדרוציטים.

לעומת זאת, ל-PTHrP יש גם פעילות להאטה של תהליכי התמיינות בכונדרוציטים, מה שמתבצע על ידי זרחון של גורם השעתוק SOX9, וכן על ידי דיכוי הסינתזה של mRNA המקודד לגורם השעתוק Runx2. מסלולים אלה וודאי אחרים שעדיין לא התגלו, חוברים על מנת לווסת את קצב ההתמיינות של כונדרוציטים בפלטת הגדילה בתגובה ל-PTHrP.

לקצה ה-N טרמינאלי של PTHrP יש הומולוגיה עם קצה זה ב-PTH, לכן שני חלבונים אלה יכולים להיקשר לאותו קולטן, הידוע כ-type 1 PTH receptorאו PTHR1. אך בניגוד ל-PTH המסוגל להיקשר רק לסוג קולטנים יחיד, PTHrP מסוגל להיקשר למגוון גדול יותר של קולטים. אכן, PTHrP יכול לגרות את רוב הפעילויות שמשרה PTH, כולל הגברת ספיגת עצם, והגברת הספיגה מחדש בקצה הרחיקני (דיסטאלי) של אבוביות הכליה, ועיכוב הטרנספורט של פוספאט באבוביות הקריבניות (פרוקסימאליות). יחד עם זאת, הסבירות של PTHrP לגרות יצירת קלציטריול (1,25dihydroxy vitamin D) נמוכה יותר מזו של PTH. לכן, PTHrP אינו מגביר ספיגת סידן במעי.

תפקיד PTHrP בהתפתחות בלוטות החלב בשד:

מחקרים על PTHrP ועל הקולטן PTHR1 בעכברי knock-out, העלו שאיתות על ידי הורמון זה נחוץ ליצירת ה-mammary glands העובריים (Hens וחב' ב-Breast Cancer Res משנת 2007). עוברי אדם הלוקים ב-Blomstrad's chondrodysplasia חסרים אף הם רקמת שד, מה שמוכיח שאיתות של PTHrP חיוני להתפתחות השד גם באדם (Wysolmerski וחב' ב-J Clin Endocrinol Metabol משנת 2001). בלוטות השד נוצרות בעובר בתהליך של שקיעה פנימה (invagination) של תאים אפידרמליים אל תוך סטרומה שומנית מתפתחת, באופן היוצר מעין צינורית שמתפתחת בהמשך למערכת ה-mammary ducts (עפ"י Robinson ב-Nat Rev Genet משנת 2007).

בעוברים של עכבר ואדם, תאי אפיתל בנבט של רקמת השד מייצרים PTHrP, אשר מגיב עם קולטני PTHR1 המופיעים על פני התאים המזנכימאלים המקיפים. אינטראקציה זו חיונית להתמיינות תקינה של התאים המזנכימאלים, אשר בתגובה מעודדים את הצמיחה של הצינורות (ducts) האפיתליאלים. איבוד האיתות של PTHrP מונע את ה"דו-שיח" החיוני בין תאי האפיתל והתאים המזנכימאלים, מה שעוצר את התפתחות רקמת השד כבר בשלב הנבט. PTHrPגורם למודולציה של איתותי Wnt ו-BMP, כמו גם לביטוי במזנכימה של מספר גורמי שעתוק, כולל הקולטן לאנדרוגנים, Max2 ו-Lef1, כאשר כל אלה תורמים לצמיחה של ציורות עובריים ברקמת השד (Hens וחב' ב-Dev Dyn משנת 2009).

לאחר הלידה, ממשיך PTHrP להיות מבוטא ברמה נמוכה בתאים מיו-אפיתליאלים, כאשר הקולטן PTHR1 מבוטא בתוך הסטרומה מסביב לצינוריות השד. בתקופה הבוגרת, PTHrP מבוטא באופן ניכר על ידי תאי אפיתל בשד בתקופת ההנקה, וכמויות ניכרות שלו מופרשות לחלב (Budayr וחב' ב-Proc Natl Acad Sci USA משנת 1989), אך תפקידו בחלב אינו ברור. יחד עם זאת, PTHrP מופרש גם מרקמת השד לצירקולציה, והוא משתתף בוויסות הסיסטמי של סידן והמטבוליזם של העצם בעת ההנקה. רקמת העצם של האם משמשת כמקור סידן ליצירת חלב, וידוע שבנשים מניקות יש איבוד מהיר של רקמת עצם.

רמות מוגברות של PTHrP בצירקולציה, תואמות איבוד רקמת עצם באדם, כאשר CaSR או calcium-sensing receptor, שהוא קולטן הקשור ל-G-protein type C, ה"חש" בריכוזים חוץ-תאיים של יון הסידן, ומדכא את הפרשת PTHrP מתאי השד (VanHouten וחב' ב-J Clin Invest משנת 2004). תהליך זה מבטא באופן קלאסי לולאת משוב שלילי אנדוקרינית, בה PTHrP מגייס סידן מעצם השלד, כאשר בתגובה מעוכבת הפרשת PTHrP מרקמת השד. מהבנת תפקידו של PTHrP בהגברת ספיגת העצם בעת הנקה, אין זה מפתיע ש-PTHrP תורם גם להמסת רקמת עצם (osteolysis) בתהליך יצירת גרורות לעצם. אי לכך, תאי סרטן שד גרורתיים לעצם מייצרים יותר PTHrP מאשר תאי הגידול הראשוני (Akhtari וחב' ב-Cancer Biol The משנת 2008).

נמצא ש-TGF-β המופרש באזורי ספיגת עצם, מגביר את יצירת PTHrP על ידי מסלול איתותים אליו קשור גורם השעתוק Gli2 (עפ"י Johnson וחב' ב-Cancer Res משנת 2011). בתגובה, מגביר PTHrP את קישורו של גורם השעתוק NF-κB לקולטנו, ומפחית את היצור של osteoprotegerin ובכך מגדיל את כמות התאים האוסטאוקלסטים ואת פעילותם האוסטאוליטית. בנוסף, בניגוד למתרחש בתאי שד תקינים, איתות של CaSR בתאי סרטן שד מגרה בהם את יצירת PTHrP. במחקרם של Henderson וחב' ב-Cancer Res משנת 2006, נחקרו 526 מקרים של סרטן שד בהם נמצא שביטוי של PTHrP היה מנבא בלתי-תלוי למהלך קליני יותר שפיר. גם Li וחב' במחקרם בעכברים שהופיע ב- J Clin Invest משנת 2011, הראו שפגיעה בגן ל-PTHLH האריכה באופן דרמטי את הלטנטיות של סרטן השד והאטה את התפתחות השאת.

תפקיד PTHrP בטרנספורט של סידן בשלייה:

סידן מועבר דרך השלייה מהאם לעובר (Kovacs ב-J Clin Endocrinol Metabol משנת 2001), כאשר השלייה מייצרת PTHrP שמסייע לשמור על רמת סידן תקינה בעובר. הראשונים שהדגימו את פעילות PTHrP במעבר סידן דרך דופן השלייה היו Rodda וחב' ב-J Endocrinol משנת 1998. בשנת 1990 פרסמו Care וחב' ב-Exp Physiol, ולאחר מכן Wu וחב' ב-J Biol Chem משנת 1996, שדווקא הפפטידים "הפנימיים" ב-PTHrP, דהיינו 67-86 ו-38-94 הם הפפטידים הפעילים ביותר בתחום זה, כאשר לחומצות האמינו בקצה ה-N טרמינאלי של PTHrP אין פעילות דומה. נתון זה רומזים לכך שיש בשלייה קולטנים ספציפיים ל-mid-region של PTHrP. ניסויים בעכברים של Simmonds וחב', בהם נעשתה מניפולציה גנטית אישרו שאמנם ל-PTHrP יש תפקיד בוויסות של הטרנספורט של סידן בשלייה, שחיוני לתהליך המינרליזציה של השלד בעובר (Crit Rev Eukaryot Gene Expr משנת 2012).

תפקיד PTHrP בהרפיה של שריר חלק:

דוגמה לפעילות הפאראקרינית של PTHrP ניתן למצוא בהשפעתו על תאי שריר חלק בדופן כלי-דם. PTHrP מופרש משריר חלק באיברים רבים, בדרך כלל בתגובה ל-stretching המופעל על שריר זה. כבר משנות ה-20 היה ידוע שהזרקה של תמצית של יותרת בלוטת התריס גרמה בחיות להגברה בזרימת הדם ולהפחתת לחץ הדם (Charbon וחב' ב-Eur J Pharmacol משנת 1968, וכן Wang וחב' באותו כתב עת משנת 1984 ו-Mok וחב' ב-Endocr Rev משנת 1989). אך כאשר התגלה PTHrP, התברר שפעילות זו של הרפיית כלי-דם אינה תפקידו של PTH, אלא היא נובעת מהשפעה פיזיולוגית מקומית של PTHrP המשפיעה גם על שריר חלק בקיבה, במעי, ברחם, בשלפוחית השתן וכן בדופן העורקית (עפ"י Philbrick וחב' ב-Physiol Rev משנת 1996, וכן Qian וחב' ב-Endocrinology משנת 1999, ו-Martin וחב' ב-J Endocrinol משנת 1997).

בשנת 1991 הראו Roca-Cusache וחב' ב-J Pharmacol Exp Ther, ש-PTHrP הבא לביטוי בשריר חלק פועל באופן מהיר להרחבת כלי הדם במנגנון שאינו תלוי באנדותל, כאשר מכווץ כלי דם כמו angiotensin II, משרה עלייה מהירה ביצירת PTHrP (עפ"י Pirola וחב' ב-J Biol Chem משנת 1993). נראה שדווקא ה-PTHrP של גרעין התא, חיוני במיוחד בוויסות השגשוג של תאי שריר חלק בדופן כלי הדם. ל-PTHrP עלולה להיות גם השפעה שלילית, ונמצא שלאחר פרוצדורה אנגיופלסטית של פתיחת כלי דם עם בלון, יש הגברה ביצירת PTHrP, מה שעלול להגביר שגשוג תאי שריר חלק, מה שיכול לעבות את שכבת ה-neointima (עפ"י Fiaschi-Taesch וחב' ב-Circulation משנת 2004, ו-Sicari וחב' ב-J Endocrinology משנת 2012).

תפקיד PTHrP בבלוטת הלבלב:

בפנקריאס, תאי האיים נמצאו מייצרים PTHrP וכן נושאים את הקולטנים ל-PTH ול-PTHrP, כאשר השפעת PTHrP היא בהגברה משמעותית ברמת סידן בתוך תאי β (עפ"י Vascavada וחב' ב-J Biol Chem משנת 1996) ובשפעול של האנזים phospholipase C (עפ"י Vasvada וחב' ב-Diabetes משנת 2007). מחקרם של Drucker וחב' ב-Mol Endocrinol משנת 2011, הראה שכל ארבעת הסוגים של תאי בלוטת הלבלב, α, β, δ ו-pancreatic polypeptide cells, מייצרים PTHrP. יצירת-יתר של PTHrP כמו גם החדרה של הפפטיד ה-N טרמינאלי 1-36 של חלבון זה לעכברים, מגבירה את יצירת תאי β (עפ"י Gutalu וחב' ב-Diabetes משנת 2010) ומפחית תהליכי אפופטוזיס של תאים אלה, מה שגורם להיפוגליקמיה המושרית על ידי יצירת עודף של אינסולין (Cebrian וחב' ב-Diabetes משנת 2002). ניסויים עדכניים בעכברים, הראו שהזרקות תת-עוריות יומיות של PTHrP 1-36, מגבירות את שגשוגם של תאי β, משפרות את ה-glucose tolerance, ויכולות להילקח בחשבון כטיפול פוטנציאלי בסוכרת (Williams וחב' ב-Diabetologia משנת 2011).

החלבון PTHrP והשן:

שיניים מתפתחות מוקפות על ידי עצם והן חייבות לפרוץ דרך הכיסוי של הקריפטה הדנטאלית כדי להופיע בחלל הפה. בקיעת שיניים (tooth eruption) דורשת קואורדינציה מרחבית של עצמות הלסת, כאשר אוסטאוקלסטים חייבים לספוג את רקמת העצם המכסה את כתר השן על מנת לאפשר לה לבקוע ולהופיע, ואילו אוסטאובלסטים אמורים ליצור עצם בבסיס השן, כדי לאפשר לה להידחף אל מחוץ לקריפטה. PTHrP מיוצר באופן נורמאלי על ידי תאי ה-stellate reticulum שהם מארג של תאים אפיתליאלים במרכז ה-enamel האפיתליאלי (Beck וחב' ב-Cell Tissue Res משנת 1995, וכן Ouyang וחב' ב-J Bone Miner Res משנת 2000 ו-Tenorio ו-Hughes ב-Arch Oral Biol משנת 1996).

בשנת 1998 פרסמו Philbrick וחב' ב-Proc Natl Acad Sci USA שעל ידי שימוש ב-cytokeratin שהוא טרנסגן של K14-PTHrP, ניתן היה להראות שהחלפת PTHrP באפיתליום של ה-enamel, החזירה לתקינות את פעולת בקיעת השיניים. כיוון שאוסטאוקלסטים אינם מכילים קולטנים מסוג PPR, הממצא הזה תומך בתפקיד ההתפתחותי של PTHrP בהשפעה על אוסטאוקלסטים לפלס דרך לבקיעת השן. תפקידו של PTHrP הוא לאותת לתאי הזקיק הדנטאלי לעודד את יצירת האוסטאוקלסטים מעל הקריפטה. בהיעדר PTHrP לא נוצרים אוסטאוקלסטים אלה, ולא מתרחשת בקיעת השיניים הצעירות.
מגבלות הבדיקה:

אין לבצע בדיקה זו כדי לשלול ממאירות או על מנת לבחון חולי סרטן לתרחיש של היפר-קלצמיה של ממאירות. PTHrP יכול להיות מוגבר בנשים הרות או מניקות כמו גם ביילודים. תרחישים לא ממאירים שתוארו בהקשר של רמות מוגברות של PTHrP בפלזמה, כוללים systemic lupus erythematosus, לימפאדנופתיה הקשורה ל-HIV, מצב של lymphedema של החזה, וכן במקרה שלך גידולים שפירים של השחלות, הכליות, ושל המערכת הנוירואנדוקרינית (Burtis ב-Clin Chem משנת 1992).

בגלל המוּרכּבוּת של האיזופורמים של PTHrP, ההבדלים בשיטות המדידה השונות של PTHrP והמחסור בסטנדרט כיול אחיד, קיים קושי בהשוואה של רמות הורמון זה או של האיזופורמים שלו בתרחישים שונים. תערובת של האיזופורמים יכולה לפגוע בלינאריות של תוצאות הבדיקה בדגימות פלזמה של מטופלים, ולמנוע קביעה מדויקת של ריכוזי PTHrP (עפ"י Wu וחב' ב-Mayo Clin Proc משנת 1997).

המשמעות של תוצאות תקינות ובלתי-תקינות של PTHrP:

ריכוזים נמוכים ביותר שלPTHrP עד כדי כאלה שלא ניתן לגלותם הן תוצאות נורמאליות. בנשים מיניקות ניתן לגלות את PTHrP. רמות מוגברות של PTHrP עם רמות מוגברות של סידן בדם, נגרמות בדרך כלל על ידי תהליכים סרטניים. PTHrP יכול להיווצר על ידי סוגי סרטן שונים, כולל סרטן ריאות, שד, ראש וצוואר, מערכת העיכול, שלפוחית השתן והשחלות כמו גם בלויקמיה ובלימפומה. בתלות באוכלוסייה הנבדקת, עד 80% מהנבדקים עם שאתות ממאירות והיפרקלצמיה, יסבלו מ-HHM או humoral hypercalcemia of malignancy. רמה גבוהה של PTHrP היא הסיבה להיפרקלצמיה בערך ב-2/3של חולי הסרטן. בנבדקים אלה בנוסף להיפרקלצמיה ניתן יהיה לגלות גם היפו-פוספטמיה, hypercalciuria, רמות מוגברות של פוספטאזה בסיסית בנסיוב ו-hyperphosphaturia. רמות מוגברות של PTHrP מוצאים גם בנבדקים עם מחלת כליות.

במטופלים עם ממצאים ביוכימיים המרמזים, אם כי לא מוכיחים מצב של היפר-פאראתירואידיזם ראשוני (דהיינו היפרקלצמיה, אך רמות נורמאליות או קרובות לנורמה של פוספאט ושל PTH, כאשר רמת האחרון היא בתחום הנורמה (אם כי מעל 30 פיקוגרם/מ"ל), ניתן לקחת בחשבון אפשרות של HHM, בעיקר אם המטופל קשיש, ובעל היסטוריה של ממאירות, או של גורמי סיכון לממאירות. רמות מוגברות של PTHrP במטופל האחרון, מצביעים על HHM כסיבה להיפרקלצמיה.

== הוראות לביצוע הבדיקה ==

ברוב ערכות הבדיקה יש העדפה לנטילת דם במבחנות EDTA (פקק סגלגל) לאחר צום של 8 שעות. הסרכוז נעשה בצנטריפוגה מקוררת, ויש לפסול דגימות המוליטיות באופן בולט. הפלזמה המופרדת יציבה לצורך הבדיקה עד 7 ימים בטמפרטורת החדר, עד 30 יום בקירור, ועד שנה בהקפאה. יש מעבדות המבצעות את הבדיקה בפלזמה שנלקחה במבחנת הפארין (פקק ירוק), אלא שאז יציבות הדגימה שונה: 7 ימים בטמפרטורת החדר או בקירור, וחודש בהקפאה. רצוי לכלול במבחנת נטילת הדם מעכב פרוטאזות דוגמת aprotinin או leupeptin, ויש המשתמשים במעכב הפרוטאזות PPACK או Phe-Pro-Arg-chlomethylketone.

שיטות המדידה: ניתן למדוד רמת PTHrP או על ידי שילוב של שיטת HPLC ו- Tandem Mass Spectrometry, או בשיטת ICMA או immunochemiluminometric assay, תוך שימוש ב-2 נוגדנים שנוקו על ידי כרומטוגרפיית-זיקה מנסיוב של עז מחוסנת כנגד המקטע 1-86 של PTHrP. אחד מ-2 הנוגדנים מסומן עם acridinium ester כנוגדן גלאי (tracer), כאשר הנוגדן השני מקובע על פני כדורונים זעירים (beads). כאשר הפלזמה מכילה PTHrP נוגדן ה-tracer נקשר אל ה-beads וניתן לגילוי וכימות (עפ"י Wu וחב' ב-Ann Clin Lab Sci משנת 1997).

(להכניס כאן את התרשים מתחתיו המקרא הוא.... מסלול זרימה של בדיקת מעבדה לרמת PTHrP)

פפטיד דמוי הורמון פאראתירואידי - Parathyroid hormone-related protein

2015-06-28T06:11:48Z

בן עמי סלע: יצירת דף עם התוכן "== Parathyroid hormone-related protein == כינויים נוספים: PTHrP; PTH Related Peptide. תחום: גורם הורמונאלי מרכזי במטבול..."

== Parathyroid hormone-related protein ==

כינויים נוספים: PTHrP; PTH Related Peptide.
תחום: גורם הורמונאלי מרכזי במטבוליזם של סידן בגוף.
טווח ערכים תקין: פחות מ-2 פיקומול' למ"ל, או 14-27 פיקוגרם למ"ל.
יוצר הערך: פרופ' בן-עמי סלע.

== מטרת הבדיקה ==

אבחון מטופלים החשודים לתרחיש של היפר-קלצמיה של ממאירות (HHM אוhumoral hypercalcemia of malignancy), או אבחון של מטופלים עם היפר-קלצמיה מסיבה לא ידועה). רמת PTHrP יכולה לשמש גם לניטור יעילות הטיפול האנטי-סרטני.

== בסיס פיזיולוגי ==
PTHrP הוא חלבון חבר במשפחת ההורמון PTH. הוא מופרש על ידי תאים סרטניים אך יש לו גם תפקידים בפיזיולוגיה התקינה של גוף האדם. PTHrP בא לביטוי באתרים רבים בגוף, ויש לו פעילות אנדוקרינית, פאראקרינית ואינטרה-קרינית, ובכך הוא משפיע על מגוון של תרחישים פיזיולוגיים ופתולוגיים, בנוסף לתפקידיו בבניית איברים (Wysolmerski ב-J Clin Endocrinol Metabol משנת 2012, ו-McCauley ו-Marin ב-J Bone Miner Res משנת 2012).

(להכניס כאן את התרשים שהמקרא תחתיו מתחיל במילים...תפקידיו הפיזיולוגיים של PTHrP)

(להכניס כאן את התרשים שהמקרא שלו מתחיל במילים ... הפעילויות הפאראקריניות של PTHrP...)

PTHrP הוא פפטיד מונומרי הקיים במספר איזופורמים, שגודלם נע בין 60 חומצות אמינו ועד 173 חומצות אמינו, הנוצרים על ידי תהליך splicing דיפרנציאלי, ומעורבות של האנזים prohormone convertase. החלבון PTHrP מיוצר בריכוזים נמוכים על ידי כל רקמות הגוף. תפקידיו הפיזיולוגיים אינם ברורים באופן מוחלט, וניתן לחלקם לארבע קטגוריות, שלא כולן באות לביטוי על ידי כל אחד מהאיזופורמים ולבטח לא כולם באים לביטוי בכל הרקמות: א. טרנספורט של סידן משני צידי האפיתל בעיקר בכליות וברקמת השד; ב. הרפיה של שריר חלק ברחם, בשלפוחית השתן, במערכת העיכול, ובדופן העורקים; ג. וויסות של שגשוג תאים; ד. התמיינות (דיפרנציאציה) של תאים ואפופטוזיס במגוון רקמות. כיוון ש-PTHrP הוא מרכיב חיוני של הריון תקין והתפתחות עוברית, חסר או פגם של חלבון זה קטלני בעוברי יונקים.

עניין רב ומחקר רחב ממדים מתחילת שנות ה-90, הם תולדה של הממצאים על היות PTHrP מיוצר באופן נורמאלי ברקמות רבות בהן הוא פועל באופן פאראקריני. ישנם רק שלושה מצבים, בהם PTHrP מופיע בצירקולציה ופועל באופן אנדוקריני: א) התסמונת ההיפרקצמית של ממאירות (HHM) בה מיוצר PTHrP על ידי השאתות ונודד דרך הדם לרקמת העצם וגורם לספיגת עצם (Burtis וחב' ב-J Clin Endocrinol Metabol משנת 1992, ו-Grill וחב' באותו כתב עת משנת 1991); ב) תהליך ההנקה (lactation) בו PTHrP נוצר בבלוטות החלב בשד ומגיע לצירקולציה (Grill וחב' ב-Clin Endocrinol משנת 1992); ג) החיים העובריים, בהם PTHrP מווסת את הטרנספורט של סידן מהאם לעובר דרך השליה (Kovacs וחב' ב-Proc Natl Acad Sci USA משנת 1996).

PTHrP זוהה כגורם להיפרקלצמיה של מצבי ממאירות בשנת 1987, על ידי Martin וחב' במלבורן על ידי שבודדו אותו משורת תאים של סרטן ריאה באדם (Proc Natl Acad Sci USA משנת 1987). באותה עת זיהו Rodan וחב' (J Clin Invest משנת 1983) חלבון זה המופרש מתאים אוסטאובלסטים, וכן זיהו Burtis וחב' (J Biol Chem משנת 1987) תאים שמקורם בסרטן שד חלבון שמשקלו המולקולארי 17,000 דלטון בעל פעילות מעודדת את האנזים adenylate cyclase), ואילו Strewler וחב' משנת 1987 ב-J Clin Invest, בודדו משורת תאים של סרטן כליה את החלבון שבדיעבד זוהה כ-PTHrP. לאחר מכן הראו Miao וחב' על ידי פגיעה בעכברים בגן המקודד ל-PTHrP שהדבר קטלני בעכברים אלה על ידי פגיעה במערכת העצמות, על ידי מניעת צמיחת העצם הטרבקולארית (Endocrinology משנת 2004).

ממצא אחרון זה הצביע על החשיבות הפיזיולוגית הניכרת של PTHrP. בשנים שחלפו מאז נמצא ש-PTHrP ו-PTH מקודדים על ידי גנים הקשורים זה לזה המהווים חלק ממשפחת גדולה יותר של ה-PTH gene. הקשר האבולוציוני הזה, מאפשר ל-חלבונים אלה להיקשר לאותו קולטן הידוע כ-type 1 PTH/PTHrP Receptor, מה שמסביר מדוע היפרקלצמיה של הממאירות דומה לזו הופיעה בהיפר-פארא-תירואידיזם. במקור, היו סבורים ש-PTHrP קשור בעיקר בתסמונת פארא-נאופלסטית, אך כיום כבר ברור ש-PTHrP קשור לתרחישים של אוסטאופורוזיס, אוסטאו-ארתריטיס, וסרטן השד, ואף נמצא ש-PTHrPעצמו עשוי לשמש כתרפיה של אוסטאופורוזיס וסוכרת.

כיום קיימת כבר ההכרה בדבר הפיזור הרחב של PTHrP ברקמות נרחבות בגוף, ולפעילויות האנדוקרינית, הפאראקרינית והאינטרה-קרינית, המניעות מספר תרחישים פיזיולוגיים ופתולוגיים, וכן בדבר תפקידו המרכזי ב-organogenesis. במחקר חלוצי קלאסי של מטופל עם קרצינומה של הכליות והיפרקלצמיה משנת 1941 ב-N Eng J Med, העלה Fuller Albright את ההשערה שמספר גידולים סרטניים יכולים לגרום להיפרקלצמיה, על ידי הפרשה של PTH או של "חלבון מאוד דומה ל-PTH". אכן בתרחיש של "היפרקלצמיה של ממאירות" יש ל-PTHrP פעילות דומה לזו של PTH, וכאשר שאת סרטנית מפרישה PTHrP הדבר גורם ישירות להיפרקלצמיה (Broadus וחב' ב-N Eng J Med משנת 1988). כיוון שהיפרקלצמיה הנגרמת על ישי PTHrP היא לעתים הסימן המוקדם של ממאירות, היא נחשבת כתופעה פארא-נאופלסטית.

הסינתזה והמבנה של PTHrP:

PTHrP של אדם מקודד על ידי גן בודד (PTHLH) הנמצא על הזרוע הקצרה של כרומוזום 12 (עפ"י Strewler וחב' ב-J Clin Invest משנת 1987, ו-Suvaוחב' ב-Science משנת 1987). על ידי splicing חלופי, נוצר מגוון של סוגי mRNA, המקודדים ל-3 איזופורמים של PTHrP בעלי 139, 141 ו-173 חומצות אמינו. כבר מהתחלת המחקר הייתה הכרה שהגנים PTHLH ו-PTH קשורים זה לזה, כאשר ה-exon/intron של המקטע ב-2 גנים אלה המקודד לרצפי pre-pro שלהם, והחלק ההתחלתי של 2 הפפטידים הבשלים זהה לחלוטין. יתרה מכך, הקטעים של 2 הגנים המקודדים את הקצה ה-N טרמינאלי של PTH ו-PTHrP המופרשים לצירקולציה, הם בעלי הומולוגיה ניכרת, הבאה לביטוי בהיותם זהים ב-8 מתוך 13 חומצות האמינו (עפ"י Mangin וחב' ב-Proc Natl Acad Sci USA משנת 1988), וכן בהיותם בעלי מבנה שניוני דומה לאורך 21 חומצות האמינו הבאות.

ממצא אחר של Kemp וחב' שהופיע ב-Science בשנת 1987, היה שבדומה למה שידוע לגבי PTH גם במקרה של PTHrP כל פעילותו הביולוגית נכללת ב-34 חומצות האמינו בקצה ה-N טרמינאלי. רצפים הומולוגיים אלה, מאפשרים לשני הפפטידים להיקשר לאותו קולטן ולשפעל אותו, מה שעשוי להסביר מדוע PTHrP גורם להיפרקלצמיה של ממאירות. כל החברים במשפחת הגן PTH, הופיעו במקביל לאבולוציה של בעלי החוליות, כנראה כתוצאה מדופליקציה של גן קדמון בודד. בין כל חברי משפחת הגן PTH, הגן PTHLH הוא בעל המבנה הגנומי המורכב ביותר ואת השוֹנוּת הרבה ביותר בין מיני בעלי חיים שונים, מה שמשקף כנראה את המגוון הגדול של תפקודי PTHrP ברקמות השונות. אכן, המגוון הגדול של פעילויות פיזיולוגיות של PTHrP בא לביטוי בכך שהרכב חומצות האמינו של חלבון זה השתמר באופן בולט באדם, חולדה, עכבר, תרנגולת, ובכלב עד לחומצת אמינו 111. מעניין לציין שאפילו PTHrP של דג fugu הוא בעל הומולוגיה של 53% עם PTHrP של האדם.

(להכניס כאן את התמונה שהמקרא מתחתיה מתחיל במלים ...מולקולת האם של PTHrP מכילה בקצה...)

הפפטידים של PTHrP והקולטנים שלו:

הפפטיד PTHrP 1-36 מופרש ממספר סוגי תאים כמו תאי לב, מוח, שריר השלד, שלפוחית השתן, צינורות המרה, מערכת החיסון, כבד, רחם ואשכים, כמו גם איברים אנדוקריניים הכוללים את בלוטת יותרת המוח ותאי C בבלוטת התריס (Orloff וחב' ב-Endocr Rev משנת 1994 ו-Ureña וחב' ב-Endocrinology משנת 1993), אך הצורות הארוכות יותר של הפפטידים בקצה האמיני של PTHrP, מופרשות גם מקרטינוציטים ומתאי אפיתל של בלוטות השד, במקרים של סרטן העור ובתקופת הנקה (Burtis וחב' ב-N Eng J Med משנת 1990, וכן Sowers וחב' ב-JAMA משנת 1996 ו-VanHouten וחב' ב-J Clin Invest משנת 2003).

ההפרשה של הפפטידים המוגדרים כ-midregion כולל חומצות אמינו 38-94, 39-95 ו-38-101 תוארה גם כן (Soifer וחב' ב-J Biol Chem משנת 1992), אם כי הביולוגיה של פפטידים האחרונים אינה ברורה, פרט לעובדה שה-mid-region של PTHrP מעודד טרנספורט של סידן בשִליָה וקשור למודולציה של ביקרבונאט בכליות. כמו כן, המקטעים ה-C טרמינאלים של PTHrP המורכבים מחומצות אמינו 107-138 ו-109-138 תוארו ותפקידם הוא בעיכוב יצירת אוסטאוקלסטים ובעידוד השגשוג של אוסטאובלסטים (Philbrick וחב' ב-Physiol Rev משנת 1996).

בשנת 1991 התפרסם ב-Science מחקרם של Juppner וחב', בו תואר בידודו של הקולטן של PTHrP, כאשר מחקרים בעכברי knock out עם פגיעה בקולטן זה, הדגימו את החשיבות של PTHrP (עפ"י Lanske וחב' ב-Science משנת 1996) אותה קבוצת חוקרים אף הדגימה במאמר משנת 1998 ב-Endocrinology, שאותו קולטן יכול לשמש את 2 הליגנדים, PTH ו-PTHrP. כמעט 20 שנה חלפו עד לפרסום של Miao וחב' משנת 2005 ב-J Clin Invest בו הודגמה חשיבותו של PTHrP המופרש מאוסטאובלסטים, כגורם אנאבולי פוטנטי בכל הקשור ליצירת עצם.

הפעילות התוך גרעינית של PTHrP ופעילותו כ-intracrine factor:

בנוסף לפעילויות האנדוקריניות והפאראקריניות של PTHrP המופרש מרקמות שונות, יש ראיות מוצקות לכך שצורה מסוימת של PTHrP אינה מופרשת, ועל ידי הכוונתו של הורמון זה לגרעין תאים יש לו שם פעילות גרעינית כגון זו הקשורה למודולציה של אפופטוזיס בתאים אלה. בין היתר, שעתוק של הגן PTHLH יכול להשפיע עת מניעת ההפרשה של PTHrP אל מחוץ לתאים, והכוונתו לגרעין התאים (Fiaschi-Taesch וחב' ב-Endocrinology משנת 2003). תנועת PTHrP לתוך גרעין התא מושפעת מרצף של חומצות אמינו בין עמדות 84 ו-93 המשפיע על התנועה הדו-כיוונית של PTHrP אל תוך הגרעין, והחוצה ממנו (Roth וחב' ב-J Biol Chem משנת 2011). נראה שהזרחון של PTHrP בעמדה Thr85 על ידי cyclin-dependent kinase p34cdc2, משחקת תפקיד בהחדרת PTHrP לגרעין התא.

לא הרבה ידוע על הפעילות התוך-גרעינית של PTHrP. ידוע שהוא נקשר ל-RNA ובמספר תאים הוא ממוקם בגרעינון (nucleolus), מה שמרמז לכך ש-PTHrP קשור לוויסות התנועה של RNA, לדינאמיקה של ריבוזומים ואף לתרגום של חלבונים. בתאים בתרבית נמצא ש-PTHrP גרעיני, משפיע על שגשוג תאים, אך גם על אפופטוזיס, ולעתים הוא פועל לנטרול פעילותו של THrP המופרש מתאים. בתאי סרטן השד, המעי הגס והערמונית, נראה ש-PTHrP מעודד שגשוגם של תאים אלה, מגן עליהם מפני אפופטוזיס, ומעודד את כושר נדידתם, בה בשעה ש-PTHrP המופרש מתאים אלה, מעכב את שגשוג התאים הללו ומעודד בהם אפופטוזיס (Park וחב' ב-Endocr Related Cancer משנת 2012, ו-Shen וחב' ב-Exp Cell Res משנת 2004).

PTHrP גרעיני נמצא גם כמעודד את השגשוג של תאי שריר חלק וסקולאריים in vitro ו-in vivo על ידי השריית הביטוי של c-myc ושל skp2, שבתגובה מפחיתים את רמות מעכב מחזור חלוקת התא, p27. לעומת זאת ל-PTHrP המופרש מהתא יש השפעות מנוגדות.

תפקיד PTHrP במערכת העצם והשלד:

החשיבות הפיזיולוגית של PTHrP במערכת השלד הייתה מוכרת מאז שהתברר שפגיעה ביצירת הורמון זה בעכברים מייד לאחר הלידה גרמה למותם כתוצאה מכשל נשימתי, מה שיוחס לפגם ביצירת קופסת הצלעות שלהם (Karaplis וחב' ב-Genes Dev משנת 1994). תרחיש זה מבליט את ההבדל בין PTHrP לבין PTH שפגיעה בגן שלו הייתה פחות דרמטית בעכברים יילודים (Miao וחב' ב-J Clin Invest משנת 2002). החשיבות של PTHrP בהתפתחות השלד מבחינת הפגמים ביצירתו הנגרמים בחסרים של הורמון זה chondrodysplasia ו-premature epiphyseal closure, הודגמה בעוברי עכברים על ידי Amizuka וחב' ב-J Cell Biol משנת 1994, העיקר לגבי יצירת סחוס אפיפיזיאלי בלתי תקין ושינויים ביצירת עצם אנדוכונדראלית.

נמצא שעכברי PTHrP(+/-) עם חסר חלקי של PTHrP, נורמאליים פנוטיפית בלידה, אך לאחר 3 חודשים הם בעלי מסת עצם נמוכה, עם ירידה בולטת בעובי העצם הטרבקולארית, ועלייה ניכרת במספר האדיפוציטים במח העצם (Amizuka וחב' ב-Dev Biol משנת 1996). חוקרים אלה מצאו שעכברים עם גנוטיפ PTHrP(+/-), לוקים בגיוס של precursors של מח העצם, וכן יש באוסטאובלסטים שלהם רמת אפופטוזיס גבוהה בהשוואה לעכברים תקינים. עכברים פגומים לגבי יצירת PTHrP נמצאו גם בעלי יצירה מופחתת של אוסטאוקלסטים.

במודלים של בעלי-חיים נמצא שביטוי-יתר או ביטוי-חסר של PTHrP, נקבע על ידי האופן בו מגיב הקצה ה-N טרמינאלי של ההורמון עם הקולטן PTRH1 על מנת לסנכרן את קצב ההתמיינות של הכונדרוציט, ולשמור על גידול סדיר של עצמות ארוכות (Kronenberg ב-Ann NY Acad Sci משנת 2006). פלטת הגדילה מורכבת מעמודות של כונדרוציטים מתחלקים ומתמיינים הגדלים בהדרגה לשלב של כונדרוציטים קדם-היפרטרופיים ולאחר מכן לכונדרוציטים היפרטרופיים. PTHrP מופרש בעיקר על ידי בונדרוציטים לא-בשלים בקצות העמודות המתוארות, בתגובה למולקולה אחרת הידועה כ-IHH או Indian hedgehog, המיוצרת על ידי כונדרוציטים היפרטופיים מתמיינים. בתגובה, PTHrP משפעל את הקולטן PTHR1 הממוקם על פני תאים מתחלקים וקדם-היפרטרופיים כדי לשמר את קצב החלוקות שלהם ולהאט את קצב ההתמיינות שלהם לתאים היפרטרופיים. באופן זה, IHH ו-PTHrP פועלים במין לולאת משוב שלילית כדי לווסת את קצב ההתמיינות של כונדרוציטים.

לאחרונה התגלו פרטים רבים על מארג האיתותים דרכם מפעיל PTHrP את השפעתו על התמיינותם של כונדרוציטים. שתי קבוצות מחקר הראו ש-IHH מגביר את ביטויו של PTHrP בפלטת הגדילה על ידי החלשת הפעילות של גורם השיעתוק Gli3 (עפ"י Koziel וחב'ב-Development משנת 2005). הדרך בה פועל PTHrP על כונדרוציטים דרך הקולטן PTHR1, נעשית על ידי השפעול של Gα3, על ידי יצירת cAMP ועל ידי פעילות האנזים protein kinase A, כאשר בתגובה משתתפים בסדרת אירועים הכוללים זרחון של SOX9, עיכוב ביטויו של p57, והשריית הפעילות של Gli3, Bcl-2 ו-cyclin D1. בדיעבד פעילות PTHrP מזרחנת ופוגעת בשני גורמי השעתוק Runx2 ו-Runks3, החיוניים להתמיינות של כונדרוציטים (Marino ב-Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes ).

לאחרונה הודגם ש-PTHrP יכול להשתתף במודולציה של התמיינות כונדרוציטים על ידי וויסות התנועה של histone deacetylase לתוך גרעין התא, מה שגורם לוויסות פעילותם של גורמי השעתוק Zfp521, MEF2, ו-Runks2 (עפ"י Correa וחב' ב-Dev Cell משנת 2010 ו-Seriwatanachai וחב' ב-FASEB Jמשנת 2011). מסלול זה נדרש לפעילות PTHrP. יתרה מכך, הוכר לאחרונה שמוטציות בגנים של PTHrP ושל HDAC4 גורמות לצורה של chondrodysplasia type E הידועה גם כ-brachydactyly type E, המזכירה אי-סדירויות במטופלים עם מוטציות בגן GNAS, מה שמרמז שכל שלושת הגנים נמצאים על אותו מסלול גנטי (Williams וחב' ב-Am J Hum Genet משנת 2010). מחקר עדכני של Hirai וחב' משנת 2011 ב-Proc Natl Acad Sci USA, בו השתמשו בגישה גנטית לפגיעה בגן של PTHrP בכונדרוציטים במהלך התקופה שלאחר הלידה של עכברים, מצא ש-PTHrP מווסת גם את ההתמיינות של כונדרוציטים ומשמר אותם בפלטת הגדילה הבשלה. הדבר מרמז על האפשרות שאובדן האיתות של PTHrP יכול לגרום ל"סגירה" של פלטת הגדילה, בשלב ההתבגרות (Wang וחב' ב-J Bone Miner Res משנת 2011).

PTHrP מיוצר גם באתרים סחוסיים אחרים כמו ב-perichondrium המקיף את רצועות ה-hyaline המשמשות להארכת הצלעות ותורמות לאלסטיות של קירות בית החזה, והידועות כ-costal cartilages, וכן מקיף את הכונדרוציטים הסוּב-ארטיקולאריים. PTHrP מבוטא גם באופן בולט בנקודות הנעיצה של רצועות וגידים לתוך העצם, ותורם לבניית מכלולים אלה בעת תהליך גדילת השלד.

ל-PTHrP יש תפקידים אנאבוליים חשובים בעצם, ומתוך לימוד מעורבותו של חלבון זה בביולוגיה התקינה של רקמות סחוס ועצם, אין הדבר מפתיע ששינויים בתפקוד PTHrP קשורים למפגעי שלד. הדוגמה הבולטת ביותר היא HHM בו PTHrP בצירקולציה המגיב עם הקולטן PTHR1 בשלד גורם לתהליך ספיגת עצם ושחרור סידן להופעת היפרקלצמיה. מוטציות loss-of-function בגן של PTHR1 גורמות ל-Blomstrand's chondrodysplasia הגורמת למות העובר ברחם (Nissenson ב-Endocrinology משנת 1998). בנוסף, מוטציות loss-of-function בגן של PTHLH גורמות לתסמונת הכוללת קומה נמוכה, עצמות מטקרפליות קצרות בידים, גרורות סרטניות, וקשיי לימודים. נראה שהפעילות האנאבּולית של PTHrP בעצם עשויה להיות שימושית בטיפול באוסטאופורוזיס (Horwitz וחב' ב-J Clin Endocrinol Metabol משנת 2010).

השפעול של PPR שהוא הקולטן המשותף של PTH/PTHrP, מגרה 2 חלבוני G הטרודימריים, Gs ו-Gq. אנליזה גנטית מראה שהשפעול של Gs מתווך בפעילות PTHrP לשמור על כונדרוציטים שיתחלקו וישגשגו, ואילו השפעול של Gq נוגד את הפעילות האחרונה. כאשר משופעל Gs, יש פעילות במסלול התוך-תאי בו חל דיכוי סינתזה של p57 שהוא מעכב של cyclin-CDK, וכתוצאה מכך יש שגשוג של כונדרוציטים.

לעומת זאת, ל-PTHrP יש גם פעילות להאטה של תהליכי התמיינות בכונדרוציטים, מה שמתבצע על ידי זרחון של גורם השעתוק SOX9, וכן על ידי דיכוי הסינתזה של mRNA המקודד לגורם השעתוק Runx2. מסלולים אלה וודאי אחרים שעדיין לא התגלו, חוברים על מנת לווסת את קצב ההתמיינות של כונדרוציטים בפלטת הגדילה בתגובה ל-PTHrP.

לקצה ה-N טרמינאלי של PTHrP יש הומולוגיה עם קצה זה ב-PTH, לכן שני חלבונים אלה יכולים להיקשר לאותו קולטן, הידוע כ-type 1 PTH receptorאו PTHR1. אך בניגוד ל-PTH המסוגל להיקשר רק לסוג קולטנים יחיד, PTHrP מסוגל להיקשר למגוון גדול יותר של קולטים. אכן, PTHrP יכול לגרות את רוב הפעילויות שמשרה PTH, כולל הגברת ספיגת עצם, והגברת הספיגה מחדש בקצה הרחיקני (דיסטאלי) של אבוביות הכליה, ועיכוב הטרנספורט של פוספאט באבוביות הקריבניות (פרוקסימאליות). יחד עם זאת, הסבירות של PTHrP לגרות יצירת קלציטריול (1,25dihydroxy vitamin D) נמוכה יותר מזו של PTH. לכן, PTHrP אינו מגביר ספיגת סידן במעי.

תפקיד PTHrP בהתפתחות בלוטות החלב בשד:

מחקרים על PTHrP ועל הקולטן PTHR1 בעכברי knock-out, העלו שאיתות על ידי הורמון זה נחוץ ליצירת ה-mammary glands העובריים (Hens וחב' ב-Breast Cancer Res משנת 2007). עוברי אדם הלוקים ב-Blomstrad's chondrodysplasia חסרים אף הם רקמת שד, מה שמוכיח שאיתות של PTHrP חיוני להתפתחות השד גם באדם (Wysolmerski וחב' ב-J Clin Endocrinol Metabol משנת 2001). בלוטות השד נוצרות בעובר בתהליך של שקיעה פנימה (invagination) של תאים אפידרמליים אל תוך סטרומה שומנית מתפתחת, באופן היוצר מעין צינורית שמתפתחת בהמשך למערכת ה-mammary ducts (עפ"י Robinson ב-Nat Rev Genet משנת 2007).

בעוברים של עכבר ואדם, תאי אפיתל בנבט של רקמת השד מייצרים PTHrP, אשר מגיב עם קולטני PTHR1 המופיעים על פני התאים המזנכימאלים המקיפים. אינטראקציה זו חיונית להתמיינות תקינה של התאים המזנכימאלים, אשר בתגובה מעודדים את הצמיחה של הצינורות (ducts) האפיתליאלים. איבוד האיתות של PTHrP מונע את ה"דו-שיח" החיוני בין תאי האפיתל והתאים המזנכימאלים, מה שעוצר את התפתחות רקמת השד כבר בשלב הנבט. PTHrPגורם למודולציה של איתותי Wnt ו-BMP, כמו גם לביטוי במזנכימה של מספר גורמי שעתוק, כולל הקולטן לאנדרוגנים, Max2 ו-Lef1, כאשר כל אלה תורמים לצמיחה של ציורות עובריים ברקמת השד (Hens וחב' ב-Dev Dyn משנת 2009).

לאחר הלידה, ממשיך PTHrP להיות מבוטא ברמה נמוכה בתאים מיו-אפיתליאלים, כאשר הקולטן PTHR1 מבוטא בתוך הסטרומה מסביב לצינוריות השד. בתקופה הבוגרת, PTHrP מבוטא באופן ניכר על ידי תאי אפיתל בשד בתקופת ההנקה, וכמויות ניכרות שלו מופרשות לחלב (Budayr וחב' ב-Proc Natl Acad Sci USA משנת 1989), אך תפקידו בחלב אינו ברור. יחד עם זאת, PTHrP מופרש גם מרקמת השד לצירקולציה, והוא משתתף בוויסות הסיסטמי של סידן והמטבוליזם של העצם בעת ההנקה. רקמת העצם של האם משמשת כמקור סידן ליצירת חלב, וידוע שבנשים מניקות יש איבוד מהיר של רקמת עצם.

רמות מוגברות של PTHrP בצירקולציה, תואמות איבוד רקמת עצם באדם, כאשר CaSR או calcium-sensing receptor, שהוא קולטן הקשור ל-G-protein type C, ה"חש" בריכוזים חוץ-תאיים של יון הסידן, ומדכא את הפרשת PTHrP מתאי השד (VanHouten וחב' ב-J Clin Invest משנת 2004). תהליך זה מבטא באופן קלאסי לולאת משוב שלילי אנדוקרינית, בה PTHrP מגייס סידן מעצם השלד, כאשר בתגובה מעוכבת הפרשת PTHrP מרקמת השד. מהבנת תפקידו של PTHrP בהגברת ספיגת העצם בעת הנקה, אין זה מפתיע ש-PTHrP תורם גם להמסת רקמת עצם (osteolysis) בתהליך יצירת גרורות לעצם. אי לכך, תאי סרטן שד גרורתיים לעצם מייצרים יותר PTHrP מאשר תאי הגידול הראשוני (Akhtari וחב' ב-Cancer Biol The משנת 2008).

נמצא ש-TGF-β המופרש באזורי ספיגת עצם, מגביר את יצירת PTHrP על ידי מסלול איתותים אליו קשור גורם השעתוק Gli2 (עפ"י Johnson וחב' ב-Cancer Res משנת 2011). בתגובה, מגביר PTHrP את קישורו של גורם השעתוק NF-κB לקולטנו, ומפחית את היצור של osteoprotegerin ובכך מגדיל את כמות התאים האוסטאוקלסטים ואת פעילותם האוסטאוליטית. בנוסף, בניגוד למתרחש בתאי שד תקינים, איתות של CaSR בתאי סרטן שד מגרה בהם את יצירת PTHrP. במחקרם של Henderson וחב' ב-Cancer Res משנת 2006, נחקרו 526 מקרים של סרטן שד בהם נמצא שביטוי של PTHrP היה מנבא בלתי-תלוי למהלך קליני יותר שפיר. גם Li וחב' במחקרם בעכברים שהופיע ב- J Clin Invest משנת 2011, הראו שפגיעה בגן ל-PTHLH האריכה באופן דרמטי את הלטנטיות של סרטן השד והאטה את התפתחות השאת.

תפקיד PTHrP בטרנספורט של סידן בשלייה:

סידן מועבר דרך השלייה מהאם לעובר (Kovacs ב-J Clin Endocrinol Metabol משנת 2001), כאשר השלייה מייצרת PTHrP שמסייע לשמור על רמת סידן תקינה בעובר. הראשונים שהדגימו את פעילות PTHrP במעבר סידן דרך דופן השלייה היו Rodda וחב' ב-J Endocrinol משנת 1998. בשנת 1990 פרסמו Care וחב' ב-Exp Physiol, ולאחר מכן Wu וחב' ב-J Biol Chem משנת 1996, שדווקא הפפטידים "הפנימיים" ב-PTHrP, דהיינו 67-86 ו-38-94 הם הפפטידים הפעילים ביותר בתחום זה, כאשר לחומצות האמינו בקצה ה-N טרמינאלי של PTHrP אין פעילות דומה. נתון זה רומזים לכך שיש בשלייה קולטנים ספציפיים ל-mid-region של PTHrP. ניסויים בעכברים של Simmonds וחב', בהם נעשתה מניפולציה גנטית אישרו שאמנם ל-PTHrP יש תפקיד בוויסות של הטרנספורט של סידן בשלייה, שחיוני לתהליך המינרליזציה של השלד בעובר (Crit Rev Eukaryot Gene Expr משנת 2012).

תפקיד PTHrP בהרפיה של שריר חלק:

דוגמה לפעילות הפאראקרינית של PTHrP ניתן למצוא בהשפעתו על תאי שריר חלק בדופן כלי-דם. PTHrP מופרש משריר חלק באיברים רבים, בדרך כלל בתגובה ל-stretching המופעל על שריר זה. כבר משנות ה-20 היה ידוע שהזרקה של תמצית של יותרת בלוטת התריס גרמה בחיות להגברה בזרימת הדם ולהפחתת לחץ הדם (Charbon וחב' ב-Eur J Pharmacol משנת 1968, וכן Wang וחב' באותו כתב עת משנת 1984 ו-Mok וחב' ב-Endocr Rev משנת 1989). אך כאשר התגלה PTHrP, התברר שפעילות זו של הרפיית כלי-דם אינה תפקידו של PTH, אלא היא נובעת מהשפעה פיזיולוגית מקומית של PTHrP המשפיעה גם על שריר חלק בקיבה, במעי, ברחם, בשלפוחית השתן וכן בדופן העורקית (עפ"י Philbrick וחב' ב-Physiol Rev משנת 1996, וכן Qian וחב' ב-Endocrinology משנת 1999, ו-Martin וחב' ב-J Endocrinol משנת 1997).

בשנת 1991 הראו Roca-Cusache וחב' ב-J Pharmacol Exp Ther, ש-PTHrP הבא לביטוי בשריר חלק פועל באופן מהיר להרחבת כלי הדם במנגנון שאינו תלוי באנדותל, כאשר מכווץ כלי דם כמו angiotensin II, משרה עלייה מהירה ביצירת PTHrP (עפ"י Pirola וחב' ב-J Biol Chem משנת 1993). נראה שדווקא ה-PTHrP של גרעין התא, חיוני במיוחד בוויסות השגשוג של תאי שריר חלק בדופן כלי הדם. ל-PTHrP עלולה להיות גם השפעה שלילית, ונמצא שלאחר פרוצדורה אנגיופלסטית של פתיחת כלי דם עם בלון, יש הגברה ביצירת PTHrP, מה שעלול להגביר שגשוג תאי שריר חלק, מה שיכול לעבות את שכבת ה-neointima (עפ"י Fiaschi-Taesch וחב' ב-Circulation משנת 2004, ו-Sicari וחב' ב-J Endocrinology משנת 2012).

תפקיד PTHrP בבלוטת הלבלב:

בפנקריאס, תאי האיים נמצאו מייצרים PTHrP וכן נושאים את הקולטנים ל-PTH ול-PTHrP, כאשר השפעת PTHrP היא בהגברה משמעותית ברמת סידן בתוך תאי β (עפ"י Vascavada וחב' ב-J Biol Chem משנת 1996) ובשפעול של האנזים phospholipase C (עפ"י Vasvada וחב' ב-Diabetes משנת 2007). מחקרם של Drucker וחב' ב-Mol Endocrinol משנת 2011, הראה שכל ארבעת הסוגים של תאי בלוטת הלבלב, α, β, δ ו-pancreatic polypeptide cells, מייצרים PTHrP. יצירת-יתר של PTHrP כמו גם החדרה של הפפטיד ה-N טרמינאלי 1-36 של חלבון זה לעכברים, מגבירה את יצירת תאי β (עפ"י Gutalu וחב' ב-Diabetes משנת 2010) ומפחית תהליכי אפופטוזיס של תאים אלה, מה שגורם להיפוגליקמיה המושרית על ידי יצירת עודף של אינסולין (Cebrian וחב' ב-Diabetes משנת 2002). ניסויים עדכניים בעכברים, הראו שהזרקות תת-עוריות יומיות של PTHrP 1-36, מגבירות את שגשוגם של תאי β, משפרות את ה-glucose tolerance, ויכולות להילקח בחשבון כטיפול פוטנציאלי בסוכרת (Williams וחב' ב-Diabetologia משנת 2011).

החלבון PTHrP והשן:

שיניים מתפתחות מוקפות על ידי עצם והן חייבות לפרוץ דרך הכיסוי של הקריפטה הדנטאלית כדי להופיע בחלל הפה. בקיעת שיניים (tooth eruption) דורשת קואורדינציה מרחבית של עצמות הלסת, כאשר אוסטאוקלסטים חייבים לספוג את רקמת העצם המכסה את כתר השן על מנת לאפשר לה לבקוע ולהופיע, ואילו אוסטאובלסטים אמורים ליצור עצם בבסיס השן, כדי לאפשר לה להידחף אל מחוץ לקריפטה. PTHrP מיוצר באופן נורמאלי על ידי תאי ה-stellate reticulum שהם מארג של תאים אפיתליאלים במרכז ה-enamel האפיתליאלי (Beck וחב' ב-Cell Tissue Res משנת 1995, וכן Ouyang וחב' ב-J Bone Miner Res משנת 2000 ו-Tenorio ו-Hughes ב-Arch Oral Biol משנת 1996).

בשנת 1998 פרסמו Philbrick וחב' ב-Proc Natl Acad Sci USA שעל ידי שימוש ב-cytokeratin שהוא טרנסגן של K14-PTHrP, ניתן היה להראות שהחלפת PTHrP באפיתליום של ה-enamel, החזירה לתקינות את פעולת בקיעת השיניים. כיוון שאוסטאוקלסטים אינם מכילים קולטנים מסוג PPR, הממצא הזה תומך בתפקיד ההתפתחותי של PTHrP בהשפעה על אוסטאוקלסטים לפלס דרך לבקיעת השן. תפקידו של PTHrP הוא לאותת לתאי הזקיק הדנטאלי לעודד את יצירת האוסטאוקלסטים מעל הקריפטה. בהיעדר PTHrP לא נוצרים אוסטאוקלסטים אלה, ולא מתרחשת בקיעת השיניים הצעירות.
מגבלות הבדיקה:

אין לבצע בדיקה זו כדי לשלול ממאירות או על מנת לבחון חולי סרטן לתרחיש של היפר-קלצמיה של ממאירות. PTHrP יכול להיות מוגבר בנשים הרות או מניקות כמו גם ביילודים. תרחישים לא ממאירים שתוארו בהקשר של רמות מוגברות של PTHrP בפלזמה, כוללים systemic lupus erythematosus, לימפאדנופתיה הקשורה ל-HIV, מצב של lymphedema של החזה, וכן במקרה שלך גידולים שפירים של השחלות, הכליות, ושל המערכת הנוירואנדוקרינית (Burtis ב-Clin Chem משנת 1992).

בגלל המוּרכּבוּת של האיזופורמים של PTHrP, ההבדלים בשיטות המדידה השונות של PTHrP והמחסור בסטנדרט כיול אחיד, קיים קושי בהשוואה של רמות הורמון זה או של האיזופורמים שלו בתרחישים שונים. תערובת של האיזופורמים יכולה לפגוע בלינאריות של תוצאות הבדיקה בדגימות פלזמה של מטופלים, ולמנוע קביעה מדויקת של ריכוזי PTHrP (עפ"י Wu וחב' ב-Mayo Clin Proc משנת 1997).

המשמעות של תוצאות תקינות ובלתי-תקינות של PTHrP:

ריכוזים נמוכים ביותר שלPTHrP עד כדי כאלה שלא ניתן לגלותם הן תוצאות נורמאליות. בנשים מיניקות ניתן לגלות את PTHrP. רמות מוגברות של PTHrP עם רמות מוגברות של סידן בדם, נגרמות בדרך כלל על ידי תהליכים סרטניים. PTHrP יכול להיווצר על ידי סוגי סרטן שונים, כולל סרטן ריאות, שד, ראש וצוואר, מערכת העיכול, שלפוחית השתן והשחלות כמו גם בלויקמיה ובלימפומה. בתלות באוכלוסייה הנבדקת, עד 80% מהנבדקים עם שאתות ממאירות והיפרקלצמיה, יסבלו מ-HHM או humoral hypercalcemia of malignancy. רמה גבוהה של PTHrP היא הסיבה להיפרקלצמיה בערך ב-2/3של חולי הסרטן. בנבדקים אלה בנוסף להיפרקלצמיה ניתן יהיה לגלות גם היפו-פוספטמיה, hypercalciuria, רמות מוגברות של פוספטאזה בסיסית בנסיוב ו-hyperphosphaturia. רמות מוגברות של PTHrP מוצאים גם בנבדקים עם מחלת כליות.

במטופלים עם ממצאים ביוכימיים המרמזים, אם כי לא מוכיחים מצב של היפר-פאראתירואידיזם ראשוני (דהיינו היפרקלצמיה, אך רמות נורמאליות או קרובות לנורמה של פוספאט ושל PTH, כאשר רמת האחרון היא בתחום הנורמה (אם כי מעל 30 פיקוגרם/מ"ל), ניתן לקחת בחשבון אפשרות של HHM, בעיקר אם המטופל קשיש, ובעל היסטוריה של ממאירות, או של גורמי סיכון לממאירות. רמות מוגברות של PTHrP במטופל האחרון, מצביעים על HHM כסיבה להיפרקלצמיה.

== הוראות לביצוע הבדיקה ==

ברוב ערכות הבדיקה יש העדפה לנטילת דם במבחנות EDTA (פקק סגלגל) לאחר צום של 8 שעות. הסרכוז נעשה בצנטריפוגה מקוררת, ויש לפסול דגימות המוליטיות באופן בולט. הפלזמה המופרדת יציבה לצורך הבדיקה עד 7 ימים בטמפרטורת החדר, עד 30 יום בקירור, ועד שנה בהקפאה. יש מעבדות המבצעות את הבדיקה בפלזמה שנלקחה במבחנת הפארין (פקק ירוק), אלא שאז יציבות הדגימה שונה: 7 ימים בטמפרטורת החדר או בקירור, וחודש בהקפאה. רצוי לכלול במבחנת נטילת הדם מעכב פרוטאזות דוגמת aprotinin או leupeptin, ויש המשתמשים במעכב הפרוטאזות PPACK או Phe-Pro-Arg-chlomethylketone.

שיטות המדידה: ניתן למדוד רמת PTHrP או על ידי שילוב של שיטת HPLC ו- Tandem Mass Spectrometry, או בשיטת ICMA או immunochemiluminometric assay, תוך שימוש ב-2 נוגדנים שנוקו על ידי כרומטוגרפיית-זיקה מנסיוב של עז מחוסנת כנגד המקטע 1-86 של PTHrP. אחד מ-2 הנוגדנים מסומן עם acridinium ester כנוגדן גלאי (tracer), כאשר הנוגדן השני מקובע על פני כדורונים זעירים (beads). כאשר הפלזמה מכילה PTHrP נוגדן ה-tracer נקשר אל ה-beads וניתן לגילוי וכימות (עפ"י Wu וחב' ב-Ann Clin Lab Sci משנת 1997).

(להכניס כאן את התרשים מתחתיו המקרא הוא.... מסלול זרימה של בדיקת מעבדה לרמת PTHrP)

Prostate cancer antigen 3

2015-06-11T05:36:04Z

בן עמי סלע: יצירת דף עם התוכן "==Prostate cancer antigen 3 או PCA3 == כינויים נוספים: DD3 ,UPM3. מעבדה: כימיה בשתן. תחום: אבחון סרטן הערמוני..."

==Prostate cancer antigen 3 או PCA3 ==

כינויים נוספים: DD3 ,UPM3.
מעבדה: כימיה בשתן.
תחום: אבחון סרטן הערמונית.
טווח ערכים תקין: PCA3 score הנמוך מ-25 מתאים לממצא שלילי בערמונית; טווח של 25-35 מצביע על חשד לסרטן בבלוטה; תוצאה שמעל 35 מגבירה חשד זה.
יוצר הערך: פרופ' בן-עמי סלע.

== בסיס פיזיולוגי ==

על פי ה-ACS, סרטן הערמונית הוא סוג הסרטן השני בשכיחותו בין גברים בארה"ב (לאחר סרטן העור), וסוג הסרטן הקטלני השני במעלה בין גברים אמריקנים (לאחר סרטן ריאות). אחד מכל שישה גברים אמריקנים יאובחן עם סרטן הערמונית במהלך חייו, ואחד מכל 36 גברים שם ימות במחלה זו. הגילוי של סרטן הערמונית עלה ב-2 העשורים האחרונים ברחבי העולם, על ידי למעלה מ-1.7 מיליון ביופסיות מדי שנה, כאשר רוב הביופסיות הללו התבקשו כתוצאה מקבלת תוצאה מוגברת של PSA בנסיוב. על פי נתוני ה-CDC בשנת 2011 אובחנו 229,292 גברים עם סרטן הערמונית בארה"ב, ובאותה שנה מתו שם במחלה 29,970 מאובחנים עם סרטן זה. נתוני התמותה בארה"ב נמצאים בקו ירידה, בשל הגילוי והטיפול המושכל, אם כי סמן ספציפי לסרטן מוקדם של הערמונית, עדיין אינו בנמצא, ואכן סמן כזה היה מאפשר הורדה משמעותית במספר המאובחנים בשלב מוקדם של המחלה כאשר הטיפולים יעילים יותר.

הסמן PCA3:

מועמד אחד להפוך לסמן יעיל בשגרת האבחון של סרטן זה, הוא PCA3 או הגן ל-prostate cancer antigen 3, שהוא מקטע של mRNA שאינו מקודד לחלבון כלשהו, גן הממוקם בכרומוזום 9 במיקום 9q21-22, המבוטא ביתר בלמעלה מ-95% ממקרי סרטן הערמונית שנבדקו על ידי Marion Bussemakers מהמכון האורולוגי ב-Johns Hopkins וחב' ב-Cancer Res משנת 1999. בהמשך שופר המבדק על ידי הכנסת הערכה Progenza, והיא כרגע הערכה השלטת בתחום זה (Durand וחב' ב-Expert Rev Mol Diagn משנת 2011, ו-Makarov וחב' ב-Ann Rev Med משנת 2009). הביטוי של PCA3 גדול פי 60-100 מזה ברקמות שפירות של בלוטת הערמונית (עפ"י Hessels וחב' ב-Eur Urol משנת 2003), מה שמקנה לגן זה דרגת ספציפיות שאינה נחלת הסמן PSA שהוא prostate-specific אך לא cancer-specific. ברמת התא, קביעת PCA3 יכולה להבדיל בין תאים ממאירים לתאים שפירים של הבלוטה עם רמת דיוק המתקרבת ל-100% (עפ"י Schalken וחב' ב-Urology משנת 2003). יתרה מכך, עד כה לא נמצאו עותקים של PCA3 במגוון רחב של רקמות שפירות וממאירות שמחוץ לבלוטת הערמונית, מה שמצביע על PCA3 כגן הסרטני הספציפי ביותר לבלוטה זו (ע"פ Neves וחב' ב-Clin Biochem משנת 2008, ו-Loeb ב-Eur Urol משנת 2008). ביטוי יתר זה של PCA3 בתאים סרטניים, מאפשר שימוש אבחוני ברמות גן זה ברקמות או בנוזלים המכילים חומר תאי של הערמונית (Fradet וחב' ב-Urology משנת 2004). במחקרים קליניים עדכניים היחס PCA3-mRNA/PSA-mRNA, נמצא באופן עקבי עדיף על קביעת רמות PSA לאבחון סרטן הערמונית (עפ"י Deras וחב' ב-J Urol משנת 2008, וכן Marks וחב' ב-Urology משנת 2007 ו- Tinzl וחב' ב-Eur Urol משנת 2004).

במחקרים קליניים עדכניים היחס PCA3-mRNA/PSA-mRNA, נמצא באופן עקבי עדיף על קביעת רמות PSA לאבחון סרטן הערמונית (עפ"י Deras וחב' ב-J Urol משנת 2008, וכן Marks וחב' ב-Urology משנת 2007). בשני המחקרים האחרונים נמצא ש-PCA3 יעיל בניבוי נוכחות של ממצא סרטני גברים העוברים ביופסיה חוזרת של הבלוטה. לנתון זה משמעות קלינית במקרה של נבדקים בהם בדיקה רקטאלית דיגיטאלית (להלן DRE) כמו גם רמת PSA מחשידים לסרטן בבלוטה, אם כי הביופסיה הראשונה התקבלה שלילית. תסריט כזה מתרחש בערך ב-60% מהמקרים, כאשר בביופסיה חוזרת ב20-40% מהמקרים תוצאת הביופסיה החוזרת מראה נתונים מחשידים לתהליך סרטני. אכן ה-FDA נתן אישורו ב-15 בפברואר 2012 לבדיקת PCA3 בערכת Progensa בגברים בהם נשקלת אפשרות של ביופסיה חוזרת, כאשר הביופסיה הקודמת נתקבלה שלילית. במספר מדינות באירופה ובקנדה התקבל האישור לביצוע בדיקת PCA3 כבר בשנת 2006, באופן גורף יותר מהאישור המוגבל בארה"ב. האישור התקבל על בסיס היות PCA3 מבוטא ביתר על ידי קרוב ל-100% מהדגימות של קרצינומה של הערמונית שנבדקו, כפי שהופיע ב-Nat Rev Urol משנת 2011. ה-FDA נתן אישורו למבדק PCA3 בהתבססו על מחקר אליו נרשמו 495 גברים מ-14 מרכזים רפואיים. מחקר זה מצא שלמבדק PCA3, היה ערך ניבוי שלילי (NPV) של 90%, וזאת בגברים שהומלץ להם לעבור ביופסיה חוזרת. ממצאי מחקר זה הוצגו בכינוס Genitourinary Cancer Symposium שנערך בסן פרנסיסקו בשנת 2010. מחקר נוסף שנערך על ידי אנשי Gen-Probe ואשר כלל 1,072 גברים, הראה שאלה מתוכם עם ערכי PCA3 מוגברים, היו בסיכון מוגבר לקבלת תוצאה חיובית בביופסיה חוזרת.

(להכניס פה את הטבלה שמתחתיה המקרא ... סרטן הערמונית עם תוצאות PSA תקינות על ידי Deras וחב' ב- J Urol משנת 2008).
במחקר של Marks השתתפו 233 גברים שבאופן עקבי תוצאות PSA שלהם היו גבוהים מ-2.5 ננוגרם/מ"ל, ואשר עברו לפחות ביופסיה אחת בעבר עם תוצאה שלילית. בגברים אלה נאספו דגימות שתן לאחר שעברו RDE, וב-226 דגימות שתן (97%) התקבלו תוצאות CA3P מוגברות או גבוליות שהצדיקו ביצוע ביופסיה חוזרת. ביופסיה זו גילתה בין המשתתפים 60 גברים (27%) עם סרטן הערמונית. כדי לבחון את היכולת של מבדק PCA3 לנבא את תוצאות מבחן הביופסיה החוזר, התבצעה אנליזת עקומת ROC, ונמצא שהשטח שמתחת לעקומה (ROC-AUC) במקרה של PCA3 נקבע כ-0.678 לעומת 0.524 שנקבע למבדק PSA עם מובהקות של p<0.01.

הערך הדיאגנוסטי של PCA3 מבוסס על רצף (continuum) של תוצאות PCA3, כאשר תוצאה הנמוכה מ-20 מצביעות על סבירות נמוכות של סרטן הערמונית, ואילו תוצאות גבוהות מעל 50 משקפות סבירות גבוהה של תהליך סרטני בבלוטה. הנתונים ממחקר זה של Marks וחב' מצביעים על ערך PCA3 של 35 כערך הסף שהיה הערך האידיאלי איתו מתקבלת ספציפיות של 72%, ונשמרת רגישות גבוהה יחסית של 58%. יחד עם זאת מציינים בעלי המחקר שערך סף זה אינו פסקני באופן מובהק, וייתכן שיש צורך בהסטתו כלפי מעלה או מטה באוכלוסיות גברים שונות. בתמונה שלמטה מיוצגות רמות PCA3 באדם שאובחן בו סרטן הבלוטה כאשר רמות PSA שלו נעו בין 1.1-3.0 ננוגרם/מ"ל.

(להכניס פה את התרשים שהמקרא שלו מתחיל במילים...כאשר ה-PCA3 score גדל....)

פרמטרים נוספים שניסו לכרוך אותם עם תוצאות של בדיקת PCA3, כגון נפח השאת הסרטנית בבלוטה, דירוג התהליך הסרטני (Gleason score), או אפשרות חריגת התהליך הסרטני לרקמות סמוכות ורחוקות, כל אלה הניבו תוצאות סותרות (van Giles וחב' ב-Prostate שמנת 2008, כמו גם Nakanishiוחב' ב-J Urol משנת 2008 ו-Whitman וחב' ב-J Urol משנת 2008). יתרונה של בדיקת PCA3 על בדיקת PSA הוא בספציפיות היותר גדולה שלה ובערכי הניבוי השלילי והחיובי הטובים יותר שלה, אך יחד עם זאת רגישותה נמוכה מזו של PSA (עפ"י Vlaeminck-Guillem וחב' ב-Prog Urol משנת 2008. יתרון נוסף של בדיקת PCA3 שהיא אינה תלויה בנפח הבלוטה, כאשר בדיקת PSA כן תלויה בנפח הבלוטה (Deras וחב' ב-J Urol משנת 2008). בדיקת PCA3 אינה מושפעת מתרחישים כמו prostatitis, בניגוד ל-PSA.

(להכניס כאן את התרשים שמתחתיו המקרא ... תרשים המדגים את ההבדל בין מדידת PCA3 בשתן בהשוואה למדידת PSA בדם).

בניגוד למבדקי "הדור הראשון" להערכת הגן PCA3 בערכה שהייתה מוכרת כ-uPM3™, DiagnoCure, Quebec, Canada, שהייתה מבדק איכותי שקבע תוצאות כ"שלילי" או "חיובי", הערכה העדכנית של "הדור השני" המוכרת כ-Gen-Probe, San Diego, Ca מספקת תוצאה כמותית מהיחס בין עותקי mRNA של PCA3ו-PSA. בכך ניתן להתייחס גם למספר תאי האפיתל של הערמונית המצויים בשתן, שכן רק תאים אלה מכילים עותקי mRNA של PSA.
שיתוף פעולה בין איגוד האורולוגים האמריקני USRF לבין חברתGen-Probe , החל בשנת 2004 במטרה להערכת מבדק הגן PCA3 כסמן ספציפי לסרטן הערמונית בשלביו המוקדמים. בשנת 2005 הוצגו ממצאי סקר זה ב-Gordon Conference, ופורסמו על ידי Groskopf וחב' בשנת 2006 ב-Clin Chem. מייד לאחר פרסום שיטה זו, מספר מעבדות מסחריות בארה"ב החלו משווקות גרסאות שונות של ערכת הבדיקה, שזכו לברכתן של חברות לביטוח חיים, למרות שה-FDA לא נתן בשלב זה את אישורו למבדק זה. המעבדה של Bostwick בריצ'מונד, וירג'יניה, ערכה 200 בדיקות במטופלים מדרום קליפורניה בשנים 2006-7, כאשר דגימות השתן נאספו לאחר פרוצדורה רקטאלית-דיגיטאלית.

הניסוי של Deras וחב' משנת 2009, הדגים את הערך הפוטנציאלי של בדיקת הגן PCA3 ב-570 גברים שעברו ביופסיה של הבלוטה, ו-36% מתוכם התבררו כחיוביים בביופסיה. בניסוי זה נבחר ערך cutoff של 35 כיוון שערך זה נתן בניסוי את הספציפיות והרגישות הגבוהים ביותר. כאמור מדי שנה נכון היום מתבצעות בארה"ב בלבד למעלה מ-1.5 מיליון ביופסיות של הערמונית, אם כי אין רישום ותיעוד מדויקים. חלק הארי של ביופסיות אלו מתבצע כתוצאה מרמות מוגברות של PSA, אך בכל 5 ביופסיות המתבצעות, מתקבלת תוצאה שלילית ב-4 מתוכן. יחד עם זאת, בכ-25% מהגברים בהם תוצאת הביופסיה מתקבלת שלילית, יתברר בדיעבד בביופסיה חוזרת שאמנם מתחולל תהליך סרטני בבלוטה (Roehl וחב' ב-J Urol משנת 2002).

הרי הממצאים של מבחן הגן PCA3 בארבעה תרחישים שונים על פיMarks ו-Bostwick ב-Rev Urol משנת 2008 :

א. רמות מוגברות של PSA, וביופסיה המגלה היפרפלזיה שפירה (BPH) של הערמונית:

בתמונה שלמטה, מיוצגות תוצאות PSA וממצאי ביופסיה שליליים שהתקבלו בנבדק עם רקע משפחתי של סרטן הערמונית, אשר בבדיקות שגרה בגיל 38 התגלתה בדמו רמת PSA של 4.5 ננוגרם/מ"ל. נבדק זה נכנס למעקב שנמשך 12 שנה, במהלכו בוצעו לו למעלה מ-20 מדידות PSA ואחת לשנתיים בוצעה בו ביופסיה (ובסך הכול 6 ביופסיות).

במהלך תקופת המעקב חלה עליה מתמשכת ברמת PSA מערך התחלתי של 4.5 עד ל-12.1 ננוגרם/מ"ל בסוף תקופת המעקב. באותה תקופה חלה הגדלה של נפח הבלוטה מ-43 סמ"ק בגיל 53 שנה, עד ל-58 סמ"ק בגיל 65 שנה, ובמשך כל תקופת המעקב התקבלו תוצאות לא סדירות של רמת PSA מותאמת לגיל, ערכי PSA density, וערכי PSA velocity, אך ערכי PSA חופשי היו בתחום הנורמה. תוצאות 6 הביופסיות שהצביעו רק על BPH, ללא כל עדות לתהליך סרטני. במהלך השנתיים האחרונות למעקב, בוצעו לנבדק זה 2 מדידות של הגן ל-PCA3, כאשר בדיקה זו הפכה לזמינה. שתי התוצאות התקבלו נמוכות (10.1 ו-5.0) בהפרש של שנה וחצי. ייתכן שאם הבדיקה האחרונה הייתה ניתנת לביצוע בראשית המעקב היו נחסכות מגבר זה רוב הביופסיות שנאלץ לעבור.

(להכניס כאן את התרשים שהמקרא מתחתיו מתחיל ב...שגשוג טב של הערמונית...)

ב. מקרים בהם רמת PSA תקינה, והביופסיה מגלה סרטן בבלוטה:

ב-15% מהגברים הנבדקים בהם אובחן בדיעבד תהליך סרטני בבלוטה, לא התגלו במהלך 7 שנות מעקב תוצאות של PSA סדרתיות המוגברות מעל 4.0 ננוגרם/מ"ל (Thompson וחב' ב-JANA משנת 2005). רמות PSA בנסיוב אינן מבחן סריקה מושלם לאבחון סרטן הבלוטה, כאשר תוצאות PSA עלולות להיות חיוביות-כזובות או שליליות כזובות. אמנם מדדי-עזר כמו density-PSA ו-velocity-PSA כמו גם % PSA חופשי, עשויים לסייע במקרים אחדים, אך תוצאות "מטעות" של רמת PSA עדיין רווחות.

בתמונה שלמטה מיוצגות רמות PSA באדם שנמצא בו סרטן הבלוטה כאשר רמות PSA שלו נעו בין 1.1-3.0 ננוגרם/מ"ל. תוצאה חריגה של PSA-veloity הגבירה את החשד, וכיוון שהנבדק סרב להמתין למבדק חוזר של PSA לאחר תקופת זמן, הוחלט על מדידת PCA3 שנתנה תוצאה של 71.7, הנחשבת גבוהה באופן משמעותי. ואכן ביופסיה בוצעה והדגימה אדנוקרצינומה עם דרוג Gleason של 3+4=7. בוצע ניתוח כריתה מלאה של הבלוטה, והממצאים הפתולוגיים הדגימו שאת אקסטנסיבית של קרצינומה עם דרוג Gleason של 7 בשתי האונות, כאשר שולי הבלוטה וקשרי הלימפה נמצאו נקיים. בתמונה שלמטה מיוצגות רמות PCA3 באדם שאובחן בו סרטן הבלוטה כאשר רמות PSA שלו נעו בין 1.1-3.0 ננוגרם/מ"ל.

(להכניס פה את התרשים מתחתיו מופיע ..סרטן הערמונית עם תוצאות PSA תקינות...)

חלק B של התמונה משקף מקרה של גבר בן 63 שנה שרמת PSA בדמו נקבעה כ-1.0 ננוגרם/מ"ל. במשפחתו של גבר זה נמצאה המוטציה בגן BRCA2, מה שמגביר הן את הסיכון של סרטן הערמונית (Struewing וחב' ב-N Eng J Med משנת 1997) וכן גוברת האגרסיביות של התהליך הסרטני (Tryggvadottir וחב' ב-J Natl Cancer Inst משנת 2007). לכן הוחלט על ביצוע ביופסיה, זאת למרות ערך PSA תקין ו-DRE שפורש כתקין. בדיקת PCA3 שבוצעה לאחר DRE הניבה תוצאה גבוהה של 123. הביופסיה שאת אקסטנסיבית של אדנוקרצינומה עם דרוג Gleason של 7, ובוצעה כריתה מלאה של הבלוטה.

על פי Deras ב-J Urol משנת 2008 במדגם של 570 גברים, התוצאה של PCA3 בניגוד לזו של PSA, אינה גדלה במתאם עם נפח הבלוטה. גברים עם נפח בלוטה גדול מ-50 סמ"ק, היו בעלי ערכי PCA3 זהים לאלה שהתקבלו בגברים עם נפח בלוטה נמוך מ-30 סמ"ק. אי לכך, הנתון שעלול להשפיע על תוצאת PSA, אינו רלוונטי לגבי PCA3. לכן, רמת PSA בתרחיש של BPH יכולה להיות גבוהה באופן ניכר, ואף יותר מאשר במקרים של סרטן הבלוטה (Magklaraוחב' ב-Urology משנת 2000). היפוכו של גבר מתרחש עם מדד PCA3: תאי סרטן הערמונית מבטאים PCA3 פי-60-100 מאשר תאי ערמונית בריאים, לכן לא יתקבלו בבדיקת PCA3 תוצאות חיוביות כזובות של המדד האחרון.

ג. מקרים של PSA מוגברות, וצריבה או כאבים במתן שתן (prostatitis):

דלקת חריפה של בלוטת הערמונית ידועה כגורמת לעלייה שרמת PSA בדם. לעומת זאת, פחות דרמטית היא ההשפעה של דלקת מתונה וקצרה בבלוטה, על רמת PSA) על פי Kawakami וחב' ב-Urology משנת 2004). קיים קושי אובייקטיבי להעריך את דרגת התהליך הדלקתי בערמונית, כתרחיש חריף, תת-חריף או כרוני, ובהתאם קשה להעריך את השפעת דרגות הדלקת השונות על רמת PSA בדם. בתמונה שלמטה יש תיאור של גבר בן 55 שנה הנתון במעקב משך שנים עם תסמינים מתונים של התרוקנות שאינם מחייבים טיפול רפואי. בשלב מסוים חזר האיש עם תלונות על צריבה וכאבים בעת מתן שתן במהלך מספר שבועות. ב-DRE התגלתה בלוטה מעט מוגדלת, חלקה, סימטרית ובלתי-רגישה. בדיקת שתן כללית (urinalysis) הראתה שתן נטול-תאים, ובדיקות של תרבית שתן התקבלו שליליות. רמת PSA בשתן שלו עלתה ל-9.1 ננוגרם/מ"ל, ואילו רמת PCA3 שהתקבלה-22.5 הייתה נמוכה מרמת הסף המקובלת של 35.0 לרגישות וספציפיות אופטימאליים, ובדיקת PCA3 חוזרת נתנה תוצאה נמוכה אף יותר של 6.2. ההערכה הייתה שמדובר ב-prostatitis והאי שטופל משל 3 שבועות באנטיביוטיקה מסוג quinolone שהביאה להתפוגגות התרחיש ולחזרת ערכי PSA לתחום הנורמה. ביופסיה לא בוצעה.

(להכניס כאן את התרשים בו מופיע prostatits עם ערכי PSA מוגברים)

יחד עם טראומה ישירה לבלוטה כגון ביופסיה או בדיקה ציסטוסקופית, prostatitis היא הסיבה השכיחה ביותר לעליה בולטת ומהירה ברמת PSA. אך דלקת הבלוטה לדרגותיה, אינה אמורה להשפיע על רמת PCA3, ולכן יתרונה כמדד ספציפי יותר לממאירות בבלוטות, שאינו מושפע משני תרחישים לא-סרטניים, BPH ו-prostatitis.

ד. מקרים של מחלה סרטנית מיקרו-ממוקדת (micro-focal) עם מעקב פעיל:

בגברים רבים מתגלה מחלה סרטנית המתבטאת במוקדים זעירים בבלוטת הערמונית, מצב שאינו מחייב טיפול מיידי, וגברים אלה מיועדים למעקב צמוד (active surveillance) עפ"י Villers וחב' ב-Cancer משנת 1992, ו-Epstein וחב' ב-JAMA משנת 1994. ההמלצות בדבר בחירת של מטופלים אלה ועקרונות המעקב אחריהם הוצעו על ידי Carter וחב' משנת 2007 ב-J urol, על ידי Kattan וחב' ב-Cancer משנת 2008, ועל ידי Klotz ב-Urol Oncol משנת 2006. ייאמר יחד עם זאת, שדאגתם של מטופלים אלה בהקשר של אי הוודאות משמעותית ביותר מבחינת איכות החיים הנתונים למעקב פעיל כזה (Latini וחב' ב-J Urol משנת 2007). זאת ועוד, סקירה ספרותית של Harnden וחב' ב-Cancer משנת 2008 שנערכה בבריטניה, מצאה שלא תמיד שמחלה מיקרו-ממוקדת היא בלתי משמעותית, כאשר חלק מהמטופלים הללו מראים תוצאות קליניות לא רצויות, למרות שהמוקדים הסרטניים שאובחנו בביופסיה הראשונה הם בנפחים זעירים. לכן כה חיוניים המאמצים לגלות סמן אמין לתהליך הסרטני בחולים אלה.

בתרשים שלמטה, מתואר הערך הפוטנציאלי של PCA3 בזיהוי תהליך סרטני "לא משמעותי" בבלוטה. מתוארים 2 מקרים של מאובחנים של נגעים זעירים סרטניים ממוקדים בדרגת התמיינות גבוהה. המטופל המתואר בחלק A הוא גבר בן 31 שנה שעבר ביופסיה בה נלקחו 12 דגימות מהבלוטה (12-core biopsy), כיוון שרמת PSA בדמו נקבעה כ-3.4 ננוגרם/מ"ל. כל דגימה (core) הכילה 1 מ"מ של אדנוקרצינומה עם מדרג Gleason של 3+3=6. מבדק PCA ראשוני נתן תוצאה של 6.6 הנחשבת נמוכה ביותר, והמטופל עבר ביופסיות מדי שנה למשך 3 שנים, ללא כל רמז להתקדמות המחלה. בבדיקה העדכנית ביותר שלו רמת PCA3 הייתה 2.5 ורמת PSA נקבעה כ-0.8 ננוגרם/מ"ל.

המקרה המופיע בחלק B של התרשים, מתייחס לגבר בן 64 שנה עם נגע סרטני microfocal הדומה לזה שאובחן במקרה המופיע בחלק A. רמת PSA בדמו הייתה 5.2 ננוגרם/מ"ל, וה-PCA3 שלו נקבע כ-27.2. יועץ למטופל להיכנס למשטר של מעקב פעיל, אך החשש מפני התהליך הסרטני הניע את המטופל לדרוש כריתה מלאה של בלוטת הערמונית. הבלוטה שהורחקה שקלה 60 גרם, והכיל מספר מוקדים זעירים של אדנוקרצינומה עם מדרג Gleason של 3+3=6, שנפחם במקובץ לא עלה על 1% מנפח הבלוטה כולה, מה שלא היה אמור להיות ממצא מאיים בהתחשב בתוחלת החיים המשוערת שלו.

(להכניס כאן את התרשים שמתחתיו מופיע .. מעקב אחר מקרה של מטופל עם ממצא סרטני מיקרו-פוקאלי בבלוטת הערמונית).

המקרים האחרונים מספקים חיזוק ואישור למחקרם של Nakanishi וחב' ב-J Urol משנת 2008, אשר בחן 96 גברים שעמדו לפני ניתוח הרחקת הערמונית, שהתבצעו אצלם מדידות של PCA3. נמצא שב-25 מתוך גברים אלה רמת PCA3 הקדם-ניתוחית הייתה גבוהה מ-25.0, וב-24 מתוכם (94%) נמצאו לאחר הניתוח גידולים סרטניים משמעותיים בבלוטה שהיו גדולים מ-0.5 סמ"ק, עם דירוג Gleason של 7 ומעלה. יתרה מזאת, תוצאות PCA3 בנבדקים עם גידול סרטני לא משמעותי, לא היו שונות מאלו שהתקבלו בנבדקים ללא סרטן בבלוטה: החוקרים הגיעו למסקנה שתוצאת PCA3 הן כלי יעיל לקבוע מי מהגברים מועמדים למעקב אקטיבי ללא צורך בניתוח.

תוצאות דומות התקבלו במחקר דומה באופיו, בו השתתפו 72 גברים שעברו ניתוח כריתת הבלוטה, במרכז הרפואי הצבאי Walter Reed. מחקר זה של Whitman וחב', שהתפרסם ב-J Urol משנת 2008, הראה שתוצאת PCA3 נמצאה במתאם טוב עם נפח הגידול הסרטני (r=0.38, ו-p<0.01), כך שמדד זה יכול לשמש מנבא בלתי-תלוי של חריגת השאת מחוץ לגבולות הקפסולה: תוצאת PCA3 שמעל 47.0 נבאה במחקר זה חריגת השאת מחוץ לקפסולה בספציפיות של 94%, עם ערך ניבוי חיובי (NPV) של 80%.

ראוי לציון שכאשר תוצאת PCA3 צורפה לרמת PSA שלפני הניתוח כמו גם לדירוג Gleason, השטח מתחת עקומת ROC, לניבוי החריגה של השאת מחוץ לגבולות הקפסולה היה 90%. מכאן שביטוי הגן PCA3 מתפקד באופן סינרגיסטי עם מידעים קליניים אחרים.

דרגת הדיוק באבחון סרטן הערמונית בביופסיה חוזרת:

Barbera וחב' פרסמו בשנת 2012 ב- Arch Ital Urol Androlאת תוצאות מחקרם ב-177 מטופלים. בין ינואר 2010 עד מרס 2012 מדגם של 177 גברים בגיל ממוצע של 64 שנה, שביופסיה מקורית בהם פורשה כשלילית, עברו ביופסיה חוזרת בשל חשד עיקש לסרטן הערמונית. האינדיקציות לביופסיה החוזרת היו: ערכי PSA שבין 4.1-10.0 ננוגרם/מ"ל עם PSA-חופשי מעל 25%. לפני ביצוע SPBx או saturation prostate biopsy, נמדדה בהם רמת PCA3. תוצאות מחקר זה היו כדלקמן: רמת PSA הממוצעת הייתה 9.5 ננוגרם/מ"ל, כאשר ב-74 מתוכם (41.8%) ערכי PSA היו מעל 10.0 ננוגרם/מ"ל, ב-99 מתוכם (56%) ערכי PSA היו בין 4.0-10.0 ננוגרם/מ"ל, וב-4 מתוכם (2.2%) ערכי PSA היו בין 2.6-4.0 ננוגרם/מ"ל. הערך הממוצע של PCA3 נקבע בכל דגימות השתן כ-52, כאשר ש-140 נבדקים (79%) ערך PCA3 היה גבוה מ-20, וב-100 מכלל הנבדקים (56%) ערכי PCA3 היו מעל 35.

סרטן ערמונית מקומי בשלב T1c נמצא ב-48 נבדקים (27.1%) כאשר ערך ממוצע של PCA3 באחרונים היה 60. ב-129 הנבדקים ללא גילוי סרטן הבלוטה ערך PCA3 היה בממוצע 34, עם מובהקות סטטיסטית של p<0.05. כאשר חוקרים אלה בחנו את הדיוק האבחוני, הרגישות, ספציפיות, ואת ערכי הניבוי החיובי (ppv) והשלילי (ppv), כאשר הם בחנו את ערך סף הנורמה העליון של PCA3 של 35 לעומת ערך סף נורמה נמוך יותר (20) התקבלו התוצאות הבאות: דיוק האבחון היה גבוה יותר עם סף הנורמה של 35 עם ממצא של (50.2% לעומת 43.5%), הרגישות הייתה גבוהה יותר עם סף הנורמה של 20 עם ממצא (91.7% לעומת 73.0%), הספציפיות הייתה גבוהה יותר עם סף הנורמה של 35 עם ממצא של (41.8% לעומת 25.6%), ה-PPV היה גבוה יותר עם סף הנורמה של 35 עם ממצא של (35% לעומת 31.5%), וה-NPV היה גבוה יותר עם ערך סף עליון של 20 עם ממצא של (89.5% לעומת 80.6%). מסקנות מחקר זה הם שניתן לצמצם את ביצוע הביופסיות החוזרות המיותרות, בעזרת מדד PCA3: אם משתמשים בערך סף של 20 ניתן היה למנוע 21.0% מהביופסיות המיותרות לעומת חיסכון של 37.8% בביופסיות מיותרות אם ערך הסף של PCA3 הוא הערך המקובל של 35. שימוש במדד PCA3 היה גורם במדגם זה להחמצת 4 מקרים של ממצא סרטני בבלוטה (8.4%) עם ערך סף של 20, או להחמצת 13 מקרים (27.0%) עם ערך סף של 35.

מחקר שנעשה על ידי Aubin וחב' והופיע ב-Urology בשנת 2010, בהשתתפות 466 גברים בני 50 שנה ומעלה עם ממצא ביופסיה שלילי קודם, אשר ב-102 מתוכם נמצאו ממצאים חיוביים בביופסיה עדכנית יותר, מצא ששימוש בערך סף-עליון של PCA3 של 25, הניב רגישות של 77.5% וספציפיות של 57.1% לממצא של סרטן הערמונית. על פי מחקר זה מבחן PCA3 אינו ראוי לשימוש בגברים עם שגשוג אצינרי זעום באופן לא שגרתי (ASAP) בביופסיה העדכנית ביותר שלהם. ממצאי הניסוי האחרון מסוכמים בטבלה הבאה:

(להכניס פה את הטבלה שהמקרא מתחתיה...הטבלה מראה את אחוזי הנבדקים עם תוצאות ביופסיה חיוביות על פי ממצאי PCA3 score שלהם).

==הוראות לביצוע הבדיקה==
נפח השתן המינימאלי הנדרש 2.5 מ"ל. אין להשתמש בשתן המאטורי. ערכה לבדיקת PCA3 תחת הכותרת Progensa PCA3 Test, משווקת על ידי Gen-Probe מקליפורניה. שרכשה בשנת 2003 את זכויות שיווק ערכה זו מחברת Diagnocure (עפ"י de la Taille ב-Expert Rev Mol Diagn משנת 2007). הערכה מבוססת על שילוב של target capture, transcription-mediated amplification או TMA ו- hybrid protection assay או HPA.

בדיקת PCA3 מחייבת איסוף של 20-30 מ"ל של השתן הראשון המופרש לאחר ביצוע בדיקה רקטאלית-דיגיטאלית. חיוני שהבדיקה תתבצע אמנם עם מנת השתן הראשונה המופרשת לאחר עיסוי משמעותי של אונות הבלוטה במסגרת הבדיקה הרקטאלית-דיגיטאלית (עפ"י Haese וחב' ב-Eur Urol משנת 2008). אם השתן נאסף ללא פרוצדורה רקטאלית דיגיטאלית המבדק מספק ממצאים תקפים בערך ב-80% מהמקרים; לעומת זאת, אם איסוף השתן נעשה לאחר בדיקה רקטאלית-דיגיטאלית יעילות המבדק עולה ל98% מהמקרים. נוטלים כ-2 מ"ל מדגימת השתן ומעבירים למבחנה המכילה בּוּפר המסה (lysis buffer) המכיל מעכבים של האנזים ribonuclease. זהו השלב הקריטי ביותר, שכן המבדק מעריך את רמת mRNA מולקולה רגישה מאוד הנהרסת תוך 20 דקות בערך ללא מעכבי ריבונוקלאזה. הדגימה נשמרת בהקפאה או בקירור עד 5 ימים.