הצגת המקור של הדף "ביוטינידאז - Biotinidase"

{{בדיקת מעבדה
|שם עברי=ביוטינידאז
|שם לועזי=Biotinidase
|קיצור=amidohydrolase biotinidase, BTD
|תמונה=
|כיתוב תמונה=
|מעבדה=[[כימיה בדם]]
|תחום=הערכת מצב של biotinidase deficiency ומפגעים במשק ביוטין
|יחידות מדידה=
|טווח ערכים תקין=3.5-13.8 יח' לליטר, או עד 10 ננומול'/דקה/מ"ל נסיוב
|יוצר הערך=[[משתמש:בן עמי סלע|פרופ' בן-עמי סלע]]
|אחראי הערך=
}}
{{הרחבה|ויטמין B}}
==בסיס פיזיולוגי==
===ביוטין===
ביוטין, הידוע גם כוויטמין H וכן כוויטמין B7, הוא ויטמין מסיס-מים חשוב, המסייע במטבוליזם של שומנים, פחמימות וחלבונים. גופנו אינו יכול לייצר ביוטין שהוא נגזר של imidazole ורוב אספקתו מגיעה מהמזון, אם כי כמות מסוימת יכולה להתקבל מחיידקי המעי. חסר ביוטין עלול להתבטא בהפרעות התנהגותיות, בחסר קואורדינציה, בקשיים בלמידה ובפרכוסים. בניגוד לרוב הוויטמינים הקשורים לאנזימים בקשר לא-קו-ולנטי, ביוטין קשור לאנזימים להם הוא משמש קו-פקטור בקשר קו-ולנטי, ואינו יכול להשתחרר בקלות מתאחיזה זו, ולשם כך הוא זקוק לפעולת האנזים ביוטינידאז. אנזים זה חיוני אם כך בשחרור ביוטין מתאחיזתו במזון, בכך שהוא מאפשר לגוף למחזר את האנזים בצורתו החופשית לפעולתו. ביוטינידאז משחרר את הוויטמין מתאחיזתו ב-4 אנזימים ממשפחת carboxylase, החיוניים במטבוליזם של 3 אבות המזון, כגון הסינתזה של חומצות שומן, קטבוליזם של חומצות אמינו וגלוקונאוגנזה. ארבעת הקרבוקסילאזות הן: pyruvate carboxylase, propionyl-CoA carboxylase, β-methylcrotonyl-CoA carboxylase ו-acetyl-CoA carboxylase. 
 
ביוטין קשור לקרבוקסילאזות דרך חומצת האמינו ליזין, ליצירת קומפלקס הידוע כ-biocytin. ביוטינידאז משחרר את מולקולת ביוטין מ-biocytin, והופכת אותו זמין לאנזימים אחרים. באותה מידה ביוטין קשור גם לפפטידים, וגם מהם הוא משתחרר בעזרת ביוטינידאז. יש ראיות לכך שביוטין חיוני גם לאיתותים תאיים ולביטוי של גנים, כאשר למעלה מ-2,000 גנים באדם תלויים בביוטין כדי לבוא לביטוי. דוגמה לתהליך חיוני כה, הוא הוויסות של גורם השעתוק NF-κB, וכן ההשפעה של ביוטין על מבנה הכרומאטין הנובעת מהשפעתו המודולאטורית של ביוטין על היסטונים, מאבני הבניין של כרומאטין.

===חסר ביוטין===
חסר ביוטין יכול להיות מאובחן בדרך כלל על ידי ברור ההיסטוריה התזונתית. אלה עם חסר ביוטין יכולים להיקלע למצב זה עם אכילת ביצים לא מבושלות המכילות כמות משמעותית של החלבון avidin הקושר ביוטין בזיקה גבוהה ביותר. כמו כן אלה המוזנים תקופה ממושכת בהזנה תוך-ורידית שאינה מכילה ביוטין. רמה נמוכה של ביוטין בנסיוב, שימושית באבחנה מבדלת של חסר ביוטין וחסר ביוטינידאז מחסר האנזים holocarboxylase synthetase, אך חשוב לדעת מה השיטה למדידת רמת ביוטין. רק שיטות המבדילות בין ביוטין חופשי לבין biocytin (ביוטין קשור) נותנות הערכה נכונה של רמות ביוטין בנסיוב. 

===האנזים ביוטינידאז===
אנזים זה הוא גליקופרוטאין מונומרי במשקל מולקולארי של 76-77 אלף דלטון, המורכב מ-543 חומצות אמינו, הכוללות רצף של 41 חומצות אמינו שמשמש כ- signal peptide. פעילות האנזים מתגלה בנסיוב, בלויקוציטים, בפיברובלסטים, ובכבד. האנזים חיוני כאמור בשחרור של הוויטמין ביוטין מקשריו השונים, ובהפיכתו לזמין כקו-פקטור החיוני בעיקר לפעולתם של 4 קרבוקסילאזות: 
# propionyl-CoA carboxylase, הנחוץ לביקוע של מספר חומצות אמינו כגון ואלין, מתיונין, איזולאוצין ותראונין, וכן לביקוע של חומצות שומן עם מספר לא-זוגי של פחמנים. חסר בפעילות אנזים זה גורם גם ליצירת חומצה פרופיונית, ושל חומצה הידרוקסי-פרופיונית (ולהופעת חמצת), ומביא ליצירת methylcitrate המפריע לפעילות התקינה של מעגל חומצת לימון, מה שמפחית את יצירת האנרגיה הנחוצה בעיקר במוח וממילא לפיגור התפתחותי.
# acetyl-CoA carboxylase, הנחוץ לביוסינתזה של חומצות שומן בכבד ובאדיפוציטים. חסר בפעילות אנזים זה מפחית את הזמינות של חומצות שומן הנחוצות לפעילות גופנית מוגברת, וממילא נגרמת חולשת שרירים והיפוטוניה.
# pyruvate carboxylase, הנחוץ ליצירת גלוקוזה, כאשר ירידה בפעילות אנזים זה עלולה לגרום להיפוגליקמיה, וכיוון שחומצת חלב אינה מנוצלת ליצירת גלוקוזה היא מצטברת וגורמת להתעייפות שרירים ולחמצת לקטית.
# β-methylcrotonyl-CoA carboxylase, הנחוץ לביקוע של חומצת האמינו לאוצין. ירידה בפעילות אנזים זה תביא ליצירה מוגברת של methylcrotonic acid שמובילה ליצירה מוגברת של hydroxyvaleric acid, המגיבה עם קרניטין, מורידה את רמת קרניטין מה שמפחית תהליך של β-אוקסידציה של חומצות שומן במיטוכונדריה ליצירת אנרגיה. פרט לכך מתיל קרוטוניל מגיב עם חומצת האמינו גליצין וגורם להפרשתה המוגברת של האחרונה בשתן. 

ביוטינידאז הוא אנזים תיולי המכיל שייר SH-, והאנזים נודד באלקטרופורזה ב-agarose לאיזור של α-1 גלובולינים. האנזים פועל באופן אופטימאלי ב-pH5-6, כאשר המצע הוא biocycin או PABA. ביוטינידאז משחק תפקיד בעיבוד וניצול ביוטין הקשור לחלבונים במזון, בהעבירו את הביוטין המשתחרר מ-biocytin לנוקלאופילים דוגמת היסטונים. כאמור אנזים זה חיוני למחזור ביוטין, והוא בעל 2 פעילויות הקשורות לוויטמין: biotinyl-hydrolase ו-biotinyl transferase.

ה-cDNA של האנזים מקודד לחלבון בעל 543 חומצות אמינו עם שלד חלבוני בעל משקל מולקולארי של 56,771 דלטון. בצורתו השלמה האנזים הוא גליקופרוטאין מונומרי בעל 6 שרשרות סוכריות עם חומצה סיאלית טרמינאלית, הקשורות לשלד הפפטידי של האנזים בקשר N-גליקוזידי. שרשרות סוכריות אלו מוסיפות למשקל המולקולארי /של ביוטינידאז עוד מסה של 18-19 מאלף דלטון, כך שהאנזים השלם הוא בעל משקל מולקולארי של 76-77 אלף דלטון. באנליזה של northern blot תוך שימוש ב-probes של 2,000bp המכילים את רצף cDNA, נמצא שהמידע של ביוטינידאז נמצא גם ברקמת הכליות, הריאות, הכבד, שריר השלד, הלב, הלבלב, המוח והשליה. אנזים ביוטינידאז תקין בפלזמה או בנסיוב, מכיל לפחות 9 איזופורמים (4 משמעותיים וחמישה משניים), שניתן לגלותם בטכנולוגיה של isoectric focusing, ב-pH של 4.15. רוב ההטרוגניות שמביאה להפרדה ב-isoelectric focusing, נובעת בהבדלים בדרגת הסיאליזציה של השרשרות הסוכריות.  

באנליזה של northern blot תוך שימוש ב-probes של 2,000bp המכילים את רצף cDNA, נמצא שהמידע של ביוטינידאז נמצא גם ברקמת הכליות, הריאות, הכבד, שריר השלד, הלב, הלבלב, המוח והשליה. אנזים ביוטינידאז תקין בפלזמה או בנסיוב, מכיל לפחות 9 איזופורמים (4 משמעותיים וחמישה משניים), שניתן לגלותם בטכנולוגיה של isoectric focusing, ב-pH של 4.15. רוב ההטרוגניות שמביאה להפרדה ב-isoelectric focusing, נובעת בהבדלים בדרגת הסיאליזציה של השרשרות הסוכריות.

הגן BTD המקודד לאנזים ממוקם על הזרוע הקצרה של כרומוזום 3 בעמדה 3p25.1. לגן BTD שאורכו לפחות kb23,000 יש 4 ארבעה exons באורך של bp79, וכן bp265 כמו גם bp150 ו-bp1,502, בהתאמה, וכן מכיל הגן 3 introns. כ-100 מוטציות בגן זה אותרו שעלולות לגרום לחסר באנזים, בחלקן מונעות את יצירת האנזים, ובחלקן מביאות ליצירת אנזים פגום. המפגע מועבר בהורשה אוטוזומאלית-רצסיבית. 

===מוטציות הקשורות בחסר ביוטינידאז===
ארבע מוטציות שכיחות גורמת לחסר כבד (profound deficiency) של פעילות האנזים (פחות מ-10% מפעילותו הרגילה). בין ילדים עם תסמונות אופייניות, 2 המוטציות השכיחות ביותר הן המוטציה הידועה כ-7base deletion/3 base insertion או c.98-104del7ins3 או G98d7i3, הגורמת בפפטיד לשינוי p.Cys33PhefsTer36 המתרחש באקסון 2, ומופיע לפחות באלל אחד, בערך ב-50% מהילדים עם חסר האנזים. המוטציה השכיחה השנייה, היא R538C היא מוטצית miseence הגורמת בפפטיד לשינוי p.Arg538Cys, המתרחשת באקסון 4, ומופיעה בערך ב-30% מהילדים עם חסר ביוטינידאז. שתי מוטציות אלה גורמות לחסר מוחלט של חלבון האנזים.

מוטציות שכיחות נוספות שמתגלות על ידי סקר יילודים, גורמות לחסר כבד של ביוטינידאז. בקבוצה זו שתי המוטציות השכיחות ביותר הן: א. מוטצית missence הידועה כ-Q456H או p.Gln456His. הגורמת לחסר כבד של פעילות האנזים, ו-D444H או p.Asp444His, מוטציה מתונה המפחיתה את פעילות האנזים בערך ב-50%. כאשר D444H נמצא בקונפיגורצית trans, עם מוטציה חמורה של BTD, מקבלים פעילות חלקית של האנזים, ואילו כאשר מוטצית D444H נמצאת בקונפיגורצית cis עם מוטצית p.Ala171Thr (כלומר מוטציה כפולה) יש חסר כבד של פעילות האנזים. אלה המוגדרים כ-compound heterozygous למוטציה Asp444His וכן למוטציה הגורמת לחסר כבד של פעילות האנזים, הם בעלי פעילות אנזים המהווה 20-25% מפעילותו הנורמאלית.

===השכיחות של חסר ביוטינידאז===

סקר עולמי של חסר ביוטינידאז שפורסם ב-1991 על ידי Wolf וחב' העלה את הנתונים הבאים: מקרה אחד ל-137,401 של חסר חמור של האנזים (profound deficiency); מקרה אחד ל-109,921 של חסר חלקי של האנזים (partial deficiency), ומקרה אחד ל-61,067 לכלל המקרים של חסר חמור או חלקי של האנזים. שכיחות הנשאים של חסר האנזים באוכלוסייה הכללית הוא בערך 1:120. כצפוי, שכיחות המפגע גדולה יותר בארצות בהם נהוגים יותר נישואי קרבה (טורקיה, סעודיה), על פי נתונים של Pomponio וחב' שהתפרסמו בשנת 2000 בשני מאמרים ב-J Inherit Metab Dis. על פי Cowan בדו"ח משנת 2012, שכיחות המפגע מוגברת באוכלוסייה היספאנית, ונמוכה מעט בקרב אפרו-אמריקנים. המדינה עם אחוז המקרים הגבוה ביותר של חסר ביוטינידאז היא ברזיל עם 1 ל-9,000 על פי Neto וחב' בדיווח משנת 2004 ב-Brazil J Med Biol Res. 

נתונים של סקר יילודים בארה"ב מהשנים 2007-8, מעלים שהשכיחות של חסר כבד של ביוטינידאז שם היא של מקרה אחד ל-80,000 לידות, ושחסר חלקי של האנזים במדינה זו מופיע באחד ל-30 עד 40 אלף לידות. רוב המקרים בארה"ב של חסר ביוטין היו בתינוקות שהוריהם ממוצא אירופי.

===תחלואה הנובעת מחסר ביוטיניזאז===
המפגע הידוע כ-multiple carboxylase deficiency או MCD, המגיב לטיפול בביוטין, תואר לראשונה על ידי Wolf ב-1971. חוקר זה תאר בשנות ה-80את הצורה הילדותית של מפגע זה כחסר באנזים ביוטינידאזה. בתקופה הנאונטאלית היא בדרך כלל השלב להופעת התסמינים הקליניים של MCD, כאשר חומרתם נקבעת על בסיס דרגת החסר של האנזים, והם מקיפים את המערכות הנוירולוגית, העורית, החיסונית, והאופטלמולוגית. חסר ביוטינידאז אופייני למפגע המתבטא בגיל מאוחר יותר והידוע כ-late onset MCD, כאשר המפגע המוקדם בהופעתו בשלב הנאונטאלי או בשבועות הראשונים לחיים קשור בדרך כלל לאי-סדירות ביוכימית אחרת הקשורה לביוטין, הידועה כ-holocarboxylae synthetase deficiency או HSD. 

בלידה נראה התינוק נורמאלי, ובדרך כלל התסמינים המקדימים הם התרחשות של קטו-אצידוזיס מטבולית, ו-organic aciduria. ב-HSD התסמונות הקליניות המוקדמות שעלולות להופיע הן בתחומים מגוונים. תסמונות גסטרואנטראליות כוללות בעיות הזנה, הקאות, שלשולים, טחול וכבד מוגדלים; בתחום הנשימתי סטרידור, tachypnoea ואף apnoea; בתחום הנוירולוגי היפוטוניה, פרכוסים, אטקסיה, פיגור התפתחותי, נוירופתיה, חרשות סנסורית-נויראלית, bulbar palsies, דלקת הלחמית (conjunctivitis) ולעתים נדירות פאראפארזיס ספסטית; בתחום הדרמטולוגי התקרחות מקומית (alopecia), דרמטיטיס סביב הפה או סביב פי הטבעת, פריחה עורית דמויית אקזמה, פסוריאזיס ו-seborreic dermatitis, הדבקות פטרייתיות כגון קנדידיאזיס. בגיל מאוחר יותר עם חסר עמוק של ביוטינידאז מראים חולשת גפיים, פארזיס ספסטית, ראייה מוחלשת. כאשר מופיעים התסמינים הקשורים לראייה, שמיעה, אטקסיה ופיגור התפתחותי, תסמינים אלה בדרך כלל אינם הפיכים אפילו בטיפול בביוטין. 

אם הלוקים החסר ביוטינידאז מטופלים באופן סדיר ומוקפד עם הוויטמין ביוטין, חסר האנזים יכול להיות א-תסמיני. תסמינים ממושכים למי שהתחלת הטיפול אצלו התאחרה, עלולה להותיר בו מספר ממצאים נוירולוגיים בדרגות חומרה שונות, כולל פיגור שכלי, פרכוסים, ואף תרדמת. מוות עלול להתרחש במקרים של חסר עמוק ובלתי מטופל של האנזים. חסר חלקי של ביוטינידאז (10-30% מפעילות האנזים התקינה) כרוך בסיכון מוגבר ללקות בחלק מהתסמינים המופיעים בילדים עם חסר עמוק של האנזים. בדרך המפגעים בילדים אלה הם היפוטוניה, פריחה עורית, ואיבוד שיער, והם יופיעו רק בתרחישי מחלה, הדבקה בפתוגנים, או בעקות שונות, מצוקות מטבוליות, חום גבוה, צום. במצבים האחרונים של תסמיני חוסר ביוטינידאז הבאים לביטוי במשברים מטבוליים, תסמינים אלה יגיבו היטב לטיפול במתן ביוטין.

מוות פתאומי עליו דיווחו במקרים אחדים של חסר ביוטינידאז, עלול להתרחש כתוצאה מהתקף פרכוסים אן אי-תפקוד של גזע המוח. לכן, יש לקחת מחשבון חסר ביוטינידאז בהערכת הסיבה האפשרית לאירוע של SIDS ("מוות העריסה"), בפרט אם בני משפחה אחרים הראו סימנים קליניים אפשריים שלחסר ביוטינידאז. מקרה מוות שיוחס ל-SIDS, התברר בדיעבד ככזה שנגרם מחסר ביוטינידאז (Burton 1987).

הספקטרום של סימנים ותסמינים קליניים בחסר ביוטינידאז עלול להיות רחב: יש לקחת בחשבון חסר אנזים זה בהתרחשות של פרכוסים בלתי נשלטים, חמצת, פריחה עורית בעלת מאפיינים דמויי-אקזמה, התקרחות, פגיעה בעצב השמיעה (ב-20-30% מהמקרים) או הראייה (optic atrophy), היפוטוניה, כשל בגדילה (FTT), וכן spastic paraparesis (חולשה וטונוס גבוה של הגפיים התחתונות) לעתים פחות שכיחות. מחקרים מראים שב-35-38% מבין אלה עם חסר ביוטינידאז עלולים להופיע פרכוסים, בדרך כלל כלליים, פרכוסים קלונים או פרכוסים טונים-קלונים (Grand Mal), אם כי גם מיוקלונים, וכן infantile spasms . פרכוסים אלה אינם מגיבים באופן אופייני לטיפולים המקובלים אך מגיבים מהט לטיפול בביוטין. תסמינים אחרים כוללים בעיות נשימה (apnea, tachypnea, היפרונטילציה), שיעול נבחני (סטרידור). תסמינים פחות שכיחים הפרעות אכילה, הקאות ושלשולים, הדבקות בפטריות דוגמת קנדידה, טחול וכבד מוגדלים. תוצאות נוירולוגיות אחרות ידועות כהפרעות דיבור, שיגשון (אטקסיה), נוירופתיה.

===חסר ביוטינידאז ו-organic aciduria===
למרות שברוב המקרים של חסר ביוטינידאז מוצאים גם חמצת מטבולית, הפרשה מוגברת של חומצות אורגניות בשתן (organic aciduria) והיפר-אמונמיה מתונה, היעדר של organic aciduria או של קטו-אצידוזיס מטבולי, אינם שוללים את האבחון של חסר ביוטינידאז בתינוק או בילד תסמיני. אנליזה של חומצות אורגניות בשתן על ידי גז כרומטוגרף/ מס ספקטרומטר, או מדידה של רמת acylcarnitines בפלזמה על ידי liquid chromatography-tandem mass spectrometry, יכולות לגלות חריגות אופייניות מהנורמה בנבדקים עם חסר ביוטינידאז. כאמור קביעת הפרופיל של חומצות אורגניןת בשתן לגילוי חומצות מוגברות אופייניות לחסר ביוטינידאז, איה יכולה להיחשב כמדד אבחוני, אלא יותר לשמש מדד להיענות (compliance) של המטופלים לצריכה יומית של ביוטין.

עם זאת, גישה זו של מדידת חומצות אורגניות אינה מתאימה כבדיקה יחידה בנבדקים חשודים לחסר ביוטינידאזה, כיוון שברבים מאלה החסרים את האנזים, לא נמצאה בבדיקות השתן חריגה בהרכב החומצות האורגניות. כמו כן, מאפיינים של אי-סדירות מטבולית שיכולים להתאים לחסר ביוטינידאז, הכוללים עליות ברמה של 3-hydroxyisovaleric acid, כמו גם של 3-methylcrotonylglycine וכן של 3-hydroxyisovalerylcarnitine, יכולים להופיע גם במחלות ומפגעים אחרים, ואם לא מבצעים מדידה ישירה של biotinidase, האבחון עלול להיות שגוי.

אנליזה של חומצות אורגניות בשתן שימושית להבדיל בין מה שידוע כ-isolated carboxylase deficiency, לבין תרחיש של multiple carboxylase deficiency המתרחש בחסר של האנזימים ביוטינידאז ו-holocarboxylase synthetase. יש לציין שהמפגע-holocarboxylase synthetase deficiency נקרא בעבר בשמות early-onset או infantile multiple או combined carboxylase deficiency.

יש לציין שהמטבוליט β-hydroxyisovaleric acid הוא המטבוליט השכיח ביותר שרמתו מוגברת בשתן במקים של חסר ביוטינידאז, במצב של holocarboxylase synthetase deficiency, במצב של חסר מבודד של β-methylcrotonyl-CoA carboxylase, וממילא בחסר בביוטין. בנוסף לרמות מוגברות של β-hydroxyisovaleric acid, רמות מוגברות של חומצת חלב בשתן, וכן של methylcitrate, ושל β-hydroxypropionic acid, הן אינדיקציה ל-multiple carboxylase deficiency.

===אבחנה מבדלת של חסר ביוטינידאז===

מבחינת הגדרת חסר האנזים, הוא ידוע גם כ-late-onset carboxylase deficiency, מה שמבדיל בינו לבין צורה מוקדמת יותר של הופעת התסמינים הנגרמת על ידי holocarboxylase synthetase deficiency. תסמינים קליניים כהקאות, היפוטוניה ופרכוסים, בתוספת לקטואצידוזיס מטבולית, או היפר-אמונמיה מתונה, נצפים לעתים קרובות במחלות מטבוליות העוברות בהורשה. אלה עם חסר ביוטינידאז, יכולים להראות תסמינים קליניים שמאובחנים בשוגג עם מפגעים אחרים, כמו isolated carcboxylase deficiency. תסמינים נוספים האופייניים יותר לחסר ביוטינידאז כמו פריחה או התקרחות (alopecia), יכולים להופיע גם בילדים עם חסר תזונתי של ביוטין, בילדים עם חסר אבץ, עם חסר של חומצות שומן חיוניות או באלה עם חסר באנזים holocarboxylase synthetase.

===חסר מבודד של קרבוקסילאז===

חסר של multiple carboxylase מגיב לטיפול בביוטין, אך חסר של isolated carboxylase אינו מגיב לטיפול זה. חסר מבודד של קרבוקסילאז יכול להיות מאובחן על ידי הדגמה של פעילות חסרה של אחד משלושת הקרבוקסילאזות המיטוכונדריאליות בלויקוציטים של דם היקפי (קודם לטיפול בביוטין), או בפיברובלסטים בתרבית הגדלים במדיום המכיל כמות קטנה של ביוטין, לעומת רמת פעילות תקינה של 2 הקרבוקסילאזות האחרות. 

===מניעת התבטאות ראשונית של חסר ביוטינידאז===
כל אלה עם חסר אנזים עמוק, חייבים להתחיל להיות מטופלים בביוטין ללא כל קשר לגנוטיפ שלהם (Wolf, 2003). הוויטמין ניתן פומית והניסיון מראה שתינוקות שהתגלה אצלם חסר האנזים בבדיקת סקר-יילודים, או בסמוך ללידה, השתפרו מבחינת תסמיניהם בטיפול יומי של 5-10 מיליגרם. יש עדות לכך שחריגות ביוכימיות כחמצת (ketoacidosis), היפר-אמונמיה וכן הפרכוסים, מתפוגגים במהירות לאחר תחילת הטיפול בביוטין, כאשר בשלב מאוחר יותר יש שיפור בתסמינים הדרמטולוגיים, צמיחת השיער בתינוקות עם alopecia (לא בכל המקרים), אם כי אטרופיה של עצב הראייה ואיבוד שמיעה עלולים שלא להגיב לטיפול בשל האיחור שחל בהתחלתו. גם הפיגור ההתפתחותי עשוי להראות דרגות שונות של שיפור בילדים שונים עם התחלת הטיפול בביוטין. כיוון שלא ידועות תופעות לוואי טוקסיות של ביוטין, הטיפול בטווח של 1-10 מיליגרם ליום נסבל, והוא אמור להימשך לשארית החיים. 

אלה עם חסר ביוטינידאז לדרגותיו חייבים להימנע מאכילת ביצים לא מבושלות, שכן חלבון הביצה מכיל ריכוז גבוה של avidin שהוא חלבון בעל זיקה גבוהה ביותר לביוטין, שהיא בלתי הפיכה וגורעת מרמת הביוטין הזמין.

מספר ילדים עם חסר עמוק של ביוטינידאז נמצאו א-תסמיניים עד שנות הבחרות שלהם, כאשר הם פיתחו באופן פתאומי איבוד ראייה עם נוירופתיה אופטית מתקדמת וכן פאראפרזיס ספסטית (עפ"י Lott, 1993, וכן עפ"י Tokatli, 1997). לאחר מספר חודשים של טיפול בביוטין, ממצאי הראייה השתפרו, ונמצא גם שיפור בפאראפרזיס הספסטי. יש מספר דיווחים על מבוגרים עם חסר עמוק של ביוטינידאז, שילדיהם התגלו בסקר יילודים כבבעלי חסר עמוק של האנזים אך לא היו אצלם כל תסמינים אף שלא טופלו בוויטמין (Baykal, 2005).

===תסמיני חסר ביוטנידאז עמוק בילדים לא מטופלים===

תסמינים אלה מופיעים בין הגילים של שבוע אחד ל-10 שנים, עם הגיל הממוצע של 3.5 חודשים (עפ"י Wolf וחב' משנת 1985). התסמינים הנוירולוגים השכיחים ביותר בהיעדר טיפול, הם פרכוסים והיפוטוניה (עפ"י Wastell, 1988 ו-Wolf 2011). הפרכוסים הם בדרך כלל מיוקלונים, אך יכולים להיות גם- grand mal, כאשר ילדים עלולים לסבול גם מ-infantile spasms עפ"י מחקר של Salbert משנת 1993. על פי Chedrawi וחב' משנת 2008, הימנעות מטיפול גורמת למעורבות עמוד השדרה ומיאלופתיה. בגיל מבוגר יותר, אי-טיפול כרוך באטקסיה ובפיגור התפתחותי.

איבוד שמיעה סנסו-נויראלי ובעיות ראייה (optic atrophy) תוארו בילידים לא מטופלים, כאשר ב-76% מבין הילדים מבין הילדים התסמיניים עם חסר אנזים עמוק שלא טופלו, בעיית איבוד השמיעה אינה מתפוגגת או משתפרת ונותרת בעינה למרות הטיפול בביוטין (עפ"י Wolf, 2002). ברבים מהילדים התסמיניים עם חסר עמוק של ביוטינידאז עלולים להתפתח מגוון של אי-סדירויות של ה-CNS שניתן לגלותם ב-MRI אוCT של המוח.

===בדיקת סקר יילודים (newborn screening) לגילוי חסר ביוטינידאז===
שיטות לקביעה חצי-כמותית של פעילות ביוטינידאז בטיפות דם מיובשות, פותחו ב-1984 על ידי Barry Wolf וחב' במאמר ב-Clin Chem, וכבר באותה שנה נוסו בתכנית סקר pilot במדינת וירג'יניה. שיטה זו תואמת את עקרונות בדיקת סקר יילודים בכך שהיא אמינה ולא יקרה, וכן גילויה בזמן אמת יכול באמצעי טיפול פשוטים ויעילים למנוע תחלואה קשה, עד כדי תמותה. בשיטה זו הדומה בעיקרון לשיטת גאטרי לזיהוי פנילקטונוריה, מוציאים דסקית בקוטר נתון מהאזור הספוג בדם יבש שנלקח מעקב התינוק 48 שעות מלידתו. דסקית זו מועברת לפלטת ELISA בת 96 בארות ושם נעשה מיצוי תכולת הדם לתמיסה המכילה בופר מתאים ואת המצע N-biotinyl-aminobenzoic acid, ולאחר סיום ההדגרה מתבצעת קריאת הצבע המתפתח ב-ELISA reader באורך גל 546 ננומטר.

סולפונאמידים ותכשירים נוספים המשמשים לטיפול בגיל הרך, נבחנו להשפעתם האפשרית על תוצאות מדידת PABA, תוצר הריאקציה. כצפוי, sulfisoxazole ו-sulfamethoxazole נותנים צבע סגול בהיעדר המצע b-ABA, ויש להימנע מנטילתן לפני הבדיקה. לעומת זאת, phenytoin, אמפיצילין, גנטמיצין סולפט, ויטמין K, פניצילין G, ו-kanamycin sulfate לא מפתחים כל צבע בתנאי הריאקציה שעלול לגרום לתשובה מוגברת כזובה. 

כיוון שסקר חסר ביוטינידאז נעשה במבחן אנזימטי ישיר, התוצאות אינן מושפעות מהזנה בחלבונים, כמו שנכון לגבי בדיקת פניקטונוריה או במפגעי חומצות אמינו אחרים. בערך 50% מתוצאות כזובות בהן מתקבלת הערכה נמוכה של פעילות האנזים, הן כתוצאה מהיות התינוקות פגים, או התנהלות לא נכונה עם כרטיסי הבדיקה, כמו חשיפתם לתנאי לחות, או לטמפרטורה גבוהה שעלולה לפגוע בפעילות האנזים, בכל מקרה בו תוצאת בדיקת הסקר על טיפת דם מיובשת מתקבלת לא תקינה או גבולית, יש לבצע את הבדיקה בשיטה כמותית יותר בדגימת נסיוב/פלזמה.

===אבחון גנטי-מולקולארי===

בשל הארגון הפשוט של הגן BTD. ניתן לבצע מבחן מולקולארי, או על ידי targeted mutation analysis כפי שהראו Naylor וחב' בשיטת PCR ב-2003 ב-Mol Gen Metabol, או על ידי ריצוף שלם של הגן, כמו שהראו Hymes וקבוצתו ב-1997 ב-Pediatr Res. בדיקה מולקולארית שימושית במיוחד כדי לעשות אבחנה מבדלת נבדקים עם חסר אנזים כבד, לבין אלה עם חסר חלקי של האנזים, לבין אלה שהם הטרוזיגוטים לחסר אנזים כבד, כיוון שכמעט כל הילדים עם חסר חלקי של האנזים הם בעלי מוטציה D444H, באלל אחד בשילוב עם מוטציה נוספת לחסר עמוק של האנזים באלל אחר, כפי שהראו Swango וחב' ב-1998 ב-Hum Genet. אנליזה של מוטציות שכיחות כולל D444H, ניתנות להיקבע על ידי אנליזה של DNA המופק מטיפות דם מיובשות, ואם התוצאות אינו החלטיות, ניתן לבצע ריצוף שלם של הגן ניתן לביצוע. 

אנליזה של מוטציות לאבחון חסר ביוטינידאז זמינה כיום. הגן BTD מורכב מ-4 אקסונים מה שמאפשר ריצוף מהיר של ה-DNA שלו מלוא אורכו, כולל הצמתים של exon-intron. אנליזה של מוטציה אינה מתאימה לסקר יילודים, אך מתאימה ככלי משלים להבדלה בין חסר כבד לחסר חלקי. אנליזה של מוטציות מתאימה גם לסקרי משפחות, ולאבחון קדם-לידה של מפגע.

===מדידה ביוכימית של רמת האנזים===
פעילות ביוטינידאז בנסיוב נמדדת בדרך כלל תוך שימוש במצע N-biotin-4-aminobenzoic acid (אנאלוג של biocytin) על ידי מדידה של כמות -p-aminobenzoic acid המשתחררת. שיטה זו פורסמה בשנת 1983 על ידי Wolf וחב' ב-Clin Chim Acta. בשיטה זו מדגירים את הנסיוב הנבדק ב-37 מעלות למשך 30 דקות עם המצע, והריאקציה מופסקת על ידי הוספה של חומצה טריכלורואצטית (TCA). התוצר PABA המשתחרר מפעילות ביוטינידאז, עובר דיאזוטציה עם סודיום ניטריט, ועודף הניטריט מורחק על ידי הוספה של ammonium sulfamate. לבסוף, מגיב תוצר הדיאזוטציה של PABA עם N-1-naphtyl-ethylene-diamine dihydrochloride, לקבלת תוצר צבוע שמודדים בספקטרופוטומטר באורך גל 546 ננומטר. ניתן בשיטה זו למדוד את פעילות ביוטינידאז גם בתמצית של תאים לויקוציטים ופיברובלסטים. 

ניתן כמו כן למדוד את פעילות האנזים בשיטה פלואורימטרית, על ידי שימוש במצע מלאכותי דוגמת biotinyl-6-aminoquinoline, ומידת של התוצר הפלוארסצנטי aminoquinoline. שיטה פלואורימטרית זו הותאמה לבדיקות סקר יילודים, על ידי מדידת הזריחה הפלואורסצנטית של טיפות דם מיובשות על נייר הספוג במצע האמור. ישנן עוד שיטות למדידת פעילות ביוטינידאז, כמו שחרור ביוטין מ-biocytin, תוך שימוש בנגזרים פלואורסצנטיים אחרים של ביוטין, או באנאלוגים רדיו-איזוטופיים של ביוטין.

===פענוח התוצאות===

לבדיקות המבוצעות כתוצאה מממצאי חריגות בסקר יילודים, תוצאה של פעילות ביוטינידאז הנמוכה מ-10% של מממוצע הנורמה, יכולה לשמש מדד אמין לחסר כבד של האנזים (profound deficiency), ואילו תוצאה של פעילות אנזים שהיא 10-30% מממוצע הנורמה, מעידה על חסר חלקי של האנזים (partial deficiency). תוצאות נמוכות של פעילות אנזים יכולות להיגרם מפּגוּת או מאי-תפקוד חמור של הכבד. פעילות ביוטינידאז ביילודים, עולה בדרך כלל בימים עד שבועות ראשונים לחיים, ואלה עם תוצאות של 50-70% מהנורמה, אינם זקוקים בדרך כלל לבדיקת פעילות אנזים חוזרת. רצוי במידת האפשר להשיג דגימות דם של ההורים, כדי למנוע אבחון לא נכון של חסר אנזים בילד, או לחילופין למנוע החמצה של אבחון כזה. אם קיים איזשהו ספק לגבי הפענוח של התוצאה, ריצוף (sequencing) הגן יכול לשמש לאישוש או שלילה של ההערכה על חסר האנזים (שכן אנליזה של targeted mutation לא תזהה את כל המוטציות האפשריות).


{| border="1" align="center"
|+ <big>'''פעילות ביוטינידאז באנשים בריאים, בהורים נשאים, בילדים עם חסר ניכר, או עם חסר חלקי'''</big>
|-
! קטגוריה !! פעילות ביוטינידאז
|-
! אנשים בריאים
|| 7.57 + 1.41 (100) 
|-
! הורים לילדים עם חסר אנזים קשה
|| 3.49 + 0.72 (21)
|-
! ילדים עם חסר אנזים קשה עפ"י הקליניקה
|| 0.12 + 0.18 (23)
|-
! {{רווח קשיח|5}}ילדים עם חסר אנזים קשה עפ"י בדיקת סקר בלידה{{רווח קשיח|5}}
|| 0.16 + 0.19 (41)
|-
! אנשים עם חסר אנזים חלקי
|| 0.41 + 1.47 (23) 
|}


כאשר פעילות ביוטינידאז הנמדדת היא בתחום של 10-30% מהנורמה, באופן אופייני כאשר יבדקו את ההורים אחד מהם יהיה בעל פעילות של כ-50% מהנורמה, שמצביעה על כך שהורה זה הוא נשא של האלל לחסר כבד של האנזים. בהורה השני תימצא פעילות של בערך 75% מהרמה הממוצעת, מה שמצביע על היותו נשא של המוטציה D444H. אך לעתים באחד או בשניים מן ההורים הפעילות הנמדדת היא בתחום הנורמה. מקרים אלה ניתן להבהיר בעזרת אנליזה של המוטציה. לעתים, להורה יש פעילות אנזים בתחום ההטרוזיגוטי, ובסופו של תהליך הוא נמצא על ידי אנליזה של המוטציה הומוזיגוטי לאלל D444H, או שהורה זה יימצא בעצמו כבעל פעילות ביוטינידאז חלקית.

===אבחון קדם-לידתי של חסר ביוטינידאז===

ניתן לבדוק בשעת הריון בסיכון גבוה את פעילות האנזים בעובר שברחם, על ידי מדידת פעילות האנזים בנוזל מי השפיר המתקבל בסביבות שבוע 15-18להיריון על ידי דיקור השליה (amniocentesis) ע"פ McVoy משנת 1984 ו-Chalmers משנת 1994. במשפחות עם סיכון ידוע לחסר ביוטינידאז ניתן לבצע אנליזה של DNA לאחר מיצוי מתאי עובר שמפיקים ממי השפיר בשבוע ה-15-18 להיריון, או ב-DNA המופק מסיסי שליה (CVS) בשבועות 1-12 להיריון.

==הוראות לביצוע הבדיקה==
את פעילות ביוטינידאזה ניתן למדוד בפלזמה או בנסיוב, ומסובך יותר לקבוע אותה בפיברובלסטים או בלימפוציטים. יש להקפיד לא להשתמש בדם בטווח זמן של שבועיים לפחות מעירוי דם. דגימות דם שנלקחו לאחר המוות אינן ראויות לבדיקה זו, ובמקרים אלה ניתן לבצע כחלופה מבדק מולקולארי, או לקבוע אנזימטית את סטאטוס ה"נשאות" (carrier) של הורי הנפטר. בדיקות מולקולאריות לקביעת מוטציות בגן BTD מתבצעות על DNA שמבודדים מלויקוציטים, פיברובלסטים או מטיפות דם מיובשות על נייר גאטרי. 

לצורך הבדיקה יש ליטול דם במבחנה כימית (פקק אדום או צהוב) או במבחנת הפארין (פקק ירוק), ויש לסרכז להפרדת התאים לא יאוחר משעה מנטילת הדם. את הנוזל המופרד יש להקפיא מייד בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות אם הבדיקה אינה מתבצעת בזמן אמת. דגימות פלזמה או נסיוב שהוקפאו חייבות להישלח למעבדה באריזת קרח יבש. אפילו הקפאה לזמן ממושך במינוס 20 מעלות נמצאה מורידה את פעילות האנזים, כפי שדיווחו Wolf ו-Hymesב-1990 ב-Methods Enzymol.

לבדיקה אנזימטית יש להפשיר את הדגימה הקפואה ממש לפני הבדיקה.יש ליטול דם גם מההורים במידת האפשר. חובה לבדוק במקביל רמת האנזים בדגימת דם של ביקורת בריאה, כדי לאשש את איכות הבדיקה. לצורך הפקת DNA יש ליטול 1-2 מ"ל דם במבחנת ספירת-דם (EDTA, פקק סגלגל), שיכולה להישלח למעבדה בטמפרטורת החדר ללא אמצעי הקפאה, והן יציבות למטרת הפקת DNA מספר ימים.

טיפות דם מיובש על נייר גאטרי, חייבות להיות מיובשות היטב לפני שליחת הדגימה למעבדה. לחות או רטיבות של דגימות טריות עלולה להפחית משמעותית את הפעילות האנזימטית.

==ראו גם==
* [[מדריך בדיקות מעבדה|חזרה לדף מדריך בדיקות מעבדה]]
* [[אבחון תסמנות גנטיות|בדיקות מעבדה - אבחון תסמנות גנטיות]]
* [[אבחון מחלות ומפגעים מטבוליים-גנטיים|בדיקות מעבדה - אבחון מחלות ומפגעים מטבוליים-גנטיים]]


{{ייחוס בן עמי}}


[[קטגוריה:בדיקות מעבדה - אבחון תסמנות גנטיות]]
[[קטגוריה:בדיקות מעבדה - אבחון מחלות ומפגעים מטבוליים-גנטיים]]
[[קטגוריה:בדיקות מעבדה: כימיה בדם]]