הצגת המקור של הדף "פרגננולון - Pregnenolone"

{{בדיקת מעבדה
|שם עברי=פרגננולון
|שם לועזי=Pregnenolone 
|קיצור= P5 או pregn-5-en-3β-ol-20-one
|תמונה=[[קובץ:Pregnenolone 1.png|250 פיקסלים]]
|כיתוב תמונה=Pregnenolone
|מעבדה=[[אנדוקרינולוגיה בדם]]
|תחום=הורמונים סטרואידים
|יחידות מדידה=
|טווח ערכים תקין=ילדים (Kushnir וחב' ב-Clin Chem משנת 2006): 
זכרים - גיל 7-9 שנים - פחות מ-206 ננוגרם/דציליטר; גיל 10-12 שנים פחות מ-152 ננוגרם/דציליטר; גיל 13-15 שנים - 17-228 ננוגרם/דציליטר; גיל 16-17 שנים - 17-228 ננוגרם/דציליטר; שלבי Tanner: שלב I - פחות מ-157 ננוגרם/דציליטר; שלב II - פחות מ-144 ננוגרם/דציליטר; שלב III - פחות מ-215 ננוגרם/דציליטר; שלב IV-V - 19-201 ננוגרם/דציליטר.
נקבות - גיל 7-9 שנים - פחות מ-151 ננוגרם/דציליטר; גיל 10-12 שנים - 19-220 ננוגרם/דציליטר; גיל 13-15 שנים - 22-210 ננוגרם/דציליטר; גיל 16-17 שנים - 22-229 ננוגרם/דציליטר; שלבי Tanner:  שלב I פחות מ-172 ננוגרם/דציליטר; שלב II בין 22-229 ננוגרם/דציליטר; שלב III בין 34-215 ננוגרם/דציליטר; שלב IV-V בין 26-235 ננוגרם/דציליטר.
במבוגרים מעל גיל 18 שנה - 33-248 ננוגרם/דציליטר, אם כי כללית רמת P5 בנשים גבוהה במעט מזו של גברים.
|יוצר הערך=[[משתמש:בן עמי סלע|פרופ' בן-עמי סלע]]
|אחראי הערך=
}} 
==מטרת הבדיקה==
בדיקת עזר במקרים של congenital adrenal hyperplasia, בעיקר במצבים בהם נשלל החסר של האנזימים hydroxylase{{כ}}-21  ו-hydroxylase{{כ}}-11. כמו כן הבדיקה נדרשת לאישור החסר באנזים β-hydroxy dehydrogenase{{כ}}-3.     

Pregnenolone (להלן P5) או pregn-5-en-3β-ol-20-one, הוא סטרואיד אנדוגני, ומטבוליט המשמש כקודמן (precursor) בביוסינתזה של רוב ההורמונים הסטרואידים, כולל פרוגסטרונים, אנדרוגנים, אסטרוגנים, גלוקו-קורטיקואידים ומינרלו-קורטיקואידים   (Henderson וחב' ב-J Clin Endocrinol Metab משנת 1950). בנוסף, P5 הוא בעל פעילות ביולוגית בזכות עצמו, בפעילותו כנוירו-סטרואיד (Marx וחב' ב-Neuroscience משנת 2011). בנוסף לתפקידו כהורמון טבעי, משמש כתרפיה וכתוסף. P5 סונתז לראשונה על ידי Adolf Butenandt וחב' בשנת 1934 ופורסם ב-Berichte der Deutschen Chemischen Gesellschaft. 

==תפקיד ביולוגי==
P5 ונגזר ה-β-sulfate{{כ}}-3 שלו, pregnenolone sufate, בדומה ל-DHEA, ל-DHEA sulfate ול[[פרוגסטרון]], שייכים לקבוצה של neurosteroides הנמצאים בריכוזים גבוהים באזורים מסוימים של המוח, והם מסונתזים שם. נוירוסטרואידים משפיעים על התפקוד הסינפטי, הם בעלי תפקיד הגנתי על הנוירונים, ומסייעים לתהליך המייאלינציה. P5 ואסטר הסולפט שלו עשויים לשפר תפקוד קוגניטיבי וזיכרון (Vallée וחב' ב-Brain Res משנת 2001). בנוסף, הם עשויים להיות בעלי השפעה הגנתית נגד [[סכיזופרניה]]. 

==פעילות נוירו-סטרואידית==
P5 הוא אנדו-קנבינואיד אלוסטרי, שכן הוא מודולטור אלוסטרי שלילי של הקולטן ל-CB<sub>1</sub> (על פי Vallée  וחב' ב-J Steroid Biochem Mol Biol משנת 2016, ו-Pertwee וחב' ב- Endocannabinoids משנת 2015). Pregnenolone מעורב בלולאת המשוב השלילי כנגד השפעול של הקולטן של CB<sub>1</sub> בבעלי חיים. הוא מונע מאגוניסטים של קולטן זה, כגון tetrahydrocannabinol, שהוא המרכיב הפעיל העיקרי ב[[קנאביס]], משפעול מלא של CB<sub>1</sub> (על פי Vallée וחב' ב-Science משנת 2014). כמו כן, P5 נקשר בזיקה ננומולרית גבוהה לחלבון 2 הקשור ל-microtubule (או MAP2) במוח (Mellon ב-Pharmacol Ther משנת 2007, ו-Fontaine-Lenoir וחב' ב-Proc Natl Acad Sci USA משנת 2006).  

בניגוד ל-pregnenolone, נמצא ש-pregnenolone sulfate אינו נקשר ל-microtubules. עם זאת, פרוגסטרון נקשר ל-P5 באותה זיקה, אם כי בניגוד ל-P5 הוא לא הגדיל את הקישור של MAP2 ל-tubulin. נמצא ש-P5 משרה פולימריזציה של tubule בתרבית נוירונלית, ומגדיל את גידול הניוריטים בתאי PC12 המטופלים עם nerve growth factor. בתור שכזה, P5 עשוי לפקח על היצירה והייצוב של microtubules בנוירונים, ועשוי להשפיע הן על התפתחות נוירונלית בשלב העוברי וכן על הפלסטיות העצבית בגיל המתקדם. למרות ש-P5 עצמו אינו מכיל פעילויות אלה, המטבוליט שלו, pregnenolone sulfate משמש כמודולטור אלוסטרי שלילי של הקולטן של GABAA (על פי Majewska וחב' ב-Neurosc Lett משנת 1988), ובה במידה משמש כמודולטור אלוסטרי חיובי של הקולטן של NMDA (על פי Wu וחב' ב-Mol Pharmacol משנת 1991, ו-Irwin וחב' ב-Neurosci Lett משנת 1992). בנוסף, pregnenolone sulfate נמצא משפעל את תעלת היונים TRPM3 (או transient receptor potential M3) בהפטוציטים ובאיי הלבלב, מה שגורם לכניסת סידן וכתוצאה מכך להפרשת אינסולין (Wagner וחב' ב-Nature Cell Biology משנת 2008).

==פעילות על קולטני הגרעין==
נמצא ש-P5 פועל כאגוניסט של הקולטן של pregnane X (על פי Kliewer וחב' ב- Recent Prog Horm Res משנת 1999). לעומת זאת מתברר ש-P5 חסר פעילות פרוגסטוגנית, קורטיקו-סטרואידית, אסטרוגנית, אנדרוגנית, או אנטי-אנדרוגנית.

==ביוכימיה==
'''ביוסינתזה''': כדי למדוד את ההפיכה של כולסטרול ל-P5, נעשה שימוש בכולסטרול רדיואקטיבי (Hanukoglu ו-Jefcoate ב-J Chromatog A משנת 1980). התוצר P5 יכול להיות מופרד מכולסטרול שמשמש כמצע תוך שימוש מיני-עמודות של LH-20. התוצר P5 מסונתז מכולסטרול (Lemke ו-Williams ב-Foye's Principles of Medicinal Chemistry משנת 2008), כאשר התמרה זו כרוכה בהידרוקסילציה של השרשרת הצדדית בעמדות C20 ו-C22 בעזרת האנזים cytochrome P450-scc הממוקם במיטוכונדריה, ונשלט על ידי ההורמונים הטרופיים של קדמת יותרת המוח, כגון ACTH, וכן FSH ו-LH מבלוטת האדרנל ומבלוטות המין. ישנם שני תוצרי ביניים בהתמרה של כולסטרול ל-P5, והם 20α,22R-hydroxycholesterol ו-dihydroxycholesterol, וכל שלושת השלבים מקוטלזים על ידי P450-scc. נמצא ש-P5 מיוצר בבלוטות האדרנל, בלוטות המין, העור רשתית העין והמוח, אך עיקר ייצורו מתבצע בקליפת האדרנל. כיוון ש-P5 היא תרכובת ליפופילית, היא חוצה בקלות את מחסום דם-מוח (Sripada וחב' ב-Biol Psych משנת 2013). זאת בניגוד ל-pregnenolone sulfate שאינו מסוגל לחצות מחסום זה (Rho וחב' ב-CRC Press משנת 2010).

==מטבוליזם==
P5 עובר מטבוליזם סטרואידי נוסף באחת ממספר דרכים: הוא יכול להיות מותמר לפרוגסטרון. הצעד האנזימטי הקריטי הוא צעד כפול תוך שימוש באנזימים  β-hydroxysteroid dehydrogenase{{כ}}3 ו-Δ{{כ}<sup>}5-4</sup>{{כ}} isomerase. האנזים האחרון מעביר את הקשר הכפול מ-C5 ל-C4 על טבעת A. פרוגסטרון מהווה את נקודת הכניסה למסלול Δ{{כ}}<sup>4</sup>, והתוצאה היא יצירת  α-hydroxyprogesterone{{כ}} 17 ו-androstenedione, הקודמנים של [[טסטוסטרון]] ושל estrone. אלדוסטרון וקורטיקו-סטרואידים נוצרים אף הם מפרוגסטרון ונגזריו. P5 יכול להיות מותמר ל- 17α-hydroxypregnenolone על ידי האנזים α-hydroxylase{{כ}}-17 (או CYP17A1). על ידי שימוש במסלול זה הידוע כ-Δ{{כ}}<sup>5</sup> {{כ}} pathway, הצעד הבא הוא ההתמרה ל-dehydroepiandrosterone (או DHEA) דרך האנזים 17-20{{כ}}17-20lyase. {{כ}}DHEA הוא הקודמן של androstenedione. נמצא ש-P5 יכול להיות מוסב ל-androstadienol על ידי  synthase-ene{{כ}}-16, וכן להיות מותמר ל-pregnenolone sulfate על ידי steroid sulfotransferase, והתמרה זו יכולה להיות מוסבת לאחור על ידי steroid sulfatase. 

הרמות הממוצעות של P5 נמצאו לא שונות משמעותית בנשים בגיל המעבר ובגברים קשישים, 40 ו-39 ננוגרם/דציליטר, בהתאמה (Vermeulen וחב' ב-J Clin Endocrinol Metab משנת 1982). מחקרים מצאו שרמות P5 אינן משתנות משמעותית לאחר סירוס רפואי או כירורגי בגברים, מה שנמצא בהתאמה עם העובדה ש-P5 נובע בעיקר מבלוטות האדרנל (Vickery וחב' ב-Contraceptive and Therapeutic Applications משנת 2012, Bélanger וחב' ב-J Clin Endocrinol Metab משנת 1984, ו-Faure וחב' ב-Fertil Steril משנת 1982). לעומת זאת, סירוס כימי נמצא לדכא חלקית רמות P5 בנשים בגיל המעבר (Dupont וחב' ב-Fertil Steril משנת 1990, ו-Steingold וחב' ב-J Clin Endocrinol Metab משנת 1987). באופן דומה, בנשים שעברו כריתה של האדרנל נמצאו רמות מופחתות של P5 בציקולציה (Abraham ו-Chakmakjian ב-J Clin Endocrinol Metab משנת 1973).

==הכימיה של P5==
P5 ידוע כימית כ-pregn-5-en-3β-ol-20-one (על פי Elks ב-Structures and Bibliographies משנת 2014). בדומה לסטרואידים אחרים, הוא מורכב מ-4 הידרוקרבונים ציקליים הקשורים ביניהם. התרכובת מכילה קטון וקבוצות הידרוקסיליות תפקודיות, 2 ענפים מתיליים, וקשר כפול בעמדה C5, בטבעת B של ההידרוקרבון הציקלי. כמו הורמונים סטרואידים אחרים P5 הידרופובי, אך נגזר הסולפט שלו, pregnenolone sulfate, מסיס במים. 3β- dihydroprogesrterone (או pregn-4-en-3β-ol-20-one) הוא איזומר של P5 , בו הקשר הכפול בעמדה C5 הוחלף על ידי קשר כפול בעמדה C4.

== מידע קליני==
CAH או congenital adrenal hyperplasia, נגרמת על ידי פגמים מולדים בביוסינתזה של סטרואידים. חסרים במספר אנזימים כולל  -21-hydroxylase (מוטציות CYP21A2 ב-90% מהמקרים), -hydroxylase11 (מוטציות CYP11A1 ב-5-8% מהמקרים), 3-β-hydroxy dehydrogenase  (מוטציות HSD3B2 בפחות מ-5% מהמקרים), ו17α-hydroxylase (מוטציות CYP17A1), כל אלה גורמים ל-CAH.  
 
חוסר האיזונים ההורמונליים הנוצר (רמה נמוכה של גלוקו-קורטיקואידים כמו גם מינרלו-קורטיקואידים, ורמה מוגברת של תוצרי ביניים של סטרואידים ואנדרוגנים) עלולים לגרום לתרחיש מסכן-חיים של רמת נתרן נמוכה בתינוקות מאוד צעירים, ואף למצב של הגדרת מגדר בלתי ודאי בנקבות עם מאפיינים זכריים של שרירים מפותחים ושיער פנים וחזה (virilized women). בלוטות האדרנל, השחלות, האשכים והשלייה מייצרים תוצרי ביניים של סטרואידים, שעברו הידרוקסילציה בעמדה 21 על ידי -21-hydroxylase, ובעמדה 11 על ידי  -hydroxylase11 ליצירת קורטיזול (Kao וחב' ב-Ann Clin Lab Sci משנת 2001). חסר באחד מ-2 אנזימים אלה גורם ליצירה מופחתת של קורטיזול, ואיבוד העיכוב כתוצאה ממשוב שלילי, של הפרשת יתר של  adrenocorticotropic hormone (או ACTH). השחרור המוגבר של ACTH מבלוטת יותרת המוח, מביא ליצירה מוגברת של תוצרי ביניים של סטרואידים. 
 
תוצרי הביניים של הסטרואידים עוברים חמצון בעמדה 3 על ידי -3β-hydroxy dehydrogenase. אנזים אחרון זה מאפשר יצירה של 17-hydroxyprogesterone (או 17-OHPG מ-hydroxypregnenolone17, ויצירה של פרוגסטרון מ- pregnenolone. כאשר יש חסר באנזים -3β-hydroxy dehydrogenase יש ירידה ברמת קורטיזול, ורמות pregnenolone ו- hydroxypregnenolone17 עלולות לעלות, ואילו רמות OHPG17 ופרוגסטרון נמוכות. Dehydroepiandrosterone גם כן מותמר ל-androstenedione על ידי -3β-hydroxy dehydrogenase, ויכול להיות מוגבר במטופלים עם חסר האנזים האחרון. בדיקת הסריקה הטובה ביותר ל-CAH, היא האנליזה של hydroxyprogesterone17 (ביחד עם בדיקת רמת קורטיזול ו- androstenedione. אם נשלל החסר של 21hydroxylase ושל  hydroxylase11, יש לבצע אנליזה של 17hydroxypregnenolone ושל pregnenolone על מנת לאשש חסר ב-3-3β-hydroxy dehydrogenase או של α-hydroxylase17.  
   
אינטרפרטציה:    

אבחון מבדיל של CAH מולד, דורש תמיד את המדידה של מספר סטרואידים (Therrell ב-Endocrinol Metab Clin North Am משנת 2001, ו- Collett-Solberg ב-Clin Pediatr משנת 2000). במטופלים עם CAH כתוצאה ממוטציות בגן CYP21A2 הגורמות לחסר של  hydroxylase21, יש בדרך כלל רמות מאוד גבוהות (פי 5-10) של  androstenedione. רמות 17hydroxyprogesterone בחולים אלה הן אף גבוהות יותר, בעוד שרמות קורטיזול נמוכות או אף אינן ניתנות לזיהוי (Wody וחב' ב-Horm Res משנת 2000). כל שלושת האנליטים הללו חייבים להימדד. באשר למוטציה HSD3B2, רמות קורטיזול, פרוגסטרון ו- 17-OHPG, יימצאו מופחתות, בעוד שרמות hydroxypregnenolone17 ו-pregnenolone ו-dehydroepiandrosterone יימצאו מוגברות (Bachega וחב' ב-Clin Endocrinol משנת 2000). במוטציה השכיחה הרבה פחות CYP11A1, רמות androstenedione תהיינה מוגברות באותה מידה כפי שנמצא במוטציה CYP21A2, ורמת קורטיזול אף היא נמוכה, אך לעומת זאת, ניתן למצוא עלייה קלה, אם בכלל, ברמת  17OHPG. 

בחסר המאוד נדיר של hydroxylase17, נמצא ש-androstenedione וכל שאר הקודמנים של אנדרוגן כגון α-hydroxypregnenolone   17OHPG17 ו- dehydroepiandrosterone sulfate, וכן האנדרוגנים טסטוסטרון, estrone ו-estradiol וכן קןרטיזול נמוכים ברמתם, בעוד שהיצירה של מינרל-קורטיקואיד ושל קודמניו (ובעיקר pregnenolone, קורטיקוסטרון, 11dexycorticosterone ו- 18hydroxycorticosterone, מוגברים.            
       
 

 
 
רמות P5 פוחתות באופן טבעי עם הזדקנות האדם, מה שעלול לגרום לחסר יחסי של הורמונים אחרים. התסמינים של חסכים אלה יכולים להתבטא בירידה בליבידו, בדיכאון, בעייפות, בדעיכה בזיכרון, בירידה בצפיפות העצם, ובהפחתה של מסת השרירים. תוספים של P5 סינטתי או נגזרות שונות שלו נמצאים בשימוש במסגרת מאמץ ה"anti ageing", והם אמנם מעלים את רמת DHEA והורמונים סטרואידים אחרים, כולל טסטוסטרון בגוף. יחד עם זאת, רמות מוגברות ביתר עלולות לגרום לתופעות לוואי כגון אגרסיה, רגזנות, נדודי שינה, ושעירות פנים בנשים. לא מומלץ לנשים הרות לצרוך P5. יש עדויות לכך ש-P5 עלול להפריע למחזור החודשי, לגרום לחטטת פנים (acne), להפרעת קצב-לב, בעיות כבד, נשירת שיער ראש, או לעור שמנוני. P5 עלול גם להפחית רמות כולסטרול-HDL.

בה בשעה ש-P5 מפגין מספר השפעות בריאותיות חיוביות, אין לו פעילות אנאבולית, אסטרוגנית או אנדרוגנית. תכונה בולטת אחת של P5 היא בהיותו פעיל פי-100 בהשוואה לסטרואידים אחרים או לקודמניהם, בשיפור הזיכרון. 
חיוני למדוד רמת P5 בתינוקות הנולדים עם מגדר לא ברור. כמו כן, כאשר יש סימנים של אי-ספיקה של האדרנל, כגון איבוד עודף של נוזלים ושל נתרן או שיבושים בלחץ הדם, חשוב למדוד רמת P5. אי-ספיקת האדרנל יכולה להתבטא בכעסנות, דאגנות, פחדים ורגשי אשמה, דלקות וזיהומים כרוניים, כאבים, היפר-גליקמיה, חסכים תזונתיים, ספיגה לקויה והפרעות שינה. 
pregnenolone הוא הסטרואיד הראשון הנוצר מכולסטרול במסלול של סטרואידוגנזה, והוא קודמן שכיח של כל הסטרואידים המופרשים מהאדרנל ומבלוטות המין, כולל DHEA, פרוגסטרון, טסטוסטרון, אסטרוגנים וקורטיזול. יצירת P5 מתרחשת במיטוכונדריון על ידי ביקוע של השרשרת הצדדית c-20 במולקולת כולסטרול על ידי האנזים P-450 SCC. פעילותו של P5 במוח כנוירו-סטרואיד קשורה למודולציה של מעבר איתותים בין תאי עצב, מה שמשפיע על כושר לימוד וזיכרון (Baulieu ב-Recent Prog Horm Res משנת 1997, ו-Schumacher וחב' ב-Develop Neurosci משנת 1996). בדומה ל-DHEA, רמת P5 היא בשיאה בשנות הילדות והבחרות, וזו מתחילה דעיכה אטית ברמה זו בהמשך החיים.  בגיל 75 שנה, הגוף מייצר 60% פחות P5 בהשוואה לאמצע שנות השלושים לחיים (Roberts ב-Biochem Pharmachol משנת 1995), בדומה להורמונים אחרים הדועכים עם הגיל (Roberts ב-Biochem Pharmachol משנת 1999). 
רקע היסטורי של מחקר על P5:
המחקרים המקוריים על P5 החלו כבר בשנות ה-30, ובשנות ה-40 עובדי תעשייה טופלו ב-P5 בניסיון להפחית את עייפותם (Pincus ו-Hoagland ב-J Aviation Med משנת 1944, Hoagland ב-Science משנת 1944 ו-Pincus ו-Hoagland ב- Psychsom Med משנת 1945), להפחית מחלות אוטו-אימוניות (Henderson וחב' ב-J Clin Endocrinol nab, 1950), כולל rheumatoid arthritis. התוצאות נראו מעודדות ונצפו שיפורים. למרות ש-P5 נמצא לא רק יעיל אלא גם בטיחותי, השימוש בו נעלם כאשר חברת Merck החלה משווקת בשנת 1949 את תוצרה החדש cortisone, שנחשב אז לטיפול היעיל ביותר כנגד rheumatoid arthritis (על פי Hirschmann ב-Steroids משנת 1992). מיד לאחר תחילת השימוש הרווח ב-cortisone וב-cortisol, ההורמונים הסטרואידים הסינטתים, dexamethasone ולאחר מכן prednisone, נכנסו לשימוש המוני, ופעולתם חזקה יותר בשני סדרי גודל מזו של P5 או של DHEA. כיוון שניתן לפטנט אותם, שני התכשירים האחרונים היו בעלי יתרון כלכלי מובהק לחברות התרופות לשווק אותן על פני P5. בנוסף, דקסמתאזון ופרדניזון הראו פעולה מהירה מאוד בהשוואה ל-P5, אם כי הייתה להם השפעה שלילית על מערכת החיסון ונטייה להשרות אוסטאופורוזיס.

למרות שקורטיזון וקורטיזול הם הורמוני עקה טבעיים של הגוף, מבחינה היסטורית הם  המשיכו להיות מוזרקים לגוף בריכוזים פרמקולוגיים ולא פיזיולוגיים, מה שעלול לגרום תופעות לוואי לא רצויות. ניסויים בהמשך הראו שיש ל-P5 השפעה חיובית על האינטליגנציה והזיכרון. Eugene Roberts דמות מרכזית בתחום הנוירו-כימיה לאורך 50 שנה, תמך בשימוש ב-P5 וב-DHEA למטרות טיפוליות. לדעתו, "מכל התכשירים שנחקרו באזורי מוח שונים, P5 הוא הפוטנטי ביותר" (Travis ב-Science News משנת 1995, ו-Flood וחב' ב-Proc Natl Acad Sci USA משנת 1992). מחקרים שונים הראו ש-P5 מסייע למוטיבציה, ליכול רכישת ידע ולזיכרון לטווח ארוך (De Wied ב-Hosp Practice משנת 1976). מחקר אחר של De Wied מצא ש-P5 יעיל פי-100 מסטרואידים תומכי זיכרון אחרים. מחקרים נוספים גילו את היכולת של P5 לסייע לכושר הלימוד אף בריכוזים נמוכים ביותר (Flood וחב' ב-Proc Natl Acad Sci USA משנת 1995). בגיל המתקדם תופעות דיכאון ואיבוד אנרגיה הן חלק בלתי נפרד מחוויית שנים אלו. ידוע שנוירו-הורמונים משפיעים על נוירו-טרנסמיטורים, ויכולה להיות להם השפעה ניכרת על התפקוד המנטלי. השחזור של רמות P5 וכנראה של נוירו-הורמונים נוספים עשוי למנוע או להקל על תופעות דיכאוניות. נראה אם כן ששחזור רמות גבוהות יותר של נוירו-סטרואידים עשוי להפיק יתרונות שהגיל מחק (Sahelian ב-Life Enhancement משנת 1997).

==הוראות לביצוע הבדיקה==
את הדם יש לדגום למבחנה כימית (פקק צהוב או אדום), ולאר קרישת הדם והסרכוז יש להעביר את הנסיוב למבחנת פלסטיק, ולהקפיא. ניתן לבצע את הבדיקה גם בנסיוב מאוד המוליטי, ליפמי או איקטרי. הבדיקה מתבצעת על ידי  liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry או LC-MS/MS, או בשיטות של enzyme-immunoassay.