הצגת המקור של הדף "פירימידין '5 נוקלאוטידאז - Pyrimidine 5' Nucleotidase"

{{בדיקת מעבדה
|שם עברי=פירימידין '5 נוקלאוטידאז
|שם לועזי=Pyrimidine 5' Nucleotidase
|קיצור=NT5C3, uridine monophosphate hydrolase-1 (UMPH-1), Cytosolic 5'-nucleotidase 3, cytosolic 5'-nucleotidase 3A, PN-I, P5'NI, p56
|תמונה=[[קובץ:Protein NT5C3 PDB 2bdu.png|250 פיקסלים]]
|כיתוב תמונה=
|מעבדה=[[גנטיקה בדם]]
|תחום=אנמיה המוליטית
|יחידות מדידה=
|טווח ערכים תקין=
|יוצר הערך=[[משתמש:בן עמי סלע|פרופ' בן-עמי סלע]]
|אחראי הערך=
}}
'''מטרת הבדיקה:''' הערכה של אנמיה המליטית, ושל ניקוד (stippling) בבזופילים. 

==מידע קליני==
Pyrimidine 5' nucleotidase (להלן P5′N-1) הוא אנזים קטבולי המווסת את הרמות התאיות של נוקלאוטידים ונוקלאוזידים על ידי דה-פוספורילציה של nucleoside 5'-monophosphates לא-ציקליים. הפעילות של P5'N גבוהה בהרבה ברטיקולוציטים מאשר באריתרוציטים בשלים בגין  דרישה מוגברת במהלך ההתבגרות של אריתרואידים (Rees וחב' ב-Br J Hematology משנת 2003). הדגרדציה של RNA ריבוזומלי של רטיקולוציטים מביאה לשיירים של pyrimidine nucleotide הדורשים המרה לנוקלאוזידים כדי לאפשר דיפוזיה אל מחוץ לתאים. פגיעה בתהליך זה גורמת להצטברות של pyrimidine nucleotide תוך-תאי המשתקף כנקודות גסות בבזופילים. מספר אנזימים שונים של 5'-nucleotidase זוהו עם ספציפיות שונה למצעים, למיקום התאי, ולפיזור הרקמתי. רק P5'N type 1 ידוע ככרוך עם חסר של P5'N הידוע גם כ- uridine 5' monophosphate hydrolase deficiency, הגורם לאנמיה המוליטית לא-ספרוציטית מולדת אוטוזומלית רצסיבית (Zanella וחב' באותו כתב עת משנת 2006). המפגע מתאפיין כאנמיה המוליטית קלה עד מתונה, עם רטיקולוציטוזיס עיקשת. מאפיינים נוספים כוללים [[צהבת]] או היפר-בילירובינמיה בלידה, טחול מוגדל, וניקוד גס בבזופילים במשטח דם היקפי. הופעה בו-זמנית של המוגלובין E יכולה לגרום לאנמיה המוליטית חמורה יותר. חסר של P5'N נגרם על ידי שינויים הומוזיגוטיים או compound heterozygous בגן NT5C3A הממוקם באתר הכרומוזומלי 7p4. בדיקה לנוכחות של pyrimidine nucleotides משמשת כסמן עזר לחסר של P5'N, אך אינה ספציפית לאבחון של חסר P5'N מולד. פעילות האנזים תלויה בנוכחות של יון מגנזיום ומעוכבת על ידי תכשירים קושרי מתכות, כגון EDTA. פעילות האנזים מעוכבת על ידי יוני מתכות כבדות כגון עופרת, כספית, נחושת, ניקל וקדמיום, כאשר רמות טוקסיות של מתכות אלו עלולות לגרום הצטברות של פירימידין נוקלאוזידים תוך תאיים. תוצאה נורמלית מצביעה על חסר של pyrimidine nucleotides ועל תפקוד נורמלי של 5'-NT. תוצאה לא נורמלית מצביעה על נוכחות של pyrimidine nucleotides ועל חסר של P5'N ({{כ}}Warang וחב' ב-J Clin Toxicol משנת 2016). ביונקים, פעילות אנזים תאי זה מקיפה מספר צורות של אנזים השונות גנטית ומבנית, או כאלה הקשורות לממברנה או מסיסות, בעיקר ציטוזוליות המאופיינות על ידי ספציפיות רחבה למצעים מסוג nucleoside 5'-monophosphate השונים בהרכב הבסיסים (פורינים או פירימידינים), או בהרכבם הסוכרי (oxy/deoxy-ribose). מאז הסקירה הראשונה על נוקלאוטידאזות הספציפיות לפירימידין, הופיעו סקירות נוספות בנושא (Amici ו-Magni ב- Arch Biochem Biophys משנת 2002).  
 
==דרך הפעולה של האנזים Pyrimidine-5'-nucleotide nucleosidase==
pyrimidine 5'-nucleotide + H<small>2</small>O > D-ribose 5-phosphate + a pyrimidine base,

כלומר שני המצעים של האנזים pyrimidine 5'-nucleotide ומים, בעוד ששני התוצרים של הריאקציה הם בסיס פירימידין ו-D-ribose 5-phosphate. אנזים זה שייך למשפחה של הידרולאזות, ובאופן ספציפי גליקוזידאזות אלו מבצעים הידרוליזה של תרכובות N-גליקוזיליות. שמות נוספים שלו הם pyrimidine nucleotide N-ribosidase וכן Pyr5N ({{כ}}Imada ב-J Gen Appl Microbiol משנת 1967).

==אנליזה תפקודית של מוטנטים של pyrimidine 5′-nucleotidase הגורמים לאנמיה המוליטית לא-ספרוציטית==
חסר האנזים המולד pyrimidine 5′-nucleotidase type 1, נחשב לאנזימופתיה השלישית מבחינת שכיחותה הגורמת להמוליזה לאחר glucose-6-phosphate dehydrogenase ו-pyruvate kinase) ({{כ}}Hirono וחב' ב-Medicine משנת 1988). זוהו 14 מוטציות שונות. הבסיס המולקולרי של המחלה נחקר על ידי לימוד התכונות הביוכימיות של אנזים הבר הריקומביננטי, וארבעה חלבונים וריאנטים (D87V ,L131P ,N179S ו-G230R) הנושאים מוטציות missense שמוצאים במטופלים הלוקים באנמיה המוליטית לא-ספרוציטית. P5′N-1 הוא חלבון יחסית יציב עם יעילות קטליטית זהה לקראת cytidine monophosphate (להלן CMP) ו-uridine monophosphate (להלן UMP). כל החלבונים המוטנטיים שנחקרו הם בעלי תכונות קטליטיות ו/או יציבות טרמית מופחתת, מה שמספק רציונל להבנת ההשפעות הפתולוגיות של המוטציות. למרות השינויים המשמעותיים בפרמטרים הקינטיים וביציבות הטרמית, פעילות האנזים המתגלה באריתרוציטים של מטופלים הומוזיגוטיים למוטציות L131p ו-G230R, מגלה שינויים מתונים. עובדה זו מציעה שחסר ב-P5′N-1 מפוצה על ידי נוקלאוטידאזות אחרות או על ידי מסלולים חלופיים של מטבוליזם נוקלאוטידי. לפיכך, פעילות נוקלאוטידאזות עשויה לא להיות נחשבת כאינדיקטור פרוגנוסטי במטופלים הנפגעים על ידי האנזימופתיה.

האנזים Pyrimidine 5′-nucleotidase type I הוא חבר הקבוצה התפקודית של אנזימים המקטלזים את הדה-פוספורילציה של nucleoside 5′-monophosphates שונים על מנת להפכם לנוקלאוזידים המתאימים. ידוע על שבע 5'-נוקלאוטידאזות באדם שזוהו על פי תכונותיהם הקינטיות ומיקומם בתוך תאים (Bianchi  ו-Spychala ב-J Biol Chem משנת 2003).

P5′N-1 הוא אנזים ציטוזולי המבוטא באופן חזק באריתרוציטים. תפקידו העיקרי הוא הקטבוליזם של UMP ושל CMP, הנובעים בעיקר מדגרדציה של RNA במהלך הבשלות של האריתרוציטים (eRees וחב' ב-Br J Hematol משנת 2003).{{כ}} P5′N-1 הוא בעל פעילויות של phosphotranspherase הספציפיות ל-pyrimidine nucleotides, מה שמציע תפקיד נוסף בקטבוליזם של נוקלאוטידים (Amici וחב' ב-FEBS Lett משנת 1997). התכונות המולקולריות והאנזימטיות של האנזים שנוקה מאריתרוציטים מצביעים על חלבון מונומרי במשקל מולקולרי של 34 קילו-דלטון, ללא קשרים דיסולפידיים או תכולת פוספאט (Amici ו-Magni ב-Arch Biochem Biophys משנת 2002). פעילות האנזים תלויה בנוכחות יוני מגנזיום, והיא מעוכבת על ידי מתכות כבדות כגון Cd<sup>2+</sup> Cu<sup>2+</sup>, Hg<sup>2+</sup>, Ni<sup>2+</sup>, Pb<sup>2</sup>> וכן על ידי תרכובות פעילות כגון p-chloromercuribenzoate. הגן המקודד לאנזים P5′N-1 מכיל 10 אקסונים, והוא מקודד לשני mRNAs  שעברו splicing חלופי. ה-mRNA הקצר יותר  הוא המוביל לחלבון המכיל 288 חומצות אמינו שיש לו מאפיינים של P5′N-1 ({{כ}}Amici וחב' ב-Blood משנת 2000). ה-mRNA הארוך יותר היה צריך לקודד לפוליפפטיד של 297 חומצות אמינו, אך המשמעות של תוספת 11 חומצות אמינו בקצה ה-N טרמינלי אינה ברורה. חסר של P5′N-1 הוא מפגע אוטוזומלי-רצסיבי המאופיין על ידי אנמיה המוליטית לא-ספרוציטית, ניקוד חזק בבזופילים והצטברות של pyrimidine nucleotides בתוך אריתרוציטים (Valentine וחב' ב-J Clin Invest משנת 1974, ו-Vives-Corrons ב-Baillieres Best Pract Res Clin Haematol משנת 2000). {{כ}}14 מוטציות שונות זוהו ברמת ה-DNA, כאשר 4 מתוכן הן מוטציות missense שאינן משפיעות על אורך החלבון, שאר 10 המוטציות (nonsense, השמטים, insertions ו-שינויים באתרי ה-splicing) הן מוטציות המייצרות צורות קצרות יותר של הפוליפפטיד. חסר P5′N-1 בדרך כלל קשור לאנמיה המוליטית קלה או מתונה (Bianchi וחב' ב-Br J Hematol משנת 2003).

==מיצוי של RNA, סינתזה של cDNA, ותת-שיבוט של תוצר PCR==
דם היקפי נאסף ממתנדבי ביקורת. סך RNA בודד מלויקוציטים תוך שימוש ב-TRIzol, תוצרת Life Technologies, ועבר שעתוק היפוכי תוך שימוש ב-hexamer primers אקראיים ו-AMV reverse transcriptase. כל ה-cDNA של P5′N-1 עבר אמפליפיקציה על ידי PCR ({{כ}}94°C, 40 seconds, 72°C, 90 seconds ו-58°C, 40 seconds ב-30 מחזורים, תוך שימוש ב-primers הבנויים על פי הרצף של cDNA, והתוצר הבלתי מעוכל שובט לתוך ווקטור pCR II-TOPO (ערכת שיבוט TA, של Invitrogen (הולנד)). הפלסמיד הריקומביננטי שהתקבל הוגדר כ-pMI 2. ה-insert עבר ריצוף באנלייזר גנטי ABI PRISM 310 (תוצרת Applied Biosystems, Foster City, CA) בשיטת Big Dye termination. הריצוף גילה את ההימצאות של מוטציה "שקטה" בקודון 81 ({{כ}}TAT<TAC) מה שמתאים לפולי-מורפיזם של קודון 92 מתוך 297 חומצות אמינו. 
 
==בדיקת פעילות האנזים==
פעילות האנזים של P5′N-1 נקבעה בטמפרטורה של 37°C על ידי שיטה המבוססת על HPLC על פי Amici וחב' ב-Anal Biochem משנת 1994, עם שינויים קלים תוך שימוש ב-250 × 4.6 mm Synergi Polar reverse phase בקולונת RP. תערובת הריאקציה הסטנדרטית כללה 50 מילימולר של Tris (tris(hydroxymethyl)aminomethane)-HCl ב-pH7.5, {{כ}}1 מילימולר MgCl<sub>2</sub>, {{כ}} 1 מילימולר  dithiothreitol (DTT) ו-1 מילימולר CMP בנפח סופי של 100 מיקרוליטר. יחידה אחת היא כמות האנזים המקטלזת את יצירת 1 מיקרומול של cytidine בדקה, כאשר הפעילות הספציפית  מבוטאת ביחידות של מיליגרם חלבון. הפעילות האנזימטית נמדדה ב-37°C תוך שימוש בריכוזים שונים של CMP או UMP בתנאים זהים לאלה שתוארו למעלה, פרט למצעים. בכל המקרים הריאקציה התחילה על ידי הוספה של CMP או של UMP, ופעילות האנזים נמדדה לפחות ב-10 ריכוזים שונים של מצע. כל המדידות בוצעו בטריפליקטים. הפרמטרים הקינטיים נקבעו על ידי Enzyme Kinetic Module 1.1 עם ערכת SPSS Science Software, Chicago, IL. ה-K<sub>cat</sub> הוא המספר של אירועים קטליטיים /moment ל-active site. {{כ}}K<sub>m</sub> הוא ריכוז המצע בו מהירות הריאקציה היא בחצי מהירות.  היחס K<sub>cat</sub>/K<sub>m</sub> משקף את מידת היעילות בה האנזים ממיר את המצע לתוצר הריאקציה בריכוזי מצע נמוכים.  כל האנזימים נמהלו ל-100 או ל-200 מיקרוגרם/מ"ל ב-20 מילימולר אשלגן פוספאט (pH6.5), 1 מילימולר EDTA ו-2 מילימולר β-mercaptoethanol. דגימות של 50 מיקרוליטר הודגרו למשך שעה להגיע לטמפרטורה נתונה. דגימות בודדות הוסרו בפרקי זמן, קוררו במהרה, ונמדדו על ידי פרוטוקול סטנדרטי. פעילות יחסית חושבה כאחוז של פעילות האנזים לפני הדגרה. t<sub>1/2</sub> הוא פרק הזמן הנדרש על ידי האנזים לאבד 505 מפעילותו ב-5 דקות. 

הבסיסים המולקולריים של חסר P5′N-1 נלמדו על ידי הבנת התכונות הביוכימיות של ה-wild-type ושל ארבעת המוטנטים D87V ,L131P ,N179S ,G230R.  הפעילות הספציפית של wild-type P5′N-1 הייתה 48 U/mg. האנליזה של הקצה ה-N טרמינלי של החלבון מבחינת 10 חומצות האמינו תאמה באופן מושלם את חומצות האמינו הראשונות של צורת 286 חומצות האמינו של P5′N-1. היציבות של החלבון חשובה במיוחד באריתרוציטים בשלים, החסרים את המנגון לסנתז חלבונים. כדי להעריך את הפעילות האנזימטית המופחתת במטופלים הומוזיגוטיים למוטציות, שנגרמה כתוצאה מהרמה המופחתת של P5′N-1 כתוצאה מאי היציבות של החלבון, נבדקה פעילות האנזימים ה-wild type והמוטנט בבדיקות של יציבות טרמית. נמצא שהאנזים ה-wild-type שמר על פעילות מלאה לאחר הדגרה של שעה בטמפרטורה של 46°C. בניגוד לכך, בטמפרטורה זו, שלושה מתוך ארבעת המוטנטים (D87V ,L131P ו-G230R) שאיבדו למעלה מ-50% מפעילותם כבר במהלך 5 הדקות הראשונות של ההדגרה בטמפרטורה של 37°C, ומדידה לאחר מכן של פעילותם השיורית גילתה שאפילו בטמפרטורה זו, L131P ו-D87V, היו מאוד בלתי יציבים. לבסוף, אנליזה טרמית יותר מעמיקה שבוצעה בטווח טמפרטורות של 26°C-60°C אפשרה לקבוע את ערך T<sub>50</sub> לכל האנזימים (כאשר T<sub>50</sub> היא הטמפרטורה בה האנזים מד 50% מפעילותו ב-5 דקות). נמצא ש-T<sub>50</sub> הייתה 52°C עבור wild-type P5′N-1 ועבור המוטנט N179S, בעוד שהמוטנטים L131P, D87V ו-G230R הפגינו ערכים נמוכים בהרבה.

==התכונות הקטליטיות של wild-type P5′N-1 ושל האנזימים המוטנטים==
ערכי הפעילות השיורית המדווחים במטופלים עם אנמיה המוליטית לא-ספרוציטית כתוצאה ממוטציות missense של P5′N-1 נעים בין 2% במוטציית N179S עד 65% במוטציית G230R. לכן, כדי להסביר את הפעילות המופחתת של האנזים במטופלים הומוזיגוטים למוטציות אלה, נלמדו התכונות הקינטיות של ה-wild-type P5′N-1 ושל המוטציה שלו. כל האנזימים הציגו תגובה היפרבולית לשני המצעים, CMP ו-UMP. עבור ה-wild type, ערכי K<sub>cat</sub> כנגד CMP ו-UMP נמצאו בערכי s<sup>-1</sup>{{כ}} 28.11 ו-11.98, בהתאמה; וערכי K<sub>m</sub>  נקבעו כ-0.18 ו-0.056 מילימולר, בהתאמה. היעילות הקטליטית כנגד CMP ו-UMP, הייתה אם כך מאוד דומה,  214 s<sup>-1</sup>  {{כ}} ו-145 מילימולר, בהתאמה.  בכל ארבעת המוטנטיםימ נמצאה ירידה ביעילות הקטליטית אם כי בשיעורים שונים.  ערכי  K<sub>cat</sub> של N179S ושל G230R, עברו שינויים כבדים. לעומת זאת, ערך K<sub>cat</sub> של D87V  לא עבר כל שינוי, ואילו בערך זה עבור האנזים המוטנטי L131P  נמצא שינוי קל. ערכי K<sub>m</sub> עבור G230R  ו-L131P לא השתנו, מה שמצביע על כך ש-CMP ו-UMP הגיבו באופן נורמלי עם אתר הקישור הפעיל. לעומת זאת, המוטנטים N179S ו-D87V הדגימו הגדלות ניכרות בערכי K<sub>m</sub>, בעיקר כנגד UMP. החלבון N179S שהראה שינוי גדול ב-K<sub>cat</sub>, מה שמציע שהוא כרוך ישירות בקישור למצע ולקטליזה (Shinohara ו-Tanaka ב-Hum Genet משנת 1979).

==הוראות לביצוע הבדיקה==
יש לאסוף את הדם במבחנה כימית (פקק צהוב), או במבחנת ספירת דם (EDTA) פקק סגלגל. יש לשלוח את הדם למעבדה כדם מלא במבחנה המקורית, ללא aliquoting. היציבות של הדגימה כאשר היא נשלחת בקירור היא של 20 יום.

==ראו גם==
* [[מדריך בדיקות מעבדה|חזרה לדף מדריך בדיקות מעבדה]]
* [[אבחון תסמנות גנטיות|בדיקות מעבדה - אבחון תסמנות גנטיות]]


{{ייחוס בן עמי}}

[[קטגוריה:בדיקות מעבדה - אבחון תסמנות גנטיות]]
[[קטגוריה:בדיקות מעבדה: גנטיקה]]
[[קטגוריה:בדיקות מעבדה: כימיה בדם]]