נוגדנים כנגד נוירוכונדרין בנסיוב ובנוזל המוח והשדרה

מדריך בדיקות מעבדה
נוגדנים כנגד נוירוכונדרין בנסיוב וב-CSF
שמות אחרים	NCDN; Norbin.
מעבדה	כימיה בנסיוב וב-CSF
תחום	בחינת תסמינים נוירו-ניווניים.
טווח ערכים תקין	שלילי למציאת אוטו-נוגדנים.
יוצר הערך	פרופ' בן-עמי סלע

מטרת הבדיקה

הערכה של נוגדני IgG כנגד נוירוכונדרין (Neurochondrin) על ידי cell-binding assay תוך שימוש בנוזל השדרה של מטופלים עם תסמונת המוחון או תסמונת גזע המוח.

מידע קליני

נוירוכונדרין הוא יעד אנטיגני נוירונלי במצב של ניוון אוטואימוני של המוחון. מטופלים מגיבים לטיפול מדכא את מערכת החיסון ארוך-טווח על ידי יציבות קלינית או אף שיפור (Shelly וחב' ב-Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm משנת 2019).

אינטרפרטציה

תוצאה חיובית תומכת באבחון של תגובה אוטו-אימונית ב-CNS. פנוטיפים נוירולוגיים אופייניים כוללים שיגשון (ataxia) של המוחון, ואנצפליטיס של גזע המוח. יציבות או שיפור נוירולוגי ייתכנו לאחר תרפיה אימונית. תוצאה שלילית אינה שוללת אוטו-אימוניות נוירולוגית או סרטן.

נוירוכונדרין (הידוע גם כ-norbin על שם ההומולוג שלו בעכבר (Istvánffy וחב' ב-Develop Genes Evolut משנת 2004) הוא חלבון שמקודד באדם על ידי הגן NCDN. הגן מקודד לחלבון ציטופלזמטי עתיר-leucine, הדומה מאוד לחלבון norbin בעכבר האחראי לרגולציה שלילית של הפוספורילציה של פרוטאין קינאז 2 התלוי ב-Ca/calmodulin, ועשוי להיות חיוני לתהליכי לימוד מֶרְחָבִיים. Norbin יכול לאפנן פעילות איתות של glutamate receptor 5 מטבוטרופיים, כאשר עכברים עם שמט של NCDN הם בעלי תכונות פנוטיפיות שמוצאים בדרך כלל במודלים של סכיזופרניה במכרסמים, כולל פגיעה ב-prepulse inhibition (‏Wang וחב' ב-Science משנת 2009). המושג prepulse inhibition מתייחס לתופעה נוירולוגית בה קדם-גירוי חלש יותר (prepulse) מעכב את תגובת האורגניזם לגירוי מאוחר יותר המבוסס על רפלקס חזק (pulse), לרוב תוך שימוש ב-startle refex אשר בבעלי-חיים כולל האדם היא תגובה תת-מודעת הגנתית לגירוי מאיים, כגון רעש פתאומי, או תנועה חריפה. בדרך כלל, ה-startle response היא תגובה רפלקסיבית שמקורה בגזע המוח, שנועדה להגן על חלקים פגיעים כמו המפרקת או העיניים. יתרה מכך, הביטוי של חלבון norbin שונה במוח הסכיזופרני (Matosin וחב' ב-Acta Neuropathol משנת 2015). תפקיד נוסף שממלא norbin הוא ברגולציה של תגובות אנטי-מיקרוביאליות בנויטרופילים (Pantarelli וחב' ב-Blood Advances משנת 2021). החלבון נוירוכונדרין משרה פעילות ספיגה של hydroxyapatite בתאי מח העצם העמידים ל-bafilomycin A1, שהוא מעכב ספיגה המתווכת על ידי מקרופאגים ואוסטאוקלסטים. הביטוי של הגן ממוקם בכונדרוציטים, אוסטאובלסטים, ואוסטאוציטים בעצם וכן בהיפוקמפוס ובשכבת תאי Purkinje במוחון (Ishiduka וחב' ב-Biochim Biophys Acta משנת 1999).

נוירוכונדרין הוא אנטיגן יעד נויורונלי בדגנרציה אוטו-אימונית של המוחון

שלושה מטופלים עם שיגשון תת-חריף כרוני של המוחון, ומטופלי ביקורת, עברו הערכה קלינית ונוירו-פסיכולוגית מפורטת, במקביל להערכה סטרוקטורולית על ידי MRI. דגימות נסיוב ו-CSF נחשפו להערכה מקיפה של סריקה אוטו-אימונית על ידי indirect immunofluorescence assay (להלן IFA) ו-immunoblot. אימונו-פרסיפטציה עם ליזאט של ההיפוקמפוס ושל המוחון בשילוב עם אנליזה מס-ספקטרומטרית שימשו לזהות את הנוירוכונדרין כאוטו-אנטיגן, שאומת על ידי ביטוי רקומביננטי בתאי HEK293. רב-פאראמטר של flow cytometry בוצע על דם היקפי ועל CSF, והדם ההיקפי נחשף ל-T-cell receptor spectratyping. תוצאות מחקר זה היו מרשימות. מטופלים היו אלה עם תסמונת תת-חריפה עד כרונית של המוחון ושל גזע המוח. תוצאות MRI הראו אטרופיה של החומר האפור בקליפת המוח ובמוחון, שהייתה כרוכה עם ניוון נוירו-אקסונלי. סריקת IFA גילתה פעילות חזקה של IgG בנסיוב וב-CSF, עם שכבות גרנולריות בהיפוקמפוס ובמוחון, אך לא עם פאנל של 30 אוטואנטיגנים נוירונליים המבוטאים באופן רה-קומביננטי. phenotyping אימוני גילה הצטברות בתוך ה-thecum של תאי T ו-B במהלך הפאזה החריפה אך לא הכרונית של המחלה. Spectratyping של הקולטן של תא-T, הציעה תגובה ספציפית של תאי T המלווה את יצירת נוגדנים עצמיים כנגד נוירוכונדרין. לא נמצאה תגובה דומה של פעילות נוירוכונדרין בדגימות ביקורת עם תסמונות נוירולוגיות שונותת כגון טרשת נפוצה, סוג אטרופיה רב-סיסטמית של המוחון, שיגשון תורשתי של המוחון, מפגעים נוירולוגיים אחרים, או בדגימות של אנשים בריאים.

אוטו-נוגדנים כנגד מרכיבים נוירונליים כרוכים עם מספר מפגעים חמורים של ה-CNS המכוונים על ידי מערכת החיסון. מפגעים אלה יכולים להשפיע בעיקר על החומר האפור באזורי מוח שונים כגון ה-archicortex של המערכת הלימבית, על ה-neocortex, על הגנגליה הבזלית, כמו גם על קליפת המוחון ועל גזע המוח (Melzer וחב' ב-Curr Opin Neurol משנת 2012). בשנים האחרונות, דווח מספר ניכר של אוטו-נוגדנים כנגד אנטיגנים על ממברנות נוירונליות כגון הקולטן לנוירו-טרנסמיטורים, או כנגד חלבונים של תעלות יוניות, וכן כנגד מולקולות ספיחה, כאשר לכל הנוגדנים הללו פוטנציאל פתוגני. בין האוטו-נוגדנים האלה ניתן למנות נוגדנים כנגד aquaporin 4 (‏Lennon וחב' ב-J Exp Med משנת 2005), כנגד הקולטן של NMDA (‏Dalmau וחב' ב-Lancet Neurol משנת 2009), כנגד הקולטנים 1 ו-2 של AMPA (‏Lai וחב' ב-Ann Neurol משנת 2009), כנגד הקולטנים של GABAA ו- GABAB (‏Lancaster וחב' ב-Lancet Neurol משנת 2010), כנגד LGI1 (‏Lai וחב' ב-Lancet Neurol משנת 2010), כנגד CASPR2 (‏Lancaster וחב' ב-Ann Neurol משנת 2011), כנגד הקולטן של גליצין (Hutchinson וחב' ב-Neurology משנת 2008), כנגד DPPX (‏Boronat וחב' ב-Ann Neurol משנת 2013), כנגד הקולטנים המטבוטרופים של גלוטמאט 1 ו-5 (‏Lancaster וחב' ב-Neurology משנת 2011), וכן האוטו-נוגדנים כנגד IgLON5 (‏Sabater וחב' ב-Lancet Neurol משנת 2014). אם האוטו-נוגדנים מכוונים כנגד אנטיגנים נוירונליים תוך תאיים, כגון Ma/Ta, Ri ,Yo, Hu ו-CV2/CRMP5, הם נחשבים לתופעה מקבילה של תגובה אוטו-אימונית פארא-נאופלסטית המודרכת על ידי תאי-T. עם זאת, תוארו אוטו-נוגדנים כנגד אנטיגנים תוך-תאיים ללא קשר הדוק לסרטן (Solimena וחב' ב-N Eng J Med משנת 1988). בגלל הגישה המוגבלת של נוגדנים אלה לאנטיגני היעד שלהם בתוך התא, אין להם כנראה פוטנציאל פתוגני in vivo. ביצוע של multicolor flow cytometry של דם היקפי ושל ה-CSF של מטופלים ושל דגימות הביקורת נעשה על בסיס ערכות מסחריות.

איפיון של הנוגדנים העצמיים במטופלים

צביעת IFA בלתי-ישירה של הנסיוב וה-CSF תוך שימוש בחתכים מקוררים של רקמת המוח, הראתה צביעה גרנולרית-עדינה של IgG של השכבה הגרנולרית והמולקולרית שהייתה חזקה יותר בהיפוקמפוס של חולדה בהשוואה לצביעה של המוחון בחולדות ובפרימטים. חתכים חִצִּיים (סגיטליים) של מוח עכבר הראו פעילות של נוגדנים עצמיים בחלקי מוח שונים. בנוסף, גם היפותלמוס של פרימטים, כמו גם המוחון, ה-medulla spinalis, וכן ההיפוקמפוס נצבעו בדומה. למטופלים היו טיטרים ממוצעים של הנסיוב ושל ה-CSF של 1:200/1:24, שנקבעו עם ההיפוקמפוס של חולדה המתאים למדדי נוגדנים הגדולים מ-4 המצביעים על סינתזת נוגדנים שחלה בתוך ה-thecum. אנליזות ספציפיות בוצעו בתאי HEK293 רקומביננטיים המבטאים 30 אוטו-אנטיגנים נוירוליים: Hu ,Yo ,Ri ,CV2 ,SOX1 ,PNMA1 ,PNMA2 ,ITPR1 ,Homer 3 ,CARP VIII ,ARHGAP26 ,ZIC4 ,DNER/Tr ,GAD65 ,GAD67 ,amphiphysin ,recoverin ,DPPX , AMPA ,mGluR1 ,mGluR5) ,LGI1 ,CASPR2 ,AQP4 (M1 and M23) ,MOG ,ATP1A3 הקולטן של GABAB, הקולטן של גליצין והקולטנים של גלוטמאט מסוג NMDA, לא מצאו כל פעילות ספציפית.

זיהוי של נוירוכונדרין כיעד אוטואנטיגני נוירונלי

משקעים אימוניים (immunoprecipitates) מתמצית של היפוקמפוס ומוחון של חולדה שהושגו על ידי נסיוב של מטופלים, מצאו חלבון במשקל מולקולרי של 75 קילו-דלטון באלקטרופורזה על גבי sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel, שלא הושקע כאשר התמציות הודגרו עם נסיוב נורמלי כביקורת. החלבון שהושקע היה זהה לנוירוכונדרין ממקור של Rattus norvegicus. ליזאטים של היפוקמפוס ושל מוחון של חולדה, הודגרו עם מיהול 1:33 של נסיוב מטופלים או של נסיוב ביקורת. קומפלקסים אימוניים בודדו על ידי ספיחתם לגרגירים מגנטיים המצופים עם חלבון G, עברו אלוציה עם SDS, והורצו על ג'ל פולי-אקריל-אמיד הספוג ב-SDS, ועברו אנליזה על ידי צביעת הג'ל עם Coomassie קולואידלי, או על ידי הרצתם ב-Western blot תוך שימוש בנוגדן רב-שבטי של ארנבת אנטי-נוירוכונדרין. האנליזה ב-Western blot של immunoprecipitates שהתקבלו מנסיובים של מטופלים אך לא מאלה של אנשי ביקורת גילתה ריאקציה חזקה עם חלבון בעל משקל מולקולרי של 75 קילו-דלטון תוך שימוש בנוגדן רב-שבטי כנגד נוירוכונדרין. כאשר נעשה שימוש ב-IFA, נוגדנים מארנבת כנגד נוירוכונדרין יצרו מתווה פלואורסצנטי בהיפוקמפוס של חולדה, הזהה למתווה המתקבל עם נסיובים של מטופלים. כהוכחה לזיהוי נכון של האנטיגן, הדגימות של המטופלים נבחנו על ידי IFA תוך שימוש בתאי HEK293 שעברו טרנספקציה וביטאו נוירוכונדרין. כל דגימות הנסיוב וה-CSF הגיבו עם התאים המבטאים בטיטר הגבוה פי-10 בהשוואה לטיטרים של רקמה ובאופן עקבי כאשר תת הקבוצה של הנוגדן הייתה IgG1. כל הדגימות הגיבו עם נוירוכונדרין רקומביננטי ב-immunoblot תוך שימוש בליזאט של נוירוכונדרין מתאי HEK293. בניגוד לכך, תאים שהם mock-transfected לא הדגימו כל קישור ספציפי של נוגדנים. התגובה של אוטו-נוגדנים של מטופלים עם הרקמה יכולה הייתה להימנע על ידי קדם-הדגרה עם ליזאט של תאי HEK293 המכיל נוירוכונדרין.

נוירוכונדרין הוא חלבון במשקל מולקולרי של 75 קילו-דלטון, עם זהות של חומצות אמינו של 8% בין חולדות, עכברים וחלבונים אורתולוגיים של אדם (Mochizuki וחב' ב-Biochim Biophys Acta משנת 1999). במוחות של מכרסמים בוגרים, נוירוכונדרין מבוטא ביותר במוחון, בעמיגדלה, בהיפוקמפוס, ובאופן יותר מתון ב-striatum ובקליפת המוח (Istvanffy וחב' ב-Dev Genes Evol משנת 2004, ו-Shinozaki וחב' ב-Brain Res Mol Brain Res משנת 1999). נוירוכונדרין מבוטא באופן ספציפי בנוירונים בפיזור סומטו-דנדריטי (Shinozaki וחב' ב-Mol Brain Res משנת 1999), ונראה שהוא ממוקם בעיקר בציטוזול. בהקשר זה, נוירוכונדרין נמצא מגיב עם הקולטנים של חלבון-G, כגון הקולטנים המטבוטרופיים של גלוטמאט mGluR1 ו-mGluR5, הכרוכים בפלסטיות ארוכת הטווח של הסינפסה של המוחון ושל ההיפוקמפוס (Wang וחב' ב-Science משנת 2009). אוטו-נוגדנים כנגד mGluR1 תוארו בדגנרציה פארא-נאופלסטית של המוחון, הקשורה ללימפומה ע"ש הודג'קין (Shams'ili וחב' ב-Brain משנת 2003, ו-Marignier וחב' ב-Arch Neurol משנת 2010), והם גורמים לחסכים בקואורינציה מוטורית על ידי שילוב של השפעות חריפות על העברת איתות בסינפסות ופלסטיות עם השפעות דגנרטיביות כרוניות בתאי Purkinje במוחון (Coesmans וחב' ב-Ann Neurol משנת 2003). הפרעות בלימודים ובזיכרון לא תוארו במטופלים אלה. במקרים של השפעות פתוגניות של נוגדנים אנטי-נוירוכונדרין, הפרעה בלימודים ובזיכרון שמקורה בהיפוקמפוס, מצופה להתרחש עם הפרעות בתפקוד המוחון, מה שאינו קורה במטופלים במחקר זה. מסקנת המחקר היא שנוירוכונדרין הוא אנטיגן נוירונלי תוך-תאי כנגדו פועלים מספר נוגנים עצמיים בתהליך הדגנרציה (Ifergan וחב' ב-Brain משנת 2015, Becker וחב' ב-J Neurol Neurosurg Psychiatry משנת1997, ו-Saiz וחב' ב-Neurology משנת 2012). מחסום דם-מוח יכול להיות שונה באזורי מוח שונים, מה שתורם להעדפת הנדידה של הנוגדנים נגד נוירוכונדרין למוחון ולא לחומר האפור, מה שמייחס לנוירוכונדרין תפקיד במנגנון דגנרציה זה של השיגשון במוחון.

                                                                                                                                                                                                             ==הוראות לביצוע הבדיקה==

את הדם יש ליטול במבחנה כימית (פקק אדום או צהוב), ויש לסרכז את הדם בקירור. את נוזל הדגימה העליון יש להקפיא. יציבות הדגימה: כאשר מדובר ב-CSF, דגימה נשמרה בטמפרטורת החדר יציבה למשך 72 שעות, בעוד שדגימה הנשמרת בקירור (מועדפת) ודגימה שהוקפאה יציבות למשך 28 יום. .ש לפסול את הדגימה אם היא מאוד המוליטית, מאוד ליפמית או מאוד איקטרית.