הבדלים בין גרסאות בדף "PCSK9 או Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9"
שורה 133: | שורה 133: | ||
===ניסויים קליניים עדכניים עם מעכבי PCSK9=== | ===ניסויים קליניים עדכניים עם מעכבי PCSK9=== | ||
− | + | ב-15 במרץ 2015 התפרסמו ב-N Eng J Med ברצף 2 מאמרים המדווחים על תוצאות ניסויים בהם נבחנו 2 תכשירים החוסמים את פעילות האנזים PCSK9 שנועדו להקל על פינוי LDL-C מהצירקולציה על ידי הקולטנים של ליפופרוטאין זה. שני התכשירים, הנוגדנים החד שבטיים, evolocumab ו-alirocumab נמצאו מפחיתים את רמת LDL-C בדם בערך ב-60% יותר בהשוואה לתרפיה המקובלת. | |
− | ב-15 | ||
הניסויים עליהם דיווח Sabatine ידועים כניסויי OSLER-1 ו-OSLER-2 או Open-Label Study of Long-Term Evaluation against LDL-C. מדובר בניסויים בהם evolocumab ניתן בתוספת לטיפול הסטנדרטי למשך תקופה של 11 חודשים, והתברר שהוא מפחית את רמת LDL-C בממוצע ב-61% בהשוואה לאלה שקבלו רק את הטיפול הסטנדרטי. כמו כן נמצא שהטיפול המשולב הזה הפחית את שכיחותם של אירועים קרדיו-וסקולאריים כמו MI, אי-ספיקת לב המחייבת אשפוז, ומוות. | הניסויים עליהם דיווח Sabatine ידועים כניסויי OSLER-1 ו-OSLER-2 או Open-Label Study of Long-Term Evaluation against LDL-C. מדובר בניסויים בהם evolocumab ניתן בתוספת לטיפול הסטנדרטי למשך תקופה של 11 חודשים, והתברר שהוא מפחית את רמת LDL-C בממוצע ב-61% בהשוואה לאלה שקבלו רק את הטיפול הסטנדרטי. כמו כן נמצא שהטיפול המשולב הזה הפחית את שכיחותם של אירועים קרדיו-וסקולאריים כמו MI, אי-ספיקת לב המחייבת אשפוז, ומוות. | ||
שורה 142: | שורה 141: | ||
נמצא ש-evolocumab הפחית ב-12 שבועות ראשונים של הניסוי את רמת LDL-C ב-61% מרמה ממוצעת של 120 מיליגרם לד"ל ל-48 מיליגרם לד"ל, בהשוואה לטיפול הסטנדרטי (p<0.001). רמת הפחתה זו נשמרה עד 48 שבועות של הניסוי. שיעור אירועים קרדיו-וסקולאריים לאחר שנה מהטיפול, היה 2.18% במקבלי הטיפולים הסטנדרטיים, לעומת 0.95% במטופלי evolocumab (הפחתה של 47% באירועים קרדיו-וסקולאריים (p=0.003). | נמצא ש-evolocumab הפחית ב-12 שבועות ראשונים של הניסוי את רמת LDL-C ב-61% מרמה ממוצעת של 120 מיליגרם לד"ל ל-48 מיליגרם לד"ל, בהשוואה לטיפול הסטנדרטי (p<0.001). רמת הפחתה זו נשמרה עד 48 שבועות של הניסוי. שיעור אירועים קרדיו-וסקולאריים לאחר שנה מהטיפול, היה 2.18% במקבלי הטיפולים הסטנדרטיים, לעומת 0.95% במטופלי evolocumab (הפחתה של 47% באירועים קרדיו-וסקולאריים (p=0.003). | ||
− | במאמר השני שהופיע ב-15 | + | במאמר השני שהופיע ב-15 במרץ 2015 ב-NEJM, דווח על הניסוי של Robinson וחב' הידוע כניסוי ODYSSEY עם alirocumab: למרות שניסויים קודמים הראו הפחתה משמעותית ברמת LDL-C לאחר 8-12 שבועות טיפול משולב של alirocumab עם סטטין, בעלי ניסוי ODYSSEI בקשו לבחון את יעילות הטיפול המשולב לאחר תקופות מעקב ארוכות יותר. ניסוי ODYSSEI כלל 2,341 משתתפים (63.2% מתוכם גברים, בגיל ממוצע של 60 שנה) שהיו בדרגת סיכון גבוהה לאירועים קרדיו-וסקולאריים, עם רמות LDL-C של לפחות 70 מ"ג/ד"ל, המטופלים במינונים המרביים המקובלים של סטטינים. |
משתתפי הניסוי חולקו באקראי לקבוצת מוזרקים תת-עורית אחת לשבועיים עם 150 מ"ג של alirocumab שכללה 1,553 איש, לעומת 788 מוזרקים עם פלצבו. לאחר 24 שבועות מתחילת הניסוי, כבר נמצא שרמת LDL-C הייתה נמוכה ב-61% בקבוצת המטופלים עם alirocumab בהשוואה לקבוצת הפלצבו בה הפחתת LDL-C הייתה של 0.8% בלבד (p<0.001). הרמה הממוצעת של LDL-C בקרב מטפלי הנוגדן הייתה 48 מ"ג/ד"ל, לעומת 119 מ"ג/ד"ל בקבוצת הפלצבו. בנוסף, רמות מופחתות אלו של LDFL-C נותרו בעינן משך מעקב של 78 שבועות. במטופלים ב-alirocumab בנוסף לסטטין, נמצאה ירידה של 48%באירועים קרדיו-וסקולאריים בהשוואה לאלה שטופלו בעזרת סטטינים בלבד (1.7% לעומת 3.3% עם מובהקות של p=0.02. | משתתפי הניסוי חולקו באקראי לקבוצת מוזרקים תת-עורית אחת לשבועיים עם 150 מ"ג של alirocumab שכללה 1,553 איש, לעומת 788 מוזרקים עם פלצבו. לאחר 24 שבועות מתחילת הניסוי, כבר נמצא שרמת LDL-C הייתה נמוכה ב-61% בקבוצת המטופלים עם alirocumab בהשוואה לקבוצת הפלצבו בה הפחתת LDL-C הייתה של 0.8% בלבד (p<0.001). הרמה הממוצעת של LDL-C בקרב מטפלי הנוגדן הייתה 48 מ"ג/ד"ל, לעומת 119 מ"ג/ד"ל בקבוצת הפלצבו. בנוסף, רמות מופחתות אלו של LDFL-C נותרו בעינן משך מעקב של 78 שבועות. במטופלים ב-alirocumab בנוסף לסטטין, נמצאה ירידה של 48%באירועים קרדיו-וסקולאריים בהשוואה לאלה שטופלו בעזרת סטטינים בלבד (1.7% לעומת 3.3% עם מובהקות של p=0.02. | ||
שורה 153: | שורה 152: | ||
===רמות PCSK9 בפלזמה מוגברות באוטם שריר הלב=== | ===רמות PCSK9 בפלזמה מוגברות באוטם שריר הלב=== | ||
− | |||
אחת הסוגיות המעניינות בהקשר של PCSK9 היא האם רמות מוגברות של אנזים זה כרוכות במצב של מחלת-לב כלילית (CAD), ועוד יותר מכך האם רמה מוגברת של PCSK9 כרוכה באופן ישיר עם התנתקות רובד טרשתי וגרימת התקף-לב? | אחת הסוגיות המעניינות בהקשר של PCSK9 היא האם רמות מוגברות של אנזים זה כרוכות במצב של מחלת-לב כלילית (CAD), ועוד יותר מכך האם רמה מוגברת של PCSK9 כרוכה באופן ישיר עם התנתקות רובד טרשתי וגרימת התקף-לב? | ||
גרסה מ־18:44, 27 בנובמבר 2017
מדריך בדיקות מעבדה | |
Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 | |
---|---|
שמות אחרים | PCSK9, או FH3; וכן autosomal dominant hypercholesterolemia 3 או ADH3 וכן neural apoptosis regulated convertase 1 או NARD-1 proprotein convertase PC9 ;subtilisin/kexin-like protease PC9; וכןLDLCQ1. |
תחום | הערכת סמן לאירועים קרדיו-וסקולאריים |
טווח ערכים תקין | סך-PCSK9 בפלזמה 302.9±108.6 ננוגרם/מ"ל; PCSK9-חופשי-153.2±39.7 ננוגרם/מ"ל. |
יוצר הערך | פרופ' בן-עמי סלע |
ראו גם – מעכבי PCSK9 לטיפול בהיפרכולסטרולמיה - PCSK9 inhibitors for the treatment of hypercholesterolemia
הגילוי של PCSK9
היפר-כולסטרולמיה משפחתית (להלן FH) היא צורה אוטוזומאלית שולטנית של דיסליפידמיה המתאפיינת על ידי רמות מוגברות של LDL-C, שהן בדרך כלל מעל אחוזון 95th מותאם לגיל ומין. מעבר לתסמינים פתוגנומוניים כגון קסנתומה גידית וארקוס קדם-סנילית של הקרנית, אלה עם FH נמצאים בסיכון מוגבר באופן חד לתרחישים קרדיו-וסקולאריים בגיל מוקדם, בדרך כלל בעשור הרביעי או החמישי (Hobbs וחב' ב-Human mutatation משנת 1992). בערך 5-10% מהפרטים עם פנוטיפ של FH הם בעלי מוטציות במקטע הקושר-ליגנד של אפוליפופרוטאין B, המרכיב החלבוני של חלקיק LDL המגיב עם הקולטן LDLR.
באוכלוסייה הכללית ישנם 2 סוגי היפר-כולסטרולמיה משפחתית: אלה שהם הטרוזיגוטיים לפגם הגנטי מהווים 1 ל-200 עד 500 איש באוכלוסייה, ובהם רמת LDL יכולה להיות מוגברת פי-2 מהרמה הנורמאלית ולהגיע לערכים שמעל 190 מיליגרם/ד"ל. אלה שהם הומוזיגוטיים לפגם, והמפגע אצלם חמור יותר, מהווים רק אחד למיליון אנשים, כלומר זו צורה מאוד נדירה, ובהם ערכי LDL עלולים להיות פי-6 גבוהים יותר מאשר באנשים בריאים (650-1,000 מיליגרם/ד"ל). הבעיה ב-FH נעוצה ברמה נמוכה של הקולטן של LDL בתאי הכבד נמוכה, וכך גדלה רמתו בפלזמה. למרות טיפולים אינטנסיביים עם סטטינים, עם או בלי ezetimib, רבים מהמטופלים לא משיגים את יעדי הריכוזים הרצויים של LDL.
בעשור האחרון החל מתפתח סיפורה של משפחת תכשירים חדשה, ומדובר בנוגדנים חד-שבטיים המגיבים עם האנזים PCSK9, מנטרלים את פעילותו ועשויים להביא להפחתת רמת LDL-C. הסיפור החל בשנת 2003 עם פרסום מאמר ב-Nature Genet, של קבוצת חוקרים צרפתיים בראשות Abifadel, תחת הכותרת:" מוטציות ב-PCSK9 גורמות למפגע אוטוזומלי-שולטני של היפר-כולסטרולמיה".
במחקרם תארו Abifadel וחב' 2 משפחות בהן התגלו באנזים זה מוטציות שגרמו אצלן להיפר-כולסטרולמיה, לרמה גבוהה מאוד של LDL-C ולתחלואה כלילית קשה. כדי להבין את משמעות מוטציות אלו בוויסות פעילותו של הקולטן ל-LDL-C על פני התאים, יצרו החוקרים עכברים טרנסגניים שהוחדר להם הגן הפגום ל-PCSK9, ואכן נמצאו בעכברים אלה רמות נמוכות ביותר של LDLR בכבד, ובהתאם רמת LDL-C גבוהה בדם, שכן בהעדר הקולטן הכבדי ל-LDL-C, יימנע קישורו של האחרון לתאי הכבד, תיפגם קליטתו בתוכם וגריעתו מהדם.
בשנת 2005 הראו Cohen ו-Hobbs במאמר ב-Nat Genet, שב-2% מבין האפרו-אמריקאים נמצאת אחת מתוך 2 מוטציות nonsense ב-PCSK9 שגורמת אצלם דווקא להפחתת ריכוזי LDL-C בערך ב-30%, וכן נמצאה באוכלוסייה הלבנה בארה"ב מוטציית missence המפחיתה את רמת LDL-C בדם ב-15%. באופן דרמטי עוד יותר התפרסם בשנת 2007 ב-Atherosclerosis מאמר שתיאר אוכלוסייה מסוימת בדרום אפריקה, בה נמצא שאובדן הומוזיגוטי של פעילות האנזים PCSK9, מפחית את רמת LDL-C בפלזמה עד כדי התחום הנמוך במיוחד של 15 מיליגרם/ד"ל.
כלומר, עד כה התבררה מציאותם של 2 סוגי מוטציות ב-PCSK9: האחת מסוג "gain-of-function" כגון זו שהתגלתה במחקר המקורי בצרפת, בה המוטציה מגבירה את פעילות האנזים PCSK9 ומפחיתה את רמת הקולטנים ל-LDL, ולעומתה מוטציה מסוג "Loss-of-function" המפחיתה את פעילות האנזים האמור ועל ידי כך משתמרת רמת הקולטנים LDLR. נכון לשנת 2015, זוהו רק 4 בני-אדם עם חסר מוחלט של האנזים PCSK9, ובאלה רמת LDL-C אמנם נמוכה ביותר, אך הם בבריאות מלאה מה שמוכיח שחסר אנזים זה אינו כרוך בפגיעה פיזיולוגית כלשהי. מוטציות "Loss-of-function" בגן של PCSK9 שכיחות יותר ממוטציות "Loss-of-function" בגן זה.
הגן המקודד ל-proprotein convertase אנזים השייך לתת-משפחת proteinase K של משפחת subtilase שהם סרין פרוטאזות דמויי-subtilisin. האנזים PCSK9 נקשר למקטע EGF-A או epidermal growth factor-like repeat A של הקולטן של LDL (להלן LDLR) ומשרה את הריסתו. רמות מופחתות של LDLR גורמות למטבוליזם מופחת של LDL-C, מה שגורם להיפר-כולסטרולמיה. על פי Seidah וחב' ל-PCSK9 יש גם תפקיד בתהליך ההתמיינות (differentiation) של נוירונים בקליפת המוח. ואריאנטים של PCSK9 יכולים להפחית או להגדיל את רמת כולסטרול בצירקולציה.
בסיס פיזיולוגי
Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (להלן PCSK9) הוא אנזים פרוטאוליטי המבוטא בעיקר בכבד שמשקלו המולקולארי הוא 62 אלף דלטון, המקודד באדם על ידי הגן PCSK9 הממוקם על הזרוע הקצרה (p) של כרומוזום 1 בעמדה 1p32.3 (עפ"י Seidah וחב' ב-Prc Natl Acad Sci USA משנת 2003). גנים דומים ניתן למצוא במינים רבים. PCSK9 מסונתז כזימוגן בלתי פעיל, כיוון שיש במבנהו מקטעים פפטידיים החוסמים את פעילותו, ובהמשך פעילותו הפרוטאוליטית של האנזים proprotein convertases ברטיקולום האנדופלזמטי מביאה לשפעול של PCSK9 על ידי ביקוע פפטיד קצר, אך זה נותר צמוד לאתר הקטליטי של האנזים PSCK9. ביקוע האוטו-קטליטי זה נדרש כדי לאפשר את הפרשת PSCK9 מהתאים, אך כל זמן שהפפטיד המבוקע (prodomain) נותר צמוד לאתר הקטליטי של החלבון, הוא חוסם חלקית את יכולת האנזים להיקשר למצעים שלו ולבקע אותם.
המשמעות הקלינית של PCSK9 היא מעורבותו בהומאוסטאזיס של כולסטרול.
התצפית לפיה PSCK9 נקשר לקולטנים של LDL ומביא להפחתת רמתם, הודגמה במעבדה של Jay Horton בדאלאס, באופן לא צפוי. Horton פרסם בשנת 2007ב- J Biol Chem, שלמעשה ניתן היה לשמר את יכולת PSCK9 להנמיך רמת הקולטנים ל-LDL בתאי כבד מסוג HepG2 בתרבית, גם כאשר האתר הקטליטי של PSCK9 חסום ואינו פעיל. כלומר, לכאורה אין צורך בפעילות קטליטית של PSCK9 כדי להשיג את היעד של פגיעה בקולטנים ל-LDL. אם כך נותר מסתורי מנגנון הפעולה של PSCK9, אך הוא החל להתברר לאחרונה:
PSCK9 נקשר לקולטן LDL על פני שטח התאים, אך הסרת קולטנים אלה דורשת את החדרת הקומפלקס הנוצר אל תוך התאים. לאחר החדירה לתא בתוך חלקיק endosome, הסביבה החומצית בתוך האנדוזום מגבירה את הזיקה של PKSC9 לקולטן ל-LDL פי-150 בקירוב. PSCK9 נקשר אז לאזור דמוי EGF (epidermal growth factor) על פני קולטן זה, אזור שהוא חיוני להעברה של הקולטן באופן סדיר מהאנדוזומים בציטופלזמת התאים אל שטח פני התאים, לאחר שהקולטן משתחרר בתוך האנדוזום ממטען ה-LDL אותו החדיר לתא. למעשה, קישור PSCK9 לקולטן ל-LDL מביא להסטת הקולטן ממסלולו הרגיל לכיוון שטח הפנים של התא, ומכוון אותו דווקא אל הליזוזומים בתא, אותם חלקיקים ההורסים את הקולטן, ומונעים את חבירתו לשטח פני התא.
אחד המחקרים שהתפרסם ב-2009 ב-J Lipid Res, מצא 2 מוטציות בשיירי חומצות אמינו 374 ו-127 על פני PSCK9, שהביאו להפחתת מספר הקולטנים ל- LDL. המוטציה בשייר 374 שהיא החשובה בין השתיים, מגבירה את הזיקה של PSCK9 לקולטן ל- LDL, וממילא מסייעת לגריעת קולטן זה מפני התאים. מעניין לציין שחומצת האמינו "התקנית" בעמדה 374 היא חומצה אספרטית, ולה דווקא יש זיקה נמוכה במיוחד לקולטן ל-LDL , מה שמרמז אולי לכך שדווקא האבולוציה "מעדיפה" אינטראקציה בזיקה נמוכה ככל האפשר בין PCSK9 לבין הקולטן ל-LDL. מתברר שאנזים PSCK9 בו מתקיימות 2 המוטציות בעמדות 127 ו-374, מוטציות D374Y ו-S127R, הוא בעל פעילות הגדולה פי-70 מזו של צורת PSCK9 התקינה, בהפחתת מספר הקולטנים של LDL. מוטציות מסוג אלה התגלו בשעתו על ידי הקבוצה הצרפתית במה שהתחיל את "עידן ה-PCSK9".
הבנת הפיזיולוגיה של האנזים PSCK9 דרבנה מחקרים בכיוונים שימושיים כגון שיטות אנליטיות במעבדה בעיקר בשימוש בנוגדנים חד-שבטיים למדוד את רמת ה- PSCK9 בנסיוב וכן ניסיון להשרות יצירה של PSCK9 בלתי פעיל קטליטית, וזאת בגישה לנסות ולהגביר את רמת הקולטנים ל-LDL. הניסויים בעכברים הניחו את היסוד לגישה "האנושית" מן ההיבט של PSCK9. ביטוי-יתר של PSCK9 בעכברים טרנסגניים, או עירוי של PSCK9 ריקומביננטי לעכברים הביא להפחתת הרמות של הקולטן ל-LDL על פני תאים הפאטוציטים ולהיפר-כולסטרולמיה. המשמעות של ניסויים אלה בחיות הייתה ברורה: חסימת היכולת של PSCK9 להרוס את קולטני LDL, תתבטא בירידה ברמת LDL בפלזמה.
תפקידו של PCSK9 בפירוק הקולטן ל-LDL-C
האנזים PCSK9 פועל על ידי הפחתת כמות הקולטנים ל-LDL על פני ההפאטוציטים. עובדה זו הודגמה לראשונה במודל של עכברים על ידי Park וחב' ב-J Biol Chem משנת 2004, ע"י Maxwell וחב' ב-Proc Natl Acad Sci USA משנת 2005, וכן על ידי Lalanne וחב' ב- Lipid Res משנת 2005, ו-Rashid וחב' ב-Proc Natl Acad Sci משנת 2005. לאחר מכן נמצא שעובדה זו נכונה גם באדם, כאשר מוטציות הפוגעות בפעילות PCSK9 מפחיתות רמת LDL-C בפלזמה (Zhao ב-Am J Human Genet משנת 2006 ו-Hooper וחב' ב-Atherosclerosis משנת 2007). ניסויים בחיות knockout הראו בבירור ש-PCSK9 נקשר ל-LDLR לצורך השמדתו (Lambert ב-Endocrinol משנת 2006 ו-Benjannet וחב' ב-J Biol Chem משנת 2006.
ההדגמה האלגנטית ביותר של גורל הקולטן אליו נקשר LDL, כתוצאה מפעילות PCSK9 נעשתה על ידי Lagace וחב' ב-J Clin Invest משנת 2006. אנזים זה הוא סרין-פרוטאזה המקודדת על ידי גן המורכב מ-12 exons הממוקם בכרומוזום p32.31. האנזים מסונתז בעיקר בכבד וכן במעי הדק ובכליות כפפטיד קודמן שמשקלו המולקולארי בערך 75,000 דלטון המכיל 692 חומצות אמינו. האנזים מסונתז עם signal peptide בעמדות 1-30 ברצף החלבון בקצה ה-N טרמינאלי, מקטע prodomain בעמדות 31-152 חומצות אמינו, מקטע קטליטי בעמדות 153 עד 451 המכיל את שלישיית חומצות האמינו המוקפדת Asp-His-Ser, ומקטע הקצה ה-C טרמינאלי עם חומצות האמינו 452-992 ברצף (Benjannet וחב' ב- J Biol Chem משנת 2004).
הקודמן pro-PCSK9 עובר ברטיקולום האנדופלזמטי תהליך ביקוע אוטו-קטליטי תוך-מולקולארי, בין חומצות אמינו Gln152 ל-Ser153, ליצירת האנזים הבשל שמשקלו המולקולארי כ-62 אלף דלטון, שכן ביקוע ה-prodomain נחוץ לצורך ההבשלה וההפרשה של PCSK9. יש לציין שלאחרונה הודגם שחלוף המתבצע באופן טבעי בנקודת המפגש בין מקטע ה-prodomain לבין המקטע הקטליטי, בו חומצת אמינו Gln152 משוחלפת על ידי היסטידין (Gln152His), מוטציה זו (המוגדרת כ-loss-of-function) מונעת את הביקוע האוטו-קטליטי, מונעת את הפרשת CSK9 מתאים הפאטוציטים והיא כרוכה בירידה של 48% ברמת LDL-C בפלזמה, שכן האנזים אינו פוגע בקולטנים של LDL-C, כפי שמצאו Mayne וחב' במשפחת צרפתית-קנדית בקוויבק, ודיווחו ב-Clin Chem בשנת 2011.
לאחר הביקוע, מקטע ה-prodomain יוצר קשרי מימן עם חומצות אמינו חיוניות במקטע הקטליטי, ובכך מונע גישה וזמינות של מצעים פוטנציאליים אחרים לגומחה הקטליטית של PCSK9 (עפ"י Cunningham וחב' משנת 2007 ב-Nat Struct Mol Biol). היכולת של PCSK9 לעודד את הרס הקולטנים ל-LDL-C, אינה תלויה אם כן בפעילות הקטליטית של האנזים, מה שמצביע על כך ש-PCSK9 פועל כאנזים בן-לוואי (chaperone), צורת פעילות ייחודית בין סרין-פרוטאזות (עפ"י Li וחב' ב- Biochem J משנת 2007 וכן McNutt וחב' ב-J Biol Chem משנת 2007).
פעילות PCSK9 באנדוזום והשפעתו על LDLR בחלקיק התאי הזה
האזור בחלק החוץ-ממברנאלי של הקולטן LDLR איתו מגיב האנזים PCSK9 המופרש מתא הפאטוציט באדם, ממוקם במקטע הראשון של EGFA או epidermal growth factor-like repeat A homology domain, על פי Zhang וחב' ב-J Biol Chem משנת 2007 וכן Bottomley וחב' באותו כתב עת משנת 2009. קישור האנזים למקטע האמור תלוי בנוכחות סידן, והוא מתרחש בסטויכיומטריה של 1:1, עם קבוע דיסוסיאציה של 150-750 ננומול' לליטר, ב-pH הכמעט נויטראלי של הפלזמה (עפ"י Surdo וחב' ב-EMBO Rep משנת 2011 וכן Fisher וחב' ב-J Bol Chem משנת 2007). בתנאי pH נויטראלי זה, רק המקטע הקטליטי של PCSK9 מגיבים עם מקטע ה-EGFA של הקולטן (עפ"י Kwon וחב' ב-Proc Natl Acd Sci USA משנת 2008).
המיקרו-סביבה החומצית השוררת במקטע ה-prodomain מפחיתה את זיקת הקישור בין PCSK9 ל-LDLR (עפ"י Benjannet וחב' ב-J Biol Chem משנת 2010 ו-Holla וחב' ב-Biochem Biophys Res Commun משנת 2011). לעומת זאת, לאחר תהליך האנדוציטוזה (כאשר ה-pH בתוך האנדוזום חומצי), הזיקה בין PCSK9 לבין הקולטן גבוהה בהרבה (קבוע דיסוסיאציה של 1-8 ננומול' לליטר) לעומת מה שנמצא בתנאי pH נויטראליים, ובתנאים חומציים אלה יוצר ה-prodomain של PCSK9 גשרי-מלח עם הקולטן, כאשר הוצע שהמקטע ה-C טרמינאלי של PCSK9 הטעון חיובית, נקשר למקטע הקושר ליגנד הטעון שלילית של הקולטן (Yamamoto וחב' ב-J Biol Chem משנת 2011, ו-Tveten וחב' ב-Hum Mol Genet משנת 2012). מחקרים אלה מראים ש-PCSK9 מקבע קונפורמציה "פתוחה" של LDLR, ואכן אי היכולת של הקולטן לאמץ קונפורמציה מכונסת ו"סגורה" באנדוזום, מונעת מיחזור (recycling) שלו בחזרה אל פני ממברנת התא, וגוזרת את דינו להיהרס בליזוזום (Blacklow ב-Curr Opin Struct Biol משנת 2007).
(להכניס כאן ברצף את 2 התרשימים הגדולים הצבעוניים המופיעים ראשונים לפי סדר הופעתם).
בהקשר זה, מספר שחלופים של חומצות אמינו באנזים PCSK9 (כגון Asp374Tyr או Ser127Arg) או לחילופין שחלוף ב-LDLR כגון His306Tyr, שמוצאים במשפחות עם FH, מחזקים את האינטראקציה המולקולארית של הקומפלקס PCSK9-LDLR, ועל ידי כל מגבירים את הרס הקולטן וכתוצאה מכך מעלים את רמת LDL-C בפלזמה של נשאי מוטציות אלה (עפ"י Pandit וחב' ב-J Lipid Res משנת 2008 ו-Homer וחב' ב-Atherosclerosis משנת 2010). יש להדגיש שהמוטציה Asp374Tyr-PCSK9 מסוג "gain-of-function", גורמת ל-FH חמור ביותר שקשה במיוחד לטיפול עם סטטינים כפי שמצאו Naoumova וחב' ב-4 משפחות בריטיות עם מוטציה זו (Thromb Vasc Biol משנת 2005). אכן, אנשים עם מוטציה זו לוקים במחלה קרדיו-וסקולארית בגיל הנמוך ב-10 שנים בממוצע מפרטים אחרים עם FH. נמצא ש-PCSK9 המוטנטי נקשר ל-LDLR בזיקה הגבוהה פי-6-30 בהשוואה ל-PCSK9 התקין, על ידי שהוא מאפשר יצירה של קשרי-מימן בין האנזים לבין מקטע EGFA של LDLR.
המקטע ה-C טרמינאלי של PCSK9 הוא בעל תפקיד מרכזי בהכוונה של LDLR לשלב פירוקו בליזוזום. מקטע זה אינו נחוץ לקישור האנזים ל-LDLR על פני הממברנה, כפי שהודגם בסדרה של ניסויים בהם נעשה שימוש ב-PCSK9 ממנו הוסר המקטע ה-C טרמינאלי ( Zhang וחב' ב-Proc Natl Acad Sci USA משנת 2008). המטען החיובי הכולל של המקטע ה-C טרמינאלי מצטייר כפרמטר מאוד מרכזי בתפקודו של PCSK9 (עפ"י Holla וחב' ב-J lipid Res משנת 2011). נוגדן המכוון כנגד המקטע ה-C טרמינאלי של PCSK9 נמצא לא רק מעכב את קישור האנזים ל- LDLR, אלא אף מעכב משמעותית את ההחדרה של הקומפלקס LDLR-PCSK9 אל תוך התא (Ni וחב' ב- J Biol Chem משנת 2010).
בדומה, גם קישור של annexin A2 למקטע ה-C טרמינאלי של PCSK9 מונע מהאנזים להגיב עם LDLR, ובהתאם מונע ממנו את פירוק הקולטן הזה (Mayer וחב' ב-J Biol Chem משנת 2008). כיוון ש-PCSK9 אינו משפיע (או משפיע מאוד חלש) על רמות LDLR בבלוטות האדרנל (Grefhorst וחב' ב-J Lipid Res משנת 2008, ו-Luo ב- J Lipid Res משנת 2008), וכן במספר אזורים של המוח הבוגר בעכברים (Liu וחב' ב-J Lipid Res משנת 2008, ו- Rousellet באותו כתב עת משנת 2011), עלתה השערה ש-PCSK9 זקוק לסייענים ברקמות השונות, כדי לאפשר לו לפעול באותה דרגת יעילות כפי שהוא עושה זאת בכבד (Lambert וחב' ב-Atherosclerosis משנת 2009).
גישות לעיכוב פעילות PCSK9
לאחרונה, תוארו 2 מקרים הומוזיגוטיים של מוטציית "loss-of-function" ב-PCSK9, כאשר נשאי מוטציות אלה שהיו חסרים אנזים זה באופן מוחלט, היו בריאים ופוריים ורמת LDL-C בדמם הייתה נמוכה מ-15 מיליגרם לד"ל. ממצא זה מרמז לכך שהתערבות פרמקולוגית המעכבת PCSK9 עשויה להיות בטיחותית. אכן, כיום מפותחות מספר גישות של פיתוחי תכשירים לעיכוב PCSK9 באדם.
- הגישה הראשונה והמתקדמת ביותר היא זו של נוגדנים חד-שבטיים, וכאן יש כרגע מספר תכשירים כאלה בשלבי הערכה שונים: חברת Amgen מקדמת את התכשיר AMG145 שהוא הנוגדן החד-שבטי evolocumab, ואילו חברת Regeneron מקדמת את התכשיר SAR236553/REGN727 שהוא הנוגדן החד-שבטי alirocumab. לשני נוגדנים אלה נחזור בפירוט בהמשך. שני נוגדנים חד-שבטיים נוספים, RN316/PF-04950615 ו-ID05-IgG2 (של חברת Merck & Co.) נמצאים עדיין בשלב מקדמי ביותר של ניסויים קליניים. גם חברת Pfizer מקיימת כעת שני ניסויי phase III הידועים כ-SPIRE-1 ו-SPIRE-2 עם הנוגדן החד-שבטי bococizumab, שהיה ידוע בכינויו הקודמים PF-04950615 או RN316, להפחתת אירועים קרדיו-וסקולאריים במטופלי בדרגת סיכון גבוהה. תוצאות ביניים של ניסויים אלה נראות מבטיחות.
נוגדן חד-שבטי נוסף ממקור אדם פרי הפיתוח של חברת Roche/Genentech ידוע כ-RG7652 ומכוון אף הוא כנגד PCSK9. בשנת 2014 פרסמו Tingley וחב' ב-Eur Heart J דו"ח ראשוני של ניסוי קליני phase I, ובו ממצאים מבטיחים של תכשיר זה. חברת Novartis בוחנת בימים אלה את הנוגדן LGT209. - התכשיר BMS-962476 השייך למשפחת ה-adnectins, שהוא חלופה של חלבון בעל משקל מולקולארי קטן במקום הנוגדנים החד-שבטיים הפועלים כנגד PCSK9. בשנת 2014 פרסמו Mitchell וחב' ב- J Pharmacol Exp Ther על ה-adnectin, שהוא חלבון שמקורו בחלבון הענק פיברונקטין type III. התכשיר BMS-962476 הוא פוליפפטיד בעל משקל מולקולארי של 11,000 דלטון המחובר לפוליאתילן גליקול להגברת הפרמאקו-קינטיקה שלו, והוא נקשר ל- PCSK9 במקטע הסמוך להתקשרות האנזים ל-LDLR. בעכברים טרנסגניים היפר-כולסטרולמיים המבטאים ביתר את PCSK9, התכשיר BMS-962476 מפחית במהירות את רמת כולסטרול, וכן את רמת PCSK9 חופשי. טיפול בקופי Cynomolgus עם BMS-962476 דיכא במהירות את רמת PCSK9 חופשי בלמעלה מ-99%, ואת רמת LDL-C בקופים אלה בערך ב-55%, מה שמצביע על ה-adnectins כבעלי פוטנציאל סביר כמעכבי PCSK9. ניסויים קדם-קליניים באדם אמורים להתחיל בקרוב.
- מולקולות קטנות הפועלים לעיכוב קישור PCSK9 ל- LDLR לדוגמה SX-PCSK9 של חברת Serometrix הנמצאת בראשית דרכה לקראת ניסויים קדם קליניים. תכשירים נוספים ל"השתקת גנים" כגון AAL-PCS שנוסה עד כה על 32 מתנדבים בריאים בניסוי phase I והוא נמצא מפחית את רמת LDL-C בממוצע ב-45%. חברת Alnylam Pharmaceuticals מדווחת על תוצאות חיוביות בניסויים קדם-קליניים עם ALN-PCS הפועל על ידי RNA interference לעכב את פעילות PCSK9 (עפ"י Frank-Kamenetsky וחב' ב- Proc Natl Acad Sci USA משנת 2008). בניסויים אלה הושגה הפחתה מרשימה ברמת LDL-C במכרסמים ובקופים.
חברת Isis Pharmaceuticals פיתחה PCSK9 antisense oligonucleotide שנמצא מגביר את ביטוי LDLR, ומפחית את רמת סך-כולסטרול בעכברים (Graham וחב' ב- J Lipid Res משנת 2007 ו-Lindholm וחב' ב- Mol Ther משנת 2012) שהשיגו הפחתה ברמת כולסטרול בפלזמה על ידי antisense oligonucleotide מסוג LNA. חברת Santaris Pharm פיתחה חומצת גרעין "נעולה" שהפחיתה את רמות mRNA של PCSK9 בעכברים (Gupta וחב' ב- PLos One משנת 2001). - פפטידים "חקיינים" או mimetic peptides : פפטידים המחקים במבנה שלהם את המקטע EGFA של LDLR, גורמים ל-PCSK9 להיקשר אליהם ובכך מעכבים את פעילות האנזים על קולטני LDLR (עפ"י Shan וחב' ב-Biochem Biophys Res Commun משנת 2008). גם Shan וחב' (Biochem Biophys Res Commun משנת 2008) פיתחו פפטיד סינטתי שהפחית באופן שהוא dose dependent את הרס הקולטנים ל- LDL-C שהושרה על ידי הוספה אקסוגנית של PCSK9 רקומביננטי. ידוע ששחלוף נקודתי של חומצת אמינו H306Y המתרחש באופן טבעי במקטע EGFA של הקולטן ל-LDL-C מגביר את הזיקה של קולטן זה ל-PCSK9, כפי שדיווחו McNutt וחב' ב-J Biol Chem משנת 2009. על כן הם השתמשו אמנם בפפטיד EFGA-H306Y לחסום ביעילות את הפירוק של הקולטן ל-LDL-C המושרה על ידי PCSK9 בתאי הפאטומה המבטאים ביתר את PCSK9 או את הואריאנט היותר יעיל PCSK9-D374Y. בשנת 2011 הראו Du וחב' במאמר ב-J Biol Chem, שלמקטע ה-C טרמינאלי של PCSK9, יש השפעה מעכבת על פירוק הקולטן ל-LDL בתאי עכברים in vitro, מה שמצביע על כך שעיכוב פרמקולוגי חוץ-תאי של PCSK9, עשוי להפחית רמות LDL-C בצירקולציה.
ניסויים קליניים מוקדמים עם evolocumab ו-alirocumab
תכשירים החוסמים את PCSK9 עשויים להפחית רמת כולסטרול-LDL כאשר בשנת 2013 החלו ניסויי phase III לבחון את יעילותם ובטיחותם באדם, כדי להחליט האם יש בהם כדי לשפר נתוני מחלת לב. במהלך העשור האחרון החל מאמץ נמרץ לפיתוח של נוגדנים חד-שבטיים שיהיו מסוגלים לחסום את יכולת האנזים PSCK9 לפגוע בקולטני LDL. בשנת 2009 התפרסם ב-Proc Natl Acad Sci USA מאמר של Chan וחב', בו השתמשו בנוגדנים כאלה בקופים עם תוצאות מעודדות. בחודש מרס 2012 התפרסם ב- N Eng J Med מאמרם של Stein וחב', בו מדווח על מחקר בו נעשה שימוש בנוגדן חד-שבטי alirocomab שסומן אז כ-REGN727/SAR236553 שהוכן כנגד PSCK9 על ידי חברת Regeneron Pharmaceuticals.
נוגדן חד שבטי זה הוחדר בעירוי לווריד או בהזרקה תת-עורית במינון של 50 עד 150 מיליגרם, לאנשים בריאים, לאלה שהם הטרוזיגוטיים למחלת היפר-כולסטרולמיה משפחתית שטופלו גם ב-atorvastatin, וכן למטופלים עם היפר-כולסטרולמיה שאינה משפחתית שלא הגיבו טוב לטיפול בסטטין. תוצאות טיפול זה הראו השפעה התלויה במינון של הפחתת רמת LDL כולסטרול בפלזמה עד 64%, באופן שרמת ההפחתה ב-LDL לא הייתה תלויה באם המטופל קיבל גם סטטינים או לא טופל בהם. ההפחתה בכולסטרול הייתה מיידית ונמשכה מספר שבועות, כאשר תופעות הלוואי של הנוגדן היו בהחלט נסבלות.
בנוסף ל-Regeneron/Sanofi שהיו חלוצים בתחום זה, רשימת חברות התרופות המתמודדות על פלח השוק הזה מכובדת: חברת Amgen ייצרה את התכשיר AMG145, חברת Novartis הפיקו את LGT209, תשלובת Roche/Genentech מחזיקה ב-RG7652, חברת Pfizer שמה יהבה ב-RN316, וחברת Merck & Co. תומכת בתכשיר 1D05-IgG2-כאשר כל אלה נוגדנים חד שבטיים הפועלים כנגד אזורים שונים על פני האנזים PCSK9, וכולם נמצאים בשלב phase II או phase III של הניסויים הקליניים.
בניסוי קליני שתוצאותיו מופיעות ב-JAMA, נמצא שבעוד שטיפול משולב של AMG145 ו-Zetia הפחית רמת LDL ב-63%, טיפול של Zetia עם פלצבו הביא להפחתה של 15% בלבד. בניסוי זה לאחר 12 שבועות, רק 7% מהמטופלים ב-Zetia בלבד השיגו את היעד של רמתLDL של 100 מיליגרם לד"ל, כאשר 61% מהמטופלים במינון הגבוה של AMG145 השיגו יעד זה. טיפול משולב של Zetia ו-AMG145 הביא 90% מהמטופלים לתחום LDL של 100 מיליגרם לד"ל.
אך אנו מתעניינים יותר באופן בו מפחית האנזים PSCK9 את רמת הקולטנים ל-LDL. כאמור PCSK9 היא פרוטאזה המופרשת מתאי כבד ונקשרת לקולטן LDL על פני שטח התאים, אך הסרת קולטנים אלה דורשת את החדרת הקומפלקס "אנזים-קולטן" הנוצר אל תוך התאים. לאחר החדירה לתא בתוך חלקיק endosome, הסביבה החומצית בתוך האנדוזום מגבירה את הזיקה של PKSC9 לקולטן ל-LDL פי-150 בקירוב. למעשה, קישור PSCK9 לקולטן ל-LDL מביא להסטת הקולטן ממסלולו הרגיל לכיוון שטח הפנים של התא, ומכוון אותו דווקא אל תוך הליזוזומים בתא, אותם חלקיקים ההורסים את הקולטן, ומונעים את חבירתו לשטח פני התא.
באוקטובר 2012 התפרסמו ב-N Eng J Med ממצאי ניסוי קליני של Eli Roth מהמכון לטרשת נפוצה בסינסינטי ואנשי אוניברסיטת ריצ'מונד וחברת התרופות Sanofi בצרפת, בו השתתפו 92 מטופלים עם רמות כולסטרול-LDL מעל 100 מיליגרם לד"ל למרות היותם מטופלים ב-atorvastatin במינון יומי של 10 מיליגרם. המטופלים חולקו ל-3 קבוצות:
- אלה שטופלו משך 8 שבועות במינון יומי של 80 מיליגרם של atorvastatin בתוספת טיפול אחת לשבועיים עם alirocomab;
- אלה שטופלו משך 8 שבועות מדי יום עם atorvastatin במינון יומי של 10 מיליגרם בתוספת טיפול אחת לשבועיים עם מעכב PCSK9;
- מטופלים למשך 8 שבועות עם atorvastatin בלבד במינון יומי של 80 מיליגרם.
ניסוי זה הפיק ממצאים מרשימים: בעוד שבמטופלים בקבוצה א' נרשמה הפחתה לאחר 8 שבועות טיפול של 73.2% ברמת LDL, נרשמה בקבוצה ב' ירידה של 66.2% ברמת LDL, אם כי במטופלים עם הסטאטין בלבד ההפחתה ברמת LDL הייתה צנועה יותר של 17.3% בלבד. הנתון המרשים ביותר מניסוי זה היה שתרומת הנוגדן המעכב את פעילות PCSK9 להפחתת LDL הייתה הרבה יותר משמעותית מזו של atorvastatin גם כאשר האחרון ניתן במינון הגבוה ביותר שלו.
חברת Amgen החלה את phase III בהערכת AMG145 בתחילת 2013, כאשר היא ביססה את הערכות השיווק העתידיות של תכשיר זה על רקע הנתונים ש-10-20% מהמטופלים בסטאטינים אינם יכולים לסבול טיפול זה, לפחות לא בריכוזים גבוהים של סטאטינים היעילים בהפחתת רמת LDL. גם השימוש ב-Zetia של Merck מפחית כולסטרול רק בשיעור של 15-18% במניעת הספיגה של כולסטרול במעי. בניסוי שלב II של AMG145 נמצאה הפחתה ברמת LDL בשיעור של 41-51% כבר לאחר 12 שבועות טיפול.
הממצאים המעודדים בניסויים עם הנוגדן החד-שבטי evolocumab החלו להופיע בספרות הרפואית כבר בשנת 2013, כאשר הנוגדן הופיע עדיין בשמו הקודם, AMG145. בדיווח של Stein וחב' ב-Circulation משנת 2013 על ניסוי pilot על מדגם קטן של 8 מטופלים בגיל 12 עד 65 שנה עם היפר-כולסטרולמיה משפחתית, שחוו בעבר ערכי LDL-C מעל 500 מיליגרם לד"ל. משתתפי הניסוי היו מטופלים בתכשירים מקובלים שכללו סטטינים, מעכבי ספיגת כולסטרול, סקווסטרנטים של חומצת מרה, חומצה ניקוטינית, או שילוב שלהם לתקופה של לפחות 4 שבועות לפני תחילת הניסוי, והמשיכו בשגרת הטיפולים הללו לאורך הניסוי.
הטיפול כלל הזרקה תת-עורית של 420 מיליגרם AMG 145 אחת ל-4 שבועות למשך לפחות 12 שבועות, טיפול שלווה על ידי הזרקת 420 מ"ג AMG145 אחת לשבועיים למשך 12 שבועות נוספים. כל משתתפי הניסוי השלימו אותו עד לסיומו המתוכנן. השינוי הממוצע מרמת LDL-C בבסיס הניסוי לאחר שבוע 12 היה הפחתה של 16.5% בממוצע (p=0.0781). בין 8 משתתפי הניסוי היו שניים עם חסר מוחלט של הקולטן ל-LDL-C, ושישה עם קולטן פגום. בהתאם וכצפוי ב-2 המטופלים עם חסר מוחלט של הקולטן לא התקבלה כל ירידה ברמת LDL-C בפלזמה שכן פעילות PCSK9 אין לה כל משמעות בהם בהיעדר מוחלט של הקולטן. לעומת זאת, בששת המשתתפים עם פגם בקולטן שבא לביטוי רק בהשפעה חלקית של פעילות האנזים PCSK9, ההפחתה הממוצעת ברמת LDL-C בפלזמה הייתה של 19.3%±16.0 עם p=0.0313.
במאי 2014 התפרסם ב-N Eng J Med מאמר המסכם מחקר רב-לאומי (דרום אפריקה, צ'כיה, ארה"ב, בריטניה ואנשי חברת Amgen בקליפורניה, מחקר תחת השם DESCARTES או Durable Effect of PCSK9 Antibody Compared with Placebo Study. מחקר phase III זה נועד לבחון את היעילות והבטיחות של טיפול לאורך 52 שבועות, עם הנוגדן החד-שבטי Evolocumab, אשר במבחני phase II הפיק תוצאות משמעותיות בהפחתת LDL בפלזמה.
המשתתפים בניסוי זה היו עם רקע של טיפול תרופתי להפחתת רמת כולסטרול על ידי דיאטה מתאימה בלבד, או כאלה שטופלו עם דיאטה מתאימה בנוסף ל-atorvastatin במינון יומי של 10 מיליגרם, או כאלה שטופלו רק עם atorvastatin במינון יומי של 80 מיליגרם, או כאלה שטופלו מדי יום ב-80 מיליגרם של atorvastatin בנוסף לטיפול יומי של 10 מיליגרם ezetimib (שמות מותג Zetia וכן Ezetrol) לתקופה של 4-12 שבועות. מטופלים עם רמות כולסטרול-LDL של 75 מיליגרם/דציליטר ומעלה, חולקו באופן אקראי לכאלה שטופלו כל 4 שבועות למשך שנה ב-evolocumab במינון של 420 מיליגרם, או בפלצבו.
תוצאות טיפולים אלה נקבעו לאחר 52 שבועות מתחילת הניסוי, היו ש-evolocumab הפחית רמות LDL ב-48% באלה שקודם לכן טופלו רק בעזרת דיאטה, וכן הפחית ב-62% את רמות LDL באלה שטופלו קודם לכן ב-atorvastatin וב-ezetimib, כאשר אחוזי הפחתת LDL אלה הם מעל אחוזי ההפחתה שהושגו בטיפול בפלצבו.
ב-23 בינואר 2014 הודיעה חברת Amgen שניסוי phase III בשם GAUSS-2 או Goal Achievement After Utilizing an Anti-PCSK9 Antibody in Statin intolerant Subjects-2, שנועד להעריך את יעילות evolocumab במטופלים עם רמת כולסטרול גבוהה שלא לא יכלו לשאת את תופעות הלוואי של סטטינים, השיג את מטרת היעד שלו: אחוז ההפחתה ברמת LDL לאחר 12 שבועות של טיפול. ניסוי GAUSS-2 בחן את בטיחות, סובלנות המטופלים ויעילות התכשיר ב-307 מטופלים (בגיל ממוצע של 60 שנה) עם אלה בעלי רמת כולסטרול גבוהה שטיפול קודם עם 2 ריכוזים אפקטיביים של 2 סטטינים לפחות, היה בלתי נסבל מבחינתם. משתתפי הניסוי חולקו באקראי ל-4 קבוצות: הזרקה תת-עורית של 140 מיליגרם evolocumab אחת לשבועיים ומתן פומי של פלצבו מדי יום; הזרקה תת-עורית של 420 מיליגרם של התכשיר אחת לחודש וטיפול יומי פומי עם פלצבו; הזרקה תת-עורית של פלצבו אחת לשבועיים, ונטילה פומית של 10 מיליגרם ezetimib מדי יום; והזרקה אחת לחודש של פלצבו ונטילה פומית של ezetimib במינון של 10 מיליגרם מדי יום.
טיפול ב-evolocumab הפחית משמעותית רמות LDL, ובאופן ניכר יותר מאשר השפעת ezetimib; ממוצע של הפחתת LDL לאחר 10 ו-12 שבועות של טיפול, היה 56% עם evolocumab בטיפול של 140 מיליגרם אחת לשבועיים, לעומת הפחתה של 18% עם ezetimib. מבחינת תופעות הלוואי יש לציין שנטישת הניסוי על משתתפיו בגלל תופעות אלה הייתה נמוכה יותר בטיפולים עם evolocumab עם 8% נטישה לעומת 13% נטישה בקרב מטופלי ezetimib. תוצאות מחקר GAUSS-2 שנערך באמסטרדם על ידי Eric Stores וחב', התפרסמו בשנת 2012 ב-JAMA. לגבי תופעות הלוואי העיקריות במחקר זה, הם היו כדלקמן: כאבי ראש (7.8% במטופלי evolobumab לעומת 8.8% במטופלי ezetimib); כאבי שרירים (7.8% בטיפול ב-evolocumab לעומת 17.6% בקרב מטופלי ezetimib); כאבי בקצות הגפיים (6.8% בטיפול ב-evolocumab לעומת 1.0% במטופלי ezetimib; והתכווצות שרירים (6.3% במטופלי evolocumab לעומת 3.9% במטופלי ezetimib).
ב-1 באוקטובר 2014 הודיעה חברת Amgen על פרסומם של 2 מחקרים ב-Lancet, שני מחקרי phase III, שהדגימו שטיפולים ב-evolocumab הפחיתו רמת LDL בהשוואה לפלצבו במטופלים עם סוגים שונים של התרחיש התורשתי היפרכולסטרולמיה משפחתית (או FH), בהם רמת LDL גבוהה במיוחד.
בניסוי הרב-לאומי הראשון מבין השניים, הידוע כ-RUTHERFORD-2 בהשתתפות 329 מטופלים עם FH מאוסטרליה, ניו-זילנד, דרום אפריקה, ומדינות באסיה, אירופה וצפון אמריקה, נמצא שהוספה של הזרקה תת-עורית של 140 מיליגרם evolocumab אחת לשבועיים, או 420 מיליגרם אחת לחודש, לטיפול בסטטין או בתכשירים אחרים מפחיתי כולסטרול, הביא להפחתה נוספת של LDL ב-59-66% מערכי הבסיס בהשוואה לפלצבו כבר לאחר 10 ו-12 שבועות טיפול, בהתאמה. תופעות הלוואי השכיחות ביותר בניסוי זה היו נזלת, כאבי ראש , כאבי גב, ובחילות.
בניסוי השני הידוע כ-TELSA, נבחנו 49 מטופלים הומוזיגוטיים ל-FH מ-17 אתרים בצפון-אמריקה, אירופה, המזרח התיכון ודרום-אפריקה בגיל של 12שנים ומעלה. נמצא שטיפול אחת לחודש בהזרקה תת-עורית של 420 מיליגרם evolocumab, בנוסף לטיפול השגרתי בסטטין או בתכשיר מפחית כולסטרול אחר, הפחית רמת LDL ב-31% מערכי הבסיס בהשוואה לפלצבו, כבר לאחר 12 שבועות טיפול. תופעות הלוואי השכיחות יחסית היו זיהומים בדרכי הנשימה העליונות, שפעת, נזלת ודלקת בדרכי המעי.
ניסוי אחר הידוע כ-LAPLACE-2, בו השתתפו 1,896 איש, שטופלו בהזרקות תת-עוריות של 140 מיליגרם evolocumab אחת לשבועיים, הראה הפחתת LDL ב-63% לעומת פלצבו, לעומת הפחתה של 19% שהושגה בניסוי זה בטיפול ב-ezetimib לעומת פלצבו. חשוב לציין שבכל הניסויים המתוארים לא התפתחו במטופלים נוגדנים כנגד evolocumab.
ניסויים קליניים ב-phase III נמצאים הימים אלה בעיצומם: ניסוי קליני שידוע כ-FOUIER נועד לברר האם טיפול ב-evolocumab באנשים שכבר חוו התקף לב, אירוע מוחי על רקע איסכמיה, שמטופלים באופן שוטף בסטאטינים במינון אפקטיבי, יפחית את הסיכון לאירועים קרדיו-וסקולאריים בעתיד. ניסוי זה כולל 27,500 משתתפים. ניסוי זה והמעקב אחר תוצאות הטיפול יימשך 5 שנים, ותוצאותיו לא תתפרסמנה לפני סוף שנת 2017.
בניסוי נוסף בהשתתפות 614 מטופלים, MANDEL-2, נמצא ש-evolocumab הפחית רמת LDL מערכי הבסיס שלו ב-56% יותר מאשר פלצבו, וב-38.5% יותר מאשר ezetimib. בהערכתו תוצאות ניסוי זה, מציין הקרדיולוג מבוסטון Peter Libby, שכל תכשיר המפחית LDL ביותר מ-15% יכול להיחשב כתכשיר בעל משמעות.
ניסויים נוספים הם EBBINGHAUS שנועד להעריך את השפעת evolocumab על המצב הקוגניטיבי של מטופלי תכשיר זה. ניסוי GLAGOV יקבע את השפעת evolocumab על טרשת העורקים הכליליים ב-950 מטופלים שעברו צנתורים. ניסוי TAUSSIG יעריך את דרגת הבטיחות לטווח ארוך של הטיפול ב-evolocumab בחולים עם FH.
ניסויים קליניים עדכניים עם מעכבי PCSK9
ב-15 במרץ 2015 התפרסמו ב-N Eng J Med ברצף 2 מאמרים המדווחים על תוצאות ניסויים בהם נבחנו 2 תכשירים החוסמים את פעילות האנזים PCSK9 שנועדו להקל על פינוי LDL-C מהצירקולציה על ידי הקולטנים של ליפופרוטאין זה. שני התכשירים, הנוגדנים החד שבטיים, evolocumab ו-alirocumab נמצאו מפחיתים את רמת LDL-C בדם בערך ב-60% יותר בהשוואה לתרפיה המקובלת.
הניסויים עליהם דיווח Sabatine ידועים כניסויי OSLER-1 ו-OSLER-2 או Open-Label Study of Long-Term Evaluation against LDL-C. מדובר בניסויים בהם evolocumab ניתן בתוספת לטיפול הסטנדרטי למשך תקופה של 11 חודשים, והתברר שהוא מפחית את רמת LDL-C בממוצע ב-61% בהשוואה לאלה שקבלו רק את הטיפול הסטנדרטי. כמו כן נמצא שהטיפול המשולב הזה הפחית את שכיחותם של אירועים קרדיו-וסקולאריים כמו MI, אי-ספיקת לב המחייבת אשפוז, ומוות.
במאמר הראשון מבין השניים, זה של Sabatine וחב', נוסה evolocumab ב-2 ניסויי תווית פתוחה (open label), הידועים כניסוי OSLER-1 שכלל 1,324 מטופלים שהשתתפו באחד מחמשת ניסויי האם ב-phase 2, וניסוי OSLER-2 שכלל 3,141 משתתפים שסיימו להשתתף באחד מ-7 ניסויי האם ב-phase-3. הגיל הממוצע של כל המשתתפים היה 58 שנה, והם חולקו באקראי להיות מטופלים משך כשנה או עם הטיפול הסטנדרטי בסטטינים או בתכשירים אחרים בלבד (1,489 איש) או להיות מטופלים בטיפול הסטנדרטי בנוסף להזרקת evolocumab פעמיים בשבוע במינון של 140 מ"ג, או אחת לחודש במינון של 420 מ"ג (2,976 איש).
נמצא ש-evolocumab הפחית ב-12 שבועות ראשונים של הניסוי את רמת LDL-C ב-61% מרמה ממוצעת של 120 מיליגרם לד"ל ל-48 מיליגרם לד"ל, בהשוואה לטיפול הסטנדרטי (p<0.001). רמת הפחתה זו נשמרה עד 48 שבועות של הניסוי. שיעור אירועים קרדיו-וסקולאריים לאחר שנה מהטיפול, היה 2.18% במקבלי הטיפולים הסטנדרטיים, לעומת 0.95% במטופלי evolocumab (הפחתה של 47% באירועים קרדיו-וסקולאריים (p=0.003).
במאמר השני שהופיע ב-15 במרץ 2015 ב-NEJM, דווח על הניסוי של Robinson וחב' הידוע כניסוי ODYSSEY עם alirocumab: למרות שניסויים קודמים הראו הפחתה משמעותית ברמת LDL-C לאחר 8-12 שבועות טיפול משולב של alirocumab עם סטטין, בעלי ניסוי ODYSSEI בקשו לבחון את יעילות הטיפול המשולב לאחר תקופות מעקב ארוכות יותר. ניסוי ODYSSEI כלל 2,341 משתתפים (63.2% מתוכם גברים, בגיל ממוצע של 60 שנה) שהיו בדרגת סיכון גבוהה לאירועים קרדיו-וסקולאריים, עם רמות LDL-C של לפחות 70 מ"ג/ד"ל, המטופלים במינונים המרביים המקובלים של סטטינים.
משתתפי הניסוי חולקו באקראי לקבוצת מוזרקים תת-עורית אחת לשבועיים עם 150 מ"ג של alirocumab שכללה 1,553 איש, לעומת 788 מוזרקים עם פלצבו. לאחר 24 שבועות מתחילת הניסוי, כבר נמצא שרמת LDL-C הייתה נמוכה ב-61% בקבוצת המטופלים עם alirocumab בהשוואה לקבוצת הפלצבו בה הפחתת LDL-C הייתה של 0.8% בלבד (p<0.001). הרמה הממוצעת של LDL-C בקרב מטפלי הנוגדן הייתה 48 מ"ג/ד"ל, לעומת 119 מ"ג/ד"ל בקבוצת הפלצבו. בנוסף, רמות מופחתות אלו של LDFL-C נותרו בעינן משך מעקב של 78 שבועות. במטופלים ב-alirocumab בנוסף לסטטין, נמצאה ירידה של 48%באירועים קרדיו-וסקולאריים בהשוואה לאלה שטופלו בעזרת סטטינים בלבד (1.7% לעומת 3.3% עם מובהקות של p=0.02.
אירועים נוירו-קוגניטיביים הקשורים בעיקר לפגיעה בזיכרון, היו מעט גבוהים יותר עקב הטיפולים במעכבי PCSK9: תופעות לוואי אלו נרשמו ב-0.9% ממטופלי evolocumab לעומת 0.3% במטופלי סטטינים, וב-1.2% מבין מטופלי alirocumab בהשוואה ל-.0.5% מבין מטופלי הסטטינים. בניסויODYSSEY נמצא שב-2.9% מבין המטופלים בנוגדן היו תופעות של myalgia לעומת 2.9% בקבוצת הביקורת.
פרט להפחתה ברמת LDL-C וברמת apolipoprotein B, נמצא ש evolocumab ו-alirocumab יעילים גם בהפחתה של (apolipoprotein (a בשיעור של עד 30% (עפ"י Raal וחב' ב-J Am Coll Cardiol משנת 2014, ו-McKenney וחב' ב-אותו כתב עת משנת 2012, אם כי מנגנון פעילות זו אינו ברור עדיין.
התכשיר evolocumab צפוי לקבל את אישור ה-FDA ב-27 באוגוסט 2015, כאשר התכשיר המתחרה alirocumab של Sanofi&Regeneron, יזכה לאישור זה במהלך יולי 2015.
רמות PCSK9 בפלזמה מוגברות באוטם שריר הלב
אחת הסוגיות המעניינות בהקשר של PCSK9 היא האם רמות מוגברות של אנזים זה כרוכות במצב של מחלת-לב כלילית (CAD), ועוד יותר מכך האם רמה מוגברת של PCSK9 כרוכה באופן ישיר עם התנתקות רובד טרשתי וגרימת התקף-לב?
כדי לענות על סוגיות אלו, נמדדו רמות PCSK9 בשיטת ELISA ב-645 מתנדבים בקבוצת ביקורת שעברו בירור אנגיוגרפי ונמצאה בהם היצרות כלילית בדרגה ממוצעת נמוכה מ-35%, וכן נמדדות רמות PCSK9 ב-3,273 מטופלים עם מחלת לב כלילית, בהם נמצאה היצרות של לפחות 50% בעורק כלילי מרכזי, כל אלה משתתפי המחקר הידוע כ-Ottawa Heart Genomic Study. כיוון שסטטינים מעלים רמת PCSK9 בפלזמה, ועלולים לשמש כערפלנים (confounders) בניסוי מסוג זה, נלקחו בחשבון רק אלה עם CAD שאינם נוטלים טיפול תרופתי המפחית רמת LDL-C, דהיינו 279 בקבוצת הביקורת, ו-492 איש עם CAD. בנוסף לאלה מהניסוי הקנדי, נבחרו עוד 357 איש כקבוצת ביקורת וכן 465 מטופלים עם CAD שנכלל בניסוי Emory Cardiology Biobank באטלנטה.
תוצאות ניסוי זה היו כדלקמן: רמות PCSK9 לא היו כרוכות עם מחלת עורקים כלילית בקנדה, אך כן היו מוגברות באלה עם CAD ב-Emory. במדגם הקנדי רמות PCSK9 היו מוגברות ב-45 מקרים של אוטם שריר לב חריף (±140.0363.5 ננוגרם/מ"ל) בהשוואה ל-398 מטופלים ללא אוטם שריר לב בהם רמת PCSK9 שנמדדה הייתה ±91.3302.2 ננוגרם/מ"ל, כאשר p=0.004. ממצא זה חזר על עצמו במחקר של Emory, ב-74 מטופלים עם AMI בהם נמצאה רמת PCSK9 של ±171.7445.0 ננוגרם/מ"ל לעומת רמה שנמדדה ב-273 מטופלים עם CAD אך ללא AMI שנקבעה כ-369.9±39.1 ננוגרם/מ"ל, כאשר p=0.0037. כיוון שרמות PCSK9 נמצאו דומות במטופלים עם CAD עם או בלי אירוע MI קודם, ממצאים אלה מרמזים לכך שרמות PCSK9 מוגברות או מייד לפני אירוע AMI או בשעת האירוע.
![](/w/images/8/8a/PCSK9-4.jpg)
הסימון OHGS מבטא את המדגם ב-Ottawa, הסימון EMCB מבטא את הניסוי ב-Emory. המספרים בתוך העמודות מבטאים את מספר המשתתפים בכול קבוצת מטופלים. (לקוח מ-Almontashiri וחב' ב-PLos One משנת 2014).
הוויסות המוקפד של הפרשת PCSK9
נתונים מניסויים בעכברי knock-out מצביעים על הפאטוציטים כמקור העיקרי של CSK9 בצירקולציה, אם כי יש ביטוי נמוך של אנזים זה גם במעיים ובכליות (Zaid וחב' ב- Hepatology משנת 2008). לכן, יש משמעות קלינית למדוד את רמת PCSK9 בפלזמה של בני-אדם וללמוד את הגורמים הפרמקולוגיים המשפיעים על הפרשתו. בהיבט זה, פותחו מספר שיטות ELISA למדידת PCSK9 בנסיוב אדם (Alborn וחב' ב-Clin Chem משנת 2007, Lambert וחב' באותו כתב עת משנת 2008, Chan וחב' באותו כתב עת משנת 2009, Awan וחב' באותו כתב עת משנת 2012, Dubuc וחב' ב-J Lipid Res משנת 2010 ו-Qui וחב' ב-Atherosclerosis משנת 2010). הריכוז של PCSK9 הממוצע בפלזמה עליו דווח במחקרים אלה, הראה שוֹנוּת ניכרת כנראה בגלל ספציפיות שונה של הנוגדנים כנגד האנזים בהם נעשה שימוש על ידי החוקרים השונים, וכן בגלל שוני ב-PCSK9 הרקומביננטי ששימש כסטנדרט בניסויים השונים (Tibolla וחב' ב- Nutr Metab Cardiovasc Dis משנת 2011).
נראה אם כך שמדידת רמת PCSK9 בפלזמה אינה אמצעי עזר אידיאלי כסמן לתפקוד אנזים זה, שכן רוב הנוגדנים לזיהוי PCSK9 יזהו גם את הצורות הקטומות (truncated) הבלתי פעילות שלו. אך למרות מגבלות אלו, רוב המחקרים האחרונים הראו באופן עקבי מתאמים חיוביים בין PCSK9 בצירקולציה לבין רמות LDL-C באוכלוסייה (Welder וחב' ב- J Lipid Res משנת 2010, ו-Lakoski וחב' ב- J Clin Endocrinol Metabol משנת 2009). פרט לאנשים הנושאים את מוטציות "gain-of-function" בגן המקודד ל-PCSK9, רמות אנזים זה בפלזמה צריכות באופן הגיוני להיות במתאם עם ההיארעות של תרחישים קרדיו-וסקולאריים. תובנה זו הודגמה לאחרונה במודלים של בעלי-חיים המועדים לטרשת עורקים, שהונדסו גנטית לבטא רמות גבוהות של PCSK9 (עפ"י Denis וחב' ב- Circulation משנת 2012). בהקשר זה ראוי לצטט את מחקרם של Huijgen וחב' שהתפרסם ב- Circulationבשנת 2012, בו הראו שרמות PCSK9 בפלזמה יכולות לנבא הישנוּת של אירועים קליניים במטופלים עם מחלה קרדיו-וסקולארית יציבה המטופלים במינונים נמוכים של atorvastatin.
אינאקטיבציה אנדוגנית של PCSK9
הצורה הבשלה של PCSK9 במשקל מולקולארי של 62 אלף דלטון, עוברת ביקוע לאחר ארגינין בעמדה 218, מה שגורם ליצירה של צורה קטומה ובלתי-פעילה של PCSK9 במשקל מולקולארי של 55 אלף דלטון. ביקוע פרוטאוליטי זה מתֻווך בהפאטוציטים על ידי 2 אנזימים ממשפחת proprotein convertase, אחד מהם furin והאחר PC5/6A, כמו שהדגימו בעכברי knock-out (עפ"י Essalmani וחב' ב- J Biol Chem משנת 2011). בהקשר זה, מוטציית missence המופיעה באופן טבעי ב-PCSK9 באנשים מסוימים, והידועה כ- Arg218Ser, מעודדת היפר-כולסטרולמיה אוטוזומאלית שולטנית אף בקרב הטרוזיגוטים למוטציה זו (Allard וחב' ב-Hum Mutation משנת 2005). תוצאות אלה במקובץ, מראות שחסר באינאקטיבציה של PCSK9 על ידי furin או PC5/6A יתבטא ברמות מוגברות של LDL-C בפלזמה.
ויסות הורמונאלי ודיאטתי של רמות PCSK9
הביטוי של PCSK9 ורמתו בפלזמה מווסתים באופן הדוק על ידי הסטאטוס ההורמונאלי והדיאטתי. לדוגמה, ביטוי PCSK9 בכבד ורמותיו בפלזמה מופחתים באופן דרמטי על ידי צום (Costet וחב' ב- J Biol Chem משנת 2006, וכן Browning וחב' ב- J Lipid Res משנת 2010, ו-Persson וחב' ב-Arterioscler Thromb Vasc Biol משנת 2010). רמת PCSK9 בצירקולציה משתנה באופן בולט במהלך שעות היום (diurnal rhythm), במקביל לביו-סינתזה של כולסטרול באדם, השפעה המתֻווכת על ידי שינויים בהפרשת הורמון הגדילה (GH). כתוצאה מכך, רמות PCSK9 בפלזמה צריכות להימדד באופן עקבי בשעה מסוימת בכל מטופל (רצוי בבוקר לאחר הצום של הלילה). בנוסף, רמות PCSK9 גדלות בנערות אך פוחתות בנערים בשנות העשרה שלהם, במקביל לשינויים ברמות LDL-C (עפ"י Baass וחב' ב- Clin Chem משנת 2009). בשנות הבגרות (adulthood) רמות PCSK9 גבוהות יותר בנשים מאשר בגברים, אם כי הנתון האחרון אינו מושפע מהבדלים ברמות האסטרוגנים ב-2 המגדרים (עפ"י Mayne וחב' ב-Biochem Biophys Res Commun משנת 20007, ו-Persson וחב' ב-Arterioscler Thromb Vasc Biolמשנת 2012).
ויסות של PCSK9 על ידי sterols וסטטינים
בדומה לרמות LDLR הביטוי של PCSK9 נמצא תחת מודולציה של רמות כולסטרול תוך-תאי, מה שנקבע בעיקר על ידי גורם השעתוק SREBP2 או binding protein-2 sterol-responsive element (עפ"י Dubuc וחב' ב- Arterioscler Thromb Vasc Biol משנת 2004, וכן Jeong וחב' ב- J Lipid Res משנת 2008, ו-Dong וחב' באותו כתב עת משנת 2010). גורם שעתוק נוסף-HNF1α או hepatocyte nuclear factor 1α, התגלה אף הוא כגריין עוצמתי של ביטוי הגן ל-PCSK9 (עפ"י Li וחב' ב-J Biol Chem משנת 2009). Dong משער שרמת PCSK9 עולה, כיוון שסטטינים מגבירים את הביטוי של SREBP2ואת זה של HNF1α. כיוון שקיים וויסות קואורדינטיבי של PCSK9 ו- LDLR ברמת השעתוק הגרעיני על ידי רמת כולסטרול, שניהם מושרים הדדית גם בטיפול בסטטינים. הוכח באופן עקבי באדם ובמודלים בבעלי חיים שטיפול בסטטינים מגביר את רמות PCSK9, והיפוכו של דבר, שהפחתת התפקוד של PCSK9 מגבירה את ההשפעה ההיפו-ליפמית של סטטינים (Berg וחב' ב-Aeterioscler Thromb Vasc Biol משנת 2006, ו- Mayne וחב' ב- Lipids Health Dis משנת 2008).
לדוגמה, נמצא ש-atorvastatin מגביר רמות PCSK9 בפלזמה ב-34% ב-12 מטופלים עם דיסליפידמיה המטופלים בסטטין זה במינון של 40 מיליגרם ליום למשך 16 שבועות (Careskey וחב' ב- J Lipid Res משנת 2008). Welder דיווח בשנת 2010 ב- J Lipid Res ש-atorvastatin הגביר רמות PCSK9 בפלזמה ב-47% כבר אחר 4 שבועות של טיפול יומי בסטטין זה במינון של 80 מיליגרם ב-74 אנשים נורמו-ליפמיים ללא מחלה קרדיו-וסקולארית. בהקשר זה, טיפול יומי ב-rosuvastatin במינון של 20 מיליגרם, נמצא מעלה את רמות PCSK9 בפלזמה ב-28% בגברים, וב-35% בנשים בניסוי JUPITER הרחב. עיכוב של PCSK9 יעודד את השפעת סטטינים בהפחתת רמות LDL-C, ויכול אם כך להיות בעל השפעה סינרגיסטית ביחד עם סטטינים בהפחתת רמת LDL-C וממילא בהפחתת הסיכון למחלה קרדיו-וסקולארית.
העובדה שסטטינים מעלים את רמות PCSK9 בפלזמה, עשויה להסביר את היחס הלא-ליניארי שמוצאים לעתים בין מינון סטטינים לבין רמת LDL-C בפלזמה, ואת התגובה המגוונת של מטופלים בסטטינים מבחינת השפעת הטיפול, שהרי יש כאן לכאורה 2 השפעות מנוגדות זו לזו בטיפול בסטטינים: מחד גיסא הם מפחיתים את רמת LDL-C ומאידך גיסא הם מעלים רמת PCSK9 ובכך גורמים באופן עקיף להעלאה ברמת LDL-C בדם. Taylor וחב' פרסמו בשנת 2014 ב-J Lipids, את מחקרם בו ניסו לבחון האם רמות PCSK9 בנסיוב יכולות לזהות מטופלים שאינם מגיבים לטיפול במינון גבוה של סטטינים.
בניסוי השתתפו 18 מטופלים עם רקע של אי-תגובה לטיפול משך 6 חודשים ב-atorvastatin במינון יומי של 80 מיליגרם (הפחתה ממוצעת ברמת LDL-Cבשיעור של 2.6% בלבד) לעומת קבוצת מטופלים תואמי גיל ומגדר שכן הגיבו לטיפול זהה ב-atorvastatin (הפחתה ממוצעת ברמת LDL-C בשיעור של 50.7%), וכן בהשוואה לקבוצת מטופלים בפלצבו עם הפחתה ממוצעת לאחר 6 חודשי טיפול ב-9.9%, בבמוצע. נמצא , שרמת PCSK9 בעקבות הניסוי הייתה גבוהה באופן שולי בקרב קבוצת הלא-מגיבים לסטטין, אך הייתה גבוהה משמעותית לאחר 6 חודשי ניסוי בקרב אלה שהגיבו היטב ל-atorvastatin.
העלייה ברמת PCSK9 חופשי לאחר 6 חודשי טיפול ב-atorvastatin שנמצאה כ-134.2 ננוגרם למ"ל בממוצע בקרב המגיבים לסטטין, הייתה גבוהה בהרבה מהעלייה ברמת PCSK9 מקץ 6 חודשי טיפול בסטטין בקרב אלה שלא מגיבים לטיפול זה (עלייה ממוצעת של 39.9 ננוגם למ"ל) וכן מהעלייה ברמת PCSK9 במטופלי הפלצבו (עלייה ממוצעת של 27.8 ננוגרם למ"ל). ניסוי זה מרמז שרמות PCSK9 בבסיס הטיפול בסטטינים ובתגובה לטיפול זה, עשויה לסייע בהבדלת המגיבים לסטטינים מאלה שאינם מגיבים לטיפול זה.
הוראות לביצוע הבדיקה
ניתן ליטול את דגימת הדם במבחנה כימית (פקק אדום או צהוב) או במבחנת ספירת דם (EDTA, פקק סגלגל). חשוב להקפיד על נטילת הדם בשעה קבועה במהלך היום באותו נבדק במועדים שונים, שכן ידוע שרמת PCSK9 בדם משתנה בשעות היום השונות.
ראו גם