F2-Isoprostanes

הדפס

מדריך בדיקות מעבדה
F2-Isoprostanes
שמות אחרים	8-isoprostane ;F2α-isoprostane ;8-epi Prostaglandin F2 ;alpha 8-iso Prostaglandin F2 ;15-F2t-isoprostane ;F2-isoPs ;isoprostane ;PGF2 alpha
מעבדה	כימיה בשתן
תחום	הערכת עקה חמצונית בגוף
טווח ערכים תקין	באלה מעל גיל 18 שנה פחות מ-0.86 ננוגרם/מיליגרם קראטינין
יוצר הערך	פרופ' בן-עמי סלע

מטרת הבדיקה

הערכה של פראוקסידציה של ליפידים, באופן שניתן להשתמש בבדיקה זו כמדד לתהליכי עקה חמצונית סיסטמית. מדידת isoprostanes בשתן משמשת גם להעריך את יעילות הטיפול האנטי-אוקסידנטי in vivo.

Iso-prostanes

Isoprostanes הם חומרים דמויי-פרוסטגנדינים הנוצרים in-vivo בתהליך מקוטלז על ידי רדיקלים חופשיים של פראוקסידציה של חומצות שומן הכרחיות (בעיקר של חומצה אראכידונית בפוספוליפידים), ללא פעילות ישירה של אנזימים ממשפחת ה-cyclooxigenase (COX).‏ Iso-prostanes התגלו בשנת 1990 על ידי Roberts ו-Morrow מאוניברסיטת Vanderbilt (Morrow וחב' ב-Analytical Biochemistry משנת 1990, Morrow וחב' ב- Proc Natl Acad of Sci USAמשנת 1990 ו-Morrow ו-Roberts ב-Biochem Pharmacol משנת 1996). Eicosanoids לא-קלאסיים אלה הם בעלי פעילות ביולוגית פוטנטית כגון פעילותם כתווכים של תהליכי דלקת ובהגברת תחושת כאב (Evans וחב' ב-J Pharmacol Exp Ther משנת 2000). חומרים אלה הם סמנים מדויקים הן באדם אך גם בחיות במודלים של עקה חמצונית. רמות מוגברות של iso-prostanes נחשדות כתורמות לסיכון של התקפי-לב במטופלים הנוטלים תכשירי Coxib‏. Iso-prostanes והמטבוליטים שלהם נמצאו בשתן של מעשני סיגריות, ואף הוצעו כסמנים ביולוגיים של עקה חמצונית במעשנים (Seet וחב' ב-Free Radical Biol & Med משנת 2011).

חלוץ המחקרים על המטבוליזם של פרוסטגלנדינים היה Nugteren שפרסם כבר ב-1975 ב-J Biol Chem את הנתונים על מטבוליטים של פרוסטגלנדיניים בשתן אדם. Nugteren חיפש שיטה פחות מגושמת לקביעת קצב ההפרשה של פרוסטגלנדינים והמטבוליטים שלהם באדם, תוך שימוש באסטרטגיה שתגביל את מספר התרכובות שניתן לגלות במיצוי השומנים, ותאפשר הכנה של נגזרות יציבות של פרוסטגלנדינים לפני האנליזה בשיטת GC/MS.

נפיצות של F2-isoprostane

חומצות שומן רב-בלתי-רוויות השונות מחומצה אראכידונית חשופות אף הן לתרכובות מחמצנות, כגון reactive oxygen species ואף הן מייצרות isoprostanes. לדוגמה, בנוסף ל-4 הקבוצות של F2-isoprostanes הנובעות מפראוקסידציה של חומצה אראכידונית, גם פראוקסידציה של EPA או eicosapentaenoic acid מוביל ליצירה של 6 קבוצות של F3 isoprostanes, בעוד שחומצה α-linolenic וחומצה γ-linolenic יובילו ליצירה של E1-isoprostane ושל F1-isoprostanes, ואילו DHA או חומצה docosahexanoic תוביל ליצירה של 3 קבוצות של D4-isoprostanes, ו-8 קבוצות של E4-isoprostanes. כל אחת מהקבוצות הללו מורכבת מעד 8 איזומרים רצמיים, מה שמסתכם במספר רב של מולקולות isoprostane (Janssen ב- Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol משנת 2001).

עקה חמצונית נובעת מיצירה והצטברות-יתר של חמצן פעיל ושל תרכובות חנקניות, ונמצא שעקה חמצונית זו מזיקה לליפידים, לליפו-פרוטאינים, ל-DNA ולחלבונים. יתרה מכך, עקה חמצונית היא בעלת השפעה מודולטורית על מודיפיקציות בליפּו-פרוטאינים וב-DNA, באופן שחלים שינויים בתפקוד של תאי אנדותל ובתהליכי דלקת, מה שמסייע להתחלה ולהתקדמות של תהליכי טרשת ותחלואה קרדיו-וסקולארית (Strobel וחב' ב-Int J Cardiol משנת 2011, ו-Davies ו-Roberts ב-Free Radical Biol Med משנת 2011). בדיקת F2-isoprostanes נחשבת "מדד הזהב" לכימות על העקה החמצונית in vivo הנגרמת מפראוקסידציה. גם 15-F2t-isoprostane, הוא אחד מה-F2-isoprostanes המיוצר בעודף ומשחק תפקיד של מכווץ כלי-דם של הלב, המוח, הכליות והריאות. יצירה של 15-F2t-isoP משרה שגשוג של שריר חלק בדופן כלי הדם, כמו גם הפרשה של אנדותלין. ראיות נוספות מצביעות על אפשרות ש-F2 isoprostanes מגבירים את התנגודת לאספירין בטסיות-דם מה שמגביר את הצימות של תאים אלה (Vassale וחב' ב-Coron Artery Dis משנת 2003).

היתרון של F2-isoprostanea על סמנים אחרים של פּראוקסידציה של ליפידים נובע מיציבות תרכובות אלה in vivo ו-in vitro, וכיוון שניתן לגלות אותם במגוון רקמות בגוף ובנוזלים ביולוגיים כולל פלזמה, שתן, בנוזל השדרה, בנוזל שטיפה של איברים חלולים (lavage) ובאריתרוציטים. מדידת ריכוזי F2-isoprotane בדגימת שתן אקראי נחשבת למדויקת ביותר ואינה כרוכה בהתערבות חודרנית. שיטות מדידה מס-ספקטרומטריות כגון GC-MS או LC-MS/MS נחשבות רגישות יותר מאשר שיטות immunoassay. אמנם מבחינת רגישותם, F2-isoprostanes הם בעלי עדיפות על סמנים ביולוגיים אחרים לעקה חמצונית, אך מנגד הם חסרים את הספציפיות הקלינית לגבי מחלה זו או אחרת. טיפולים פרמאקולוגיים נוגדי-חמצון, תכשירים היפוגליקמיים לחולי סוכרת, הפסקת עישון והפחתת משקל, כל אלה נמצאו מפחיתים את היצירה של F2-isoprostanes.

Isoprostanes, מטבוליזם והערכת עקה חמצונית

למרות נטייה מדעית חזקה להתמקד במטבוליטים אינדיבידואליים של המסלולים המטבוליים, כיוון שרדיקלים המתווכים על ידי isoprostanes מייצרים איזומרים מרובים עם קצב שונה של מטבוליזם אנזימטי וקצב הפרשה שונה בשתן, שיטות המודדות את סך האיזומרים במקובץ, יכולות לספק הערכה כוללנית יותר של עקה חמצונית בהשוואה לבידוד ומדידה של כל אחד מהאיזומרים בנפרד (Yan ב-Anal Biochem משנת 2010). גורם קריטי להערכה אופטימאלית של עקה חמצונית על ידי מדידה של isoprostanes, הוא השיקול של שׁוֹנוּת אינדיבידואלית במטבוליזם המהיר של תרכובות אלו, הנוצרות בריאקציות המתווכות על ידי רדיקלים, אך עוברות מטבוליזם במסלולים אנזימטיים שונים. Smith וחב' מצאו שבממוצע 50% מכל ה-isoprostanes בשתן מופרשים כ-glucuronide (Ann Clin Biochem משנת 2011).

מה שמסבך עוד יותר את התמונה היא העובדה שאחוז ה-iso-prostanes המופרשים בשתן כנגזרות של גלוקורונידים, נע בין 20-80% בין אנשים בריאים. מחקרים עדכניים הניבו תוצאות דומות (Roberts וחב' ב-J Biol Chem משנת 1996). ממצא זה נובע כנראה מהשונות בביטוי של UGT או UDP-glucuronosyltransferase. נתון זה מציב סמן שאלה מעל הערך של מדידות קודמות של isoprostane בשתן, כולל אלו שבוצעו על ידי שימוש ב-GC/MS או ב-LC/MS/MS, בהם הכנת הדגימות הביאה להרחקת glucuronides (Soffler וחב' ב-J Veter Diagnost Invest משנת 2010). הערכה של Oxford Biomedical Research היא ערכת ה-ELISA היחידה המתייחסת למגבלה האמורה, וכוללת את האנזיםglucuronidase, באופן שמדידת isoprostane תיתן תשובה אמיתית.

Isoprostanes כסמנים של עקה חמצונית

רדיקאלים חופשיים הם כל כך ראקטיביים וקצרי-חיים עד כי מדידה ישירה שלהם אינה מתאפשרת. זו הסיבה ש-F2-isoprostanes המוגדרים כסמנים מולקולאריים מצוינים נמדדים במקום רדיקאלים חופשיים. ה-F2-isoprstanes גורמים לכיווץ כלי-דם, לעליית לחץ-דם, ומעודדים יצירת קרישי-דם. בנוסף, F2-isoprostanes עלולים להיות מוגברים בשלבים הראשונים של יצירת הרובד הטרשתי, ומחקרים הראו שאנשים עם רמות גבוהות של F2-IsoPs הם בסיכון הגבוה פי-30 לפתח מחלת לב (Roberts ו-Morrow ב-Free Radic Biol Med משנת 2000). המדידה בשתן מוכרת כסטנדרד הזהב לעקה חמצונית (Schwedheim וחב' ב-Circulation משנת 2004, Lawson וחב' ב- J Biol Chem משנת 1999 ו-Morrow וחב' ב-Proc Natl Acad Sci USA משנת 1992).

יצירת isoprostanes גדלה ביחס ישיר לרמת העקה החמצונית. מדידת ריכוזו של isoprostane ספציפי, F2t-IsoP-15 או כפי שהיה מוכר בעבר כ-8-iso-PGF2α בדם או בשתן, היא שיטה מוכרת מאוד להערכה של עקה חמצונית (Zhang וחב' ב-Anal Biochem משנת 2010). הבחירה באיזומר 15F2t-isoP, התבססה באופן היסטורי על הזמינות של סטנדרט אוטנטי, זאת בנוסף למחקרים רבים שתיעדו את השימוש בו כ-isoprostane מייצג.

יצירת F2-IsoP במחלות האדם

תוך שימוש בשיטות GC/NICI-MS ניתן למדוד רמות נורמאליות של יצירת F₂-IsoP באנשים בריאים במגוון של נוזלי-גוף. מכאן שניתן בעזרת מדד זה להעריך את התפקיד של עקה חמצונית בפאתו-פיזיולוגיה של מחלות האדם. רמות מוגברות של IsoP בנוזלי-גוף וברקמות נמצאו במספר ניכר של מפגעי האדם.

מחלות טרשתיות קרדיו-וסקולאריות

למרות שניסויים נכשלו באופן כללי להביא תועלת במניעת מחלת לב על ידי אנטי-אוקסידנטים, יש עדיין די ראיות לתמוך בהשערה שעקה מחצונית כרוכה באופן אינטימי בפתוגנזה של טרשת עורקים. בתיאום עם ההיפותזה של חמצון LDL כשלב קריטי בתהליכי הטרשת. כדי להתייחס לסוגיה הזו, נמדדו רמות של F2IsoP ברבדים טרשתיים מתקדמים שהוסרו בפרוצדורה של thrombarterectomy עורקי מ-10 מטופלים, והושוו עם רמות F2IsoP ברקמת רובד של וריד הטבור שהוסר מהשלייה מיד לאחר 10 לידות (Gniwotta וחב' ב-Arterioscler Thromb Vasc Biol משנת 1997). רמות של F2IsoPs ברקמה וסקולארית שנורמלה למשקל יבש או משקל רטוב של רקמה, היו באופן משמעותי גבוהות יותר ברבדים טרשתיים מאשר ברקמה וסקולארית נורמאלית. כאשר הנתונים נורמלו על בסיס תכולת חומצה אראכידונית, היחס F2IsoP/arachidonic acid היה גדול בערך פי-4 ברקמה הטרשתית בהשוואה לרקמה הווסקולארית הנורמאלית (p=0.009). ממצא זה מצביע על כך שחומצות שומן בלתי-רוויות ברבדים טרשתיים עוברים חמצון בולט יותר מאשר ליפידים ברקמה נורמאלית, ממצא התואם את הנתונים של קבוצתו של FitzGerald, שהראו רמות מוגברות של F2IsoPs בנגעים טרשתיים בעורקי אדם כולל מיקומם של F2IsoPs בתאי קצף ובתאי שריר חלק וסקולארי (Pratico וחב' ב-J Clin Invest משנת 1997).

טרשת עורקים והיפר-כולסטרולמיה

כיוון שאלה עם רמת כולסטרול מוגברת הם בעלי סיכון מוגבר לתהליכי טרשת, היה עניין לקבוע האם רמות F₂IsoPs מוגברות במטופלים אלה (Roberts ו-Morrow ב-Meth Enzymol משנת 1999). רמות F₂IsoPs בחולים עם היפר-כולסטרולמיה נמצאו גבוהות משמעותית (בממוצע פי-3.4) מעל רמות F₂IsoPs שנקבעו בקבוצת ביקורת בריאה (0.001p<). מחקר אחד מצא שהפרשה בשתן של F₂IsoPs הייתה מוגברת במטופלים עם היפר-כולסטרולמיה type II פי-2.5 בממוצע, אלא שעלייה זו דוכאה בערך ב-60% על ידי טיפול בוויטמין E נוגד החמצון שניתן במינון של 600 מיליגרם ליום (Davi וחב' ב-Arterioscl Thromb Vasc Biol משנת 1997, וב-Circulation מאותה שנה).

טרשת עורקים וסוכרת

חולים סוכרתיים ידועים כבעלי שכיחות מוגברת של טרשת עורקים. מעניין שיצירת F2IsoPs נמצאה מושרית in vitro בתאי שריר חלק וסקולאריים על ידי הגברת ריכוז הגלוקוזה (Natarajan וחב' ב-Am J Physiol משנת 1996). לכן מספר מחקרים בחנו האם יש הוכחה לעקה חמצונית מוגברת in vivo בחולי סוכרת (Oguogho ו-Sinzinger ב-J Physiol Pharmacol משנת 2000, ו-Davi וחב' ב-Chem Phys Lipids משנת 2004).נמצא ש- F2IsoPs היה מוגבר בסוכרת type 1 וכן בסוכרת type 2, למרות שהסיבה לפראוקסידציה של ליפידים אינה ברורה. במקרה של סוכרת type 1 בילדים ובנערים, העלייה ב-F2IsoP מייצגת אירוע מוקדם של המחלה והריכוז של האחרון פוחת ככל שהמחלה מתקדמת (Davi וחב' ב-Circulation משנת 2003).

במקרה של סוכרת type 2, מספר דיווחים הבחינו באדם בעליות ברמת F2IsoPs בפלזמה ובשתן. Davi וחב' דווחו ב-1999 ב-Circulation שהפרשת IsoP בשתן מוגברת באופן בולט ברוב הגדול של חולי סוכרת type 2, במחקר אחרון זה הראו מתאם גבוה משמעותית בין רמת גלוקוזה בפלזמה לרמת IsoP המופרש בשתן, מה שמרמז לכך שפראוקסידציה של ליפידים קשורה לבקרה הגליקמית. יתרה מכך, ההיפותזה ששיבוש בבקרה הגליקמית (ולא גורמים אחרים) אחראית ליצירה המוגברת של F2IsoPs בסוכרת type 2, נתמכת על ידי העובדה שטיפול אנטי-סוכרתי אינטנסיבי מביא להפחתת רמות IsoP בפלזמה וכן בשתן. בנוסף, הגברת השפעול של טסיות-דם המושרה על ידי היפרגליקמיה, התרחש במקביל לעליה בעקה חמצונית על פי מחקריהם של Davi וחב'. נתון זה הוא בעל עניין שהרי 15-F2t-isoP הוא ליגנד הנקשר לקולטן של thromboxane (על פי Fam ו-Morrow ב-Curr Med Chem משנת 2003).

בנוסף, מחקר אחר בחן האם יש ראיות לעקה חמצונית מוגברת in vivo בחולי סוכרת (Koulouris וחב' ב-Circulation משנת 1966). רמות F2IsoPs שעברו אסטריפיקציה בליפידים של הפלזמה נמדדו ב-61 מטופלים שעברו אנגיוגרפיה של העורקים הכליליים, ש-15 מתוכם היו סוכרתיים. מידת הטרשת הכלילית בחולי סוכרת הייתה דומה לזו שנמצאה ב-46 נבדקים לא-סוכרתיים. בפלזמה של סוכרתיים רמות F2IsoPs שנמדדו היו ±4.833.4 פיקוגרם/מ"ל, שהיו מוגברות משמעותית בהשוואה לרמות שנמדדו בנבדקים לא סוכרתיים (±1.922.2 פיקוגרם/מ"ל). ממצאים דומים דווחו על ידי Gopaul וחב' ב-FEBS lett משנת 1995, שמצאו עלייה ממוצעת של פי-3.5 ברמת F2-IsoP בפלזמה של חולי סוכרת בהשוואה לנבדקים בריאים. בנוסף, דווח שרמות IsoP בשתן של סוכרתיים הן על ידי טיפול בוויטמין E, או כאשר חולים אלה היו באיזון גליקמי (Lawson וחב' ב-J Biol Chem משנת 1999).

טרשת עורקים והשמנת-יתר (obesity)

ההערכה היא שכ-70% מהאמריקאים הבוגרים הם בעודף משקל, ו-25% מתוכם הם obese (על פי Eckel וחב' ב-Circulation משנת 2002). עודף משקל כרוך בתמותה מוגברת ממחלות קרדיו-וסקולאריות הנובעות מטרשת עורקים (Fontaine וחב' ב-JAMA משנת 2003). לפחות שלושה מחקרים סיפקו ראיות לכך שעלייה סיסטמית בעקה חמצונית יכולה להיות מרכיב חשוב דרכו obesity מגבירה את התחלואה הקרדיו-וסקולארית הטרשתית (Davi וחב' ב-JAMA משנת 2002, ו-Block וחב' ב-Am J Epidemiol משנת 2002, ו-Keaney וחב' ב-Arteriscl Thromb Vasc Biol משנת 2003). במחקר של Keaney וחב' נמסר שקיים קשר בין עליה ב-BMI ועליה בעקה החמצונית. על ידי מדידת רמת F2IsoPs בשתן הראו החוקרים בקרוב ל-3,000 נבדקים במסגרת מחקר הלב של Framingham, שעלייה ביצירת IsoP בגברים ונשים כרוך בחוזקה עם העלייה ב-BMI. גם Patrono וחב' דווחו ב-JAMA משנת 2002 שאיבוד משקל בנשים מאוד כבדות משקל כרוך בהפחתה משמעותית ביצירת IsoP.

מחלת אלצהיימר

עקה חמצונית נחשבת כגורם בפּתוגנזה של מספר מפגעים נוירו-דגנרטיביים כולל מחלת אלצהיימר. עליות מקומיות בנזק חמצוני ובפּראוקסידציה של ליפידים תוארו ברקמות מוח שנלקחו בניתוחים שלאחר המוות מחולי אלצהיימר (Markesbery ב-Free Radical Biol Med משנת 1997). בדומה, רמות F2-IsoPs מוגברות משמעותית באזורי מוח פגועים של חולים אלה, בהשוואה למוחות של בריאים (Reich וחב' ב-Am J Pathol משנת 2001). עם זאת, היה חסר מדד אובייקטיבי של נזק חמצוני הכרוך במחלת אלצהיימר בחולים שהם עדיין בחיים. נוזל ונטריקולארי שהושג מ-11 חולי אלצהיימר לאחר מותם, וכן מ-11 נבדקי ביקורת, להערכת רמות F2IsoPs ב-CSF (על פי Montine וחב' ב-Ann Neurol משנת 1998). מכל הנבדקים הנוזל הנבדק התקבל תוך 3 שעות לאחר המוות. רמות F2IsoPs היו מוגברות משמעותית בנוזל הוונטריקולארי של חולי אלצהיימר (72±7 פיקוגרם/מ"ל) לעומת 4±46 פיקוגרם/מ"ל ב-CSF של נבדקי ביקורת (0.01p<). ממצאים אלה של רמות מוגברות של IsoP היו במתאם עם דרגת Braak גבוהה יותר ועם משקל מוח קטן יותר, שני מדדים של חומרת המחלה.

בהמשך, נעשה מחקר לבחון את רמות F2IsoPs ב-CSF של בני-אדם חיים החשודים למחלה השיטיונית (Montine וחב' ב-Neurology משנת 1999). במחקר השתתפו 27 חולי אלצהיימר ו-25 משתתפים ללא מחלה נוירו-דגנרטיבית, כאשר 2 הקבוצות היו תואמות גיל ומגדר. רמות F2IsoPs היו מוגברות משמעותית ב-CSF של חולי אלצהיימר (31.0±2.6 פיקוגרם/מ"ל, לעומת 22.9±1.0 פיקוגרם/מ"ל, עם מובהקות של 0.05p<). במחקר של Pratico וחב' ב-Ann Neurol משנת 2000, מצא אף הוא רמות מוגברות F2IsoPs ב-CSF של מטופלים עם חשד או אבחון של אלצהיימר, כמו גם באלה עם פגיעה קוגניטיבית מתונה (MCI) מצב המקדים מחלת אלצהיימר (Pratico וחב' ב-Arch Neurol משנת 2002).

מחלת ריאות

העניין במדידת IsoPs כמדד לנזק חמצוני במחלת ריאות, נובע בחלקו ממחקרים שבחנו את הפעילויות הביולוגית של חומרים אלה בצירקולציה הריאתית. ההשפעות הפיזיולוגיות של IsoP בריאות נידונו בסקירה של Janssen ב-Am J Physiol משנת 2001). נראה על פי בעל סקירה זו שה-F2IsoPs הם לא רק סמנים של עקה חמצונית, אלא משחקים תפקיד ממשי בפתו-פיזיולוגיה הריאתית שכן הם מעודדים תגובות ביולוגיות ברוב הסוגים של תאי הריאות. שני ה-IsoPs שנלמדו בפרוט הרב ביותר בריאות, הם 15-F2t-IsoP ו-15-E2t-IsoP. באופן כללי 2 החומרים האחרונים גורמים לכיווץ השרירים החלקים בכלי הדם הריאתיים ובשרירים של דרכי האוויר. השפעות אלה נעשות על ידי האינטראקציה שלהם עם הקולטן של thromboxane, שהוא קולטן eicosanoid הקשור ל-G-protein, וכנראה גם על ידי האינטראקציה שלהם עם מספר קולטנים איקוזנואידים אחרים (Morrow ו-Roberts ב-Prog Lipid Res משנת 1997). בהמשך משרים ה-F2IsoPs בתוך תאי הריאה מערכות של 2nd messengers כולל phospolipase C/inositol triphosphate וmitogen-activated protein kinase (MAP) שגורמות לכיווץ תאי שריר חלק וסקולאריים (Fukunaga וחב' ב-Am J Physiol משנת 1993, ובאותו כתב עת משנת 1997). יתרה מכך, IsoPs משפעלים תאי דלקת שונים כמו נויטרופילים, מה שגורם לספיחה מואצת של תאים אלה לתאי אנדותל.

עישון סיגריות

המנגנון הקושר בין עישון סיגריות והסיכון למחלת ריאות או מחלה קרדיו-וסקולארית אינו ברור באופן מוחלט. הפאזה הגאזית של עשן מהסיגריה מכילה מספר חומרים מחמצנים וחשיפת הריאות לעשן זה גורמת לחמצון רקמת הריאה וכן חמצון ליפידים בצירקולציה (Frei וחב' ב-Biochem J משנת 1991). לכן נבדקה ההיפותזה שעישון גורם לעקה חמצונית ונמדדו רמות F2IsoPs בפלזמה של מעשנים לבחון האם הן מוגברות. עשרה מעשנים כבדים (מעל 30 סיגריות ליום) ו-10 מתנדבים לא-מעשנים תואמי-גיל ומגדר, נבחנו (Morrow וחב' ב-N Eng J Med משנת 1995). הרמות של F2IsoPs חופשיים ואלה שעברו אסטריפיקציה, היו משמעותית גבוהות יותר בפלזמה של מעשנים. הוכחה לכך שהבדלים אלה ברמות F2IsoPs בין מעשנים ולא מעשנים אכן נובעים מהעישון, הושגה על ידי מדידה חוזרת של רמות אלה במעשנים לאחר הימנעות של שבועיים מעישון. בכל הנבדקים, רמות F2IsoPs החופשיות בצירקולציה וכמולקולות שעברו אסטריפיקציה כליפופרוטאינים בפלזמה, היו משמעותית נמוכות יותר לאחר שבועיים של הימנעות מעישון. קבוצות מחקר נוספות אישרו ממצאים אלה (Reilly וחב' ב-Circulation משנת 1996, ו-Obwegeser וחב' ב-Lipid Mediators משנת 1999).

אסתמה מושרית על ידי אלרגנים

אסתמה היא מחלת דלקתית כרונית של דרכי האוויר שיש הכורכים אותה עם נזק חמצוני לריאה, אך הוכחה מוצקה לכך חסרה. מספר ניסויים בחנו יצירת F2IsoPs בקבוצה של 11 עם אסתמה אטופית קלה לאחר שאיפה של אלרגן מאתגר (Dworski וחב' ב-Am J Respir & Crit Care Med משנת 1999). ההפרשה בשתן של F2IsoPs גדלה בשיעור של 73% בממוצע שעתיים לאחר אתגור על ידי האלרגן ורמה מוגברת זו נותרה בעינה בכל איסופי השתן למשך 8 שעות הניסוי רמות IsoPs לא השתנו בשתן לאחר שאיפה מאתגרת של methacholine. בתשעה מתוך המטופלים האטופיים נמדדו רמות F2IsoPs בנוזל השטיפה (lavage) הברונכו-אלבאולארי בבסיס הניסוי ולאחר 24 שעות מהחשיפה לאלרגן. רמות F2IsoPs עלו משמעותית בממוצע ב-27% בדגימת lavage שנאספה מאוחר. בהמשך הראו Dworski וחב' ב-Clin Exp Allergy משנת 2001, הגברה משמעותית ברמת המטבוליט העיקרי של 15-F2t-IsoP בשתן של חולי אסתמה אטופיים לאחר חשיפה לאלרגן. ממצא זה אושר על ידי Wood וחב' ב-Lipids משנת 2000). בנוסף, Barnes וחב' הראו שרמות IsoP מוגברות משמעותית גם בתרכיז אויר הננשף מפיהם של חולי אסתמה בהשוואה לאנשים בריאים (Montuschi וחב' ב-Am J Respir Crit Care Med משנת 1999).

היבטים אנליטיים של מדידת F2-isoprostane

F2-isoprostane ו-prostaglandin F1 alfa מופרדים ועוברים כימות בשתן על ידי LC-MS/MS. העמודה בה משתמשים להפרדת שתי תרכובות אלו היא עמודה אנליטית מסוג Waters Xbridge C8. מעמודה זו, הועברה הדגימה לעמודת API 5000 MS/MS.

יתרונות של מדידת isoprostanes בשתן בערכת ELISA של Oxford Biomedical Research

אי הצורך במיצוי השתן: אמנם שיטות immuno-assay לכימות isoprostane בשתן מפיקות תשובות באופן מהיר יחסית, אך הרגישות שלהם אינה טובה דיה כדי לכמת את ה-isoprostane בשתן שריכוזו נמוך יחסית ביונקים. ריכוז דגימות השתן על יד העברתו דרך קולונות קטנות של Sep-Pak המבוססות על כרומטוגרפיית זיקה (immunoaffinity) על מנת להגדיל את ריכוז isoprostane בדגימת השתן הנבדקת, מאריכה את משך הבדיקה כמו גם את עלותה. חברת Oxford Biomedical Research פיתחה buffer מיוחד שמאפשר לדלג על שלב במיצוי בקולונות ה-solid phase. שיטת ELISA זו עברה תיקוף (validation) ונמצאה במתאם טוב עם המדידות בשיטת GC/MS, תוך קיצור משך ביצוע המדידה.

בראשונה Roberts ו-Morrow דווחו על isprostanes כעל מדד של תוצרים עיקריים של חמצון ליפידים in vivo על ידי רדיקאלים חמצוניים (Roberts ו-Morrow ב-Free Radic Biol Med משנת 2000), אך הם נחשבים כסמנים אמינים של עקה חמצונית (Lawson וחב' ב-J Biol Chem משנת 1999, ו-Morrow וחב' ב-Proc Natl Acad Sci USA משנת 1992). יצירה של isoprostane משיירים אראכידוניליים בפוספוליפידים פוגעת משמעותית בממברנות תאים (Awad וחב' ב-J Biol Chem משנת 1993). לכן isoprostanes עוברים ביקוע מהיר, משתחררים, עוברים מטבוליזם ומופרשים.

שיטות לאנליזה של isoprostanes

המחקרים החלוציים והאלגנטיים של Roberts ו-Morrow עשו שימוש ב-GC/MS. בהמשך פותחו שיטות נוספות למדידת רמות isoprostanes הכוללות LC/MS (על פי Medina וחב' ב-Rapid Commune Mass Spectrom משנת 2012, ו-Basu ב-Prostaglandins Leukoe Essent Fatty Acids משנת 1998), שיטת RIA (על פי Nasu ב-FEBS Lett משנת 1998, ו-Sasaki וחב' ב-Adv Exp Med Biol משנת 2002), ושיטת ELISA (על פי Spickett וחב' ב-Free Radic Res משנת 2010, ו-Liu וחב' ב-Free Radic Niol Med משנת 2009, ו-Proudfood וחב' ב-Anal Bichem משנת 1999).לכל אחת משיטות אלו יתרונות ומגבלות.

שיטות ממוכשרות

באופן כללי קיימת הסכמה שהשיטה המדויקת ביותר היא שיטת LC/MS/MS בה כוללים בקר מסומן בדויטריום כדי לנטר איבוד של חומר במהלך הכנת הדגימה.LC/MS/MS מאפשרת הפרדה מעולה של האיזומרים האינדיבידואליים של ה-isoprostanes. השיא המתקבל של 15-F2t-isoP, שנמדד בשיטת GC/MS המקורית, ידוע כמורכב מ-4 איזומרים של isoprostanes. אך כיוון שכל האיזומרים האלה מקורם באופן ראשוני מאותו מסלול המתווך על ידי רדיקאל חמצוני, הם עדיין מייצגים שיטה אמינה להערכת עקה חמצונית. החולשה של שיטות מדידה אלו היא העלות הגבוהה של הציוד כמו גם שיטות המיצוי המַקִּיף ואיטיות תהליך המדידה. יתרה מכך, מדידה של איזומר בודד של isoprostane, עלולה לא להיות האינדיקטור הטוב ביותר של עקה חמצונית, שכן איזומרים רבים עוברים מטבוליזם מהיר, בקצב שיכול להיות שונה, ואז הכימות שלהם בשיטות האנליטיות עלול להניב תוצאות בלתי מייצגות.

שיטות immunoassay

שיטות המדידה האימוניות כגון RIA או ELISA משמשות כחלופות פופולריות לאנליזה של isoprostanes. עם זאת, השיטות המבוססות על נוגדנים היו נתונות לביקורת על כך שמדידות בשיטת ELISA נכשלות לעיתים להיות במתאם טוב עם שיטת GC/MS (על פי Bessard וחב' ב-J Chromatogr B Biomed Sci Appl משנת 2001, ו-O'Sullivan וחב' ב-Prostaglandins & Other Lipid Mediat משנת 1999). כמו כן, ערכי ELISA של isoprostanes הם אופיינית גבוהים יותר מאלה שמקבלים בשיטות GC/MS או LC/MS/MS, זאת כיוון שנוגדנים רב-שבטיים (polyclonal) מגיבים באופן cross-reactive עם תרכובות בעלות מבנה דומה לזה של isoprostanes (על פי Calleweart ו-Sloan ב-Methods Mol Biol משנת 2010, ו-Smith וחב' ב-Ann Clin Biochem משנת 2011). בערכה המשופרת של Oxford's ELISA, הנוגדנים מזהים אך ורק תרכובות הנובעות ממסלול ה-isoprostane, ולכן התוצאות המתקבלות בשימוש בערכה זו תואמות היטב את התוצאות המתקבלות בשיטות GC/MS או LC/MS/MS (על פי Yin וחב' ב-J Biol Chem משנת 2007).

הוראות לביצוע הבדיקה

אין צורך בצום לפני מתן השתן, אך המטופל צריך להפסיק 72 שעות לפני הבדיקה נטילת תרופות NSAIDs, ולהפסיק נטילת אספירין שבועיים לפני מתן השתן. יש לאסוף 5–10 מיליליטר של שתן אקראי, ואין להוסיף לשתן חומרים משמרים. כמו כן למען דיוק התוצאות רצוי לא לעשן מספר ימים לפני הבדיקה וכן להימנע מנטילת סטטינים.

לדגימות מוסיפים בקרים (internal standards) כגון 15-F_2t-IsoP מסומן ב-deuterium וכן PGF2α, ואז הדגימות נדחסות דרך פילטר להרחקת חלקיקים ומשקעים מהשתן. היחס בין שטח ה-peak של 15-F_2t-IsoP לזה של PGF2α וכן היחס בין שטחי שיאים אלה ל-internal standards המסומנים ב-deuterium, משמש לחישוב האנליטים האמורים. אין מדווחים את רמת PGF2α, שכן האנליזה של האחרון מתבצעת רק על מנת לוודא הפרדה מוחלטת שלו מ-15-F_2t-IsoP (Milne ב-Nature Prot משנת 2007). תרחישים הגורמים ליצירה מוגברת של רדיקאלים חופשיים, כולל טרשת עורקים, עישון ואלכוהוליזם מגבירים את ההפרשה של isoprostanes בשתן.

ראו גם

• חזרה לדף מדריך בדיקות מעבדה
• בדיקות מעבדה - אבחון מחלות שונות

המידע שבדף זה נכתב על ידי פרופ' בן-עמי סלע, המכון לכימיה פתולוגית, מרכז רפואי שיבא, תל-שומר;
החוג לגנטיקה מולקולארית וביוכימיה, פקולטה לרפואה, אוניברסיטת תל-אביב (יוצר הערך)