המופקסין - Hemopexin

הדפס

מדריך בדיקות מעבדה
הֶמוֹפּקסין
Hemopexin
שמות אחרים	HPX, β-1B-glycoprotein
מעבדה	כימיה בדם ובשתן
תחום	המוליזה, המוגלובין, heme
טווח ערכים תקין	בנסיוב-במבוגרים 50-115 מיליגרם/ד"ל; בדם אִמָּהִי רמת המופקסין גבוהה בלמעלה מ-50% בהשוואה לדם של אישה שאינה בהיריון; בעוברים או בתינוקות עם לידתם רמת המופקסין כ-30% מהרמה במבוגרים, או כ-18% מהרמה בדם אמהי.
יוצר הערך	פרופ' בן-עמי סלע

המבנה של המופקסין

המופקסין (להלן HPX) הוא גליקופרוטאין בעל משקל מולקולארי של 63,000 דלטון, ומקודד על ידי הגן HPX (Altruda וחב' ב-J Mol Evol משנת 1988). גן זה בגודל של 12kb והוא נקטע על ידי 9 אֶקסוֹנים. Law וחב' מיקמו בשנת 1986 את הגן HPX לזרוע הקצרה של כרומוזום 11 בעמדה 11p15.5-p15.4, הזהה לעמדת הגן המקודד ל-β-globin.

החלבון HPX מורכב משרשרת פוליפפטידית אחת המכילה 439 חומצות אמינו ו-6 קשרים פנימיים די-סולפידים (Altruda וחב' ב-Nucleic acids Res משנת 1985). שייר ה-threonine ה-N-טרמינאלי חסום על ידי galactosamine אוליגוסכרידי בקשר O גליקוזידי, ולחלבון יש חמש שרשרות אוליגוסכרידיות בהן גלוקוזאמין קשור בקשר N-גליקוזידי לרצף Asn-X-Ser/thr, בו X יכולה להיות שייר של חומצת אמינו כלשהי, כאשר serine או threonine מופיעים בעמדה השלישית. תכונה אופיינית של HPX היא התכולה הגבוהה של 18 שיירי טריפטופן המאורגנים ב-4 צברים. עיכול טריפטי מוגבל, מבקע את apoHPX לאחר שייר ארגינין בעמדה 216, בעוד ש-HPX הקשור ל-heme עובר ביקוע דומה לאחר שייר ליזין בעמדה 101, מה שמצביע על כך שקישור הליגנד heme לחלבון HPK גורם בו לשינוי קונפורמציה.

אנליזה של ההומולוגיה של חומצות אמינו מצביעה על כך שהחלבון HPX מכיל 2 מקטעים (domains) הומולוגים שכל אחד מהם בגודל של 200 חומצות אמינו, המחוברים ביניהם על ידי פפטיד מקשר שגודלו 20 חומצות אמינו. מקטעים דומים מוצאים גם בחלבונים אחרים (Hunt וחב' ב-Protein Seq Data Anal משנת 1989), הכוללים קולאגנזות, בהם מקטע דמוי-HPX, הנקשר למקטע הקטליטי על ידי פפטיד מקשר בן 17 חומצות אמינו, החיוני להתקשרות לקולאגן. המבנה הגבישי של קולאגנזות (Li וחב' ב-Structure משנת 1995), והמקטע ה-C-טרמינאלי של HPX (על פי Faber וחב' ב-Structure משנת 1985), מראים שמקטעים אלה הם בעלי מבנה מקופל הידוע כ- 4-bladed β-propeller fold, שהוא ואריאנט של מבני β-propeller גדולים יותר שמוצאים גם בחלבוני G, ב-clathrin, וב-integrins (על פי Lambright וחב' ב-Nature משנת 1996, ו-Springer ב-Proc Natl Acad Sci USA משנת 1997).

מקטעי חלבון אלה במקובץ, מצטיירים כבעלי חשיבות רבה בביולוגיה של התא, בעיקר כמתווכים של אינטראקציות בין חלבונים (Smith וחב' ב-Trends Biochem משנת 1999). לאחר מכן קבעו Paoli וחב' ב-Nature Struct Biol משנת 1999, את המבנה הגבישי של HPX טבעי מארנבת, וכן את המבנה של apo-HPX שעבר דה-גליקוזילציה, וכן את מבנה החלבון הקשור ל-heme. לא נמצאו הבדלי מבנה משמעותיים בין HPX הטבעי לבין חלבון זה שעבר דה-גליקוזילציה. ה-heme נקשר בין 2 המקטעים הראשיים , בגומחה בה מופיע הפפטיד המקשר בן 20 חומצות האמינו. שני שיירי היסטידין מתפקדים בקואורדינציה של קישור heme ל-HPX: שייר His213 השייך לפפטיד המקשר, ו-His266, השייך ללולאה של המקטע ה-C-טרמינאלי.

ה-cDNA של HPX שובט באדם ובחולדה (Nikkila וחב' ב-Biochemistry משנת 1991, ו-Takahashi וחב' ב-Proc Natl Acad Sci USA משנת 1985). באדם, ה-HPX-cDNA הוא באורך של 1,523bp, והוא מאופיין על ידי open reading frame המקודד ל-439 חומצות אמינו, ואזור '3 בלתי מקודד שאורכו 159bp, שאחריו מופיע "זנב" של poly(A). אנליזה של רצף חומצות האמינו גילתה רצף גרעיני של בערך 45 חומצות אמינו, החוזר על עצמו 10 פעמים לאורך השרשרת הפוליפפטידית. אותו מאפיין זוהה גם ב-cDNA של חולדה, כאשר השוואה בין של רצפי חומצות האמינו של החלבון HPX בין אדם וחולדה גילה הומולוגיה של 76% בין שני חלבוני HPX בשני המינים. כן ייאמר ששיירי ציסטאין משומרים היטב, ולכן הקשרים הדיסולפידיים בחלבון זה זהים באדם והחולדה.

התפקיד הפיזיולוגי של המופקסין ויצירת הקומפלקס heme-HPX

חוץ מאשר בכבד, HPX מיוצר גם ב-CNS, ברשתית העין, בממברנת המזנגיום הכלייתית (Kapojos וחב' ב-Kidney Int משנת 2003) ובעצבים היקפיים (Chen וחב' ב-Exp Eye Res משנת 1998, ו-Tolosano וחב' ב-Biochim Biophys Res Commun משנת 1996). לאחר שהוא קושר heme, עובר HPX שינוי קונפורמציה המאפשר קישורו לקולטן ספציפי, המבוטא בעיקר על פני ממברנת תאים הפטוציטים, ואז הוא מוחדר אל תוך תאים אלה. בציטוזול של ההפטוציטים, עובר ה-heme קטבוליזם, והקומפלקס של HPX והקולטן שלו מתחילים מחזור חדש של קישור heme (על פי Smith ו-Hunt ב-Eur J Cell Biol משנת 1990). הקולטנים ל-heme-HPX מצויים לא רק על תאי פרנכימה של הכבד, אלא גם על תאי אפיתל פיגמנטריים ברשתית וכן על לימפוציטים Hunt וחב ב-J Cell Physiol משנת 1996, ו-Smith וחב' ב-Exp Cell Res משנת 1997). הקולטן על פני התא אליו נקשר הקומפלקס heme-HPX זוהה כ-CD91/LRP1 (Hvidberg וחב' ב-Blood משנת 2005).

תכונתו הבולטת של המופקסין היא זיקת הקישור הגבוהה שלו ל-heme עם Kd<1pM, כאשר החלבון קושר heme ביחס אקווי-מולארי של 1:1.1. HPX מבוטא בעיקר בכבד והוא שייך למשפחת acute phase proteins שהסינתזה שלהם מוגברת באירועי דלקת, זיהומים, טראומה ועקה. עם זאת HPX נחשב מגיב פאזה חריפה חלש יחסית, שרק לעתים רחוקות רמתו עולה יותר מאשר פי-2 מרמתו במצבי רגיעה. לאחר היווצרות הקומפלקס heme-HPX, הוא מתפנה מהצירקולציה על ידי הכבד, בניגוד לקומפלקס המוגלובין-haptoglobin המתפנה למערכת הרטיקולו-אנדותליאלית. חלבונים אלה מתחלקים ל-2 קבוצות עיקריות בהתאם לצורת תגובתם לציטוקינים. חלבוני פאזה חריפה type I, זקוקים לשילוב של 2 הציטוקינים IL-1 ו-IL-6, ולעתים אף הם זקוקים לצורך הגדלת הסינתזה שלהם גם למעורבות של גלוקו-קורטיקואידים. לעומתם חלבוני פאזה חריפה type II, מגיבים רק ל-IL-6 בעצמו בשילוב עם דקסמתאזון. HPX שייך לקבוצת type I, כאשר בקבוצה נכללים גם הפטוגלובין, complement C3, כמו גם α-1-acid glycoprotein וכן C-reactive protein וכן -serum amyloid A1, A2 ו-A3 (על פי Poli ב-J Biol Chem משנת 1998).

הזיקה הגבוהה של HPX ל-heme, והנוכחות של קולטנים ספציפיים לקומפלקס heme-HPX על ממברנות של הפטוציטים וסוגי תאים אחרים, הופכים את HPX למועמד לטרנספורט של heme לאברונים תוך-תאיים בהם heme עובר קטבוליזם ובכך נמנע הנזק החמצוני ש-heme עלול לגרום לתאים, וכן לאיבוד לא רצוי של מולקולות ברזל. רוב המחקרים in vitro התבצעו בתאי הפאטומה, ומחקרים in vivo רבים בוצעו במודלים של חיות.

תכונה בולטת של אזור הקישור של heme ל-HPX, היא הריבוי של שיירי חומצות אמינו בסיסיות וארומטיות. שמונה שיירים הידרופוביים ששבעה מתוכם הן חומצות אמינו ארומטיות, מגדירים את הגומחה של קישור heme, המאופיינת גם על ידי פוטנציאל חיובי בולט כתוצאה מנוכחות 4 שיירי ארגינין, ו-4 שיירי היסטידין. המבנה והמיקום של גומחת הקישור של heme, תואמים בברור הן את הזיקה הגבוהה של heme ל-HPX, כמו גם את ההפיכות (reversibility) של קישור זה, בדומה למבנה של חלבונים אחרים הקושרים ליגנדים, דוגמת קישור ברזל לחלבון הנשא טרנספרין (Anderson וחב' ב-Nature משנת 1990). ראוי לציין שכאשר מולקולת heme נקשרת ל-HPX, חלבון זה נעשה יותר קומפקטי, והפפטיד המקשר הופך להיות פחות רגיש לביקוע פרוטאוליטי. הזיקה הגבוהה של heme לחלבון הקושר, נובעת מיציבות האינטראקציה בין הברזל לבין שייר היסטידין, וכן מהתְאימוּת הסטרית, הגומחה ההידרופובית האופפת את ה-heme, וכן כתוצאה מאינטראקציות הידרופוביות. השתחררות ה-heme מתאחיזתו על ידי HPX, נובעת מהרס גומחת הקישור של heme לחלבון, בעקבות התנודתיות של שני המקטעים הראשיים ושל הפפטיד המקשר ביניהם.

HPX חוץ מאשר בכבד, HPX מיוצר גם ב-CNS, ברשתית העין, בממברנת המזנגיום הכלייתית (Kapojos וחב' ב-Kidney Int משנת 2003) ובעצבים היקפיים (Chen וחב' ב-Exp Eye Res משנת 1998, ו-Tolosano וחב' ב-Biochim Biophys Res Commun משנת 1996). לאחר שהוא קושר heme, עובר HPX שינוי קונפורמציה המאפשר קישורו לקולטן ספציפי, המבוטא בעיקר על פני ממברנת תאים הפטוציטים, ואז הוא מוחדר אל תוך תאים אלה. בציטוזול של ההפטוציטים, עובר ה-heme קטבוליזם, והקומפלקס של HPX והקולטן שלו מתחילים מחזור חדש של קישור heme (על פי Smith ו-Hunt ב-Eur J Cell Biol משנת 1990). הקולטנים ל-heme-HPX מצויים לא רק על תאי פרנכימה של הכבד, אלא גם על תאי אפיתל פיגמנטריים ברשתית וכן על לימפוציטים Hunt וחב ב-J Cell Physiol משנת 1996, ו-Smith וחב' ב-Exp Cell Res משנת 1997). הקולטן על פני התא אליו נקשר הקומפלקס heme-HPX זוהה כ-CD91/LRP1 (Hvidberg וחב' ב-Blood משנת 2005).

גרעין heme מורכב מפרוטופורפירין IX ומברזל, מה שיוצר מבנה שטוח וקשיח שהוא הידרופובי באופיו, המשתרבב במהירות לתוך השכבה הליפידית של ממברנת תאים, כאשר הוא אינו קשור ל-HPX. ברזל במצבי חמצון דו-ערכי (ferrous) או תלת-ערכי (ferric), יכולים ליטול חלק בריאקציית Fenton ליצירת רדיקלים הידרוקסילים מאוד טוקסיים. היכולת של heme לחדור לתוך הממברנה הליפידית ולהשתתף בריאקציית Fenton, הופכת את ה-heme לקטליסט של נזק הנגרם על ידי H2O2, על ידי LPS מחומצן או על ידי ניטרופילים משופעלים (Balla וחב' ב-Arteriosclr Throb משנת 1991 ו-Lab Invest מאותה שנה). בתוך התא heme עובר קטבוליזם מהיר, על ידי האנזים heme oxidase (להלן HO), הפותח את טבעת הפורפירין ליצירה של biliverdin ו-CO, תוך שהוא משחרר את הברזל שיכול להיקשר על ידי פריטין.

HPX ופראוקסידציה של ליפידים

מספר מחקרים ביוכימיים הראו את התכונות נוגדות-החמצון של HPX. כאשר מולקולת ליפיד מותקפת על ידי תוצר ביניים של חמצן פעיל, עוברת מולקולת הליפיד תגובת שרשרת חמצונית הידועה כפראוקסידציה של הליפיד. גם מולקולת heme המוגדרת כ-ferrous protoporphyrin IX, בדומה למולקולת hemin המוגדרת כ-ferric protoporphyrin chloride, יכולים לעודד פראוקסידציה של ליפידים על ידי פרוק פראוקסידים של ליפידים. פראוקסידציה של ליפידים המושרית על ידי hemin אינה תלויה בשום מלחי ברזל מזדמנים, כיוון שהריאקציה אינה מעוכבת על ידי desferrioxamine שהוא chelator של ברזל או על ידי apotransferrin, אך הוא מעוכב בחוזקה על די apo-HPX בריכוזים פיזיולוגיים של 13μM. החלבון HPX אינו מתחמצן על ידי heme, כנראה כיוון שהקומפלקס bis-histidyl-heme-HPX אינו יכול להגיב עם H2O2, בה בשעה שאלבומין של אדם, או האנזים glutathione S-transferase מחולדה, הקושרים heme בזיקות מתונות, מפחיתים אמנם את הפראוקסידציה של ליפידים המושרית על ידי heme, אך הם עצמם חשופים לחמצון על ידי heme (על פי Vincent וחב' ב-Arch Biochem Biophys משנת 1988).

HPX והגנה על תאים מפני עקה חמצונית

כדי להגן על תאים מפני העקה החמצונית על ידי השריית הפעילות של HO-1, MT-1 ופריטין, HPX משפיע על הגברת הישרדות התא בתרחיש של עקת heme על ידי שהוא מסייע לתא להתאים עצמו לתנאי עקה אלה. Heme-HPX משפיע על דרגת החמצון של תאיHepa על ידי הגדלה פי-2 של תכולת הקרבוניל החלבוני תוך 15 דקות. השפעה זו היא קצרת-מועד, שכן תכולת הקרבוניל דועכת תוך 30 דקות. יתרה מכך, חשיפה של תאי Hepa ל-heme-HPX בריכוז של 2-10μM משפיעה במספר אופנים: היא משרה טרנסלוקציה בגרעין התא כמו גם קישור DNA על ידי גורם השעתוק NFκB פי 5-7, וכן משפעלת תוך 30 דקות את JNK/SAPK, שהוא חבר במשפחת MAPK שבמקור זוהתה כקינאזה המשופעלת על ידי עקה המעורבת במות תאים. לאחר מכן הסתבר של-JNK/SAPK יש תפקידים תאיים נוספים הקשורים לשגשוג תאים, התמיינותם והישרדותם.

שלושה גנים מקודדים עבור שלושה איזואנזימים של HO: איזואנזים HO-1 שזוהה כ-heat-shock protein 32, הצורה המושרית על ידי מגוון של גורמים כגון heme, מחמצנים שונים וציטוקינים. HO-2 הוא גורם פעיל במטבוליזם של heme, ואילו פעילות HO-3 עדיין אינה ברורה. פריטין הוא המאגר התוך-תאי העיקרי של ברזל לא-מטבולי. פריטין שהוא חלבון המורכב מ-24 תת-יחידות, עם יכולת קישור של 4,500 מולקולות ברזל למולקולת פריטין אחת. יחדיו, HO ופריטין, מסייעים לברזל להיקשר במהירות לפריטין ומונעים את נזקיו הטוקסיים (Juckett וחב' ב-J Biol Chem משנת 1998).

מחקרים על HPX in vitro

מחקרים על קישור ליגנדים הראו שמספר סוגי תאים מבטאים את הקולטן ל-heme-HPX, אך הבולטים בהם הם תאי כבד (Smith וחב' ב-Biochem J משנת 1991), אך גם תאי שלייה (Taketani וחב' ב-J Biol Chem משנת 1987), תאי אפיתל של פיגמנט הרשתית (Hunt וחב' ב-J Cell Physiol משנת 1996), וכן שורות תאים הכוללים הפטומה Hepa ו- HepG2 (על פי Smith ו-Ledford ב-Biochem J משנת 1988), תאים פרומיאלוציטים HL60, תאים לויקמיים HeLa ו-U937, ותאים אריתרולויקמיים K562 (על פי Okazaki וחב' ב-Cell Struct Funct משנת 1989, ו-Taketani וחב' ב-Biochem Int משנת 1986, וב-J Biol Chem משנת 1987). מספר הקולטנים על פני תא בודד, נע בין 3,500-7,000 בציטוטרופובלסטים בשליית אדם, עד ל-230,000 קולטנים על פני תאי אפיתל של פיגמנט הרשתית באדם.

ההגנה שמספק המופקסין כנגד פעילות heme חוץ-תאי

החדרת heme בתיווך HPX אל תוך תאי הפטומה (Hepa) מעכבר, משרה את פעילות האנזים HO-1 וכן את פעילות metallothionein-1 (להלן MT-1). למעשה, הדגרה של תאי Hepa עם heme-HPX גורמת להגדלה בפעילות של HO-1 ושל MT-1 התלויה בריכוז heme-HPX ובמשך ההדגרה, ברמת ה-mRNAs של HO-1 ושל MT-1. נמצא שההצטברות של mRNAs של HO-1 ושל MT-1 נבעה בעיקר מהגברת השעתוק של הגנים (Alam וחב' ב-J Biol Chem משנת 1989, ו-Alam ו-Smith ב-J Biol Chem משנת 1992). ההשפעה של הקומפקס heme-HPX חזקה יותר מזו של heme חופשי, מה שמצביע על כך שהשפעול של הקולטנים הממברנליים מסוגל לשדר איתותים החודרים ומפעילים גנים בגרעין התא. השפעות אלו אינן מוגבלות לתאי Hepa, וניתן למצאן גם בתאים הפרומיאלוצטים HL-60. נמצא שגם לנחושת יש תפקיד בהשריית HO-1 ו-MT-1 על ידי heme-HPX בתאי Hepa, ואמנם העלייה ברת החלוף בחמצון של חלבוני התא המתרחשת כאשר heme חודר לתאי Hepa בעזרת HPX, כמו גם השריית הסינתזה של HO-1 ו-MT-1, מעוכבים על ידי bathocuproinedisulfonate, שהוא chelator של נחושת (Vanacore וחב' ב-Antioxid Redox Signal משנת 2000).

מלבד תאי Hepa ותאי HL-60, ההשפעות של heme-HPX נבחנו בתאי אפיתל של הרשתית, כיוון שזו מכילה apo-HPX, המסונתז כנראה באופן מקומי על ידי תאי עצב. נראה שברשתית קיים מנגנון לפירוק הקומפלקס heme-HPX, כיוון שהמחסום דם-רשתית מונע את יציאת הקומפלקס מהרשתית. נמצא שתאי אפיתל של הרשתית, קושרים ומחדירים את הקומפלקס heme-HPX בתלות בטמפרטורה, באופן הדומה לקישור והחדרת הקומפלקס לתאי הפטומה. יתרה מזאת, HPX מעכב את ההשפעות הטוקסיות של heme בתאי אפיתל של הרשתית (Hunt וחב' ב-J Cell Physiol משנת 1996). ההשריה של HO-1 על ידי heme-HPX נחשבת כפעילות של הגנה על התא, שכן הקטבוליטים של heme (בילירובין ו-biliverdin הם בעלי פעילות נוגדת חמצון in vitro. גם פריטין הקולט את הברזל המשתחרר מה-heme, מגן על התא מפני ההשפעות הטוקסיות של ברזל. גם החלבון metallothionein-1 שהוא חלבון קטן ועשיר בשיירי ציסטאין, המסוגל לקשור מתכות דו-ערכיות כגון ברזל, אבץ וקדמיום, פועל בתוך התאים כנוגד-חמצון על ידי שהוא קולט ומנטרל מתכות פעילות ומעכב רדיקלים הידרוקסיליים ו-superoxide.

הסתבר שריכוזים גבוהים של heme-HPX עוצרים את שגשוג תאי Hepa , למרות שבריכוזים נמוכים של 0.05-1μM הקומפלקס heme-HPX מסייע לשגשוג של תאי Hepa, של תאי MOLT-3 וכן של לימפוציטים פולימורפונוקלאריים. עצירת שגשוג התאים נגרמת כנראה בגלל ביטוי מוגבר של מעכב מחזור התא p21WAF1 העוצר את שגשוג התאים בפאזה G2/M. פרט לשורות תאי הפטומה, ההשפעות של heme-HPX נבחנו גם בתאים ראשוניים ((primary של הפטוציטים, ונראה שאלה מגיבים ל-heme-HPX באופן שונה. נמצא שבתרביות ראשוניות של הפטוציטים מחולדות בוגרות, או מעוברי תרנגולת, הנוכחות של heme-HPX במדיום הגידול של התאים, משפיעה על הדיכוי המושרה על ידי heme של האנזים aminolevulinic acid synthase‏-5 (שהוא האנזים הקובע את קצה הסינתזה של ה-heme), כמו גם משפיעה על ההשרייה של HO. שתי השפעות אלו של ה-heme, נמנעות בשלמותן או בחלקן על ידי הנוכחות של apo-HPX (Sinclair וחב' ב-Hepatology משנת 1995). Taketani וחב' דווחו ב-1998 ב-Hepatology משנת 1998 שבהפטוציטים ראשוניים מחולדה, הריכוז של apo-HPX בעודף של heme, מעכב את קליטת heme וכן מעכב את ההשרייה של HO-1. הפטוציטים של חולדה בתרבית הכילו רק בערך 2,000 קןלטנים של HPX לתא, מספר קולטנים שאינו תואם את רמת ההחדרה של מולקולות heme לתוך ההפטוציט. הועלתה גם ההשערה שלאחר חדירתו לתוך התא, נקשרת מולקולת heme על ידי חלבונים קושרי-heme ציטוזוליים, כגון fatty acid binding protein, glutathione-S-transferase, MSP23 או mouse stress-inducible 23 Kd protein, או החלבון ההומולוגי בחולדות-HBP23 (Harvey ו-Beutler ב-Blood משנת 1982, ו-Ishii וחב' ב-J Biol Chem משנת 1993).

השפעות heme-HPX על שגשוג תאים

תאים לימפובלסטים (MOLT-3) מאדם, מכילים בערך 58,000 קולטנים של HPX בתא, מהם כ-20% נמצאים על פני התא. הגידול של תאים אלה, במדיום ללא-נסיוב, מושרה על ידי ריכוז של 0.1-1.0μM של heme-HPX, עם השפעה מרבית בריכוז של 0.5μM. יתרה מכך, heme-HPX אך לא apo-HPX ביטלו את עיכוב גידול התאים שנגרם על ידי chelator הברזל-desferrioxamine , מה שמעיד על כך שהברזל שמקורו בקטבוליזם של heme משמש לגידול התא. CoPP-HPX, הנקשר לקולטן אך אינו נקלט על ידי תאים, גם כן מגביר את שגשוג תאי MOLT-3, במדיום חסר נסיוב, אך היה פחות יעיל בהשוואה ל-heme-HPX. בנוסף, Co-PP-HPX לא הגן על התאים מפני השפעת desferrioxamine, והתחרה עם heme-HPX על הקישור לקולטנים, ובכך פחתה השפעתו לעידוד גידול התאים. בנוסף, הן heme-HPX וכן Co-pp-HPX הגדילו את שגשוג תאי MOLT-3 שהושרה על ידי ריכוז נסיוב נמוך, וגרמו לטרנסלוקציה של האנזים PKC לכיוון ממברנת התאים. לכן, ניתן להסיק ש-heme-HPX לא רק מתפקד כמקור של ברזל לתאי MOLT-3, אלא שהתפוסה של הקולטן של HPX עצמו, מעודדת גידול תאים על ידי איתותים דרך מסלולי PCK.

מחקרים על HPX in vivo

בגוף, מולקולת heme כרוכה בקשר הדוק עם חלבונים באיברי גוף ובנוזלי גוף.

ריכוזים נמוכים של heme בפלזמה נובעים מחמצון של המוגלובין, המשתחרר במצבים של המוליזה תוך-וסקולארית. באופן נורמאלי מייצר ריכוז נמוך של המוגלובין העובר דיסוסיאציה לשני הדימרים αβ, הנקשרים במהירות על ידי haptoglobin ועוברים מטבוליזם. ההמוגלובין בפלזמה שנותר בלתי קשור ל-haptoglobin, מתחמצן במהירות ל-ferrihemoglobin, המתפרק לגלובין ול-ferriheme. בפלזמה ה-heme יכול להיקשר על ידי אלבומין בזיקה של Kd השווה בערך ל-10nM, או להיקשר על ידי HPX בזיקה הנמוכה מ-1pM. אך בגלל הפער הגדול בריכוזי 2 החלבונים בפלזמה (אלבומין 3.5-5.5 גרם/ד"ל, לעומת HPX עם ריכוז של 50-120 מיליגרם/ד"ל), נקשר ה-heme קודם כל לאלבומין, ולאחר מכן מועבר ל-HPX, והקומפלקס נקשר לקולטנים על פני תאים. ריכוז heme בפלזמה גדל לאחר המוליזה, ומצב זה באדם כרוך בתרחישים פתולוגיים כמו נזק הנגרם מזילוח מחדש (reperfusion) ואיסכמיה. בתחילה, התפקוד של המופקסין in vivo נלמד במודל נזק של reperfusion בחולדה (Brass וחב' ב-Biochim Biophys Res Commne משנת 1998), ובמודל של עכברי knockout על ידי Tolosano וחב' ב-Blood משנת 1999.

ההשפעה נוגדת החמצון הפוטנציאלית של HPX נבחנה במודל של כבד חולדה. לאחר 3 שעות של שמירה בקור, כבד החולדה עבר זילוח מחדש על ידי בופר מחומצן חם, ויצירת רדיקלים מחמצנים נמדדה בשיטת chemiluminescence בעזרתה ניתן לגלות יצירת רדיקלים לבביים. הוספה של 5μM של HPX לתרחיף הפחיתה באופן משמעותי את יצירת הרדיקלים החופשיים, מה שמעיד על כך ש-HPX מגן על הכבד מפני ההשפעות הטוקסיות של ה-heme המשתחרר לאחר המוליזה המתרחשת בעירוי דם. ראוי לציין שעכברים טרנסגניים ללא HPX, שנחשפו להמוליזה חריפה על ידי הזרקה תוך-פריטונאלית של phenylhydrazine, התאוששו לאט יותר בהשוואה לעכברי-בר, כתוצאה מנזק כלייתי חמור יותר, כתוצאה מהמוגלובינוריה ממושכת יותר, פראוקסידציה של ליפידים. ושקיעת ברזל בתאי האבוביות של הכליה.

לסיכום, התפקיד העיקרי של HPX הוא להגן על התאים מפני עקה חמצונית, ופעילות זו מתבצעת על ידי השריה של ביטוי תוך-תאי של נוגדי-חמצון דוגמת HO-1, MT-1 ופריטין.

חסר של HPX יכול להחמיר נזק מוחי בעקבות שטף-דם תוך מוחי (Ma וחב' ב-J Neuroinflam משנת 2016). כמו כן, חסר ב-HPX כרוך במספר מחלות דלקתיות כמו הלם ספטי,experimental autoimmune encephalomyelitis אוEAE (Mehta ו-Reddy ב-Curr Opin Lipidology משנת 2015) ואנמיה המוליטית תוך-וסקולארית (Hoffbrand וחב' ב-Essential Hematol משנת 2006).

מחקרים בעכברים טרנסגניים

ה-promoter של HPX אנושי שימש לכוון את ביטוי הגן ל-HPX בעכברים טרנסגניים (Chiocchetti וחב' ב-Biochim Biophys Acta משנת 1997). ניתן להסתפק ב-500bp של ה-flanking region ‏5' מאדם להשרות יצירת HPX, כאשר ה-flanking region ‏5' הוא האזור ב-DNA, הסמוך לקצה ה-region flanking ‏5' של הגן, המכיל גם את ה-פרומוטר וכן enhancers של אזורי קישור נוספים של HPX. האזור של region flanking ‏5' אינו מתורגם ל-RNA. לכן, אותם רצפים המסוגלים לעודד שעתוק בתאי הפאטומה, נמצאו גם מתפקדים in vivo. הפעילות של ה-promoter של HPX במוח, נמצאת בהתאמה עם הנתונים האחרים על mRNA של HPX, ומיקום חלבון זה במערכת העצבים. מחקרים על עכברים טרנסגניים הצביעו על כך שבמוח, הביטוי הטרנסגני בנוירונים מתחזק לאחר השריית acute phase על ידי הזרקת turpentine, LPS או המוליזה.

HPX במחלות אוטואימוניות

רמות HPX גדלות ונותרות גבוהות בעכברים עםEAE שהוא המודל בעכברים לטרשת נפוצה. כאשר הישרו EAE בעכברי knockout החסרים HPX, התפתחות EAE הייתה מהירה יותר וחמורה יותר בהשוואה לעכברי בר המכילים HPX, וזאת בגין הסננה של תאי T מסוג CD4+, כמו גם הסננה של מספר רב יותר של תאי Th17. כאשר עכברים אלה טופלו על ידי HPX קודם להשריית EAE, חומרת המחלה פחתה משמעותית. נתונים אלה מעידים על כך של-HPX יש השפעה רגולטורית שלילית על תהליכי דלקת מושרים על ידי Th17, ומצביעים על אפשרות ש-HPX יכול לשמש לתרפיה במחלות אוטו-אימוניות (Rolla וחב' ב-J Immunol משנת 2013).

רמות HPX מנבאות מחלות המוליטיות והלם ספטי:

מחלות המוליטיות כמו אנמיה חרמשית (sickle cell) ו- B-thalassemia מאופיינות על ידי תהליכים מוגברים של המוליזה תוך-כלית, מה שמביא ליצירה של ROS או reactive oxygen species, הפוגע בתפקוד האנדותל ולנזק חמצוני (Vinchi וחב' ב-Circulation משנת 2013). בנוסף, רמות נמוכות של HPX בנסיוב קשורות לחומרתו של ספסיס, ועלולות להצביע על פרוגנוזה גרועה בחולים עם הלם ספטי (Jung וחב' ב-J Crit Care משנת 2015), ולנבא את התמותה בפרק זמן של 28 יום מתחילת התרחיש הספטי. ממצא זה אושר גם על ידי Larsen וחב' ב-Sci Transl Med משנת 2010.

החדרה של HPX מספקת הגנה מפני נזק מוחי כתוצאה מאיסכמיה

Heme חופשי משתחרר מ- Methemoglobin בעקבות ischemia-reperfusion מוחי, מה שמייצג מרכיב טוקסי בדם ההיקפי. HPX הוצע כחלבון המגן על מערכת העצבים בשל הזיקה הגבוהה שלו ל-heme, ואכן Li וחב' דיווחו בשנת 2009 ב- J Cereb Blood Flow Metab שעכברים משוללי HPX סובלים מאוטמים מוחיים גדולים יותר ומשיבושים התנהגותיים בהשוואה לעכברים נורמאליים במודל של חסימה זמנית של עורק המוח המרכזי, מה שמצביע על תפקידו של HPX בהגנה כנגד נזק הקשור לשבץ מוחי. Dong וחב' בחנו את הביטוי של HPX במוח של חולדות בצביעה אימונו-פלואורסצנטית. חוקרים אלה הראו מופיעים בעיקר בנוירונים ובכמות קטנה יותר של אסטרוציטים, לאחר חסימת העורק המוחי המרכזי שלאחריו בוצע זילוח מחדש במוח החולדה. חוקרים אלה הראו שהחדרת HPX אקסוגני, הקטינה את נפח הרקמה בה מופיע האוטם, ושיפרה את התוצאות של הנזק שנגרם עקב ה-cerebral ischemia-reperfusion.

הוראות לביצוע הבדיקה

דגימת הדם במבחנה כימית (פקק צהוב או אדום), ולאחר הפרדת הדם בסרכוז הבדיקה מתבצעת בנסיוב טרי, או בדגימה שנשמרה בקירור לא יותר מ-72 שעות. בהקפאה בטמפרטורה של -20̊ הדגימה יציבה למשך 6 חודשים, ובהקפאה בטמפרטורה של -70̊ הדגימה יציבה לזמן בלתי מוגבל. מועדפות דגימות לא ליפמיות או המוליטיות. לצורך מדידת המופקסין בשתן, יש לבצע איסוף של 24 שעות. יש לסרכז את השתן, ולהביא את ה-pH שלו ל-7.0. רצוי לבצע את המדידה בשתן טרי, אך בהקפאה בטמפרטורה של -20̊ דגימת השתן יציבה עד שנה אחת.

ראו גם

• חזרה לדף מדריך בדיקות מעבדה
• בדיקות מעבדה - אנמיה והימוליזה
• בדיקות מעבדה - ברורים המטולוגיים
• בדיקות מעבדה - משק הברזל
• בדיקות מעבדה - סמני דלקת

המידע שבדף זה נכתב על ידי פרופ' בן-עמי סלע, המכון לכימיה פתולוגית, מרכז רפואי שיבא, תל-שומר;
החוג לגנטיקה מולקולארית וביוכימיה, פקולטה לרפואה, אוניברסיטת תל-אביב (יוצר הערך)