אדנילאט קינאז - Adenylate kinase

הדפס

מדריך בדיקות מעבדה
אדנילאט קינאז
Adenylate kinase
שמות אחרים	ADK, myokinase
מעבדה	המטולוגיה, כימיה בדם
תחום	ברור אנמיה המוליטית לא-ספרוציטית.
טווח ערכים תקין	מעל גיל 12 חודשים - 195–276 U/g Hb. ביילודים רמת הפעילות של AK יכולה להיות באופן נורמלי נמוכה באופן קל או מתון מהרמה במבוגרים.
יוצר הערך	פרופ' בן-עמי סלע

מטרת הבדיקה

הערכת פעילות האנזים adenylate kinase כחלק מהערכת תרחיש של אנמיה המוליטית לא-ספרוציטית כרונית.

מידע קליני

Adenylate kinase (להלן AK) הוא אנזים מונומרי המקטלז את ההמרה של nucleotide phosphoryl של adenosine triphosphate (להלן ATP) ו-adenosine monophosphate (להלן AMP) ל-2 מולקולות של adenosine diphosphate (להלן ADP), או ההמרה של 2 מולקולות ADP ל-ATP ול-AMP. באופן נורמלי, הרמה של אנזים זה ביילודים נמוכה מזו שבמבוגרים באופן קל עד מתון. חסר של AK היא סיבה נדירה של אנמיה המוליטית לא-ספרוציטית אוטוזומלית-רצסיבית (Toren וחב' ב- Brit J Haematol משנת 1994, Corrons וחב' ב-Blood משנת 2003, ו-Koralkova וחב' ב-Int J Lab Hematol משנת 2014). למרות נדירותה, אנמיה הנגרמת מחסר AK, תוארה במשפחות רבות ממוצא אתני שונה. הטרוזיגוטיות לגבי מפגע גנטי זה היא א-תסמינית עם פנוטיפ תקין. אלה שהם הומוזיגוטים או שהם compound heterozygous מפגינים אנמיה המוליטית לא-ספרוציטית כרונית עם רמות המוגלובין של 8–9 גרם/דציליטר, עם היפר-בילירובינמיה ואבני מרה. התסמינים מתגלים כבר בשנות הילדות המוקדמות, כאשר חלק מהלוקים בחסר AK סובלים מפגיעה פסיכו-מוטורית, אם כי הפתוגנזה של מפגעים אלה אינה מובנת. באלה עם חסר של AK הסובלים גם מחסר האנזים glucose 6-phosphate dehydrogenase (או G6PD). האנמיה חמורה יותר ורמת ההמוגלובין עלולה לרדת ל-6 גרם/דציליטר. הפעילות של AK במצבי חסר נעה בין 0-44% מהפעילות הנורמלית של האנזים, אך לרוב היא נמוכה מ-33% מהפעילות התקינה. בנשאים, פעילות AK יכולה להיות נורמלית או נמוכה רק באופן קל, ובאלה שהם הומוזיגוטים לחסר, פעילות האנזים נמוכה משמעותית. כריתת הטחול מסייעת למניעת אנמיה המוליטית הנגרמת על ידי החסר ב-AK (Nizuma וחב' ב-Pediatr Int משנת 2017).

האנזים AK זוהה גם במספר מיני חיידקים ושמרים (Cooper ו-Friedberg ב-Gene משנת 1992). מספר שיירים ב-AK משומרים באיזופורמים השונים, מה שמדגיש את חשיבותם לקטליזה. אחד השיירים המשומרים ביותר הוא ארגינין, שהמודיפיקציה שלו גורמת לאינאקטיבציה של האנזים. כמו כן חשוב שייר של חומצה אספרטית הממוקם בשקע (cleft) הקטליטי של האנזים. שייר משומר מאוד נוסף הוא Arg119, הממוקם באזור הקישור של האנזים לאדנוזין. רֶשֶׁת שיירים משומרים בעלי מטען חשמלי חיובי (Lys13, Arg123, Arg156 ו-Arg167) זוהו ב-AK של E. coli, והמטען השלילי של קבוצת הפוספוריל חיוני לטרנספר של קבוצה זו. האנזים AK נפוץ בגוף והוא כרוך המטבוליזם של תהליכי אנרגיה והומאוסטאזיס של יחסי adenine nucleotide באברוני תא שונים. AK מופיע בגרעין התא, בציטוזול או במיטוכונדריה של רקמות מגוונות. בערך 30-40% של פעילות AK מתקיימת במיטוכונדריה של שריר הלב. אנזים זה משחק גם תפקיד חשוב בהתאוששות ממצב של איסכמיה, וכן באפופטוזיס. מוטציה בגן של AK כרוכה ב-combined immunodeficiency חמור המכונה reticular dysgenesis.

מנגנון הפעולה

הטרנספר של פוטספוריל מתרחש רק כאשר יש הרחקה של מולקולות מים, מה שמפחית את המחסום האנרגטי הנדרש לצורך התקפה נוקלאופילית על ידי ה-α-phosphoryl של AMP על קבוצת ה-γ-phosphoryl של ATP, מה שמביא ליצירת ADP על ידי טרנספר של קבוצת ה-γ-phosphoryl ל-AMP. שני שיירים מרוחקים של חומצה אספרטית נקשרים לרשת של ארגינין, גורמים לאנזים להתקפל ומפחיתים את גמישותו. קו-פקטור של מגנזיום גם כן נדרש, כיוון שהוא חיוני להגברת האלקטרופיליות של הפוספאט על פני AMP (Müller ו-Schulz ב-J Mol Biol משנת 1992). מחקר אחר בחן את הקונפורמציות של AK בהיקשרו ל-ATP ול-AMP (Whitford וחב' ב-J Mol Biol משנת 2007). מחקר זה הראה שיש 3 קונפורמציות רלוונטיות של "ליבת AK", "ליבתית", "פתוחה" ו"סגורה". באנזים AK ישנם 2 מקטעים קטנים הקרויים LID ו-NMP (Daily וחב' ב-J Mol Biol משנת 2010). ATP נקשר בכיס הנוצר על ידי מקטעי LID ו-Core, ואילו AMP נקשר בכיס הנוצר על ידי מקטעי NMP ו-CORE.

היציבות הטרמודינמית המקומית של המקטעים הנקשרים למצע ATPlid ו-AMPlid נמצאה נמוכה משמעותית בהשוואה למקטע CORE ב-AK של E. coli (Rundqvist וחב' ב-Biochemistry משנת 2009). קישור למצעים גורם להעדפה של קונפורמציית האנזים "הסגורה", שתפקידה לסייע בהרחקת מים מהאתר הפעיל כדי למנוע הידרוליזה של ATP ובנוסף לסייע באופטימיזציה של הגישור בין האנזים למצע, לצורך הטרנספר של פוספוריל (Olsson ו-Wolf-Watz ב-Nat Commun משנת 2010).

תפקוד האנזים-ניטור מטבולי

היכולת של התא להעריך באופן דינמי רמות אנרגיה, מאפשרת לו לנטר תהליכים מטבוליים (Dzeja ו-Terzic ב-Int J Mol Sci משנת 2009). ניטור זה ושינוי רמות ADP, ATP ו-AMP, הופכים את AK לווסת חשוב של בזבוז אנרגיה ברמת התא (Dzeja וחב' ב-PLos One משת 2011). כאשר רמות האנרגיה משתנות בהשפעת עקות מטבוליות שונות, AK מסוגל אז לייצר AMP שמסוגל לדוגמה לעודד קולטנים שונים התלויים ב-AMP כגון אלה הכרוכים במסלולים גליקוליטיים, בתעלות K-ATP, וב-AMP activated protein kinase‏'5 (או AMPK). גורמים שכיחים המשפיעים על רמות אדנין נוקלאוטיד וממילא על פעילות AK, הם פעילות גופנית, עקה, שינויים ברמות הורמונים ודיאטה. האנזים AK נמצא במיטוכונדריה ובחלקי התא המיו-פיברילריים, והוא גורם ל-2 פוספורילים עתירי-אנרגיה (β ו-γ) של ה-ATP להיות זמינים לטרנספר בין המולקולות של אדנין נוקלאוטיד. למעשה, AK מוביל ATP לאזורים הצורכים אנרגיה גבוהה, ומסלק את ה-AMP הנוצר במהלך ריאקציות אלה. מעברי פוספאט אלה חיוניים מאוד על כלל ההומאוסטאזיס של התא.

חסר של האנזים nucleoside diphosphate kinase

האנזים NDP מקטלז in vivo את הסינתזה התלויה ב-ATP של ribo- ושל deoxyribonucleoside תלת פוספאטים. בחיידק E. coli מוטנט, עם חסר של nucleoside diphosphate kinase, האנזים AK מבצע את שתי הפונקציות, ומתקן את המצב של חסר nucleoside diphosphate kinase (על פי Lu ו-Inouye ב-Proc Natl Acad Sci USA משנת 1996). חסר של AK באריתרוציטים כרוך באנמיה המוליטית (Matsuura וחב' ב-J Biol Chem משנת 1989). זהו פגם אנזימטי נדיר באריתרוציטים שכרוך במספר מקרים בפיגור ובפגיעה פסיכו-מוטורית (Abrusci וחב' ב-Exp Hematol משנת 2007).

חסר באיזופורם AK2

חסר של AK2 באדם, גורם לפגמים המאטו-פויאטיים הכרוכים בחירשות סנסו-ריניוראלית (Agresle-Peyrou וחב' ב-Nat Genet משנת 2009). האיזו-אנזים AK2 מבוטא במיוחד ב-stria vascularis של האוזן הפנימית מה שמסביר מדוע אנשים עם חסר של AK2 סובלים מחירשות סנסו-ריניוראלית.

המיקום התוך-תאי של האיזופורמים השונים

המיקום התוך-תאי של האיזו-פורמים השונים של AK, והפיזור שלהם באיברים השונים יכול להסביר את הקשר בין הדיס-רגולציה שלהם לבין תחלואות רבות. ה-AK1 הציטוזולי, וה-AK2 המיטוכונדריאלי, הם 2 האיזופורמים העיקריים הכרוכים עם מודולטורים של דלקת. האיזופורם AK5 קשור לאנצפליטיס לימבית (כאשר המערכת הלימבית או מערכת הקצה, שהיא חלק ממערכת העצבים, כולל מבנים במוח האנושי המעורבים ברגשות, מוטיבציה, זיכרון, למידה, הרחה והקשרים ביניהם. מוטציה של Leu673Pro ב-AK7 גורמת בעיקר לאי-פוריות זכרית. פגיעה באיזופורמים המיטוכונדריאליים AK2 ו-AK4, מודגמת בנוירובלסטומה ובגליומה. אף על פי ש-ATP הוא המצע של רוב ה-AKs (Rogne וחב' ב-Proc Natl Acad Sci USA משנת 2018), AK3 משתמש ב-GTP כמצע. התכונות המבניות והביוכימיות של האיזופורמים של AK נחקרות זמן רב (Kuby וחב' ב-J Protein Chem משנת 1989), ומוטנטים רבים שהתגלו האירו את השינויים המבניים במהלך קטליזה (Rundqvist וחב' ב-Biochemistry משנת 2009, ו-Wang ו-Makowski ב-Proteins משנת 2018). המעורבות של AKs ברגולציה של ATP, קשורה עם תהליכים תוך-תאיים נוספים כגון עקה, circadian rhythm, ותהליכי התמרה סרטנית (Noma ב-J Med Invest משנת 2005, Dzeja ו-Terzic ב-Int J Mol Sci משנת 2009, ו-Fujisawa וחב' ב-J Exp Clin Cancer Res משנת 2016). יתרה מכך, הקישור למצע גורם בראשונה לשינוי מינורי באתר הקישור ל-AMP, ואחריו לשינוי גדול במקטע LID (Müller וחב' ב-Structure משנת 1996). המשמעות של אדנילאט קינאזות בפתולוגיה של האדם, כרוכה ברגולציה של רמות תוך-תאיות של AMP החיוני לתהליכים תאיים רבים (WuJak וחב' ב-Postepy Hig Med Dosw משנת 2015, ו-Dzeja וחב' ב-Mol Cell Biochem משנת 1998).

אדנילאט קינאזות ציטוזוליות

האיזופורם AK1 מכיל 194 חומצות אמינו והוא אחד האיזופורמים ההומניים הנחקרים ביותר. הגן המקודד ל-AK1 ממוקם על כרומוזום 9 בעמדה 9q34.11, ואיזופורם זה מבוטא מאוד ברקמת שריר, במוח ובאריתרוציטים. AK1 אנושי דומה לאיזופורם אנזימטי זה באורגניזמים רבים, ויש לו זהות של 88% עם האנזים של עכבר הבית, וזהות של 66% עם אנזים זה בתולעת Cenorhabditis elegans. הגן המקודד ל-AK1 אורכו 12kb והוא מורכב מ-7 exons. האיזואנזים AK5 מכיל 537 חומצות אמינו ואף הוא דומה מאוד לאנזים באורגניזמים שונים, עם זהות של למעלה מ-90% עם האנזים ביצורים אאוקריוטים, וזהות מעניינת של 58% עם AK1 של אדם, ו-49% זהות עם האנזים של Cenorhabditis elegans. הגן המקודד ל-AK5 ממוקם בכרומוזום 1 בעמדה 1p31.1.

האיזופורם AK7 מכיל 723 חומצות אמינו, ואילו AK8 מכיל 479 חומצות אמינו, ואף הם משומרים באאוקריוטים. הגן המקודד ל-AK7 ממוקם בכרומוזום 14 בעמדה 14q32.2. האיזופורם האנושי AK7 הוא בעל תכונות מבניות ותפקודיות בקרב משפחת אנזימי AK (על פי Panayiotou וחב' ב-Biochem J משנת 2011). הוא מבוטא במיוחד בסמפונות הריאות ובאשכים (Lonergran וחב' ב-Am J Respir Cell Mol Biol משנת 2006). האיזופורם AK7 מכיל שלושה מקטעים משומרים: ליד הקצה ה-N טרמינלי של האנזים בין חומצות אמינו 147 ו-310, ישנו מקטע WeaG השייך למשפחת העל nucleoside-diphophate-sugar epimerase, ובין חומצות אמינו 367 ו-548 מופיע מקטע ה-AK, ואילו בין חומצות אמינו 678 ו-720 ליד הקצה ה-C טרמינלי ממוקם ה-motif הידוע כ-Dpy-30, שייתכן והוא motif דימריזציה. איזופורם 8 הוא בעל מספר שיירי חומצות אמינו משומרים כאשר משווים אותו ל-AK בחיידקים אירוביים או אנארוביים: 31% של זהות רצף עם Streptococcus pneumoniae, 28% של זהות רצף עם Shewanella oneidensis, ו-29% זהות רצף עם Clostridium difficile. הגן המקודד ל-AK8 ממוקם בכרומוזום 9 בעמדה 9q34.13. המיקום התוך-תאי של AK9 אינו ברור לגמרי, אם כי מחקרים אחרונים מרמזים על דיפוזיה חופשית של AK9 בין הציטוזול והגרעין (Panayiotou וחב' ב-Int J Biochem Cell Biol משנת 2014).

אדנילאט קינאזות מיטוכונדריאליות

הגן המקודד ל-AK2 ממוקם בכרומוזום 1 בעמדה p35.1 והוא מבוטא באופן ניכר בחלל התוך-ממברנאלי של המיטוכונדריון בלב, בכבד, בכליות ובטחול (Notomi וחב' ב-PLoS One משנת 2013). האיזופורם AK2 מכיל 239 חומצות אמינו. אף על פי ש-AK2 משומר מאוד בין האאוקריוטים, הוא בעל זהות מרשימה עם איזופורמים אחרים: 45% זהות עם AK3 באדם, 39% זהות עם הזבוב דרוזופילה, 40% זהות עם AK4 באדם, 41% זהות עם AK4 של עכבר הבית, 55% זהות עם AK1 של הפרח תודרנית לבנה (Arabidopsis thaliana) 35% זהות עם AK של E.coli ו-50% זהות עם AK של החיידק Pseudomonas aeroginosa. האיזופורם AK3 שהוא GTP:AMP phosphotransferase עם 227 חומצות אמינו, ממוקם ב-matrix של המיטוכונדריה. הגן המקודד ל-AK3 ממוקם בכרומוזום 9 בעמדה 9p24.1 והוא נפוץ בכל הרקמות. הגן המקודד לאיזופורם AK4 ממוקם בכרומוזום 1 בעמדה 1p31.3. ה-AK4 הוא בעל 96% זהות עם AK3 הוא בעל 223 חומצות אמינו ואף הוא ממוקם ב-matrix המיטוכונדריאלי. פרט לדמיון שיש ל-AK4 עם AK3 ו-AK2, יש לו גם 40-42% זהות עם AK1 של תודרנית לבנה, ועם AK2 של Saccharomyces cerevisiae, של פסאודומונס, של E.coli, של Plasmodium falciparum ושל התולעת Caenorabditis elegans.

אדנילאט קינאזות הנמצאות בגרעין התא

הגן המקודד ל-AK6 ממוקם בכרומוזום 5 בעמדה 5q13.2, ויש לו 536 חומצות אמינו וזהות כמעט מלאה של 99% עם AK5. איזופורם זה נמצא בבלוטת האדרנל, ובשל מיקומו בגרעין התא, הוא יכול להיות מווסת באופן סימולטני על ידי היחסים ATP/ADP ו-GTP/GDP (Ren וחב' ב-Proc Natl Acad Sci USA משנת 2005). יש לשער ש-AK6 הוא בעל פעילות קטליטית נרחבת המווסת את ההתכנסות או אי-ההתכנסות של גופיפי Cajal בגרעין התא, שהם מבנים ספריים, בקוטר של 0.3-1.0 מיקרון, המופיעים בגרעיני תאים מתרבים כגון תאים אמבריונליים או תאי סרטן, או בנוירונים פעילים מטבולית (Drakou וחב' ב-Proteins משנת 2012). האיזופורם AK9 הוא nucleoside mono & diphosphate kinase אך גם בעל פעילות פוספטאזה נרחבת. המשפיעים על הפעילות הקטליטית שלו (Amiri וחב' ב-Int J Biochem Cell Biol משנת 2013). הגן המקודד ל-AK9 ממוקם בכרומוזום 6 בעמדה 6q21. באדם ישנם שני איזופורמים של AK9: איזופורם 1 המכיל 1911 חומצות אמינו, ואיזופורם 2 עם 421 חומצות אמינו שהוא בעל 29% זהות עם AK1 של Plasmodium falciparum, ו-26% זהות עם AK של פסאודומונס.

מצעים ותוצרי ריאקציה

הריאקציה המקוטלזת על ידי AK היא ATP + AMP ⇔ 2 ADP :. ה-ΔG^o של הריאקציה קרוב ל-0. בשריר של מגוון בעלי חוליות וחסרי חוליות, הריכוז של ATP הוא באופן רגיל גבוה פי-7–10 מריכוז ADP, וגדול פי-100 מריכוז AMP (Beis ו-Newsholme ב-Biochem J משנת 1985). קצב ה-oxidative phosphorylation מווסת על ידי הזמינות של ADP. לפיכך, המיטוכונדריון מנסה לשמור על רמות גבוהות של ATP על ידי פעולה משותפת של AK והבקרה על ה- oxidative phosphorylation.

איזואנזימים

ידוע על 9 איזופורמים של האנזים AK. בעוד שכמה מאיזואנזימים אלה נפוצים בגוף כולו, כשחלק מהם ממוקמים ברקמות ספציפיות. לדוגמה, AK7 ו- AK8נמצאים רק בציטוזול של התאים, כאשר AK7 נמצא ברקמת השריר, בעוד ש-AK8 אינו נמצא ברמת השריר (Panayiou וחב' ב-Int J Biochem Cell Biol משנת2014). אך לא רק המיקום של האיזופורמים השונים בתא שונה, גם הקישור שלהם למצע, והקינטיקה של טרנספר הפוספוריל שונים. AK1, האיזואנזים הציטוזולי הנפוץ ביותר הוא בעל Km הגבוה פי-1,000 בהשוואה ל-Km של AK7 ו-AK8, מה שמצביע על קישור חלש בהרבה של AK1 ל-AMP (Panayiou וחב' ב-Biochem J משנת 2011). לכל איזופורם יש גם זיקה שונה ל-ATP, GTP, UTP ו-CTP כנשאים של הפוספוריל. המיקום התוך-תאי של AK9 אינו ברור, אם כי מחקרים אחרונים מרמזים לכך שהוא עובר דיפוזיה חופשית בין הציטוזול לגרעין התא.

אדנילאט קינאזות וסרטן

נעשה מאמץ רב לזיהוי סמנים ביולוגיים לאבחון של סרטן בשלבי מחלה מוקדמים, כאשר AK וקינאזות נוספות נחקרים אף הן למטרה זו. ידוע היטב שגדילת תאים סרטניים מסתייעת על ידי גליקוליזה, או מה שקרוי "אפקט Warburg", אך אין ראיות חותכות לכך שתאים סרטניים מפיקים את האנרגיה שלהם מתהליך ה- Warburg) oxidative phosphorylation ב-Science משנת 1956, ו-de Padua וחב' ב-Oncotarget משנת 2017). במהלך התהליך הסרטני פעילות AK גבוהה פי-3 בתאי קרצינומה עובריים נוליפוטנטיים, מאשר לתאי גזע אמבריונליים אנושיים פלורי-פוטנטיים נורמליים (Ounpuu וחב' ב-Biochim Biophys Acta משנת 2017). יתרה מכך, ישנן ראיות ליצירה שלATP על ידי oxidative phosphorylation במיטוכונדריה בתאי נוירובלסטומה, כאשר 2 אנזימים משתתפים בתהליך זה-AK2 ו- hexokinase-2 (Klepinin וחב' ב-J Bioenerg Biomembr משנת 2014). מחקר אינטנסיבי על ידי מיפוי של למעלה מ-1,000 חלבונים מיטוכונדריאליים, זיהה קשר בין AK2 לבין הישרדות של חולי גליומה (Lanning וחב' ב-Cell Report משנת 2014). הסבר יכול להינתן תוך התחשבות ב-AK4, שאף על פי שיש לאיזופורם האחרון דמיון מבני לאיזופורמים אחרים, יש לו פעילות קטליטית רק in vivo בתגובה למצבי עקה שונים, ובכך הוא מגן על התאים מפני מוות מושרה על ידי H2O2 (Liu וחב' ב-Int J Biochem Cell Biol משנת 2009).

סימן ההיכר הבולט של תאים סרטניים נעוץ ביכולתם לכרוך את הביו-אנרגטיקה שלהם עם איתותים מטבוליים על מנת לתדלק את שגשוגם המהיר ויכולתם לשלוח גרורות. האנזים AK משחק תפקיד קריטי בניטור המטבולי של ההומאוסטאזיס של אדנין נוקלאוטיד תאי. AK גם מכוון את הטרנספר של ATP מהמיטוכונדריה לצרכים האנרגטיים השונים של התא הסרטני. המשמעות של מארג האיזופורמים של AK הולכת ומתבררת בתהליכי התמיינות תאית ותנועתיות. האיזופורם AK2 חיוני במיוחד לשחלוף המיטוכונדריאלי של הנוקלאוטיד וליצוא ATP מהמיטוכונדריה. חסר של AK2 הורס את האנרגטיקה התאית, וגורם לתחלואה קשה באדם כמו גם לתמותת עוברים בעכברים. הדיכוי של פוספו-טרנספר על ידי AK, ויצירת AMP בתאים סרטניים ובדיעבד איתותים דרך AMPK עלולים להגביר את התהליך הסרטני.

שגיאה ביצירת תמונה ממוזערת: קובץ חסר

תרשים המדגים את המעורבות של האיזופורמים שונים של AK בקישור של איתותים מטבוליים ומעגלים אנרגטיים בתא.
תחרות מוגברת על ה-ADP הציטוזולי גורמת ל-downregulation של איתותי AMP המתווכים על ידי AK, מה שמפחית את הבקרה על מחזור חלוקת התאים ושגשוגם. הביטוי של AK נחלש במספר סוגי סרטן, ולעומת זאת AMP יכול להיצרך על ידי AMPD, ועל ידיNT‏-'5 ודווקא להיות מבוטא ביתר במספר תאם סרטניים. הגברת מטבוליזם גליקוליטי מביאה ללכידה של ADP ציטוזולי תוך ניצול זיקה גבוהה יותר ושימוש ב-ATP מטוכונדריאלי, מה שמגביר הפיכת גלוקוזה ללקטאט. התוצאה של טרנספורמציות מטבוליות אלו היא חסר באיתות של AMP וירידה בבקרה בסיוע AMPK על תהליכים תאיים קטבוליים ואנאבוליים.
צבע אדום מצביע על מסלולים מוגברים וביטוי גני בתאי סרטן. AMPD-AMP-deaminase; HK2-hexokinase 2; LDHA-lactate dehydrogenase A; AMPK - AMP-activated protein kinase; ANT2 - .adenine nucleotide translocase

המשמעות הקלינית של אדנילאט קינאזות, והקשר של אנזימים אלה לחסינות ולדלקת

מחקר עדכני מראה ש-AK1 מהנוזל הזגוגי של העין (vitreous fluid) אחראי של שמירה של הסטאטוס הדלקתי בעיניים של חולי סוכרת (Loukovaara וחב' ב-J Mol Med משנת 2017). כמו כן, היחס בין ADP, ATP ו-AMP קריטי במחלות של העין כגון AMD, גלאוקומה וניוון של הרשתית (Takeda וחב' ב-PLoS ONE משנת 2013, Zhong וחב' ב-Biochim Biophys Acta משנת 2013, ו-Sanderson וחב' ב-Exp Cell Res משנת 2014). איזופורם AK2 חיוני לנשימה במיטוכונדריה, בגלל מיקומו בחלל התוך-ממברנלי של המיטוכונדריה, והוא חיוני בעיקר בבקרת במטבוליזם של האנרגיה בתאים עם דרישות אנרגטיות גבוהות כגון תאי-גזע המאטו-פויאטיים או במהלך ההתמיינות של אדיפוציטים (Ito ו-Suda ב-Nat Rev Mol Cell Biol משנת 2014, ו-Burkart וחב' ב-J Biol Chem משנת 2011). לפיכך, פגיעה ב-AK2 משקפת הופעה מוקדמת של מצבים קליניים המאופיינים על ידי כשל משולב חיסוני חמור (SCID). היעדר ביטוי של AK2 גורם לתסמונת נויטרופניה מולדת, או לדיסגנזה רטיקולרית המאופיין על ידי נויטרופניה חמורה, לימפופניה וחירשות סנסורינורלית דו-צידית (Pannicke וחב' ב-Nat Genet משנת 2009, ו-Six וחב' ב-Cell Death Dis משנת 2015). כיוון שהמיטוכונדריה מתפקדים גם בבקרה של תהליכי דלקת (Chandel ב-BMC Biol משנת 2014), ניתן להתייחס ל-AK הנמצאים במיטוכונדריה כמאפננים (modulators) של דלקת (Meyer וחב' ב-Front Immunol משנת 2018). מפגע של limbic encephalitis הוא דוגמה למחלה אוטו-אימונית של מערכת העצבים, המתבטאת בדלקת של המערכת הלימבית. מחקרים עדכניים מראים נוכחות נוגדנים עצמיים כנגד AK5 ב-CSF ובנסיוב של לוקים ב-limbic encephalitis (Tuzun וחב' ב-J Neuroimmunol משנת 2007, ו-Do וחב' ב-Neurology משנת 2017). המעורבות של AKs הממוקמים בגרעין במחלות באדם, לא נחקרה באותה מידה כמו מעורבותם של AKs ציטוזולים או מיטוכונדריאלים במחלות אלה.

אדנילאט קינאזות, תסמונת מטבולית ומחלות נוירו-דגנרטיביות

ברקמות עם דרישה אנרגטית גבוהה, פעילות AK משפיעה על אספקת האנרגיה. בשריר השלד הפעילות של האיזופורמים של AK עולה או יורדת בתגובה לרמת הפעילות של השריר, למצבי היפוקסיה או למחלות שריר. לדוגמה, פעילות ה-AK2 המיטוכונדריאלי עולה כאשר השריר נמצא במאמץ אינטנסיבי (Seccia וחב' ב-Clin Exp Hypertens משנת 1998, ו-Wang וחב' ב--Exp Physiol משנת 2012). לעומת זאת הביטוי של AK1 פוחת ב-Duchenne muscular dystrophy (Ge וחב' ב-Proteomics משנת 2012). פעילות שריר השלד קשורה באופן אינטרינזי לשימוש ב-ATP ולהומאוסטאזיס האנרגטי, לכן ל-AK יש תפקיד חשוב בתסמונת המטבולית (Myers וחב' ב-Science משנת 2017). זאת ועוד, המפגעים המטבוליים בסוכרת type 2 עלולים להיות המקור לפתו-פיזיולוגיה של מחלות נוירו-דגנרטיביות כמו פרקינסון ואלצהיימר. פעילות מופחתת של AMPK (או AMP activated kinase‏-'5) המלווה בהצטברות של חלבונים misfolded, ביחד עם ביוגנזה מיטוכונדריאלית מופחתת, יכולים להסביר את המנגנונים המולקולריים של מחלות אלו (Kodiha וחב' ב-Trends Mol Med משנת 2011, ו-Kang וחב' ב-Yonsei Med J משנת 2017). הודגם שביטוי מופחת של AK2 ,AK3 ו-AK4 ב-substantia nigra וביטוי-יתר של AK1 באזור 8 של קליפת המוח הקדמית, מוסברים על ידי פיצוי לשינוי במטבוליזם של פורינים (Garcia-Esparcia וחב' ב-Neuropathol Appl Neurobiol משנת 2015).

אדנילאט קינאזות כמדד אבחוני

הנוכחות של נוגדנים עצמיים כנגד AKs, אינה כרוכה תמיד עם תפקיד פתוגני של נוגדנים אלה, אך יש לה חשיבות כסמן בהכרה מוקדמת של מספר מפגעים. למבחן זה יש חשיבות בעיקר במחלות המתקדמות במהירות כגון autoimmune limbic encephalitis, כאשר טיפולים מוקדמים עשויים למנוע נזק חמור באיברים חיוניים. נוגדנים עצמיים כנגד AK5 יכולים להיות מבדק שעשוי לסייע באבחון מוקדם של המחלה האחרונה. פורסמה גישה בדבר השימושיות של הערכת פנוטיפים מטבוליים בסרטן הפה באדם (Hye וחב' ב-J Cancer משנת 2017). אנליזה מטבולומית של תאי סרטן הפה, במצבי knockdown של AK2 ושל phosphorylate glycerol kinase 1, מאפשרת את המדידה של רמת מטבוליטים שונים לאחר עיכוב של אנזימים מטבוליים. במודל של עכבר הודגם ש-AK הוא סמן שימושי של אימונו-דיאגנוסטיקה ובפיתוח תרכיב כנגד שחפת (Xiao וחב' ב-J Mol Med משנת 2016).

אדנילאט קינאזות כיעד תרופתי

ה-AMPK האאוקריוטי כווסת חשוב של הומאוסטאזיס של האנרגיה, הוכח כיעד תרפויטי פוטנציאלי בסוכרת type-2, בסרטן ובמחלות מטבוליות (Day וחב' ב-Trends Endocrinol Metab משנת 2017, ו-Carling ב-Curr Opin Cell Biol משנת 2017). בנוסף, nucleoside monophosphate kinases נחקרו כיעד פוטנציאלי של פיתוח תרופות (Egeblad-Welin וחב' ב-FEBS J משנת 2007). מחקר עדכני הראה שנגזרות של thiazolidine עיכבו באופן ספציפי AKs של חיידקים (Ionescu ו-Oniga ב-Molecules משנת 2018). ההבדלים בין AKs של אדם ושל חיידקים יכולים להיות מנוצלים לצורך תכנון של תרכובות חדשות לטיפול בזיהומים על ידי זני חיידקים העמידים לתרופות. לדוגמה, נמצא ש-AK1 ביחד עם protein kinase אחר (PRKACB) משמעותיים בבקרת הפעילות של HIV-1 (על פי Jiang וחב' ב-Int J Clin Exp Pathol משנת 2014).

דוגמאות של מוטציות ב-AK1 שהתגלו במטופלים עם חסר ב-AK

• מוטציה 118GA> הגורמת ל-missense G40R ומוטציה 190G>A הגורמת ל-missense G64R, התגלתה בספרד (Vives Corrons וחב' ב-Blood משנת 2003)
• מוטציה 138delG הגורמת ל-frameshift, התגלתה באיטליה (Fermo וחב' ב-Blood Cells Mol Dis משנת 2004)
• מוטציה 319C<T הגורמת ל-nonsense R107Stop, התגלתה באיטליה (Bianchi וחב' ב-Br J Hematol משנת 1999
• מוטציה 382C<T הגורמת ל-missense R128W, התגלתה ביפן (Matsuura וחב' ב-J Buol Chem משנת 1989)
• מוטציה 491A<G הגורמת ל-missense Y164G, התגלתה באיטליה (Qualitiri וחב' ב-Br J Hematol משנת 1997)
• מוטציה 418-420delGAC הגורמת ל-deletion D140, התגלתה בארצות הברית (Vives Corrons וחב' ב-Blood משנת 2003)

הוראות לביצוע הבדיקה

הכנת ליזאט של תאי דם: לצורך הבדיקה יש צורך ב-1–5 מיליון תאי דם. יש לשטוף את התאים בתמיסת PBS והומוגניזציה של התאים מתבצעת על ידי פיפטציה מהירה בקרח בפיפטת פסטר, ואחריה יש לבצע אינקובציה נוספת למשך 15 דקות על rotary shaker בקור. צנטריפוגציה של התאים למשך 10 דקות בקור במהירות 16,000g להרחקת חומר בלתי מסיס, המלווה על ידי איסוף הנוזל העליון למבחנת פלסטיק הנשמרת בקור.

מדידת פעילות האנזים מתבצעת בטמפרטורה של 37 מעלות (Rhodes ו-Lowenstein ב-J Biol Chem משנת 1968). תערובת ריאקציה סטנדרטית מכילה:

• Tris-HCl בריכוז 100mM
• 100mM KCL
• 10mM MgCl2
• 0.5mM EDTA
• 2mM β-mercaptoethanol
• 5mM phophoenolpyruvate
• mM MgATP‏2
• 0.3mM NADH
• 0.5mg/ml BSA
• IU pyruvate kinase ‏5
• IU LDH‏ 10
• mM AMP3

כל אלה בנפח סופי של 1 מיליליטר ו-pH8.0. הכנסת AMP כתוסף האחרון מתחילה את הריאקציה. יחידה אחת היא כמות האנזים המקטלזת את החמצון של 1μmole NADH1 בדקה ב-37 מעלות.

ראו גם

• חזרה לדף מדריך בדיקות מעבדה
• בדיקות מעבדה - אנמיה והימוליזה
• בדיקות מעבדה - ברורים המטולוגיים

המידע שבדף זה נכתב על ידי פרופ' בן-עמי סלע, המכון לכימיה פתולוגית, מרכז רפואי שיבא, תל-שומר;
החוג לגנטיקה מולקולארית וביוכימיה, פקולטה לרפואה, אוניברסיטת תל-אביב (יוצר הערך)