פיבולין-3-Fibulin

הדפס

מדריך בדיקות מעבדה
פיבולין 3
Fibulin 3
שמות אחרים	EFEMP1
מעבדה	פתולוגית
תחום	אבחון של מזותליומה
יוצר הערך	פרופ' בן-עמי סלע

מטרת הבדיקה

זיהוי של מרכיבים עמילואידיים ברקמות.

משפחת ה-fibulins כוללת 8 גליקופרוטאינים של המשתית החיצונית של התא (ECM), fibulin-1 עד fibulin-8, המאופיינים על ידי מבנה מודולרי המכיל מקטעים דמויי EGF, המלווים על ידי מקטעים דמויי EGF-קושר-סידן, וכולם מכילים מקטע C-טרמינלי ייחודי של fibulin. בין שמונת הפיבולינים, fibulin-3 הוא הקטן ביותר עם משקל מולקולרי של 50,000 דלטון, כאשר fibulin-6 ו-fibulin-8 הם בעלי משקל מולקולרי של 600,000 דלטון. כל אחד משמונה ה-fibulins מקודד על ידי גן הממוקם בכרומוזום שונה. כפי שמודגם בטבלה למטה ה-fibulins מתחלקים לארוכים, קצרים ו-hemicentins כאשר בקבוצה האחרונה הקצה ה-N-טרמינלי מכיל מקטעי von Willebrand המלווים על ידי מודול ארוך עם חזרות (repeats) של immunoglobulin.

כינויים, גודל ומיקום כרומוזומלי של ה-fibulins במערכת הקרדיו-וסקולרית

עקומת ה- receiver operating characteristic או ORC של רמות fibulin-3 בפלזמה, הייתה בעלת רגישות של 96.7% וספציפיות של 95.5% כאשר רמת ה-cutoff של fibulin-3 בפלזמה נקבעה כ-52.8 ננוגרם/מ"ל בהשוואה בין נבדקים עם או בלי מזותליומה. מטופלים בשלב מוקדם של מזותליומה כתוצאה מחשיפה לאזבסט, נמצאה רגישות של 100% וספציפיות של 94.1%, ברמת cutoff של fibulin-3 של 46 ננוגרם/מ"ל. בנוסף, רמות גבוהות של fibulin-3 בתפליט פלאורלי, הן בעלות ערך ניבוי חיובי לאבחון מזותליומה, ומשקפות פרוגנוזה גרועה. מחקרים על סמנים אחרים כולל osteopontin ו- soluble mesothelin-related protein (להלן SMRP) ,לא הראו רגישות וספציפיות גבוהות דיין כדי שישמשו סמנים קליניים במזותליומה. נקודה נוספת הראויה לתשומת לב, היא העובדה שהתפתחות מזותליומה חלה 20–50 שנה לאחר החשיפה לאזבסט, מה שמעלה את השאלה באיזו נקודת זמן כדאי לבצע את הבדיקות. מזותליומה פלאורלית עלולה לא להגיע לריפוי מלא גם לאחר כריתה אגרסיבית של הנגע הסרטני, גם לאחר גילוייה המוקדם. לפיכך גילוי מוקדם עלול לא להפחית את התמותה ועלול לגרום לעודף טיפולים ולהארכה מסוימת של תוחלת החיים.

המבנה של fibulin-3

Fibulin-3 הוא גליקופרוטאין חוץ-תאי המבוטא באופן נרחב ברחבי הגוף במהלך ההתפתחות וכן ברקמות בוגרות. פיבולינים מאופיינים על ידי מַעֲרָכים רציפים של מקטעי EGF קושרי סידן (להלן (cbEGF, ו-fibulin-3 באדם מקודד על ידי הגן EFEMP1 הידוע גם כ-S1-5, והממוקם בכרומוזום 2 בעמדה 2p16. הגן מכיל 11 אקסונים המקודדים לחלבון בעל 493 חומצות אמינו עם משקל מולקולרי של 55 קילו-דלטון. רצף החלבון מכיל signal peptide, חמישה מקטעי cbEGF, ומקטע אחד של modified cbEGF, כמו גם C-terminal fibulin-type module. מקטע ה- modified cbEGF מכיל תְּחִיבָה (insert) של 88 חומצות אמינו. Fibulin-3 מופיע כמונומר בתנאים פיזיולוגיים, והוא משומר ביותר בין מיני בעלי חיים שונים עם הומולוגיית חומצות אמינו של 92-94% זהה באדם, חולדה ועכבר.

בהשוואה למטופלים עם מזותליומה כתוצאה מחשיפה לאזבסט בשלביה המוקדמים, רמת fibrulin-3 בנסיוב עם cutoff של 46 ננוגרם/מ"ל, הייתה כרוכה רגישות של 100% ובספציפיות של 94.1% לאבחון המחלה. גם לרמות גבוהות של fibulin-3 בהפרשות פלאורליות, יש ערך ניבוי חיובי באבחון מזותליומה ואף בהערכה הפרוגנוסטית של המחלה. נראה שמדובר בסמן בעל רגישות וספציפיות גבוהות לאבחון מזותליומה פלאורלית. מחקרים עם סמנים אחרים כולל soluble mesothelin-related protein (להלן SMRP), לא מצאו רמות רגישות וספציפיות הניתנות להשוואה עם fibulin-3. החשיבות של מדד זה בולטת על רקע העובדה שקשה לעיתים לזהות תאי מזותליומה בהפרשות פלאורליות באופן שהאבחון עלול להיות מוחמץ. גם ביצוע ביופסיה פלאורלית חודרנית, אינו רגיש ב-100%, שכן הנגעים הפלאורליים אינם רצופים והביופסיה עלולה להילקח מאזור נטול תאי מזותליומה.

פיבולינים ושריר חלק וסקולרי

פיבולינים הם חלבונים גמישים חוץ-תאיים בעיקר ברקמות אלסטיות בריאות, באבי העורקים, בעור, ובמספר רקמות חיבור כולל עצם וסחוס הכרוכות עם סיבים. תאי שריר-חלק וסקולריים (להלן VSMC) מעכברים החסרים fibulin-5, הם בעלי יכולת משופרת של שגשוג ונדידה, מה שמצביע על תפקיד מעכב של fibulin-5 בתגובה של VSMC לגירוי מיטוגני. שֶמֶט (deletion) של הגן המקודד ל-fibulin-4 שהוא ספציפי ל-VSMC גורם ליצירת מפרצת (aneurysm) גדולה באופן בררני באבי העורקים העולה, ולהפחתה של חלבונים מתכווצים ספציפיים של תאי-שריר חלק, ולהפחתת פעילות גורמי השעתוק להתמיינות של תאי שריר חלק (Hilenski ו-Griendling ב-Vasc Med משנת 2013). נראה אם כן ש-fibulin-4 הוא בעל תפקיד דואלי הן ביצירת סיב אלסטי, ובהתמיינות של תאי שריר חלק, ולפיכך עשוי להגן כנגד יצירת מפרצת. עכברים טרנסגניים משוללי Fibulin-2 ו-fibulin-5 הם בעלי כלי-דם עם שכבת lamina גמישה בלתי-מאורגנת בדופן כלי הדם, ולפגיעה בעורק הקארוטידי.

fibulins מופיעים בכל היצורים השייכים ל-metazoa (שהם כל בעלי החיים המורכבים מתאים שעברו התמיינות לרקמות ולאיברים), וכך אפילו נמטודות כדוגמת C. elegans, מכילות 2 ,fibulins fbl-1 ו-him-4, האורטולוגים ל-fibulin-1/2, ול-hemicentrin-1/2, בהתאמה. Fibulin-4, fibulin-3 ו-fibulin-5 נמצאים באותה קבוצה טקסונומית פילוגנטית שכוללת את כל צאצאיו של אב קדמון משותף, והם מופיעים בבעלי חוליות. אלה מכונים באופן קולקטיבי "פיבולינים קצרים" או "פיבולינים אלסטוגניים" בהתאם לתפקידם הייחודי בסיבים אלסטיים. Fibulins אינם יוצרים סטרוקטורות מולטימריות, ובמקום זאת הם נוטים להיקשר לצברים אחרים של ה-ECM. Fibulin-1 מבוטא באופן נרחב בנסיוב, בסיבי משתית, וב-basement membrane. ביטוי מוגבר של fibulin-1 מוצאים בפצעים מגלידים, כמו גם בקרצינומה של השחלות, בהן הם משחקים לכאורה תפקיד של מדכאי התהליך הסרטני. Fibulin-2 ממוקם באופן חלקי בצוותא עם fibulin-1, ושני אלה עוברים אינטראקציה עם fibronectin ועם אנדוסטאטינים (שהם קולאגן מתתי-סוגים XV ו-XVIII), והם מגיבים עם aggrecan ועם versicam. שלושת ה-fibulins הקצרים, 3, 4 ו-5, קשורים להִתְגּוֹדְדוּת של הסיבים האלסטיים, אך יש להם גם פונקציות לא אלסטוגניות.

התכונות הביוכימיות של כל אחד מהפיבולינים

הראשון מבין הפיבולינים שהתגלה, Fibulin-1, בודד משליית אדם (Argraves וחב' ב-EMBO Rep משנת 1989) ומגידול Engelbreth-Holm-Swarm בעכברים (Kluge וחב' ב-Eur J Biochem משנת 1990). שאר הפיבולינים זוהו כ-cDNAs ורובם קשים לבידוד מהרקמות בגין ריכוזם הנמוך.

Fiblin-1: ארבעה וריאנטים שעברו splicing (1A, 1B, 1C ו-1D) שונים במוֹדוּל ה-C טרמינלי שלהם נמצאים באדם, ורק 2 וריאנטים (1C ו-1D) מופיעים ב-species אחרים כולל בנמטודה C. elegans, בדרוזופילה, בדגי זברה, בתרנגולות, ובעכברים. באלקטרופורזה בגל פוליאקרילאמיד-SDS בתנאים מחזרים החלבונים המנוקים נודדים לעמדה של 90–100 אלף דלטון, אך נודדים מהר יותר בתנאים לא-מחזרים, בגין התכולה הגבוהה של גשרים די-סולפידיים תוך-מולקולריים. מצא אחרון זה אופייני גם לגבי פיבולינים אחרים.

Fibulin-2: פיבולין-2 הוא דימר בו שני מונומרים שכל אחד מהם במשקל מולקולרי של 200 אלף דלטון, מחוברים ביניהם בקשר די-סולפידי. המקטעים ה-N טרמינליים (Na העשיר בשיירי ציסטאין, ו-Nb החופשי מציסטאין) מופיעים רק ב-fibulin-2, ומכילים 20 שרשראות אוליגוסכרידיות הקשורות לשלד הפפטידי בקשר O, מה שמוכיח שיש ל-fibulin-2 אופי מוציני. תהליך אלטרנטיבי של splicing גורם באדם לאלימינציה של מקטע בודד דמוי-ebCGF, (שהוא למעשה ebCGF3), תהליך שלא מוצאים בעכברים.

Fibulin-3: ה-cDNA זוהה כ-S1-5 שהוא גן המבוטא ביתר בתסמונת Werner ובפיברובלסטים נורמליים אך בתהליך של הזדקנות. צפויים חמישה תהליכי splicing אלטרנטיביים בקצה ה-'5 של ה-pre-RNA של fibulin-3, ושניים מתוכם מכילים רצפים של signal peptide. בעכברים, fibulin-3 רקומביננטי מבוטא בתאי HEK293 בשתי צורות שונות מבחינת הגליקוזילציה שלהן, במשקלים מולקולריים של 63 אלף, ו-80 אלף דלטון (Kobayashi וחב' ב-J Biol Chem משנת 2007). צורת ה-80 אלף דלטון, מכילה יותר גליקנים קשורים בקשר O, אם כי צורה זו אינה מופיעה ב-fibulin-3 רקומביננטי המבוטא בתאי HEK293 של עכבר.

Fibulin-4: פיבולין זה זוהה דרך חיפוש הומולוגיה של הרצף, כחלבון המגיב עם MBP1 שהיא צורת מוטנט של החלבון p53 המדכא סרטן. דווחה נוכחות של עותק אלטרנטיבי החסר את הרצף המקודד ל-signal protein.

Fibulin-5: במקור התייחסו לפיבולין זה כאל EVEC (embryonic vasculature and the presence of Ca2 + binding EGF-like repeats) וכן כאל DANCE (developmental arteries and neural crest EGF-like).

Fibulin-7: פיבולין זה זוהה כ-TM14 על ידי היברידיזציה דיפרנציאלית על ידי שימוש ב-microarrays של cDNA מנבט של שיני עכבר. Fibulin-7 מכיל מקטע Sushi הייחודי לפיבולין-7, וידוע גם כן כ- complement control protein module או כ- short consensus repeat בקצה ה-N טרמינלי.

Fibulin-6/8: ההתייחסות של שני פיבולינים אלה היא גם כאל hemicentin-1 ו-hemicentin-2. ה-hemicentin היה קרוי במקור him-4 (או (high incidence of males בנמטודה C. elegans. המשקל המולקולרי של 2 פיבולינים אלה הוא בערך 600 אלף דלטון.

Fibulin-3 וסרטן מסוג מזותליומה

Fibulin-3 הוא חלבון המיוצר בתאי מזותליומה. ניתן למצוא אותו בנוזל הפלאורלי ובדם. Harvey Pass מאוניברסיטת Langone בניו-יורק המומחה למזותליומה, פיתח ותיקף את הבדיקה למדידת fibulun-3 לאבחון מזותליומה. במאמר שלו וחב' ב-N Eng J Med משנת 2012, הודגם ש-fibulin-3 יעיל ב-96.7% לזיהוי מזותליומה, ויעיל ב-95.5% בשלילת המחלה בנבדקים ללא מזותליומה. יש צורך בסמנים ביולוגיים נוספים נדרשים על מנת לזהות מזותליומה פלאורלית בשלביה המוקדמים כפי שמסתבר מנתוני רקע של מחקר זה. לצורך המחקר, נעשה שימוש פרוספקטיבי בבדיקת fibulin-3 בדגימות שנאספו באוניברסיטת Wayne State בדטרויט בין השנים 1998–2005, ובדגימות שנאספו ב-NY University בין השנים 2005–2011. המדגם מדטרויט כלל 78 מטופלים מאובחנים עם מזותליומה, מתוכם 41 חולים שנחשפו לאזבסט, וכן דגימות פלאורליות של 53 נבדקים ללא מזותליומה. המדגם הניו-יורקי כלל 64 מטופלים מאובחנים עם מזותליומה, 95 נבדקים שנחשפו לאזבסט אך עדיין לא חלו, ו-40 נבדקים עם תפליט (effusion) ריאתי שלא כתוצאה ממזותליומה, ועוד 43 דגימות של נבדקים בריאים לחלוטין. תוצאות ניסוי זה הראו שרמת fibulin-3 בפלזמה, לא היו תלויות בגיל, במגדר, במשך החשיפה לאזבסט או לדרגת השינויים הרדיו-גרפיים שנצפו בנבדקים. תוצאות מחקר זה הצביעו על רמות מוגברות משמעותית של fibulin-3 במטופלים עם מזותליומה (8±113 ננוגרם/מ"ל), בהשוואה עם נבדקים שנחשפו לאזבסט אך ללא מזותליומה (1±42 ננוגרם/ מ"ל במדגם דטרויט). תוצאות המחקר הצביעו על רמות fibulin-3 בפלזמה הגבות משמעותית במטופלים עם מזותליומה פלאורלית (11±18 ננוגרם/מ"ל), בהשוואה לנבדקים שנחשפו לאזבסט ללא מזותליומה (4±21 ננוגרם/מ"ל) במדגם ניו-יורק נמצאו רמות מוגברות בהרבה של fibulin-3 בהפרשות פליאוראליות של מטופלים עם מזותליומה פלאוראלית (636 ± 92 ng/mL), לעומת רמות חלבון זה בהפרשות פליאוראליות של מטופלים עם הפרשות שאינן כתוצאה של מזותליומה (151 ± 23 ng/mL), P<0.001). עקומת ROC עבור רמות fibulin-3 בפלזמה, הייתה בעלת רגישות של 96.7% וספציפיות של 95.5%, עם ערך cutoff של 52.8 ננוגוגרם פיבולין-3/מ"ל, בהשוואת מטופלים עם או בלי מזותליומה.

מחקר זה מצא רמות fibulin בתפליט הפלאורלי שהיו גבוהות משמעותית במאובחנים עם מזותליומה פלאורלית (46±937 ננוגרם/מ"ל), בהשוואה לרמות חלבון זה שנמצאו בתפליט ללא מזותליומה (21±225 ננוגרם/מ"ל) במדגם דטרויט. תוצאות דומות התקבלו במדגם ניו-יורק, עם רמת fibulin-3 בתפליט של חולי מזותליומה (37±694 ננוגרם/מ"ל) לעומת 25±212 ננוגרם/מ"ל בתפליט של אלה שאינם חולים במזותליומה (0.001p<). עקומת ה-ROC של רמות fibulin-3 בפלזמה נמצאה בעלת רגישות של 96.7%, וספציפיות של 95.5% בערך cutoff של 52.8 ננוגרם/מ"ל של fibulin-3 בהשוואה כוללנית של רמת חלבון זה בחולי מזותליומה לעומת אלה השליליים לתרחיש. בבדיקה של אלה בשלב מוקדם של מזותליומה לאחר חשיפה לאזבסט, הרגישות של רמת fibulin-3 הייתה 100%, והספציפיות נקבעה כ-94.1% בערך cutoff של 46 ננוגרם/מ"ל, של חלבון זה. ממצאי מחקר זה מצביעים על רגישות וספציפיות של מדידת fibulin-3 כסמן למזותליומה, כאשר סמנים אחרים שנבדקו במחקרים אחרים כגון soluble mesothelin-related protein (או SMRP), וכן גם osteopontin לא השיגו מידה דומה של רגישות וספציפיות, כדי שייחשבו כסמנים יעילים לאבחון המחלה. החשיבות הפוטנציאלית של מדידת fibulin-3 נובעת מהעובדה שתאי מזותליומה בתפליט פלאורלי קשים לזיהוי, ואפילו ביופסיות אינן רגישות ב-100% באבחון המחלה, שכן יכולים להיות אזורים לא-רציפים בפלאורה מבחינת הנגיעות התאים הסרטניים. האבחנה המבדלת של מזותליומה וסוגי סרטן ריאות אחרים כגון NSCLC, קשה אף היא גם בבחינה על ידי פתולוג בעל ניסיון, מכשול שאינו קיים במדידת רמת fibulin-3 שאינה מוגברת בסוגי סרטן ריאות אחרים. צביעה אימונו-היסטוכימית של fibulin-3 שימושית באשרור של סוג עמילואידי של המחלה. נוגדנים כנגד fibulin-3 צובעים את המשקעים העמילואידיים בחולים עם fibulin-3 amyloidosis, תרחיש הכורך באופן טיפוסי את דפנות הוורידים במערכת העיכול.

הוראות לביצוע הבדיקה

ביצוע בדיקה של immunostain רקמתית: מועדף שימוש ב-2 זכוכיות נושא טעונות חיובית (25X75X1 mm), כאשר חתכי הרמה הם בעובי של 4 מיקרון. ה-block המועדף עבר קיבוע בפורמלין, ותהליך embedding בפרפין.

סיבות לפסילת הדגימה: רקמה רטובה או קפואה; משטחים ציטולוגיים; רקמה שלא קובעה בפורמלין; רקמה שלא עברה embedding בפרפין; זכוכיות נושא לא טעונות; זכוכיות נושא ProbeOn.

גיל הרקמה עלול להשפיע על התגובה האימונית, לכן יש להקפיד על רקמה טרייה ככל האפשר. עדיף לקבל את החומר לאימונו-היסטוכימיה בטמפרטורת החדר אך ניתן גם לקבל את החומר בקירור. שיטת הבדיקה: אימונוהיסטוכימיה.

המבנים המבניים המודולריים של חברי משפחת ה-fibulins: Fibulin-3, fibulin-4 ו-fibulin-5 משותפים בהומולוגיה של למעלה מ-50% מחומצות האמינו שלהם, ובעלי דמיון רב בארגון המבני שלהם. כל אחד מפיבולינים אלה מכיל מקטע cbEGF עם תּוֹסֶפֶת של 28–88 חומצות אמינו. AT-anaphylatoxin. הפיבולינים מאופיינים על ידי tandem array של מודולים דמויי-EGF המכילים motif קונצנזוס לקישור סידן ((cbEGF (צבוע באדום), או חסרים motif זה (צבוע בסגול). מקטע N המחולק לאזור עשיר בציסטאין (Na) ולאזור חסר ציסטאין (Nb) ייחודי ל-fibulin-2.

ראו גם

• חזרה לדף מדריך בדיקות מעבדה
• בדיקות מעבדה - סמנים סרטניים

המידע שבדף זה נכתב על ידי פרופ' בן-עמי סלע, המכון לכימיה פתולוגית, מרכז רפואי שיבא, תל-שומר;
החוג לגנטיקה מולקולארית וביוכימיה, פקולטה לרפואה, אוניברסיטת תל-אביב (יוצר הערך)