הסמן ZAP-70

הדפס

מדריך בדיקות מעבדה
הסמן ZAP-70
שמות אחרים	: Zeta-chain-associated protein kinase 70
מבנה מתחמי SH2 של האנזים. מתוך PDB 1m61
מעבדה	המטולוגיה בדם
תחום	הערכה פרוגנוסטית של חולים עם לאוקמיה לימפוציטית כרונית
יוצר הערך	פרופ' בן-עמי סלע

מטרת הבדיקה

לקבוע פרוגנוזה ואת הצורך בתרפיה אגרסיבית במטופלים עם CLL של תאי B.

רקע קליני

המהלך הקליני של לאוקמיה לימפוציטית כרונית של תאי B או B-CLL מגוון, ופרמטרים ביולוגיים חדשים צריכים להתווסף לשיטות ה-staging המקובלות כדי לנבא מהלך אגרסיבי או שמא אינדוּלֶנטי של המחלה. CLL היא הלאוקמיה השכיחה ביותר בעולם המערבי, והיא מאופיינת על ידי הצטברות של תאי B חד-שבטיים מסוג ⁺CD5, והופעה של לימפוציטים בשלים קטנים (Matutes וחב' ב-Leukemia משנת 1994). אחת התכונות המסקרנות של המחלה, היא ההטרוגניות הקלינית שלה, כאשר חלק מהחולים בה נאלצים להיכנע למסלול מחלה מואץ ומוות תוך זמן קצר, בעוד שאחרים מפגינים מסלול מחלה יציב יותר, שקצב התקדמותו אטי והחולה שורד שנים רבות. לכן חיוני למצוא סמנים רגישים לזיהוי חולים עם פרוגנוזה גרועה (Caligaris-Cappio וחב' ב-J Clin Oncol משנת 1999).

ל-CLL יש מהלך מחלה מאוד משתנה. חלק מהחולים שורדים עשרות שנים ללא כל טיפול, ואילו חולים אחרים עם CLL זקוקים לטיפול אגרסיבי תוך שנים אחדות לאחר האבחון של המחלה. היכולת לנבא מחלת איזה מהחולים תתקדם במהירות, עשויה לסייע בהחלטה על אסטרטגיית הטיפול ומועדו. המנבא המבוסס ביותר של התקדמות CLL הוא חסר מוטציות במקטע המשתנה של השרשרת הכבדה של האימונוגלובולין (IgVH) בתאים הסרטניים. עם זאת, כיוון שבחינת מוטציות ב-IgVH אינה זמינה ברוב המעבדות, מספר סמני עזר אחרים נחקרו. כיום, הסמן המקובל ביותר הוא הביטוי של zeta-associated protein 70 או ZAP-70, המבוטא בעיקר על פני תאי T ותאי NK, ומשחק תפקיד קריטי בהעברת איתותים המלווים שפעול של הקולטן של תאי T. ב-CLL, ביטוי מוגבר של ZAP-70 בתאי B מנבא את הצורך בטיפול רפואי מוקדם יותר, באותה מידה שניתן להסיק על נחיצות טיפול זה בהיעדר מוטציות ב-IgVH. ברור ששילוב של שתי בדיקות אלו ייתן תחזית פרוגנוסטית מדויקת יותר.

למסקנה אחרונה זו הגיע גם ה-CLL Research Consortium או CRC, תוך הדגשה שבדיקה משולבת זו יעילה במיוחד כאשר היא מוגבלת לחולים בשלבי מחלה מוקדמים, לחולים לא מטופלים ולאלה מעל גיל 65 שנה. מחקר ה-CRC מצביע על ZAP-70 כסמן הפרוגנוסטי החזק ביותר, לנבא את מהלך CLL. לאלה עם ZAP-70 חיובי יש פרק זמן של 3 שנים מאבחון המחלה עד תחילת הטיפול, ללא קשר לסטטוס המוטציות ב-IgVH או לסטטוס של CD38.

באשר לקבוצת המאובחנים עם ZAP-70 שלילי, ניתן לחלקה לשניים: אלה עם סיכון ממוצע (6 שנים עד לתחילת הטיפול) ולאלה עם סיכון נמוך (10 שנים לתחילת הטיפול הראשון), בהתבסס על סטטוס המוטציות של IgVH.

הביטוי של CD38 על תאי CLL נמצא מוגבר במספר גדול יותר של שבטי תאים (clones) מתחלקים. קיים קשר הדוק בין ביטויו של CD38 לבין מדד ההתחלקות של Ki67, במקביל לחיוּביוּת מוגברת של ZAP-70 (על פי Damle וחב' ב-Blood משנת 2007). נתון זה מראה ששבטי-תאים חיוביים ל-CD38 נכנסים למעגל חלוקת התא באופן תכוף יותר מאשר שבטי-תאים שליליים ל-CD38. שבטי-תאים חיוביים ל-CD38 מבטאים ביֶתֶר את VEGF, גורם הגדילה של תאי האנדותל הכרוך כשלעצמו עם ביטוי מוגבר של Mcl-1, החלבון האנטי-אפופטוטי, מה שעשוי להסביר את שגשוגם הבולט של שבטי-תאים אגרסיביים של CLL (על פי Pepper וחב' ב-Leukemia משנת 2007).

בשנת 1991 דווחו לראשונה Chan וחב' ב-Proc Natl Acad Sci USA על זיהוי בתאי Jurkat מֽגוּרים על ידי הקולטן של תאי T, של טירוזין פוספו-פרוטאין בעל שרשרת (zeta , ζ) שמשקלו המולקולארי 70 קילו-דלטון, שכונה מאז ZAP-70. החשיבות של ZAP-70, טירוזין קינאזה ציטופלזמטי, המבוטא בעיקר בתאי T, התגלתה במהירות על בסיס התצפיות הבאות:

• למטופלים החסרים ZAP-70 אין תאי T פונקציונאליים בדם ההיקפי, והם סובלים מחסר חיסוני משולב חמור (SCID) על פי Arapia וחב' ב-Cell משנת 1994, ו-Elder וחב' ב-Science משנת 1994
• ההתפתחות של תאי T בעכברים משוללי ZAP-70, נעצרת במעבר מהשלב של +CD4 ל+CD8 בו מתרחשת הסלקציה החיובית והשלילית של תימוציטים (Kadlecek וחב' ב-J Immunol משנת 1998, ו-Negishi וחב' ב-Nature משנת 1995)
• ההדגמה בשורת תאים P116 ממקור Jurkat החסרים ביטוי של ZAP-70, שתאים אלה נכשלים בשפעול של איתותים downstream לאחר סטימולציה על ידי הקולטן של תאי T (על פי Williams וחב' ב-Mol Cell Biol משנת 1998). כיוון ש-ZAP-70 משחק תפקיד קריטי בהתפתחות תאי T, מאמץ מחקרי ניכר הושקע ללמידת הוויסות, המבנה והתפקיד של ZAP-70.

המבנה והביולוגיה של ZAP-70

ZAP-70 שייך למשפחת טירוזין קינאזה הכרוך עם איתותים של תאי-T. החלבון ZAP-70 מבוטא על פני תאי T ותאי NK ומהווה חלק מה-T cell receptor ומשחק תפקיד קריטי באיתות של תאי-T. הגן המקודד ל-ZAP-70 ממוקם על כרומוזום 2 בעמדה 12q2, ומכיל 18 אֶקסונים. חלבון זה זוהה לראשונה בשנת 1994 כשותף מועדף לפוספורילציה של שרשרת zeta של הקומפלקס CD3 הכרוך עם קולטן תאי-T המצוי על לימפוציטים מסוג T על ידי van Oers וחב' ב-Immunology. ל-ZAP-70 יש 619 חומצות אמינו והוא מורכב מ-3 מקטעים (domains).

מקטעי הטירוזין קינאזה קרויים על בסיס של Src kinase המכיל שלושה מקטעים עיקריים המכונים SH המייצג את Src homology. המקטע SH1 מכיל את הפעילות האנזימטית, המקטע SH2 מפקח על האינטראקציה בין החלבונים ועל הזרחון על ידי פוספו-טירוזינים ספציפיים, ואילו SH3 מספק תוספת של ספציפיות הכרה בין החלבונים. ישנם 2 מקטעי SH2 בקצה ה-N-טרמינאלי של ZAP-70, בעוד שהמקטע הקטליטי של האנזים kinase ממוקם בקצה ה-C-טרמינאלי של חלבון זה. כל אחד ממקטעי SH2 מכילים בערך 100 חומצות אמינו, והם בנויים על בסיס שני סלילוני α-helix וגדילי β אנטי-מקבילים. בכל צד של שרשרות בטא נמצאות שתי גומחות-קישור, אחת מהן טעונה חיובית כדי לרתק את המטען השלילי של פוספו-טירוזין, והשנייה מספקת את הספציפיות לאינטראקציה בין החלבונים.

המקטע הקטליטי מכיל שלושה חלקים שהשתמרו מאוד של PTK או protein tyrosine kinase (על פי van Oers ו-Weiss ב-Senin Immunol משנת 1995):

1. אזור עתיר-גליצין הקושר נוקלאוטידים הכרוך בקישור של ATP, כאשר שיירי גליצין מעגנים את הפוספאט, בעוד ששיירי ליזין קושרים את הנוקלאוטיד עצמו
2. אתר של פוספורילציה עצמית
3. motif ספציפי המכיל את רצף חומצות האמינו HRDLAARN.

ZAP-70 קשור למשפחת PTK ספציפית, עם טירוזין קינאזה של הטחול (SyK), המעורב בעיקר בשפעול של תאי B. שני PTKs אלה דומים מאוד עם הומולוגיה של 73% ברצף חומצות האמינו שלהם, והם מאופיינים על ידי חסר של מקטע SH3, מה שקובע שהספציפיות שלהם נקבעת על ידי שני מקטעי SH2. ב-ZAP-70 כמו גם ב-Syk חל שחלוף של טריפטופן בחומצת האמינו פניל-אלנין במקטע ה-N-טרמינאלי. שחלוף זה עלול להגביל את הספציפיות של ZAP-70 ושל Syk באשר ל-ITAMs המזורחנים, אך לא ביחס לחלבונים מזורחנים אחרים, על ידי המודיפיקציה של הלִבָּה ההידרופובית של הגומחה אליה נקשרים פוספו-פרוטאינים.

ביטוי של ZAP-70 על תאי B משמש כסמן פרוגנוסטי בזיהוי צורות שונות של CLL. אנליזת DNA מבחינה בין 2 צורות CLL, עם אורך הישרדות שונה. CLL חיובי ל-ZAP-70 הוא בעל משך הישרדות ממוצעת של 8 שנים, ואילו CLL שלילי ל-ZAP-70 הוא בעל אורך הישרדות ממוצעת של 25 שנה. רבים מהמאובחנים עם CLL, בעיקר אלה בגיל מתקדם, עם מחלה מתקדמת באיטיות עשויים להימנע מכל טיפול על פי תוצאות מדידת ZAP-70 (על פי Chiorazzi וחב' ב-N Engl J Med משנת 2005).

מדידות וכּימות של ZAP-70

CD38 נמדד על ידי flow cytometry כנגד ביטוי הסמן של תאי-B, הידוע כ-CD19. דיווח עדכני של Letestu וחב' ב-Blood משנת 2010, מראה ש-CD38 הוא מנבא בלתי-תלוי של הישרדות ללא התקדמות המחלה במטופלים עם CLL המסווג כ-Binet stage A. ערך הסף של חיוביות של CD38 נתון לוויכוח: באופן מסורתי ביטוי CD38 על פני למעלה מ-30% של תאי B של CLL, מזוהה עם מחלה יותר פרוגרסיבית. מחקר במדגם גדול של חולים עם CLL מצא שערך סף של 7% של תאים חיוביים ל-CD38 היה יעיל ביותר בהגדרה הפרוגנוסטית של שתי קבוצות הנבדקים (Krobler וחב' ב-Blood משנת 2002), ממצא שנתמך גם במחקר של 130 חולי CLL על ידי Hock וחב' ב-Intern Med J משנת 2010. מחקר אחרון זה מצא שסך ההישרדות שופר משמעותית באלה עם CD38 שלילי, אם כי לא היה הבדל משמעותי בהישרדות בין חולים בהם למעלה מ-5% מהתאים היו חיוביים ל-CD38, לבין אלה בהם למעלה מ-95% מהתאים נמצאו חיוביים לסמן זה.

אנליזה של ZAP-70 על ידי reverse transcriptase-PCR פּוּתחה על ידי שימוש בתאים לאוקמיים ממוינים (Wiestner וחב' ב-Blood משנת 2002), אך שיטת PCR זמינה ומהירה עדיין לא קיימת ברוב המעבדות הקליניות. נכון להיום, שתי הטכניקות העיקריות למדידת ZAP-70 הן flow cytometry על ידי השוואה של ביטוי ZAP-70 בתאי-B או כנגד ביקורת איזוטיפית או כנגד ביטויו של ZAP-70 בתאי-T באותה דגימה (Orchard וחב' ב-Lancet משנת 2004, Rassenti וחב' ב-N Engl J Med משנת 2004, ו-Kay וחב' ב-Cytometry B Clin Cytom משנת 2006). Crespo וחב' דיווחו ב-N Engl J Med משנת 2003, שבערך סף של 20%, ZAP-70 הבדיל באופן חיובי וברור בין שתי קבוצות של חולי CLL: אלה עם ביטוי ZAP-70 בפחות מ-20% מהתאים היו בעלי משך הישרדות ארוך יותר וסיכון נמוך יותר להתקדמות המחלה, ולפיכך ברוב המעבדות ZAP-70 מוגדר כ"חיובי" כאשר לפחות 20% מהתאים חיוביים לסמן זה.

ההערכה הסובייקטיבית של שיטות אלו עלולה להביא למסקנות שונות בין מעבדות, וכדי להתגבר על סובייקטיביות זו הוצע שרצוי אולי לקבוע את עוצמת הזריחה הפלואורסצנטית הממוצעת של תאי CLL, ולהשוותה לנתון זה בלימפוציטים מסוג T, במקום קביעת אחוז התאים החיוביים ל-ZAP-70 (על פי Rossi וחב' ב-J Transl Med משנת 2010). שיטות המבוססות על PCR להערכה של ZAP-70 מצטיירת כבעלת מתאם גבוה עם האנליזה של מוטציות ב-IgVH, כאשר 94% מהמטופלים ללא מוטציות ב-IgVH נמצאים חיוביים ל-ZAP-70 ואילו 92% מאלה עם מוטציות ב-IgVH נמצאים שליליים ל-ZAP-70 (על פי Catherwood וחב' ב-Eur J Hematol משנת 2006).

לעתים יש מקרים חריגים, בהם ממצאי ZAP-70 וסטטוס המוטציות ב-IgVH אינם תואמים, דהיינו מקרים בהם ZAP-70 חיובי, ויש מוטציות ב-IgVH. במחקר המצוטט של Orchard וחב', נבחנו 6 מטופלים עם הממצא הסותר האחרון ונמצא שאלה מתוכם עם ZAP-70 חיובי היו בעלי הומולוגיה של 96.5% עם הרצף של תאי הנבט (germline). לעומתם, במטופלים עם הומולוגיה פחותה מ-96% לא בא לביטוי ZAP-70. היפוכו של דבר גם כן זוהה, דהיינו ZAP-70 שלילי וחוסר מוטציות ב-IgVH.