Anti-Saccharomyces cerevisiae mannan antibodies

הדפס

מדריך בדיקות מעבדה
Anti-Saccharomyces cerevisiae mannan antibodies מסוג IgA ו-IgG
שמות אחרים	ASCA, Saccharomyces cerevisiae antibodies
מעבדה	אימונולוגיה בדם
תחום	בדיקה שמטרתה לסייע באבחון מחלות דלקתיות של המעי
טווח ערכים תקין	תוצאה שלילית-< or =20.0 U; תוצאה גבולית-20.1-24.9 U; תוצאה חיובית חלשה-25.0-34.9 U; תוצאה חיובית-> or =35.0 U. ערכי הייחוס מתייחסים לכל קבוצות הגיל.
יוצר הערך	פרופ' בן-עמי סלע

מטרת הבדיקה

סיוע לקלינאי להבדיל בין קוליטיס כיבית (להלן UC) ומחלת קרוהן (להלן CD) במטופלים חשודים למחלת מעי דלקתית (להלן IBD).

נוגדני ASCA

ASCAs הם נוגדנים המכוונים כנגד אנטיגנים הממוקמים בדופן של השמר Saccharomyces cerevisiae מזן Su1 (Sandborn וחב' ב-Inflamm Bowel Dis משנת 2001). נוגדנים כנגד ASCA וכנגד pANCAs‏ (perinuclear antineutrophil cytoplasmic antibodies) הם הנוגדנים השימושיים ביותר בתחום האבחון של מחלת קרוהן וקוליטיס (Desplat-Jégo וחב' ב- World J Gastroenterol משנת 2007). ASCA נוטה לזהות מחלת קרוהן באופן שכיח יותר, ואילו pANCA מזהה יותר קוליטיס כיבית (Joossens וחב' ב-Gastroenterology משנת 2002). נוגדני ASCA מגיבים עם גליקופרוטאין בעל משקל מולקולרי של 200 אלף דלטון המכיל mannan של שמר (Lindberg וחב' ב-Gut משנת 2002, ו-Heelan וחב' ב-Immunol Lett משנת 1991). מחלות בהן ניתן למצוא נוגדני ASCA הן כדלקמן: מחלת Bechҫet (Monselise וחב' ב-Clin Exp Rheumatol משנת 2006, ו-Fresko וחב' באותו כתב עת משנת 2005); מחלת צליאק {Giaffer וחב' ב-Gut משנת 1992, ו-Toumi ןחב' ב- Scand J Gastroenterol משנת 2007); קוליטיס כיבית משפחתית וקוליטיס מיקרוסקופית (Annese וחב' ב- Am J Gastroenterol משנת 2001); קוליטיס קולגנית (Holstein וחב' ב- J Gastroenterol Hepatol משנת 2006); מחלת קרוהן (Main וחב' ב-Br Med J משנת 1988, ו-Barnes וחב' ב- Int Arch Allergy Appl Immunol משנת 1990).

אנטי-mannans

Mannan או אוליגו-mannan הוא מרכיב בדופן שמרים, ונוגדנים כנגדו מופיעים בשכיחות מוגברת במחלת קרוהן. מחקר של הסוכרים המרכיבים את mannan מצא ש-mannotetraose (4-mer) היה אחראי לתגובת הנוגדנים החזקה ביותר (Sendid וחב' ב-Clin Diagn Lab Immunol משנת 1996). Mannans משמרים אחרים כגון candida albicans, נמצאו מגיבים גם הם בצורה צולבת על נוגדני ASCA, מה שמרמז לכך שגם שמרים אחרים יכולים להשרות מחלות מעי בהן משחק ASCA תפקיד.

לקטין קושר-mannan

לקטין זה מיוצר על ידי האדם. במחלת קרוהן חיובית ל-ASCA, הרמות של לקטין זה בנסיוב נמוכות יותר. התגובה התאית ל-mannan בלימפוציטים היקפיים בדם במצב של +‏ASCA, יכולה להיות מעוכבת בהוספה של לקטין קושר-mannan, אך בגן המקודד ללקטין זה נמצאה שכיחות גבוהה של מוטציות בנבדקים חיוביים ל-ASCA (Seibold וחב' ב-Gastroenterology משנת 2004). בנוסף, הרמות של לקטין קושר-mannan נמצאות במתאם הופכי לרמות ASCA במאובחנים עם מחלת קרוהן עם פנוטיפ חמור של המחלה (Choteau וחב' ב-Sci Rep משנת 2016, ו-Seibold וחב' ב-Inflamm Bowel Dis משנת 2007).

ASCA במחלת קרוהן

נוגדני ASCA הם באופן עקבי גבוהים יותר במחלת קרוהן. שמרים גורמים לעלייה פי-3 בשגשוג של לימפוציטים בהשוואה לביקורת בריאה (Young וחב' ב-Digestion משנת 1994). נוגדני ASCA נמצאים גם בשכיחות גדולה יותר במחלת קרוהן משפחתית (Annese וחב' ב-Am J Gastroenterol משנת 2001). מבחינים בתגובה חיסונית תאית והומוראלית מוגברת ל-mannan, כנראה בגלל אובדן הסבילות לשמרים (Conrad וחב' ב-Inflamm Bowel Dis משנת 2004). שינוי זה בתגובה החיסונית בא לביטוי על ידי סמנים משפעלים מוגברים, כגון CD25/CD69, על ידי גירוי לשגשוג לימפוציטים מסוג T-helper.{{כ} ASCA חיובי מנבא מחלת קרוהן בספציפיות גבוהה של 87%, וכן הוא בעל ערך ניבוי חיובי (ppv) גבוה של 78% (Walker וחב' ב- Clin Exp Immunol משנת 2004).

נוגדני ASCA כרוכים עם המעי הדק בחלק הקריבני (פרוקסימלי) של הקיבה-תריסריון, יותר מאשר עם מחלת המעי הגס (0.001p<), וכן כרוכים נוגדני ASCA עם פנוטיפ חמור יותר וצורך לניתוח במהלך תקופת מעקב של 9 שנים (0.0001p<). בניסויים בהם השרו קוליטיס באופן כימי, נוצרו מושבות מזדמנות של השמר הפתוגני Candida albicans המשרה יצירת נוגדני ASCA (על פי Jawhara וחב' ב-J Infect Dis משנת 2008, ו- Schaffer וחב' ב- Inflammatory bowel dis משנת 2007).

נוכחות נוגדני ASCA כנגד השמר Sacchromyces cerevisiae וכנגד ניטרופילים (perinuclear anti-cytoplasmic antibody או pANCA, היוו 2 מדדים סרולוגיים ל-IBD משך שנים רבות. השילוב של תוצאה חיובית של ANCA ותוצאה שלילית של pANCA היה בעל ערך ניבוי חיובי (ppv) של 96% וספציפיות של 97% לאבחון CD (על פי Quinton וחב' ב-Gut משנת 1998). עם זאת, 2 נוגדנים אלה נמצאו גם במחלות אחרות, כגון מחלת כבד אוטואימונית, primary sclerosing cholangitis , בהן מוצאים pANCA, ומחלת צליאק בה מוצאים ASCA. לכן, תפקידם של 2 נוגדנים אלה כסמנים איבחוניים סרולוגיים של IBD נראה מוגבל.

הקביעה של נוכחות נוגדנים היא בעלת עניין במטופלים עם קוליטיס לא מוגדרת. עם זאת, כמעט 50% מנבדקים אלה ASCA כרוכה במחלת מעי קריבנית של המעי הדק והקטע הגסטרו-תריסריוני ופחות במחלת המעי הגס (p<0.001), וכן היא כרוכה בפנוטיפ מלה חמור יותר והזדקקות לניתוח במהלך מעקב של 9 שנים (p<0.0001).

הרגישות והספציפיות של בדיקת ASCA

על פי Walker וחב' ב-Clin Exp Immunol משנת 2004, הרגישות של בדיקת ASCA לאבחון מחלת קרוהן היא 57% ואילו הספציפיות שלה מגיעה ל-87%. בדיקה זו מתייחסת ל-2 סוגי אימונוגלובולינים IgA ו-IgG. אם הבדיקה נעשית בנפרד לגבי כל אחד משני isotypes אלה, בשיטת אימונו-פלואורסנציה בלתי-ישירה (Klebl וחב' ב-Int J Colorectal Dis משנת 2004) לאבחון מחלת קרוהן, רגישות השיטה היא 41-61% לגבי IgA, ו-41-75% לגבי IgG. לעומת זאת, אם הבדיקה מתבצעת במשולב לגבי IgA ו-IgG, בשיטת אימונו-פלואורסנציה בלתי-ישירה, רגישות השיטה נעה בין 30-53%, ואילו הספציפיות שלה מאוד גבוהה, 97-98%. זאת ועוד, אם IgA ו-IgG נמדדים במשול בתוך שימוש בשיטת האימונו-פלואורסנציה יחד עם שיטת ELISA, רגישות הבדיקה אמנם יורדת מעט, ל-23-38%, אך הספציפיות מגיע ל-99-100%.

נבדקים שנמצאים חיוביים בבדיקת ASCA, הם בעלי שיעור גבוה יותר של מחלת ה-ileum והמעי הגס הימני (58%), מאשר אלה עם תוצאת ASCA שלילית (18%), על פי Zholudev וחב' ב-Am J Gastroenterol משנת 2004). באותו מחקר נקבע גם שמטופלים הנמצאים חיוביים ל-ASCA הם בשיעור גבוה יותר (36%) של ניתוח להרחקת קטע ileocecal מאשר אלה עם תוצאת ASCA שלילית. בדיקת ASCA כשלעצמה אינה יכולה לשמש לאבחון של קרוהן או של קוליטיס כיבית, או להבדיל בין 2 המחלות, שכן בחלק מחולי קרוהן מוצאים נוגדני pANCA, בעוד שבחלק מחולי קוליטיס כיבית מוצאים תוצאת ASCA חיובית.

כמו כן, הערך הקליני של של מדידת ASCA ו-pANCA בהערכת IBD מוגבל כיוון שהרגישות והספציפיות שלהן אינה גבוהה במיוחד. בערך 30-80% של אלה עם קוליטיס כיבית מכילים רמות מוגברות של נוגדני pANCA, בהשוואה ל-5-40% של חיוביים לבדיקה זו בקרב חולי קרוהן. אך מוצאים נוגדני pANCA גם בקרב אלה עם vasculitis של כלי-דם קטנים, בקרב אלה עם sclerosing cholangitis ראשונית וכן באלה עם הפטיטיס אוטו-אימונית. ניתן אף למצוא תוצאה חיובית של pANCA ב-2% מאנשים בריאים לחלוטין, וב-11% של הסובלים ממחלות לא רלוונטיות.

מעבדות Mayo Clinic בחנו רטרוספקטיבית 2,754 דגימות שהגיעו אליהן, ומצאו בתוכן מקרים מוחלטים של קרוהן או של קוליטיס כיבית רק ב-18% מהנבדקים (פרסום של Mayo מספטמבר 2006, כרך 31). מוסד רפואי זה פרסם הנחיות לגבי בחינה של IBD, וקבע שבדיקות סרולוגיות אינן מומלצות בתרחישים הבאים:

• בדיקת סקר של נבדקים ללא תסמינים ספציפיים של מערכת העיכול
• בחינה של נבדקים עם חשד חזק של IBD
• הבדלה בין קרוהן וקוליטיס כיבית בנבדקים שלא עברו עדיין בדיקות אבחון סטנדרטיות
• קביעת חומרת המחלה בנבדקים עם אבחון של IBD
• ניטור של יעילות הטיפול הספציפי במחלה

מיון של פנוטיפים קליניים

מחלת המעי הדק, פנוטיפ של היצרות המעי, פנוטיפ מהסוג החודרני, והצורך בהתערבות ניתוחית של המעי הדק, שכיחים בקרב נבדקים עם תוצאת ASCA חיובית: הפנוטיפ החודרני שכיח בין אלה החיוביים ל-anti-OmpC; ואילו אלה עם מחלת מעי דק מהסוג החודרני או זה עם היצרות, שכיחים בקרב אלה החיוביים ל-anti-Cbir1; ואילו אלה עם פנוטיפ של היצרות המעי הדק הנדרשים להתערבות ניתוחית שכיחים בקרב אלה החיוביים ל-anti-I2. יתרה מכך, אלה מהנבדקים החיוביים לכל שלושת הבדיקות (ASCA anti-OmpC ו-anti-I2) הם בסבירות הגבוהה ביותר לפרוצדורה כירורגית (OR=8.6, ו-p<0.001) על פי Forcione וחב' ב-Gut משנת 2004, ו-Mow וחב' ב-Gastroenterology משנת 2004. תוצאות דומות התקבלו במחקר רב-מוסדי פרוספקטיבי של ילדים עם קרוהן, בו בחנו את כל ארבעת הנוגדנים: ASCA, ו-anti-OmpC, כמו גם Cbir1 ו-anti-I2 (על פי Dubinsky וחב' ב-Am J Gastroenterol משנת 2006). הצורך בניתוח מוקדם והתרחשות סיבוכים שלאחר הניתוח כגון ileal pauchitis נמצאו באלה עם קוליטיס כיבית חיוביים ל-pANCA על פי Kuisma וחב' ב-Scand J Gastroenterol משנת 2004 ו-Gupta וחב' ב-Gastroenterology משנת 2006).

ASCA: האם הוא סמן גנטי, מנבא של מחלה, או סמן של תגובה לאנטיגן סביבתי (על פי Seibold)

נבדקים שאינם לוקים במחלת קרוהן או בקוליטיס כיבית אינם מפתחים בדרך כלל ASCA אוpANCA, בעוד ששאלה עם -‏ASCA+/pANCA מנבאים CD ב-80% מבין הנבדקים עם קוליטיס לא-מוגדרת, ואילו מקרים של +‏ASCA−/pANCA מנבאים קוליטיס כיבית ב-64% מהמקרים (Joossens וחב' ב-Gastroenterology משנת 2002). היצירה של 2 הנוגדנים האמורים אינה ברורה. מספר מחקרים הראו שהטיטר של 2 הנוגדנים אינו נמצא במתאם עם דרגת המחלה, והוא נותר יציב לאורך פרקי זמן ממושכים. pANCA וגם ASCA בקוליטיס כיבית נותרים בעינם אפילו לאחר 20 שנה לאחר colectomy (Seibold וחב' ב-Gut משנת 1992). הועלתה השאלה האם pANCA ו-ASCA מייצגים סמנים גנטיים של רגישות ל-IBD. מספר מחקרים בקרב משפחות התייחסו לשאלה זו, ונמצא ש-16-30% מבין בני-משפחה בריאים מדרגה ראשונה של חולים עם קוליטיס כיבית היו חיוביים ל-pANCA (Shanahan וחב' ב-gastroenterology משנת 1992, ו-Seibold וחב' ב-Gastroenterology משנת 1994). נראה אם כן ש-pANCA יכול לשמש סמן גנטי (Lee וחב' באותו כתב עת משנת 1995). בהשוואה לנתונים של pANCA, מספר מחקרים הראו ש-ASCA התגלו ב-20-25% של קרובי משפחה בריאים מדרגה ראשונה של אלה עם מחלת קרוהן (Sendid וחב' ב- וחב' ב-Am J Gastroenterol משנת 1998, ו-Seibold ב-Scand J Gastroenterol משנת 2001).

כיוון שבני-זוג של אלה עם קוליטיס כיבית או עם מחלת קרוהן נמצאו שליליים ל-2 סוגי נוגדנים אלה, נראה שמדובר בגורמים גנטיים ולא סביבתיים הקשורים למחלות אלו. השכיחות של ASCA במשפחות בהם יותר מ-2 בני משפחה לוקים במחלת קרוהן, הייתה משמעותית גבוהה יותר מאשר במשפחות בהן רק 2 בני-משפחה נמצאו לוקים במחלה, מה שמצביע על משמעות ASCA כסמן גנטי (Vermeire וחב' ב- Inflamm Bowel Dis משנת 2001). השאלה שצריכה להתעורר היא האם נוגדנים אלה מתפתחים רק כ-epiphenomenon במהלך התפתחות המחלה. מחקר שנערך בישראל על ידי Israeli וחב' ופורסם ב-Gut בשנת 2005, זיהה ASCA ב-31% מהנבדקים עוד לפני אבחון קליני של מחלת קרוהן. יתרה מכך, ההגדלה של שכיחות ASCA נצפתה במהלך הזמן, כאשר השכיחות הגבוהה ביותר תועדה כ-36 חודש לפני אבחון מחלת קרוהן. תוצאות אלה מראות שהתפתחות ASCA מתרחשת לפני או בשלבים הראשונים של מחלת קרוהן. נראה אם כן ש-ASCA לא נוצרת כסמן גנטי במהלך הילדות המוקדמת, אלא במהלך ראשית המחלה.

ASCA עשוי לשמש סמן לתגובה חיסונית לאנטיגן סביבתי בשלבי המחלה המוקדמים. במספר חולים עם מחלות אוטו-אימוניות אחרות דוגמת לופּוס או rheumatoid arthritis, הנוגדנים התגלו אף 9 שנים לפני אבחון קרוהן (Arbuckle וחב' ב-N Eng J Med משנת 2003, ו-Scofield וחב' ב-Lancet משנת 2004). האירוע הראשוני המוביל ל-IBD אינו ברור, וממצא חיובי של ASCA נמצא כרוך בחסר של לקטין-קושר-mannan, שהוא מרכיב של מערכת החיסון הטבעית (innate) (Seibold וחב' ב-Gasroenterology משנת 2004).

נוגדנים עצמיים ב-IBD

נוגדנים מיקרוביאליים: ASCA –נוגדן אנטי-glycan, מכוון כנגד mannan על דופן השמר Saccharomyces cerevisiae, הידוע גם כ-baker's yeast. העובדה שמחלת קרוהן שכיחה בקרב אופים מעניקה למחלה את השם baker's disease, והעובדה שפעילות המחלה בחולי קרוהן נחלשת בתגובה לדיאטה דלה בשמר אופים, מרמזת ש-ASCA קשורה לפתוגנזה של מחלת קרוהן. מאידך גיסא, למרות ש-mannan שהוא האנטיגן המזוהה על ידי ASCA, הוא מרכיב בדופן של מיקרואורגניזמים חיים, כולל שמר האופים, אן ודאות שהוא האימונוגן היחיד המעורב במחלת קרוהן. במחלת קרוהן זוהו שני סוגי ASCAs, IgG ו-IgA, ולמרות ש-IgA ASCA הוא בעל ספציפיות גבוהה, רגישותו אינה כה גבוהה. לכן בדרך כלל משתמשים ב-IgG ASCA כסמן (Main וחב' ב-Br Med J משנת 1988). מקרים חיוביים של IgG ASCA מוצאים ב-60-70% של חולי קרוהן, ב-10-15% של אלה עם קוליטיס כיבית, ופחות מ-5% בחולים עם non-IBD colitis (Reese וחב' ב-Am J Gastroenterol משנת 2006). ASCA גם מוגברת משמעותית ביפאנים עם מחלת קרוהן, אך הטיטר נמוך באחרונים ושיעורי המקרים החיוביים יותר מאשר בחולים מערביים עם מחלה זו, מה שמצביע על כך שהתבטאות ASCA יכולה להיות מושפעת מהרקע האתני (Hisabe וחב' ב-J Gastroenterol משנת 2003).

נוגדנים חדשים אנטי-גליקנים נוגדנים חדשים אנטי-גליקנים, כולל נוגדנים מסוג IgG כנגד laminaribioside carbohydrate (להלן ALCA), נוגדנים מסוג IgA כנגד chitobioside carbohydrate (להלן ACCA), ונוגדנים מסוג IgG כנגד mannobioside carbohydrate (להלן (AMCA, נמצאו מוגברים בנסיוב של חולי קרוהן תוך שימוש ב- GlycoChip microarrays(Dotan וחב' ב-Gastroenterology משנת 2006, ו-Seow וחב' ב-Am J Gastroenterol משנת 2009). נוגדנים אחרונים אלה בעיקר מכוונים כנגד הדופן של מיקרו-אורגניזמים כולל שמרים, אצות, וחיידקים. השיעור החיובי של ALCA ו-ACCA הוא 20-40% במחלת קרוהן, ו-10% בקוליטיס כיבית, אך שיפור באבחון של מחלת קרוהן מתקבל בשילוב של נוגדנים אחרונים אלה עם ASCA. ה-laminaribioside שהוא מרכיב של laminarin, ידוע כמסייע ליצירת ה- dectin-1-dependent cytokine בשגשוג של תאי-T ומקרופאגים, והוא מגביר את הביטוי של chitinase 3-like-1, שיש לו היכולת לקשור chitin (המכיל chitobioside), והוא מצוי גם בתאי אפיתל במעי ובלימפוציטים בסמיכות לאזורים פעילים של IBD במעי.

אנטי porin C חוץ-ממברנלי: הנוגדן הידוע כ-anti-outer-membrne porin C (להלן OmpC) הוא נוגדן כנגד חלבון של E coli חוץ- ממברנלי. הנוגדן IgA anti OmpC חיובי ב-55% מהמקרים של מחלת קרוהן, ב-5-10% מהמקרים של קוליטיס כיבית, וב-5% של מקרי non-IBD colitis, והוא אפילו חיובי ב-17-36% של מקרי קוליטיס לא-מוגדרת (Landers וחב' ב-Gastroenterology משנת 2002, Zholudev וחב' ב-Am J Gastroenterol משנת 2004, Ferrante וחב' ב-Gut משנת 2007, Joossense וחב' ב-Gut משנת 2006.

נוגדן אנטי-Cbir1 (להלן נוגדן אנטי-flagellin): נוגדן אנטי-flagellin מכוון כנגד מרכיב בשוטונים של חיידקים שוכני-מעיים במודל קוליטיס של עכבר (Lodes וחב' ב-J Clin Invest משנת 2004). Cbir1 שובט מהנסיוב של עכברים עם קוליטיס. נוגדנים מסוג IgG כנגד Cbir1 מוצאים ב-55% של מקרי קרוהן, ב-10% של קוליטיס כיבית וב-8% של מקרי non-IBD colitis (על פי Targan וחב' ב-Gastroenterology משנת 2005, ו-Sitaraman וחב' ב-Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol משנת 2005).

נוגדן אנטי-I2: נוגדן כנגד I2 מכוון כנגד מרכיב זה ב-Pseudomonas fluorescens המבודד מתאים חד-גרעיניים ברירית המעי של חולים בקרוהן. נוגדנים מסוג IgA anti I2 מופיעים ב-55% מחולי קרוהן, ב-10% של אלה עם קוליטיס כיבית, וב-20% מאלה עם non-IBD colitis. ‏I2 פעיל כ-super-antigen של תאי T.

נוגדן כנגד Mycobacterium avium paratuberculosis (להלן MAP): נוגדנים אלה בודדו מרקמת מעי ומחלב-אם של חולי קרוהן, ומשערים ש-MAP קשןר לפתוגנזה של מחלה זו (Chiodini וחב' ב-J Clin Microbiol משנת 1984). בשנת 1999 דווחו Naser וחב' ב-Clin Diagn Lab Immunol, טיטר מוגבר של נוגדנים כנגד חלבונים נושאי MAP (הידועים כ-p35 ו-p36) בנסיוב של חולי קרוהן. עם זאת, MAP בודד גם מנסיוב של אנשים בריאים, ונשאלת השאלה מה הרלוונטיות שלו למחלת קרוהן.

נוגדן אנטי-Caenorhabditis elegans: אנליזה של פפטידים קושרי HLA-DR ברירית המעי של חולים עם IBD גילתה אנטיגן המבוטא על ידי הנמטודה C elegans החיה באדמה (Oshitani וחב' ב-Int J Mol Med משנת 2003). בהמשך דווחו חוקרים אלה הגברה בטיטר של של נוגדנים כנגד C, elegans בנסיוב של חולי קרוהן ושל אלה עם קוליטיס כיבית (Oshitani וחב' ב-Clin Diagn Lab Immunol משנת 2003).

נוגדנים כנגד פפטידים:

נוגדן anti-cocktail multiple antigenic peptide: ‏Saito וחב' דווחו ב-Gut משנת 2003, על גילוי 4 פפטידים שונים, cocktail multiple antigenic peptides (להלן cocktail MAP) המגיבים עם נסיובים של חולי קרוהן בשיטת סריקה של phage library. שיעור החיוביות נמצא כ-44% בקרב חולי קרוהן, אך החיוביות הייתה נדירה בקרב אלה עם קוליטיס כיבית או באנשים בריאים.

נוגדן כנגד TCP ‏: Mitsuyama וחב' דווחו ב-Clin Exp Immunol משנת 2011 על כך שהם עשו שימוש ב-IgG מנסיוב של חולי קרוהן לסרוק ספריית T7 phage שנוצרה על ידי cDNA של חולי סרטן המעי הגס. הם בחרו פאג' שנקשר באופן ספציפי לנסיובים של חולי קרוהן, ואז קבעו את רצף חומצות האמינו של הפפטיד המבוטא. פפטיד חדש התגלה שלא היה מוכר קודם לכן בשם TCP ששימש כ-solid phase, ונמצא שבה בשעה ש-61.7% מחולי קרוהן נמצאו חיוביים ב-ELISA זו, בחולי קוליטיס כיבית רק 7.3% מהמקרים נמצאו חיוביים, ואילו במקרים של nob-IBD colitis היו 0%, במקרי סרטן המעי הגס 11.4% נמצאו חיוביים, ובאנשים בריאים 2.8% נמצאו חיוביים.