גלאנין - Galanin

הדפס

מדריך בדיקות מעבדה
גלאנין
Galanin
שמות אחרים	Gal
מעבדה	כימיה בדם
תחום	מפגעים נוירולוגיים
טווח ערכים תקין	בדם: 36-67 פיקוגרם/מ"ל.
יוצר הערך	פרופ' בן-עמי סלע

הביוכימיה של galanin

Galanin הוא נוירופפטיד עם 29 חומצת אמינו (באדם 30 חומצות אמינו) המשומר היטב בין species שונים כולל אדם וחולדה. הגן GAL המקודד ל-galanin אנושי ממוקם על כרומוזום 11q13.3, כאשר הקודמן הפפטידי של galanin מקודד על ידי עותק גני בודד מ-6 אקסונים קטנים המכסים קטע של 6 kb של ה-DNA הגנומי. הקדם-פפטיד של galanin נוצר מביקוע של prepro galanin שאורכו 123 חומצות אמינו, ומכיל signal peptide וקטע הקרוי galanin message-associated peptide או GMAP (Evans וחב' ב-Genomics משנת 1993). ל-galanin פיזור נרחב ב-CNS כמו גם במערכת העצבים ההיקפית בסוגי יונקים רבים (Kask וחב' ב-Cell Mol Neurobiol משנת 1995). במוח, galanin מסונתז ב-raphe nucleus הדורזלי, ב-locus coeruleus, במדולה הוונטרו-לטרלית, בגרעין המרכזי של העמיגדלה, בגרעין הפארא-ונטריקולרי, בגרעין ה-supraoptic, וכן נמצא galanin בחוט השדרה ובמעי. בעכברים תוכן galanin במושגים של פיקוגרם/גרם משקל רקמה נמצא בסדר של ריכוז הולך ויורד ב-ileum, תריסריון, היפותלמוס, קיבה וקליפת המוח (Melander וחב' ב-J Comp Neurol משנת 1986). ב-CNS ריכוזי galanin הגבוהים ביותר נמצאים בהיפותלמוס, עם ריכוזים פחותים ב-cortex ובגזע המוח. Galanin בהיפותלמוס נמצא בגרעין הקדם-אופטי וֶנטרו-לטראלי, בו יש לו תפקוד מעודד-שינה. בתוך המוח, נמצא galanin בקדמת המוח הוֶנטראלית ובעמיגדלה. עם זאת, התגובה החיסונית של galanin במוח ממוקמת באזור היפּוֹ-תלמוֹ-היפופיזי (Chang וחב' ב-Neuroscience משנת 1985). גסטרו-אינטסטינאלי שכיח ביותר בתריסריון, עם ריכוזים מופחתים בקיבה, במעי הדק, ובמעי הגס. Galanin מבוטא גם כן בעור שם הוא מתפקד כנוגד-דלקת. באופן ספציפי, galanin נמצא בקרטינוציטים, בבלוטות הזיעה האֶקריניות, וסביב כלי-דם עוריים. Galanin מופיע גם בגידולים אנדוקריניים, כאשר בתוך תאים סרטניים בקיבה יש ל-galanin תפקיד של דיכוי התהליך הסרטני. אם כי היפר-מתילציה נמצאה מפסיקה את הפעילות מדכאת הסרטן של galanin.

Galanin זוהה לראשונה בתמציות של מעי חזיר בשנת 1978 על ידי Viktor Mutt במכון Karolinska תוך שימוש בטכניקת זיהוי פפטידים על בסיס מבנה של alanine amide בקצה ה-C טרמינלי של galanin. השם galanin נובע משייר glycine בקצה ה-N טרמינלי ו-alanine בקצה ה-C טרמינלי (Hökfelt ו-Tatemoto ב- Cell Mol Life Sciמשנת 2008).

הרצף של גן זה משומר באופן בולט בקרב יונקים, עם הומולוגיה של 85 אחוזים ברצפים של חולדה, עכבר, חזיר, בקר, ואדם, כאשר ב-species אלה, 15 חומצות האמינו הראשונות בקצה ה-N טרמינלי זהות לחלוטין, אך בעמדות 16 ומעלה קיימים מספר הבדלים בזהות חומצות האמינו, הבדלים שיש להם משמעות תפקודית. לדוגמה, galanin של חזיר וחולדה מעכבים הפרשת אינסולין המושרית על ידי ריכוז גלוקוזה בדם, אך אין לו השפעה על הפרשת אינסולין באדם (Bersani וחב' ב-FEBS Lett משנת 1991). המבנה של galanin נקבע בשנת 1983, וה-cDNA של galanin שובט מספריה של קדמת ההיפופיזה של חולדה בשנת 1987 (Wynick וחב' ב-Curr Opin Pharmacol משנת 2001). משפחת חלבוני galanin מכילה פרט לחלבון זה גם את galanin message-associated protein או GMAP, שהוא פפטיד בעל 59 או 60 חומצות אמינו הנוצר אף הוא מביקוע של prepro galanin, את galanin-like peptide או GALP, ואת alarin, כאשר שלושת הפפטידים האחרונים זוהו רק לאחרונה, ושני הפפטידים האחרונים מקודדים על ידי הגן prepro GALP. הפפטידים GALP ו-alarin נוצרים על ידי post-transcriptional splicing שונים של הגן prepro GALP (על פי Lang וחב' ב-Pharmacol Ther משנת 2007).

מאפיינים קליניים של galanin

מספר מחקרים מצביעים על כך ש-galanin כרוך בפונקציות אחדות הקשורות למטבוליזם, הפרשות אנדוקריניות, תנועתיות המעי, תחושת כאב, קוגניציה, התנהגות תזונתית, הפרשת הורמונים (דוגמת אינסולין), רגנרציה עצבית, זיכרון, הפרשה מבלוטות נוירו-אנדוקריניות, הפרשות מעי, התכווצות שרירים והתמכרות (Lundkvist וחב' ב-Neurosci Lett משנת Kakuyama ,1995 וחב' ב-Eur J Pharmacol משנת 1997, Smith וחב' ב-J Biol Chem משנת 1998, ו-Lang וחב' ב-Pharmacol Ther משנת 2007).

• תיאבון - הזרקה של galanin לתוך חדרי המוח הלטרליים, או ישירות לתוך ההיפותלמוס, יצרה כמיהה גדולה לאכילה, עם העדפה של צריכת מזון שומני (Mitsukawa וחב' ב-Experientia Supple משנת 2010). בנוסף, galanin מווסת את המטבוליזם של גלוקוזה, ועשוי להקל על תסמינים של סוכרת type 2, בגין האינטראקציה שלו עם העמידות לאינסולין (Fang וחב' ב-Front Neuroendocrinol משנת 2020). כאמור, galanin מעכב גם הפרשת אינסולין מהלבלב
• התמכרויות - Galanin משחק תפקיד בוויסות של התמכרות. הוא כרוך בחזרה לצריכת אלכוהול לאחר תקופת גמילה, ובנוסף להתמכרות לאלכוהול, galanin כרוך גם בהתמכרות לניקוטין ולאופיאטים (Genders וחב' ב-Neurosci Behav Rev משנת 2020)
• מחלת אלצהיימר - אחד המאפיינים הפתולוגיים של המוח בשלבים מתקדמים של מחלת אלצהיימר, היא הנוכחות של סיבים מוגדלים המכילים galanin המְעצְבֵּבים נוירונים כולינרגיים (Counts וחב' ב-Cell Mol Life Sci משנת 2015). מאפיין נוסף היא ההגברה בביטוי של galanin ושל הקולטנים שלו, המגיעה עד 200 אחוזים מהביטוי התקין שלו, כפי שנמצא במוחות שלאחר המוות בחולי אלצהיימר. עם זאת, הסיבה והתפקיד של הגברה זו בביטוי galanin וקולטניו אינם ברורים (Counts וחב' ב-Mol Interv משנת 2003). הועלתה השערה שהנתונים האחרונים מעודדים את מותם של הנוירונים, וכן שההשפעה של galanin על נוירונים כולינרגיים מחמירה את הניוון של התפקוד הקוגניטיבי של מטופלים על ידי הפחתת הכמות של אצטילכולין הזמין לנוירונים אלה. השערה שנייה המבוססת על נתונים מניחה ש-galanin קשור להגנה על ההיפוקמפוס מנזק ציטוטוקסי, והגנה על נוירונים בקדמת המוח הבזאלית כולינרגית מהטוקסיות של עמילואיד (Ding וחב' ב-Neurobiol Dis משנת 2006)
• ביצועים קוגניטיביים - ל-galanin השפעה על קוגניציה באופן שהוא מחליש את כושר הלימוד והקוגניציה
• אפילפסיה - Galanin בהיפוקמפוס הוא מעכב של glutamate אך לא של GABA, דהיינו galanin מסוגל להגדיל את הסף של פרכוסים ולכן הוא פועל כ-anticonvulsant. על מנת להיות יותר ספציפיים, נראה שהקולטן GalR1 נכרך עם הדיכוי של פרכוסים ספונטניים (Mazarati וחב' ב-Neuroscience משנת 2004, ו-Zhang וחב' ב-J Med Chem משנת 2009). תכשיר אגוניסטי אנטי-אפילפטי בעל פוטנציאל הוא NAX 5055 (על פי Bulaj וחב' ב-J Med Chem משנת 2008, ו-White וחב' ב-Neurotherapeutics משנת 2009)
• מעורבות galanin בהתפתחות - נמצא ש-galanin משחק תפקיד בבקרה של ההתפתחות העצבית המוקדמת לאחר הלידה של ה- dorsal root ganglion (להלן DRG) (הידוע גם כ-posterior root ganglion, שהוא צבר הנוירונים בשורש הדורזלי של עצב השדרה). בחיות עם מוטציה מושרית ב-galanin, יש ירידה של 13 אחוזים במספר תאי DRG בחיות בוגרות, כמו גם ירידה של 24 אחוזים בתאים המבטאים substance P. נתון זה מצביע על כך שאובדן תאים בתהליך אפופטוזיס המתרחש בדרך כלל בהתפתחות DRG, מווסת על ידי galanin, ועל כך שבחסר galanin גדל מספר התאים המתים
• Galanin כאב והגנה עצבית - Galanin משחק תפקיד משמעותי בעיבוד של תחושת כאב, כאשר ריכוזים גבוהים שלו נמצאו מפחיתים כאב (Hobson וחב' ב-Experien Supple משנת 2010). כאשר מוסיפים galanin לחוט השדרה, פוחת הכאב הנוירופתי (Xu וחב' באותו כתב-עת מאותה שנה). בדומה, galanin כנראה אפקטיבי בהפחתת מרוגשות-יתר ספינלית. נוירונים תחושתיים משחררים באופן הולך וגובר galanin כאשר הם ניזוקים, ועלייה ברמת galanin נובעת מסיבות של הגנה נוירונית והיא מסייעת לנוירוגנזה. השפעול של הקולטן GalR2 מתווך בתפקיד של ההישרדות שיש ל-galanin ב-dorsal root ganglion

Galanin ו-דיכאון

סרוטונין ונוראדרנלין הם שני נוירו-טרנסמיטורים המעורבים בהופעת דיכאון, ושניהם מבוטאים במקביל ל-galanin הקשור למודולציה שלהם, מה שמצביע על תפקידו של galanin בדיכאון (Kuteeva וחב' ב-Experien Supple משנת 2010). גירוי של הקולטנים GalR1 ו-GalR3, גורמת להתנהגות דמוית-דיכאון, בעוד שגירוי של הקולטן GalR2, מפחית את ההתנהגות דמוית הדיכאון. אחד המנגנונים הפוטנציאליים לממצאים אלה מיוחס לסטימולציה על ידי galanin של הציר היפותלמוס-היפופיזה-אדרנל, מה שמגביר את ההפרשה של גלוקו-קורטיקואידים, ואמנם ידוע שרמות מוגברות של גלוקו-קורטיקואידים שכיחות באנשים דיכאוניים. הפתו-פיזיולוגיה של דיכאון אינה ברורה, אך מצטברות ראיות לכך שקיימות הפרעות בהעברה מוֹנוֹ-אמינרגית (היפותזת ה-monoamine) במוח (Liu ו-Simon ב-Nature משנת 1996). זמינות תרופות לטיפול בדיכאון חמור על ידי הגברת הריכוז של מונואמינים, בעיקר סרוטונין ונור-אפינפרין. לדוגמה, SSRIs נמצאים בשימוש נרחב לטיפול בדיכאון, על ידי הגברת הריכוז של מונואמין וסרוטונין במרווח הסינפטי (Tatemoto וחב' ב-FEBS Lett משנת 1983). בנוסף לדעה שחסר בתפקוד של מונואמינים או בריכוזם גורם לדיכאון, יש ראיות לכך שגורמים נוירוטרופיים ואנדוקריניים משחקים אף הם תפקיד מרכזי בדיכאון (ההיפותזה הנוירוטרופית) (Katzung ב-Basic Clin Pharmacol משנת 2012). למרות שמספר תכשירים קיימים ומאוד בררניים מפגינים יעילות, מגוון של תכשירים חדשים ויעילים יותר כבר נראים באופק (Millan ב-Pharmacol Ther משנת 2006). נוירופפטידים והקולטנים שלהם, השייכים למשפחת הנוירו-טרנסמיטורים במוח, ניצבים בקדמת רשימת תכשירים אלה (Maes וחב' ב-Inflammopharmacol משנת 2012, ו-Trivedi וחב' ב-Am J Psychiatr משנת 2006). בהקשר זה galanin נמצא בשלב של ניסויים קדם-קליניים. ידוע ש-galanin בהתקשרותו לשלושת הקולטנים שלו, GalR1-3, נוטל חלק במספר תהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים, כאשר דיכאון הוא אחד מהתחומים בהם הוא כרוך (Diaz-Cabiale וחב' ב-Galanin Basel Springer Ed משנת 2010, Diaz-Cabiale וחב' ב-Neuropharmacol משנת 2011, Millon וחב' ב-J Neuropsycopharmacol משנת 2015, ו-Weiss וחב' ב-Ann N.Y. Acad Sci משנת 1998).

בדיכאון, נוירופפטידים פועלים כמודולטורים של הפרשת נוירוטרנסמיטורים מה-locus coeruleus (על פי Bai וחב' ב-Biochem Biophys Res Commun משנת 2018), ומה-raphe nucleus (על פי Morais וחב' ב-Behav Brain Res משנת 2016, ו-Razani וחב' ב-Neuroreport משנת 2000), זאת על ידי העברת סיגנלים דרך הקולטנים של galanin (על פי Lang וחב' ב-Pharmacol Rev משנת 2015). המעורבות של GalR1 נחקרה במודל דיכאון של חולדה המבוסס על השריית עקה של דיכאון כרוני. הפעילות של galanin ברמת הקולטן GalR1 באזור האפור של ה-ventral aqueductal הייתה כרוכה בהתנהגות דמויית-דיכאון, מה שמייצג יעד חדש לתרפיה אנטי-דיכאונית (Wang וחב' ב-Proc Natl Acad Sci USA משנת 2016). ההשפעה מקדמת הדיכאון של GalR1 מיוחסת ליכולת קולטן זה להשתתף במודולציה של איתות על ידי -hydroxytryptamine-1-A5- (להלן -HT1AR5). האינטראקציה של הקולטנים של galanin עם הקולטנים של 5-HT1A נמצאה ב-paraventricular thalamic nucleus, ב-zona incerta, בהיפותלמוס המדיאלי והלטראלי, ובאזור העמיגדלה המדיאלי והלטראלי (Hedlund וחב' ב-Brain Res משנת 1991).

אך לא רק galanin, אלא גם המקטע ה-N טרמינלי שלו המכיל 15 חומצות אמינו (Gal1-15) פעיל בהשגת הפעילות הדיכאונית שלו (Jackowski וחב' ב-J Cereb Blood Flow Metab משנת 1989, ו-Millón וחב' ב-Neuropeptides משנת 2017). האינטראקציה של Gal1-15 עם הדימר של 2 הקולטנים, GalR1-GalR2, גורמת להתנהגות דיכאונית ודאגנית (anxiogenic) גדולה יותר מזו המושגת על ידי אינטראקציה של מולקולת galanin השלימה (Borroto-Escuela וחב' ב-Biochem Biophys Res Commun משנת 2014). אינטראקציה בין GALRs לבין הקולטן של neuropeptide Y Y1 (להלן NPYY1) יכול גם כן לשחק תפקיד בפתו-פיזיולוגיה של מפגעי מצבי-רוח (Diaz-Cabiale וחב' ב-Eur J Neurosci משנת 2006, Fuxe וחב' ב-Brain Res Rev משנת 2008, ו-Branchek וחב' ב-Trends Pharmacol Sci משנת 2000). גם Narvaez וחב' אישרו שהאינטראקציה בין GalR2 ו-NPYY1R ב-dentate gyrus כרוכה בהגברת ההתנהגות האנטי-דיכאונית והאנֶקסיוֹליטית בתיווך NPY Y1R (Brain Struct Function משנת 2016, ו-Narvaez וחב' ב-Front Cell Neurosci משנת 2108). יתרה מכך, האינטראקציה בין ההטרומר GalR1-GalR2 לבין הנוירופפטיד Y Y2 (או NPYY2), עשוי להוות מנגנון מולקולרי עבור Galanin והמקטע gal1-15 שלו (Diaz-Cabiale וחב' ב-Curr Protein Pept Sci משנת 2014).

יתרה מזאת, מקטעי Gal1-15, מעודדים יצירת קומפלקסים של הטרו-קולטנים בנוירוני 5-HT ב-raphe ההיפוקמפלי ומשפיעים על הפרשת סרוטונין, כאשר מקטע Gal1-15 הוא בעל השפעה גדולה יותר מזו של galanin שלם בהשריית דיכאון. הנוכחות של הטרומרים אלה באזורי מוח שונים, מסייעת לתכנן תכשירים חדישים לטיפול בדיכאון המכוונים כנגד ההטרומר GalR1-5HT1AR (על פי Kummer ב-Neurosci Lett משנת 1987).

הקולטנים של galanin

האיתותים של galanin פועלים דרך שלושה קולטנים הקשורים ל-חלבוני-G: GALR1, GALR2 ו-GALR3 (Mitsukawa וחב' ב-Cell Mol Life Sci משנת 2008). הקולטנים של galanin מבוטאים ב-CNS, בפנקריאס ועל פני גידולים סולידיים. רמת הביטוי של שלושת הקולטנים שונה בכל אחד מהמיקומים שצוינו, והיא מושפעת מנזק הנגרם לנוירונים. מחקרים על המיקום של קולטנים אלה התבצעו בעיקר בעכברי knockout. שלושת הקולטנים מכונים גם 7TM כיוון שכל אחד מהם מכיל 7 לולאות טרנס-ממברנליות, שלוש לולאות תוך-תאיות, ושלוש לולאות חוץ-תאיות (Jurkowski וחב' ב-Mol Membr Biol משנת 2012, ו-Probst וחב' ב-DNA Cell Biol משנת 1992). למרות ששלושת הקולטנים דומים במבנה שלהם, וכן בהיותם נקשרים לחלבוני G, הם בעלי תכונות קישור שונות למולקולות אחרות, וממילא קשורים באופן ייחודי לאיתותים המשוגרים דרכם אל תוך התא. האורך של המקטעים ה-N וה-C טרמינלים שונה בשלושת הקולטנים: המקטע ה-C טרמינלי התוך-תאי מורכב מ-37 שיירים של חומצות אמינו בקולטן GalR1, מ-30 שיירים כאלה ב-GalR2 ומ-13 שיירים ב-GalR3. בדומה, המקטע החוץ-תאי ה-N טרמינלי שתפקידו חשוב בקישור הליגנדים, מכיל 47 שיירי חומצות אמינו ב-GalR1, מ-80 שיירים ב-GalR2 ומ-62 שיירים ב-GalR3.

דיאגרמה סכמטית המראה את הרצפים של חומצות האמינו של הקולטנים GalR1 (A), GalR2 (B) ו-GalR3 (C) של חולדה.
ב-A, עיגולים כחולים מבטאים שיירי חומצות אמינו הזהים לאלה ב-B; עיגולים אדומים מבטאים שיירים החסרים ב-B.
ב-B, עיגולים כחולים מבטאים שיירים זהים לאלה ב-C; עיגולים אדומים מבטאים שיירים החסרים ב-C;
ב-C, עיגולים כחולים מבטאים שיירים הזהים לאלה ב-A; עיגולים אדומים מבטאים שיירים החסרים ב-A.

GalR1 שובט לראשונה מתאי מלנומה באדם. מספר שיירי חומצות אמינו הממוקמות במקטעים הטרנס-ממברנליים הראשון והשני (זוג שיירי ציסטאין), שייר פרולין במקטע הטרנס-ממברנלי הרביעי, וכן חומצות אמינו משתנות במקטע הטרנס ממברנלי החמישי והשביעי, יוצרות כיפוף במבנה האלפא-סלילוני של החלק הטרנס-ממברנלי של הקולטן, ומשתתפות ביצירת הכִּיס (pocket) אליו נקשר הליגנד (Burbach ב-Eur J Pharmacol משנת 2009). רמה גבוהה של ביטוי של קולטני galanin נמצאה בגרעין של המסלול האולפקטורי וכן ב-olfactory bulb שהוא המבנה העצבי בקדמת המוח של בעלי חוליות הקשור לחוש הריח. כן נמצאים ריכוזים גבוהים של קולטני galanin בקליפת המוח, בגרעין העמיגדלואידי, ב-dorsal dentate gyrus ובחלקים הפנימיים-וֶנטרליים של ההיפוקמפוס, התלמוס וההיפותלמוס.

Galanin נקשר למקטע ה-N טרמינלי החוץ-תאי של GalR1 תוך יצירת שינוי מבני בקולטן. הקולטן המשופעל נקשר אז לחלבוני G, ליצירת קומפלקס שלישוני עם galanin ועם הקולטן. תהליך זה גורם לעיכוב של יצירת האנזים adenyl cyclase מה שמפחית מיצירת cAMP (על פי Wang וחב' ב-FEBS Lett משנת 1997). בנוסף, השפעול של קולטני galanin מביא לסטימולציה של מסלול האנזים mitogen activated protein kinase (להלן MAPK), שאינה תלויה ב-protein kinase C (להלן PKC). קולטן זה מווסת את פעילות תעלות אשלגן תוך מעורבות של חלבוני G.

השיבוט של הקולטן GalR2 הושג לראשונה עם תאי היפותלמוס של חולדה (Smith וחב' ב-J Biol Chem משנת 1997), והושג לאחר מכן עם תאי טחול של עכברים (Pang וחב' ב-J Neurochem משנת 1998). בשלב מאוחר יותר, שובטו הקולטנים ממגוון רקמות אדם. אפיון מולקולרי של הקולטן הצביע על 4 שיירים, His252 ו-His253, הממוקמים על הלולאה הטרנס-ממברנלית הששית, וכן Phe264 ו-Tyr271, הממוקמים בלולאה החוץ-תאית השלישית, כבעלי משמעות רבה באינטראקציות הקשורות לקישור הליגנד ולשפעול הקולטן. תפוּסָה של הקולטן על ידי אגוניסט, גורמת לשפעול של אֶפֶקטור כדוגמת פוספוליפאז C, וכך phosphatidylinositol 4,5 -biphosphate מותמר ל-diacylglycerol ול-inositol triphosphate (להלן IP3). אחד מתפקידיו של IP3 הוא במטבוליזם של סידן, על ידי יצירה של קומפלקס calcium-calmodulin, דרכו מתרחש שפעול של מצעים נוספים. לעומת זאת, diacylglycerol הממוקם בממברנת התא מקטלז את השפעול של PKC (על פי Pan וחב' ב-J Cell Physiol משנת 2005). באופן מובהק, הרמות הגבוהות ביותר של ביטוי GalR2 mRNA נמצאו ב-dorsal root ganglia, בהיפוקמפוס, בהיפותלמוס ובקליפת המוחון. GalR2 מתווך גם בעיכוב מתון של יצירת mRNA.

GalR3 בודד לראשונה מספריות DNA של ההיפותלמוס של חולדות (Wang וחב' ב-Biochemistry משנת 1998). הקולטן GalR3 מחולדה מכיל 370 חומצות אמינו, עם דמיון של 52-54% לקולטן GalR2, ודמיון של 35-36% לקולטן GalR1. הקולטן GalR3 של אדם, מכיל 368 חומצות אמינו, ויש לו 90% של הומולוגיה של רצף חומצות האמינו של GalR3 מחולדה. GalR3 מבוטא בעיקר בגרעינים הקדם-אופטיים המדיאנים, הוונטרו-מדיאנים והוונטרו-לטראלים, כן במוח המוארך (medulla oblongata) (על פי Kolakowski וחב' ב-J Neurochem משנת 2002).

הוראות לביצוע הבדיקה

דם ורידי נלקח בצום ביקור הראשון לאחר האבחון לקביעת רמות שלgalanin , אינסולין, IL-6 ו-.HbA1C הדם נלקח בתנאי קירור במבחנת ספירת-דם (EDTA, פקק בצבע סגלגל) המכילה את מעכב הפרוטאזות aprotinin, וסרכוז מיידי תוך 30 דקות מנטילת הדם למשך 15 דקות במהירות 1,000g ב-°C 4. הפלזמה המופרדת הועברה למבחנות פלסטיק שהוקפאו בטמפרטורה של -80 °C עד לביצוע המדידה. הכימות של galanin נעשה בשיטת ELISA.