אנטיגן p24 antigen - p24

הדפס

מדריך בדיקות מעבדה
בדיקת האנטיגן p24
p24 antigen
מעבדה	כימיה בדם ואימונולוגיה בדם
תחום	זיהוי של HIV
יוצר הערך	פרופ' בן-עמי סלע

לערכים נוספים הקשורים לנושא זה, ראו את דף הפירושים – HIV

בסוף שנת 2016 חיו בעולם 36.7 מיליון איש ואישה נשאי הנגיף HIV, כאשר 30% מתוכם אף לא היו ערים לעובדה שהם נשאים. מאז תחילת מגיפת AIDS בתחילת שנות ה-80, מתו בעולם 35.4 מיליון אנשים. בארה"ב בסוף שנת 2015, העריך ה-CDC ש-1.1 מיליון אמריקאים בני 13 שנה ומעלה היו נשאי הנגיף, מתוכם 15% לא ידעו על כך. באותה שנה התווספו בארה"ב 39,000 מקרי נשאות חדשים, מה שהצביע על דעיכה שנתית של 5% משנת 2011 ואילך. הדבקה בנגיף היא הגבוהה ביותר בקרב גברים שחורים הומוסקסואליים, והמספרים הולכים ויורדים דרך גברים היספנים ולבנים הומוסקסואליים, נשים שחורות במגעים הטרוסקסואליים, גברים שחורים במגעים הטרוסקסואליים, ונשים היספניות ולבנות במגעים הטרוסקסואליים.

לקוח מנתוני ה-CDC משנת 2018

זיהוי מוקדם של נשאות הוא בעל חשיבות עליונה במניעת הדבקות נוספות, ומאפשר תחילת טיפול מוקדם ככל האפשר. אכן, אלה מבין הנשאים שהתוודעו למצבם, נקטו באמצעים של ריסון עצמי וקטיעת שרשרת ההדבקה (Cleary וחב' ב-Am J Pub Health משנת 1991, ו-Fox וחב' ב-AIDS משנת 1987).

ה-virion והגנום של HIV

HIV-1 הוא חבר במשפחת Retroviridae. זה נגיף מעטפתי עם 2 עותקים של RNA חד-גדילי, שיכולים לעבור ריקומבינציה. הגנום מכיל שלושה גנים עיקריים המקודדים לחלבונים המבניים, pol, gag ו-env (על פי Muesing וחב' ב-Nature משנת 1985, ו-Gallo וחב' באותו כתב עת משנת 1988). הגן gag מקודד לחלבונים p17, p24 ו-p7 בין השאר. הגן env מקודד לגליקופרוטאינים gp120 ו-gp41. הגן pol מקודד לאנזימים reverse transcriptase, ל-integrase ול-protease. נגיף HIV מכיל גם גנים רגולטוריים, tat ו-rev, וכן גנים המקודדים לחלבוני עזר (vif ,vpr ,vpu ו-nef) החשובים לתהליך הרפליקציה של הנגיף ולאינטראקציה שלו עם הפונדקאי. הנגיף HIV-2 הוא בעל אותם גנים פרט להיעדר הגן vpu. הנגיף HIV מתחלק למספר קבוצות בהתבסס על אנליזה פילוגנטית (Simon וחב' ב-Nat Med משנת 1998): קבוצה מרכזית (M), קבוצה צידית (O), קבוצה N שאינה מרכזית או צידית, זוהתה בגורילות גם קבוצה P (על פי Plantier וחב' ב-Nat Med משנת 2009, ו-Robertson וחב' ב-Science משנת 2000). קבוצה M מורכבת ממספר clades ( קבוצות טקסונומיות שכוללות את כל צאצאיו של אב קדמון משותף): J ,H ,G ,F ,D ,C ,B ,A ו-K וממספר צורות ריקומביננטיות בצירקולציה. Clade B הוא השכיח ביותר בארה"ב. למרות שקיימים הבדלים בצורת ההדבקה, בהתקדמות המחלה, ובתגובה לתרפיה אנטי-נגיפית, ולהופעת עמידות לתרפיה בין הקבוצות השונות של HIV (על פי Parkin ו-Schapiro ב-Antivir Ther משנת 2004, Taylor וחב' ב-N Eng J Med משנת 2008, ו-Scherrer וחב' ב-Clin Infect Dis משנת 2011), ניתן לגלות בשיטות immunoassay עדכניות תת-סוגים non-B של HIV (על פי Koch וחב' ב-J Clin Microbiol משנת 2001).

ההיסטוריה של אמצעים אבחוניים לזיהוי HIV

הבדיקה המאושרת הראשונה על ידי ה-FDA לזיהוי HIV, הייתה בדיקת ELISA משנת 1985, שלוותה על ידי התפתחות מהירה של בדיקות אימונו-פלואורסצנטיות (Hedenskog וחב' ב-J Med Virol משנת 1986), בדיקות צימות (אגלוטינציה) ובדיקות dot blot (על פי Spielberg וחב' ב-Lancet משנת 1989, ו-Starkey וחב' ב-J Clin Microbiol משנת 1990). חלק מהבדיקות המוקדמות, (HIVCHEK של חברת Du Pont de Nemours על פי Josefsen ו-Myrmel ב-APMIS משנת 1989) ו-Single Use Diagnostoc System של חברת Murex (על פי Li וחב' ב-J Forensic Sci משנת 1993), יכלו להתבצע תוך 5-20 דקות, אם כי התוצאות דרשו אינטרפרטציה מיומנת. בנובמבר 2002 אישרה ה-FDA את בדיקת OraQuick Rapid HIV-1/2 Antibody Test, ובינואר 2003 אושרה בדיקה זו לביצוע גם במסגרת סביבה לא-קלינית. הזיהוי של נוגדנים anti-HIV בדם הנבדק במסגרת של point-of-care נמצא בדרך כלל בעל ספציפיות טובה (Nath וחב' ב-J Clin Microbiol משנת 1987), והוא אף נמצא מדויק, אמין ובעל עלות-יעילות בהשוואה לבדיקות שבוצעו במעבדה קלינית (Sato וחב' ב-Bulletin WHO משנת 1994, ו-Drain וחב' ב-Lancet Infectious Diseases משנת 2014). אך בדיקה זו אינה מסוגלת לאבחן באופן מדויק HIV בעוללים שחלק מהנוגדנים בדמה של האם עדיין בדמם, או במקרים ספורדיים של נוגדנים א-טיפיים (Jindai וחב' ב-Am J Emerg Med משנת 2014, Brown וחב' ב-Ann Intern Med משנת 2008, Chin וחב' ב-J Clin Microbiol משנת 2007, Mathews וחב' ב-J Med Microbiol משנת 2016, ו-Lang וחב' ב-J Clin Virol משנת 2017).

מדידת CD4 יכולה להיות בדיקה מלווה לקביעת הסטאטוס החיסוני של הנבדק, ואת הפנוטיפ העמיד לתרופות של הנגיף, באופן שיאפשר בחירה של טיפול נאות. בדיקות אמפליפיקציה של חומצות גרעין, ראויות אף הן, פותחו באופן המתאים ל-point-of-care (על פי Shafiee וחב' ב-Ann Rev Med משנת 2015, ו-Mauk וחב' ב-Lab on a Chip משנת 2017). הנחיות עדכניות ממליצות על בדיקת נוגדן-אנטיגן של "הדור הרביעי", (המזהות את p24 ואת תגובת הנוגדן לנגיף), כשיטות המועדפות לזיהוי HIV (על פי Alexander ב-Clin Vaccine Immunol משנת 2016, כיוון ששיטות אלו יכולות לצמצם את פרק הזמן בין ההדבקה לזיהוי הנגיף, שהוא פרק זמן הקצר ב-1-2 שבועות מזה נדרש לזיהויו בשיטת "הדור השלישי" הרגישה ביותר (ממצאי British HIV Association משנת 2018).

הקינטיקה של סמנים בעת הדבקה עם HIV ופרקי הזמן הנדרשים זיהוי הנגיף על ידי בדיקות מדורות שונים. NAAT-nucleic acid amplification test; EIE-Enzyme immunoassay. (על פי Liao וחב' ב-J Exp Med משנת 2011, Tomaras ו-Haynes ב-Curr Opin in HIV & AIDS משנת 2009, Binley וחב' ב-J Virol משנת 1997, Yates וחב' ב-Mucosal Immunol משנת 2013, Cohen וחב' ב-N Eng J Med משנת 2011, Delaney וחב' ב-Clin Infect Dis משנת 2017).

בדיקות "דור רביעי" מופיעות ברשימת בדיקות in vitro ש-WHO מתייחס אליהן כחיוניות כבדיקות reference במעבדות בהנחיותיו מ-2018. למרות ש-Meier גילה ראיות לחלון אבחוני שני, בו אין די נוגדן לזיהוי p24 (על פי Meier וחב' ב-J Clin Virol משנת 2001), תופעה זו לא התגלתה במערכות עדכניות יותר המסוגלות לזהות IgM (על פי Speers וחב' ב-J Clin Microbiol משנת 2005, George וחב' באותו כתב עת משנת 2014, ו-Vallefuoco וחב' ב-Exp Rev Mol Diagn משנת 2016).

למרות שנוגדנים שלטו בשוק של אבחון מהיר בתנאי point-of-care, החלבון p24 הוכר כסמן נגיפי חלופי בעיקר בניסיונות המוקדמים להקטין את חלון הזמן הנדרש לזיהוי HIV (על פי George וחב' ב-J Clin Microbiol משנת 2007, ו-von Sydow וחב' ב-Br Med J משנת 1988). חלבון קפסידי מפולמר היוצר קליפה מגוננת סביב ה-RNA הנגיפי, פוענחה על ידי Zhao וחב' ב-Nature משנת 2013. זהו חלבון בעל משקל מולקולרי של 24-25 קילו-דלטון, המקודד על ידי הגן gag (על פי Coffin וחב' ב-Cold Spring Harbor Lab Press משנת 1999), הנמצא בריכוז גבוה ב-virion של הנגיף.

ההבטחה של זיהוי מוקדם בתנאי point-of-care או אף בדיקה עצמית

הדבקה חריפה של HIV מוגדרת כפרק הזמן כאשר הנגיף מצוי בגוף, אך תגובת נוגדנים כנגד הנגיף עדיין לא הופיעה. הדבקה סמוכה של HIV מכסה את פרק הזמן בו התגובה החיסונית בתחילתה, באופן שרק שיטה אבחונית מאוד רגישה עשויה לזהות את התגובה החיסונית (Rosenberg וחב' ב-Curr Opin in HIV & AIDS משנת 2015, ו-Cohen וחב' ב-J Infect Dis משנת 2010). בעוללים ותינוקות מתחת גיל 18 חודש, פרק זמן מוקדם של זיהוי יכול להימשך עד לפינוי מוחלט של הנוגדנים שמקורם באם (Rakusan וחב' ב-J Acquir Immun Defic Syndr משנת 1991, ו-Chantry וחב' ב-Pediatr Infect Dis J משנת 1995). במבוגרים הדבקה מוקדמת נמשכת בדרך כלל בין 2-6 חודשים, ולשם זיהויה מומלצות בדיקות "דור רביעי" לגילוי האנטיגן או הנוגדן (Fiebig וחב' ב-AIDS משנת 2003). בשלב של Fiebig stage I, השלב המוקדם ביותר של הדבקה חריפה בנגיף, ה-RNA של HIV הוא הסמן הנגיפי היחיד שניתן לגילוי, ולכן רק שיטת אמפליפיקציה של RNA יכולה לשמש לזיהוי נוכחות הנגיף, אם כי במדינות אחדות בדיקת PCR אינה מאושרת כבדיקה איכותית לזיהוי הנגיף (Pierce וחב' ב-J Clin Microbiol משנת 2011).

p24 הוא רכיב בקפסיד של HIV. ישנן בערך 2,000 מולקולות p24 לכל חלקיק נגיפי, או בערך 104 חלקיקי נגיף לכל פיקוגרם של p24. תחילת התסמינים של AIDS, נמצאת במתאם עם הדעיכה במספרם של תאי CD4 לפחות מ-450 תאים/ממ"ק.

סיכום של יתרונות פוטנציאליים של מדידת p24 בקבוצות אוכלוסייה שונות

• תינוקות מתחת לגיל 18 חודש - בערך 1.5 מיליון תינוקות נולדו לנשים עם HIV (על פי דו"ח של UNAIDS משנת 2014), ומחציתם נפטרים מתחת גיל שנתיים ללא טיפול (Prendergast וחב' ב-Arch Dis in Childhood משנת 2015 ו-Newell וחב' ב-Lancet משנת 2004). המגבלה היא שנוגדנים המועברים מהאם משבשים את היכולת לזהות נוגדנים של תינוקות מתחת לגיל 18 חודש (Kenny וחב' ב-AIDS משנת 2012, ו-Palasanthiran וחב' ב-J Infect Dis משנת 1994). גם התחלה מוקדמת של תרפיה בתינוקות יכולה לגרום לתגובת נוגדנים שאינה ניתנת לזיהוי (Kuhn וחב' ב-AIDS משנת 2015). התועלת של אבחון מוקדם בתינוקות (להלן EID) עשוי להביא לתחילת טיפול בגיל מוקדם ככל האפשר (Ciaranello וחב' ב-BMC Med משנת 2011, ו-Payne וחב' ב-Lancet Infect Dis משנת 2015). חלופות עדכניות כוללות מדידת RNA נגיפי או אנטיגן p24 , אך הרגישות של שיטת טיפות הדם המיובש מוגבלת בשל נפח הדם הנמוך (Fajardo וחב' ב-J Clin Microbiol משנת 2014, Hamers וחב' ב-Antivir Ther משנת 2009, Bertagnolio וחב' ב-AIDS Rev משנת 2010, ו-Kivuyo וחב' ב-Int J STD AIDS משנת 2011).
• מבוגרים עם הדבקה חריפה (בשלב שלפני seroconversion - בשלב זה נשאי הנגיף מדביקים ביותר (Pilcher וחב' ב-J Infect Dis משנת 2004, Wawer וחב' באותו כתב עת משנת 2005, ו-Rutstein וחב' ב-J Int AIDS Soc משנת 2017). בקבוצה זו התחלה מוקדמת של טיפול יכולה לגרום ל-seroconversion או לאי זיהוי התגובה החיסונית (Hare וחב' ב-Clin Infect Dis משנת 2006, Killian וחב' ב-AIDS Res Hum Retroviruses משנת 2006, ו-Stefic וחב' ב-J Infect Dis משנת 2018). חיוני בקבוצה זו זיהוי מוקדם של הנוגדנים לפני seroconversion
• מבוגרים בדרגת סיכון גבוהה - ההמלצה לבדיקה חד שנתית עלולה לא להיות מספקת (Witzel וחב' ב-PLos One משנת 2016, Katz וחב' ב-Sex Transmitted Dis משנת 2014, ו-Clifton וחב' ב-AIDS משנת 2016). הבעייה היא שרק מספר זעום של אנשים מקבוצה זו מגיעים למעבדות להיבדק (Peters וחב' ב-JAMA משנת 2016)
• מבוגרים המבצעים בדיקה עצמית - האישור לערכות בדיקה עצמית ניתנו רק לאחרונה, והשפעת מהלך זה על האפידמיולוגיה של AIDS עדיין לא ברור (Choko וחב' ב-PLos Med משנת 2015, Sorensen וחב' ב-PLos One משנת 2012). הערכות לשימוש עצמי מאושרות על בסיס זיהוי נוגדנים בשלב שלאחר ה-seroconvesion (על פי Stevens וחב' ב-AIDS Behav משנת 2017)
• מבוגרים וילדים המטופלים במהלך הדבקה מוקדמת חריפה עם HIV - אחת המגבלות כתוצאה מהתחלת טיפול אנטי-נגיפי מוקדם, שהיא עלולה לגרום ל-seroconversion, או לכישלון לפתח תגובה סרולוגית חיובית (de Souza וחב' ב-Clin Infect dis משנת 2016)
• מבוגרים וילדים הנמצאים בניסויי חיסון כנגד HIV - בעייה בקבוצה זו שיש לנבדקים מהמעמד החברתי הגבוה שהם בסיכון גדול יותר לקבל תוצאות חיוביות-כזובות (false positive) כיוון שהם נוטים יותר להיכלל כמתנדבים בניסויים קליניים (Voronin וחב' ב-Vaccine משנת 2015). באחרונים, בדיקות בלעדיות לנוכחות נוגדנים כנגד HIV אינם מסוגלות להבדיל בין נוגדנים שנוצרו בעקבות החיסון, לבין נוגדנים מושרים על ידי ההדבקה ב-HIV. לכן יש צורך לבצע גם בדיקה לזיהוי מרכיב נגיפי לוודא הידבקות.

פותחו 2 טכנולוגיות מולקולריות המתאימות ל-point-of-care, הידועות כ-Alere Q HIV-1/2 ו-Cepheid Xpert HIV-1 Qual, ונוסו במספר ניסויי-שדה (Hsiao וחב' ב-PLos One משנת 2016, Murray וחב' ב-J Clin Microbiol משנת 2017, ו-Dunning וחב' ב-PLos One משנת 2017). בשעה שגובר בהתמדה מספר המבוגרים הפונים לטיפולים פרופילקטיים למניעת הדבקה ב-HIV (Streeck וחב' ב-AIDS משנת 2017, ו-Lehman וחב' ב- משנת 2015, מובנת החיוניות של בדיקות מהירות לזיהוי הנגיף בקבוצות בסיכון גבוה (Eshleman וחב' ב-J Clin Virol משנת 2018, ו-Fransen וחב' באותו כתב עת משנת 2017). היתרון המרבי של בדיקת p24 יתברר כאשר ביצוע הבדיקה ייתכן תחת תנאים של point-of-care באופן מהיר וגם בערכה לבדיקה עצמית (Mabey וחב' ב-Nat Rev Microbiol משנת 2004). האתגר העיקרי של זיהוי הנגיף ב-point of-care הוא ביכולת לזהותו בריכוזי p24 בתחום שבין 0.1 ל-1,000 פיקוגרם/מ"ל, שכן ריכוזי p24 מעל 10 פיקוגרם/מ"ל מושגים רק לפרקי זמן מאוד קצרים במהלך הדבקה חריפה (Böni וחב' ב-AIDS משנת 1997, Respess וחב' ב-J Clin Microbiol משנת 2005, ו-Paul וחב' ב-Clin Diagn Lab Immunol משנת 1997).

למרות שהבדיקות למציאת נוגדנים כנגד HIV הן המתאימות ביותר לזיהוי הדבקה בנגיף, חלופות טכנולוגיות עשויות לתרום לזיהוי מדויק, לסייע בניטור התגובה לתרפיה, ויכולות לסייע בניבוי של מהלך המחלה. בידוד הנגיף באמצעות תרבית תאים, בדיקות לזיהוי RNA נגיפי, ובדיקות לזיהוי האנטיגן p24, יכולות לשמש לזיהוי בדם של הנגיף או של מרכיבי הנגיף, ובהיותן מאוד ספציפות, תוצאות חיוביות שלהן יש בהן כדי לאשר הדבקה. הבדיקה לזיהוי האנטיגן הנגיפי, שמשה בשנת 2001 כבדיקת סריקה בדם המיועד לעירוי, בעיקר בהיותה קלה לביצוע ועם עלות-יעילות גבוהה. כאמור, בדיקת p24, מודדת חלבון של קפסיד הנגיף, והיא מתקבלת חיובית לפני קבלת תוצאה חיובית במדידת נוגדנים כנגד HIV בשלב ההדבקה המוקדם. הופעת האנטיגן P24 בדם, מתרחשת מוקדם לאחר ההדבקה, כתוצאה מהתפרצות התחלתית של רפליקציית הנגיף, והיא כרוכה עם רמה גבוהה של viremia בעת שהנדבק עלול להדביק ביותר (Darr וחב' ב-N Eng J Med משנת 1991). כאשר מופיעים הנוגדנים כנגד HIV, בדרך כלל האנטיגן p24 כבר לא ניתן לזיהוי, בעיקר כנראה כתוצאה מהקומפלקס נוגדן-אנטיגן p24 הנוצר בדם. הספציפיות של בדיקת p24 לזיהוי הדבקה ב-HIV תוך שימוש בשיטת PCR, נמצאה תוך שימוש ב-2 ערכות בדיקה של יצרנים שונים, נקבעה כ-99.9%.

בדיקת p24 עשויה להיות בעלת ערך בזיהוי מוקדם של ההדבקה ב-HIV, לצורך סריקת דם המיועד לעירוי, לאבחון הדבקה ביילודים ולניטור הטיפול האנטי-נגיפי (Lange וחב' ב-Br Med J משנת 1986, ו-Spector וחב' ב-J Infect Dis משנת 1989). מגבלה עיקרית של בדיקת p24, היא שבדיקה זו אינה רגישה דייה כאשר רמות האנטיגן בדם נמוכות ואינן ניתנות לזיהוי, והן כיוון שאנטיגן זה הוא בר-חלוף בשלבים מעט יותר מתקדמים לאחר ההדבקה (Goudsmit וחב' ב-Lancet משנת 1986). למעשה, לא ניתן לגלות את p24 ב-75% מתורמי דם שהודבקו בנגיף, אך הם שליליים סרולוגית (Gilmore ב-AIDS in the World משנת 1996). P24 מופיע בנסיוב בצורה חופשית, או קשור לנוגדן כנגדו. P24 חופשי יכול להימדד בשיטות enzyme immunoassay, בעוד שלצורך זיהוי p24 קשור יש צורך בטיפול מוקדם החומצה כדי לשחרר אנטיגן זה מהקשר שלו לנוגדן. עדיין, p24 נותר בלתי ניתן לזיהוי ברוב המודבקים הא-תסמיניים (Hammer וחב' ב-J Clin Microbiol משנת 1993).

הזיהוי של P24 ושל סמנים מוקדמים אחרים של הדבקה ב-HIV

Cohen וחב' תיארו בשנת 2010 ב-J Infect Dis שישה שלבים של המחלה: לאחר החשיפה לנגיף, נותר זה ברקמה הנחשפת ללא וירמיה, פרק זמן הידוע כ-eclipsed phase, ונמשך בממוצע 7 ימים. נכון ל-2020, אין שיטת זיהוי שגרתית זמינה לשימוש קליני, שיכולה לזהות הדבקה בשלב זה. השלב הבא היא התפתחות של viremia שניתן לזהות על ידי טכניקות הזיהוי הזמינות של חומצת הגרעין, שאחריה מופיע שלב הזיהוי של אנטיגן p24, ושלב האחרון הוא זה של גילוי נוגדנים כנגד הנגיף. הדבקה חריפה עם HIV-1 צריכה להיחשד בכל נבדק עם בדיקה סרולוגית שלילית או לא מוגדרת ותוצאה חיובית בבדיקת אמפליפיקציה של חומצת גרעין נגיפי, או בדיקה חיובית של p24. ה-FDA אישר לשימוש בדיקה איכותית הידועה כ-TMA/HPA (או transcription-mediated amplification/hybridization protection assay) לצורך של סריקה או של אישור (confirmation) של הדבקה ב-HIV-1 אך לא לצורך של שניהם באותו נבדק.

בעת הדבקה ב-HIV, הרצף של הופעת סמנים לזיהוי הדבקת הנגיף, על הסדר הכרונולוגי של הופעתם הוא כדלקמן: RNA נגיפי, אנטיגן P24, ונוגדנים כנגד HIV. בערך שבועיים לאחר ההדבקה, תהליך ה-viremia מתגבר באופן אקספוננציאלי, ולאחר מכן דועך לרמה של steady-state כאשר מערכות החיסון התאית וההומוראלית מגבילות את הרפליקציה של הנגיף. פרק זמן זה, הידוע כ"window period" הסרולוגי, מאופיין על ממצאים סרולוגיים שליליים, כאשר לעתים מגלים בו את האנטיגן הנגיפי, את תהליך ה-viremia על ידי מדידת RNA, וכן מופיעים לימפוציטים מסוג CD4. גילוי של נוגדנים ספציפיים כנגד HIV, מסמנים את סופו של ה-window period ומאבחן את הנבדק כחיובי מבחינה סרולוגית. RNA נגיפי, יכול להתגלות במהלך השבועיים הראשונים על ידי בדיקת RT-PCR מאוד רגישה. אנטיגן נגיפי למרות היותו בר-חלוף, יכול להופיע כבר שבועיים לאחר ההדבקה, והוא ניתן לגילוי למשך 5-8 חודשים (Allain וחב' ב-Lancet משנת 1986). ערכות בדיקה של הדור החדש, כולל ערכות ערכות הדור השלישי, עשויות לזהות נוגדנים לנגיף ברוב הנבדקים כבר 3-4 שבועות לאחר ההדבקה (Lackritz וחב' ב-N Eng J Med משנת 1995). מאוחר יותר בשלב ההדבקה, וההתקדמות לתחלואה ב-AIDS, עולה רמת הנוגדנים כנגד p24 (Schupbach וחב' ב-N Eng J Med משנת 1985. הדעיכה ברמת הנוגדנים כנגד p24, יצירת אנטיגן זה והופעת קומפלקסים חיסוניים קשורים בסבירות גבוהה לשינויים ברפליקציה של הנגיף (Gaudsmit וחב' ב-J Infect Dis משנת 1987), כיוון שנוגדנים כנגד מרכיבי נגיף אחרים (כגון גליקופרוטאין של מעטפת הנגיף) נותרים לאורך כל תקופת ההדבקה.

שימושים בבדיקת האנטיגן p24

בדיקת p24 מגלה את האנטיגן הזה בצורתו המומסת, אך אינה מזהה ספציפית נגיף חי. לכן, מבחן p24 חיובי אינו מאשר שהדגימה הנבדקת מדביקה, ולכן גם אינו משמש למטרה זו. הדרך היחידה הזמינה להוכיח שהדגימה הנבדקת מכילה נגיף מדביק, היא על ידי זיהוי הנגיף בתרבית תאים. תוצאה שלילית של בדיקת p24 אינה שוללת הדבקה, כיוון שבדיקה זו חסרה רגישות באיכות גבוהה, דהיינו אין להשתמש בבדיקת p24 על מנת לאמת מצב של "אי-הדבקה". בדיקת p24 מאוד שימושית לזיהוי אנטיגן זה בנוזלי תרבית תאים הלקוחה מנבדק חשוד להידבקות ב-HIV, לכן, בדיקת p24 בנוזלי תרבית רגישה בשני סדרי גודל מאשר בדיקת reversed transcriptase (על פי Chaisson וחב' ב-N Eng J Med משנת 1986). בדיקת p24 יכולה להתבצע גם בנוזלים שאינם נסיוב או נוזלי תרבית. נמצא שרבים מאלה שנדבקו בנגיף וסובלים משיטיון או מ-encephalopathy, מכילים p24 ב-CSF שלהם, כנראה בגלל רפליקציה פעילה של הנגיף ברקמה המוחית.

בדיקת p24 עשויה להיות בעלת ערך בבדיקות סריקה של דם המיועד לעירוי, כמו גם לצורך אבחון הדבקה בנגיף בדמם של יילודים. הבדיקה שמשה גם לזיהוי הדבקה מוקדמת במקרי אונס, זיהוי הדבקה מוקדמת במקרי תאונות וחשיפה תעסוקתית לנגיף, וכן לסיוע במקרים של תוצאות לא מוגדרות בבדיקות Western blot. בארה"ב הדבקות עם HIV כתוצאה מעירוי דם, מתרחשות באופן כמעט בלעדי בשלב בו התורם נמצא בהדבקה פעילה אך הוא סרונגטיבי. בשנת 1995, הוכנסה בדיקת p24 כתוספת לבדיקת זיהוי נוגדנים לנגיף בסריקות של דגימות דם המיועד לעירוי. לפני שנת 1995 ההערכה הייתה שאחת לכל 210,000-140,000 ממנות הדם המיועד לעירוי הייתה זו של תורם מודבק בנגיף המצוי ב-window period הנמשך בין 22-25 יום, אך יכול להיות אף ארוך יותר. על ידי הכללת p24 בבדיקות הסריקה של הדם, ייחסכו בארה"ב מדי שנה 4-6 מקרים של עירוי מוטעה של דם נגוע בנגיף. ל-1 מתוך 562,000 -825,000 עירויים (Dixon ב-Advanced Lab משנת 1996). בשנת 1996 התגלו בכל ארה"ב 4 מקרים של עירויי דם מודבק ב-HIV.

זיהוי הדבקה חריפה

מומחים רבים מסכימים שהדבקה חריפה עם HIV ניתנת לזיהוי לפני ה-seroconversion ברוב המקרים, הן קלינית כמו גם על ידי שיטות מעבדה (Most ו-Zangerle ב-Lancet משנת 1997). ברוב הנבדקים אנטיגן p24 עשוי לסייע באבחון הדבקה חריפה עוד לפני seroconversion. זיהוי של הדבקה חריפה מאפשר להתחיל בתרפיה מוקדמת, ולהפחית את התפשטות הנגיף בשותפים ליחסי מין. בנבדקים בסיכון גבוה להידבק בנגיף, שבדיקת דמם לנוגדנים לנגיף מתקבלת שלילית, בדיקת אנטיגן p24 יכולה לסייע באבחון שלבי הדבקה מוקדמים, ואף על פי כן ההנחיות של ה-USPH הן להימנע מבדיקה שגרתית של p24 כשיטה לזיהוי הדבקה ב-HIV, משום שפרק הזמן בין זיהוי p24 לזיהוי של נוגדנים כנגד HIV הוא 6 ימים בלבד, ולא כל הנבדקים שנדבקו בנגיף ונבדקו לאחרונה, היו בעלי רמות ניתנות לזיהוי של p24 (כמצוין במסמך של USPH שהתפרסם ב-1996 ב-Morb Mort Week Rep). בשתי הוועידות הבינלאומיות למאבק ב-AIDS שהתכנסו בוושינגטון-DC בשנת 1987, ובשטוקהולם בנשת 1988, דווח שהדעיכה בנסיוב של רמת הנוגדנים כנגד p24, לעומת העלייה ברמת p24 עצמו, מתרחשת כאשר אדם שנדבק בנגיף מתקדם לפאזה החמורה ביותר של המחלה (Enzensberger-Doerr וחב' בדיווחי הכינוס בשטוקהולם). בעבר, ולפני הזמינות של ה-viral load testing, בדיקת p24 הייתה מתבצעת באופן אינטנסיבי לניטור ההתפתחות של הנגיף, וממילא של המחלה. כיום, p24 ממשיך לספק ידע בעלות נמוכה ותוך TAT קצר יותר. עם זאת, יש ירידה הדרגתית בבדיקת p24, עם הפיתוח של מדידת רמות RNA נגיפי.

שיטות סריקה לזיהוי הדבקה ב-HIV

שיטות הסריקה הקיימות מבוססות על זיהוי נוגדנים כנגד הנגיף, בדיקת אנטיגן p24, ובדיקת RNA נגיפי. הנגיף HIV יכול להיות מזוהה על ידי שיטות ELISA או EIA, על ידי צימות (אגלוטינציה) של חלקיקים או בעזרת CIA (או chemiluminescent immunoassay). המקור לצורך בדיקת EIA יכול להיות דם שלם, נסיוב, פלזמה, רוק או שתן. נכון ל-2020, בדיקת EIA מהדור הרביעי, מזהה גם נוגדנים כנגד הנגיף וכן את האנטיגן p24 (במה שמוגדר כ-HIV 1/2 antigen/antibody combination assay), זמינה ומומלצת לזיהוי הדבקה בנגיף (הנחיות ה-CDC משנת 2014). בדיקת EIA היא הנפוצה ביותר להערכה ראשונית של הדבקה עם HIV-1 ו-HIV-2. כדי לשפר את הרגישות והספציפיות, 4 דורות של EIAs פותחו מאז שנות ה-90 של המאה ה-20. בדיקת EIA מהדור הראשון מבוססת על גילוי נוגדנים המגיבים עם באר בפלטת מיקרו, שצופתה קודם לכן עם lysate של תאים מודבקים בנגיף. בדיקה מהדור השני, מחליפה את lysate התאים המודבקים, בציפוי הבאר עם אנטיגנים רקומביננטיים של HIV. בדיקת הדור השלישי של EIA, שונה מבדיקות הדור הראשון והשני, בכך שבדיקת הדור השלישי מזהה נוגדנים בטכניקת "antigen sandwich" בה האנזים קשור לאנטיגן ולא לנוגדן. בשיטה זו ניתן לזהות נוגדנים מסוג IgG ו-IgM, ובכך לזהות את הנגיף מוקדם יותר. בבדיקת הדור הרביעי של EIA, מצפים את הבאר בנוגדנים כנגד p24 כמו גם באנטיגנים של HIV.

נוגדנים המגיבים עם HIV מתגלים בערך 3-6 שבועות לאחר ההדבקה, בתלות בדור של EIA המשמש במעבדה (Fiebig וחב' ב-AIDS משנת 2003). הזיהוי של אנטיגן p24 על ידי בדיקת הדור הרביעי, מקצר את חלון הזיהוי ב-4.4-4.8 ימים בהשוואה לבדיקה מהדור השלישי (Weber וחב' ב-J Clin Microbiol משנת 1998). נבדקים הנמצאים שליליים בהערכה הראשונית, אמורים לעבור בדיקת נוגדנים חוזרת לאחר 3 חודשים, במקרה שהם לא עברו seroconversion בהערכה הראשונית.

המבנה של ה-virion של HIV. חלקיק הנגיף מכוסה ב-lipid bilayer הנובע מהתא המאחסן.

רצף ההופעה של סמני מעבדה לאבחון הדבקה ב-HIV-1

על פי ה-APHL וה-CDC, יש לבצע בדיקת HIV-1 antigen/antibody ובדיקה חוזרת של HIV1/HIV2 antibody based differentiation test. בדיקה חיובית מאשרת הדבקה ודאית ב-HIV, ובמקרה זה הוסרו ההמלצות לביצוע Western blot. אם הבדיקה המאשרת הדבקה ב-HIV מתקבלת שלילית, בדיקת השילוב המקורית זיהתה כנראה את p24 ולא את הנוגדן. במקרה זה מומלץ לבצע nucleic acid amplification test (או NAT), ואם זו מתקבלת חיובית מוכחת הדבקה חריפה בנגיף. אם היא מתקבלת שלילית, נשללת ההדבקה בנגיף. לא קיימת בדיקת NAT לנגיף HIV-2. מספר מצבים עלולים לגרום לתוצאות EIA חיוביות-כזובות: טעות טכנית בביצוע הבדיקה, היריון (Shima-Sano וחב' ב-PLoS One משנת 2010), נבדק שחוסן כבר כנגד HIV-1‏ (Ackers וחב' ב-J Infect Dis משנת 2003), חיסונים כנגד כלבת שנעשו בסמוך למועד הבדיקה (Pearlman ו-Ballas ב-Arch Pathol Lab Med משנת 1994), או כנגד influenza‏ (Mac Kenzie וחב' ב-JAMA משנת 2001). הדבקות אחרות כגון ב-Hepatitis B‏ (Wai ו-Tambyah ב-Am J Med משנת 2002), או בסכיסטוזומה (Everett וחב' ב-J Clin Microbiol משנת 2010), יכולות אף הן לתת תוצאות false positive.

סיבות שעלולות לגרום לתוצאות EIA שהן false negative כוללות טעות טכנית בביצוע הבדיקה, בדיקה המתבצעת בתוך ה-window period (Ling וחב' ב-JAMA משנת 2000), מקרים של יצירת נוגדנים נמוכה כמו במגוון מצבי immunodeficiency ‏(Padeh וחב' ב-N Eng J Med משנת 2005), או במקרים של מחלת AIDS מתקדמת (Brown וחב' ב-Ann Intern Med משנת 2008), הדבקה ב-HIV-2 כאשר הבדיקה נועדה לגלות הדבקה ב- HIV-1 או מקרים של HIV-1 מזני N או O ‏(Zouhair וחב' ב-J Clin Microbiol משנת 1996).

בדיקת HIV מהירה

בדיקה זו מיועדת כאשר נדרשת תשובה דחופה לצורך התחלת טיפול פרופילקטי, בתאונת חשיפה תעסוקתית, או במקרים של יולדת בסיכון גבוה שלא נבדקה בעבר, בשעת לידה. בדיקה מהירה מבוססת על גילוי נוגדנים בדם מלא, בפלזמה, בנסיוב או בנוזל מהפה. נכון למועד כתיבת מאמר זה, מאושרות על ידי ה-FDA תשע בדיקות כאלה למסגרות קליניות ולא-קליניות (Blank וחב' ב- Am J Public Health משנת 2014, Egan וחב' ב-AIDS Patient Care STDS משנת 2014, והנחיות ה-CDC ב-CDC.gov משנת 2018). חלק מבדיקות אלה מזהות את HIV-1 ואת HIV-2. איכות הבדיקות המהירות נמצאת תחת הרגולציה של CLIA (או Clinical Laboratory Improved Amendments). תוצאת הבדיקה המהירה יכולה להתקבל "שלילית" ואז יש להתייחס אליה כתוצאה "שלילית" באופן מוחלט, אלא אם כן היא מתבצעת במהלך ה-window period. לעומת זאת, ההתייחסות אל תוצאה "חיובית" אמורה להיות פרלימינרית, ויש לאשש אותה על ידי Western blot או על ידי IFA.

בדיקת HIV ביתית

ה-FDA נתן אישורו לערכת בדיקה ביתית, לאבחון HIV-1. זו למעשה בדיקת EIA כפולה, כאשר תוצאה חיובית מאוששת על ידי IFA. הנבדק/ת דוגמים את דמם ושולחים את הדגימה באופן מבוקר למעבדה מחוזית.

בדיקת HIV בנוזל פה או בשתן

בדיקת EIA המאושרת על ידי ה-FDA, והידועה כ-OraQuick Advanced, זמינה לזיהוי HIV-1 ו-HIV-2 בנוזל הפה ובדם במצבים לא-קליניים. בנוסף, קיימות ערכות הידועות כ-Avioc HIV-1 MicroElisa System המתאימה לבדוק נוזל-פה או טיפת דם מיובשת, כמו גם DPP HIV-1/2 Assay המתאימה לשימוש בדם מלא. הבעיה העיקרית עם בדיקת נוזל בפה של שיעור גבוה של תוצאות חיוביות-כזובות, נמצאה במספר ערים בארה"ב, בעיקר בניו-יורק ובסן-פרנציסקו (AIDS alert משנת 2008), זאת עם ערכות שהיו קרובות למועד תפוגתן (Facente וחב' ב-PLoS One משנת 2009). יחד עם זאת בדגימות דם מלא ששימשו בבדיקה זו, לא נמצאה עליה בשיעור המקרים החיוביים-כזובים. ערכת בדיקת השתן הידועה כ-Calypte HIV-1 היא בדיקת EIA, כאשר תוצאה חיובית אמורה להיות מאוששת על ידי בדיקה סרולוגית.

אישור ממצאי הזיהוי

הדבקה ב-HIV מאושרת בצורה אופיינית על ידי Western blot. בבדיקה זו מפרידים את חלבוני הנגיף על פי משקלם המולקולרי על polyacrylamide gel. חלבוני הנגיף מועברים באופן חשמלי למצע סולידי דוגמת פלטת ניטרוצלולוז, שעוברת הדגרה עם תמיסת נסיוב של הנבדק, ומתבצעת אנליזה של הפסים המתקבלים מקישור הנוגדנים בנסיוב כנגד חלבוני הנגיף, אם ישנם כאלה. על פי ה-CDC בהנחיותיו משנת 1989 ב-Morb Mort Weekly Rep, תוצאת Western blot נחשבת חיובית כאשר שני פסים נצבעים: ,gp41 gp120/160 או p24. תוצאת Western blot שלילית נחשבת כאשר כל הפסים הללו נעדרים. תוצאת Western blot חיובית של HIV-1, המתקבלת לאחר תוצאה חיובית של בדיקת EIA של HIV-1 או HIV-2, נחשבת תוצאה אבחונית של הדבקה ב-HIV-1. תוצאת Western blot שלילית של HIV-1, המתקבלת לאחר תוצאה חיובית של בדיקת EIA של HIV-1 או HIV-2, נחשבת תוצאה השוללת באופן פסקני הדבקה בנגיף, אלא אם כן הדבקה חריפה ב-HIV-1 נחשדת. תוצאה לא מוגדרת של Western blot יכולה לנבוע מהדבקה אמיתית עם HIV-1, בה לא הושלם תהליך ה-seroconversion, או במצבים של AIDS מתקדם, או בהדבקה עם HIV-2, או במצב של אי-הדבקה (Guan ב-Clin Vaccine Immunol משנת 2007), ובמצבים של היריון, ערכי בילירובין מוגברים, נבדק שכבר חוסן כנגד HIV-1, נבדק בהמודיאליזה, במצבי ממאירות או בנבדק עם מחלה אוטו-אימונית. תוצאת Western blot בלתי מודרת, מחייבת חזרה על בדיקה זו לאחר 2-4 שבועות, אלא אם כן נחשד מצב של הדבקה חריפה עם HIV-1 או עם HIV-2. בדיקות מאשרות זמינות נוספות הן בדיקת IFA בלתי-ישירה, או בדיקת radioimmunoprecipitation, שאינן מבוצעות לעתים קרובות בשגרה הקלינית.

שיטות HIV Nucleic Acid Precipitation (או NAATs):

הזיהוי של proviral DNA מתבצע לעתים נדירות, כאשר יוצא הדופן הוא האבחון של הדבקת HIV-1 בתינוקות. טכניקה זו מבוססת על אמפליפיקציה של proviral DNA מתאי דם היקפי רב-גרעיניים (PBMC) מודבקים כאשר הזיהוי נעשה עם DNA probe. שיטה זו רגישה מאוד, ומסוגלת לזהות במיליליטר אחד 1-10 עותקים של proviral DNA. בדיקה זו אינה מאושרת על ידי ה-FDA לאבחון הדבקה ב-HIV-1. זיהוי של RNA נגיפי, ניתן להתבצע על ידי signal amplification (או branched-chain DNA), או על ידי nucleic acid sequence-based amplification, או על ידי reverse-transcriptase PCR. ערכת הבדיקה Aptima HIV-1 RNA Qualitative Assay היא היחידה שאושרה בשנת 2011 על ידי ה-FDA לזיהוי הדבקה חריפה בנגיף.

תרבית תאים מכילי הנגיף

טכניקה זו מבוססת על בידוד הנגיף מתאי PCMB שגודלו בתרבית בנוכחות הציטוקין IL-2. השימוש העיקרי בתאים הנגועים בנגיף, הוא לזיהוי הדבקת HIV-1 בתינוקות, אך הבדיקה יקרה לביצוע, גוזלת זמן יקר של עובד המעבדה, ויש בה סיכון להדבקת צוות המעבדה. בדיקה זו גם דורשת 2-3 שבועות עד לקבלת תוצאה, לכן מקומה נתפס על ידי NAATs (Hollinger וחב' ב-J Clin Microbiol משנת 1992).

האבחון של HIV-2:

האפשרות להדבקת בני-אדם בנגיף HIV-2 יכול להתרחש בנבדקים עם גורמי הסיכון הבאים (O'Brian וחב' ב-Morb Mort Weekly Rep Recomm Rep משנת 1992, ו-Campbell-Yesufu ו-Gandhi ב-Clin Infect Dis משנת 2011): מאפיינים קליניים הדומים לאלה בהדבקת HIV-1, אך עם תוצאות שליליות להדבקה עם HIV-1; מקור הנבדק ממערב אפריקה; נבדק המקיים יחסי מין או מזריק סמים אסורים תוך שיתוף מזרקים עם חבר הידוע כמודבק עם HIV-2 או עם חבר שאינו מודבק אך ידוע ממדינה אנדמית ל-HIV-2; או תינוקות שנולדו לאימהות מודבקות עם HIV-2 או כאלו שאינן מודבקות אך נמצאות בסיכון גבוה להדבקה עם HIV-2; או נבדק שקיבל תוצרי דם באזור אנדמי ל-HIV-2; או נבדקים עם תוצאה לא מוגדרת של Western blot ל-HIV-1, עם ממצאים בלתי רגילים (כגון פסים המגיבים עם Gag ו-Pol אך ללא פס המגיב עם Env).

היריון ולידה: ה-CDC ממליץ שבדיקת HIV תתבצע מוקדם ככל האפשר בתקופת ההיריון של אישה החשודה כחשופה לנגיף (Branson וחב' ב-MMWR Recomm Rep משנת 2006). בדיקה שניה במהלך ההיריון בטרימסטר השלישי, רצוי לפני שבוע ההיריון ה-36, הוא בעל עלות-יעילות גבוהה אפילו באזורים עם שכיחות הדבקה ב-HIV הגבוהה מ-0.1%. כל הנשים במהלך לידה שסטאטוס HIV שלהם אינו ידוע אמורות לעבור בדיקת HIV מהירה. אם התוצאה מתקבל חיובית יש לנקוט בצעדים להפחתת העברה אנכית של הנגיף ליילוד (כגון טיפול אנטי נגיף retro), בהקדם האפשרי. אבחון סב-לידתי של הדבקה ב-HIV של היילוד מסובך בשל העובדה שנוגדנים של היולדת המודבקת ב-HIV יכולים לעבור באופן פסיבי ליילוד, ויכולים להיות מזוהים עד 18 חודשים לאחר הלידה ( Readב-Pediatrics משנת 2007). הקריטריון הסטנדרטי לאבחון הדבקה ב-HIV ביילודים ובתינוקות בני פחות מ-18 חודשים הוא זיהוי של חומצת גרעין נגיפית. הוראות לביצוע הבדיקה:

את הדם יש ליטול במבחנת ספירת-דם (פקק בצבע סגלגל) המכילה EDTA. לאחר הסרכוז תוך פרק זמן של לא יותר משעתיים מנטילת הדם, להפרדת הפלזמה מכדוריות הדם, יש להעביר את הפלזמה למבחנת פלסטיק לאחסון בקירור (מועדף) עם יציבות דגימה של 6 ימים, או בהקפאה עם יציבות דגימה של 30 יום. יש לפסול דגימות מאוד המוליטיות (רמת המוגלובין בפלזמה מעל 500 מיליגרם/ד"ל), ליפמיות (רמות triolein בפלזמה מעל 1,250 מיליגרם/ד"ל), או איקטריות (רמות בילירובין בפלזמה מעל 20 מיליגרם/ד"ל).

את הערך p24 יש לשבץ בקטגוריה # 22 (מחלות נגיפיות),