Transforming growth factor beta

הדפס

מדריך בדיקות מעבדה
Transforming growth factor beta
שמות אחרים	TGF-β, Transforming growth factor β
מעבדה	כימיה בדם
תחום	גורם גדילה רב-תכליתי
טווח ערכים תקין	12-14 ננוגרם/מ"ל
יוצר הערך	פרופ' בן-עמי סלע

הפיזיולוגיה של TGFβ

TGF-β הוא ציטוקין רב-תכליתי השייך למשפחת העל של TGF המכילה ביונקים שלושה איזופורמים שונים (TGFβ1 עד TGFβ3), וחלבנים מאותתים רבים אחרים (Meng וחב' ב-Nature Rev Nephrol משנת 2016). חלבוני TGF מיוצרים על ידי כל שורות תאי הדם הלבנים. TGFβ משופעל יוצר קומפלקסים עם פקטורים אחרים ליצירת קומפלקס serine/threonine kinase הנקשר לקולטני TGFβ. קולטנים אלה מורכבים משתי תת-יחידות type 1 ו-type 2. לאחר קישור TGFβ, הקינאז של הקולטן type 2 מזרחן ומשפעל את הקינאז של הקולטן type 1, ובכך משופעת הקסקדה המאותתת (Massagué ב-Nature Rev Mol Cell Biol משנת 2012). כך מתרחש שפעול של מצעים שונים ושל חלבונים רגולטוריים, כולל השעתוק של גנים שונים הפועלים בהתמיינות התא (differentiation), בכמוטקסיס, בפרוליפרציה, ובשפעול של תאי חיסון רבים (Nakao וחב' ב-Nature משנת 1997).

TGFβ מופרש על ידי סוגי תאים רבים הכוללים מקרופאגים, בצורה לטנטית הה הוא עובר קומפלקסציה עם 2 פוליפפטידים אחרים, latent TGFβ binding protein (להלן LTBP), ועם latency-associated peptide (להלן LAP). פרוטאינאזות בנסיוב כגון plasmin מקטלזות את השחרור של TGFβ פעיל מהקומפלקס. תהליך זה מתרחש לעתים קרובות על פני המקרופאגים שם הקומפלקס הלטנטי TGFβ קשור ל-CD36 דרך הליגנד שלו, thrombospondin-1 (להלן TSP-1). גירויים דלקתיים המשפעלים את המקרופאגים מעודדים את השחרור של TGFβ על ידי השפעול של plasmin. מקרופאגים יכולים גם לבצע אנדוציטוזה של הקומפלקס IgG- latent TGFβ, המופרש על ידי תאי פלזמה, ואז לשחרר TGFβ פעיל לנוזל החוץ-תאי. בין התפקידים החשובים של TGFβ ניתן למנות את הוויסות של תהליכים דלקתיים, בעיקר במעי (Letterio ו-Roberts ב-Ann Rev Immunol משנת 1998). כמו כן יש ל-TGFβ תפקיד קריטי בהתמיינות של תאי גזע כמו גם בוויסות ובהתמיינות של תאי T (Massague ו-Xi ב-FEBS Lett משנת 2012, ו-Li ו-Favell ב-Cell משנת 2008). לכן רב המחקר והעניין הקשורים ל-TGFβ בתחומי הסרטן, המחלות האוטו-אימוניות והמחלות המדבקות. הגברת הביטוי של TGFβ קשורה עם הממאירות של סוגי סרטן רבים, שכן תכונותיו מדכאי החיסון תורמים לאונקוגנזה (Messague וחב' ב-Cell משנת 2000).

המבנה של TGFβ

ביונקים ישנם 3 איזופורמים של TGFβ, ואיזופורם רביעי (TGFβ4) זוהה בעופות (Roberts וחב' ב-Novartis Foundation Symposia משנת 1991), ואילו איזופורם חמישי (TGFβ5) זוהה רק בצפרדעים. המבנה הפפטידי של האיזופורמים של TGFβ מאוד דומה ביניהם (עם הומולוגיה של 70-80%). כל האיזופורמים מקודדים כקודמנים (precursors) גדולים: הקודמן של TGFβ1 מכיל 390 חומצות אמינו, ואילו הקודמנים של TGFβ2 ו-TGFβ3, מכילים 412 חומצות אמינו. כל הקודמנים מכילים מקטע של פפטיד סיגנל N-טרמינלי בגודל של 20-30 חומצות אמינו, המשמש אותם להפרשה מהתא, וכן הם מכילים קדם-מקטע הקרוי latency associated peptide (או LAP הידוע גם כ-pro-TGFβ1 ). כמו כן הקודמנים מכילים מקטע C-טרמינלי בגודל של 112-114 חומצות אמינו, ההופך ל-TGFβ בּשל לאחר ניתוקו מהקודמן על ידי ביקוע פרוטאוליטי (Khalil ב-Microb Infect משנת 1999). החלבון TGFβ הבשל עובר דימריזציה ליצירת חלבון פעיל במשקל מולקולרי של 25 אלף דלטון, עם motifs רבים המשומרים מבנית (Herpin וחב' ב-Develop Comparative Immunol משנת 2004). TGFβ מכיל 9 שיירי ציסטאין, כאשר שמונה מהשיירים הללו יוצרים קשר די-סולפידי בתוך החלבון, ליצירה של מבנה "קשר ציסטאיני" האופייני למשפחת העל של TGF, כאשר השייר הציסטאיני התשיעי יוצר קשר די-סולפידי עם השייר הציסטאיני הבלתי מזווג של מולקולת TGFβ אחרת ליצירת דימר (Daopin וחב' ב-Science משנת 1992). שיירים משומרים רבים נוספים במולקולת TGFβ יוצרים מבנים שניוניים על ידי אינטראקציות הידרופוביות.

שפעול על ידי TGFβ

למרות ש-TGFβ חיוני בוויסות של פעילויות תאיות קריטיות, מוכר רק מספר קטן של מסלולים המשופעלים על ידי TGFβ, ומנגנון השפעול של מסלולים אלה לא ברור במלואו. חלק מהמסלולים המשופעלים האמורים ספציפיים לתאים או לרקמות מסוימים, בעוד שחלק אחר מופיעים במספר תאים ורקמות (Annes וחב' ב-J Cell Sci משנת 2003, ו-ten Dijke וחב' ב-Trends Biochem Sci משנת 2004). פרוטאזות, אינטגרינים, pH ו-ROS הם רק חלק מתוך פקטורים הידועים שיכולים לשפעל את TGFβ (Bacellos-Hoff וחב' ב-Mol Endocrinol משנת 1996, ו-Wipff ו-Hinz ב-Eur J Cell Biol משנת 2008). ידוע שפגיעות בפקטורי שפעול אלה יכולים לגרום לרמות איתות בלתי מווסתות של TGFβ, מה שעלול לגרום לדלקת, למפגעים אוטו-אימוניים, לפיברוזיס, לסרטן וליְרוד (קטרקט) (Yu ו-Stamenkovic ב-Genes Develop משנת 2000, ו-Taipale וחב' ב-J Cell Biol משנת 1994). ברוב המקרים, ליגנד משופעל של TGFβ יאתחל את הקסקדה של איתות על ידי TGFβ, כל זמן שהקולטנים TGFβR1 ו-TGFβR2 זמינים לקישור.

שפעול על ידי פרוטאזה ו-metalloprtease

פלזמין ומספר מטלופרוטאזות של המשתית (MMP) משחקים תפקיד מפתח בסיוע לחודרנות של סרטן על ידי שהם משרים של מספר מרכיבים של ECM. השפעול על ידי TGFβ תלוי בשחרור של large latent complex (להלן LLC) מהמשתית (matrix), המלווה על ידי פרוטאוליזה נוספת של ה- latency associated peptide (להלן LAP) על מנת לשחרר את TGFβ לקולטניו. MMP-9 ו-MMP-2 ידועים ביכולתם לבקע את ה-TGFβ הלטנטי. למרות העובדה ש-MMPs הוכחו כבעלי תפקיד חשוב בשפעול של TGFβ, עכברים עם מוטציות בגנים המקודדים ל-MMP-9 ול-MMP-2, עדיין יכולים לשפעל את TGFβ, ולא מוצאים בהם פנוטיפים האופייניים לחסר ב-TGFβ משופעל.

שפעול על ידי pH

תנאים חומציים יכולים לגרום לדה-נטורציה של LAP. טיפול בתמיסה בתנאי pH קיצוניים (1.5 או 12.0) גרם לשפעול משמעותי של TGFβ כפי שהדבר הודגם בבדיקות radio-receptor, בעוד שטיפול ב-pH מתון (4.5), גרם רק לשפעול TGFβ של 20-30% בהשוואה לזה שהושג ב-pH1.5 (Lyons וחב' ב-J Cell Biol משנת 1998).

שפעול על ידי ROS (reactive oxygen species)

המבנה של LAP חשוב בקביעת פעילותו, באופן ששינוי במבנה של האחרון פוגע באינטראקציה בין LAP ו-TGFβ. גורמים שיכולים לגרום לשינויי מבנה אלה כוללים רדיקלים הידרוקסילים שמקורם ב-ROS.‏ TGFβ שופעל במהירות לאחר חשיפה in vivo ל-ROS (Barcellos-Hoff ו-Dix ב-Mol Endocrinol משנת 2006).

שפעול על ידי thrombospondin-1

thrombospondin-1 (להלן TSP-1) הוא גליקופרוטאין במשתית התא שנמצא בפלזמה של אנשים בריאים ברמות של 50-250 ננוגרם/מ"ל (Booth ו- Berndtב- Sem Thrombosis Hemostasisמשנת 1987). ידוע שרמות TSP-1 עולות בתגובה לפציעה או במהלך ההתפתחות (Raugi ב- J Invest Dermatol משנת 1987). TSP-1 משפעל TGFβ לטנטי (Schultz-Cherry ו- Murphy-Ullrichב-J Cell Biol משנת 1993), על ידי יצירת אינטראקציות עם הקומפלקס TGFβ הלטנטי, והשריית שינוי קונפורמציה המונע ממנו מלהתקשר עם TGFβ הבשל (Murphy-Ullrich ו-Poczatek ב- Cytokine Growth Factor Rev משנת 2000). מעכבים של הקולטן ל-TGFβ:

RepSox הוא מעכב בררני המונע את הקישור של ATP ל-TGFβR1 וכתוצאה מכך אינו מאפשר את הפוספורילציה של TGFβR1, ובכך נמנע האיתות של TGFβ (Tu וחב' ב-Acta Pharmacol Sinica משנת 2019). בנוסף, SB-431542 (Inman וחב' ב-Am Soc Pharmacol Exp Therpeut משנת 2002, וכן A83-01 (Tojo וחב' ב-Cancer Sci משנת 2005) מעכבים את TGFβR1 ואת type I receptor ALK4/7. נמצא ש-galunisertib הוא מעכב בררני פוטנטי של kinase (Yingling וחב' ב-Oncotarget משנת 2018).

השפעות של TGFβ על תאי חיסון:

לימפוציטי T: תפקידו של TGFβ התברר בהשפעה על תאי +CD4 ועל תאי Th17 המפרישים ציטוקינים מקדמי דלקת (Morishima וחב' ב-Biochim Biophys Res Commun משנת 2009, ו-Li ו-Flavell ב-Cell משנת 2008). מחקרים מראים שהנטרול של TGFβ1 במערכת in vitro מעכב את ההתמיינות של תאי helper T ל-Th17, מה שיכול להיות משמעותי באוטו-אימוניות. השפעול הנגרם על ידי IL-6 המופרש מתאים דנדריטים על גורם השעתוק STAT3, נדרש ביחד עם TGFβ בתהליך ההתמיינות של תאי Th17. נתונים אלה מהווים ראיה לתפקיד הרגולטורי של TGFβ1 במערכת החיסון (O'Connor וחב' ב-Nature Immunol משנת 2010).

לימפוציטי B: ל-TGFβ יש בעיקר השפעות מעכבות על לימפוציטים מסוג B, כגון עיכוב הפרוליפרציה של תאים אלה. מנגנון העיכוב האמור הוא על ידי השרייה של גורם שעתוק Id3 ובנוסף השרייה של ביטוי מעכב 21 של קינאזה התלויה ב-cyclin (שהוא מווסת של מחזור חיי התא דרך הפאזות G1 ו-S), ודיכוי של גנים רגולטוריים אחרים כגון c-myc ו-ATM (שהוא serine/threonine kinase המשופעל על ידי נזק ב-DNA) (Li וחב' ב-Ann Rev Immunol משנת 2006, ו-Roes וחב' ב-Proc Natl Acad Sci USA משנת 2003). כיוון ש-CD40, חלבון הממוקם על פני התא וקשור לשפעול של מערכת החיסון הטבעי (innate immunity), יכול להשרות את הביטוי של Smad7, הוא יכול לבטל את עיכוב הגדילה של תאי B המושרה על ידי TGFβ (Patil וחב' ב-J Biol Chem משנת 2000). לפיכך, TGFβ יכול לחסום את השפעול של תאי B וממילא יש לו פעילות המעכבת יצירת נוגדנים. TGFβ יכול להשרות אפופטוזיס של תאי B בלתי בשלים או תאי B המוגדרים כ-resting, זאת במנגנון בלתי ידוע, ונמצא גם ש-TGFβ מפחית את פעילות c-myc, ומשרה את פעילות IKBa שהוא מעכב של גורם השעתוק NF-κB (Arsura וחב' ב-Immunology משנת 1996).

מקרופאגים: יש הסכמה גורפת בספרות ש-TGFβ מעודד מונוציטים ברגיעה, ומעכב מקרופאגים משופעלים. באשר למונוציטים, TGFβ משדרג בהם את התגובה הדלקתית (Kubiczkova וחב' ב-J Translational Med משנת 2012). יחד עם זאת, TGFβ נמצא גם מפחית במונוציטים ובמקרופאגים את הייצור של ציטוקינים דלקתיים על ידי עיכוב גורם השעתוק NF-κB (Smythies וחב' ב-J Clin Invest משנת 2005). סתירה זו יכולה להתקיים בגלל העובדה ש-TGFβ תלוי מאוד בפרמטרים תאיים רבים (Wahl ב-Curr Opinion Immunol משנת 2007).

                                     פעילויותיו המגוונות של TGFβ על תאי מערכת החיסון:

אפופטוזיס הנגרם על ידי TGFbeta במסלול DAXX:

TGFβ משרה אפופטוזיס בלימפוציטים ובהפטוציטים אנושיים. החשיבות של תפקוד זה ברורה בעכברים טרנסגניים החסרים TGFbeta החווים שגשוג-יתר ואוטו-אימוניות בלתי מווסתת. במסלול אפופטוטי הנבדל מהאסוציאציה של death-associated protein-6 עם ה-death receptor Fas (להלן DAXX), יש ראיות לאסוציאציה וקישור בין DAXX לבין TGFβ type 2 receptor kinase, בו DAXX נקשר למקטע ה-C טרמינלי של קולטן זה (Yang וחב' ב-Cell משנת 1997). המנגנון המולקולרי מדויק אינו ידוע, אך נראה ש-DAXX עובר פוספורילציה על ידי homodomain-interacting proten kinase 2 (להלן HIPK2), ובהמשך הוא משפעל את האנזים apoptosis signal-inducing 1 (להלן ASK1), והאחרון משפעל את מסלול ה-Jun amino-terminal kinase (להלן JNK) (Perlman וחב' ב-Nature Cell Biol משנת 2001, ו-Hofmann וחב' ב-Cancer Res משנת 2003).

TGFβ ומחזור חיי התא:

TGFβ משחק תפקיד חיוני בוויסות של ה-cell cycle על ידי חסימת התקדמותו בפאזת G1. TGFβ גורם לסינתזה של החלבונים p15 ו-p21, החוסמים את הקומפלקס cyclin:CDK האחראי לפוספורילציה של חלבון הרטינובלסטומה, לכן, TGFβ חוסם את ההתקדמות על המחזור התאי דרך פאזת G1 (Blobe וחב' ב-N Eng J Med משנת 2000). בפעולה זו מדכא TGFβ את הביטוי של c-myc, גן המעורב בהתקדמות מחזור התא ב-G1.

TGFβ וסרטן:

בתאים נורמליים, TGFβ, הפועל דרך מסלוליו המטבוליים עוצר את המחזור התאי בפאזת G1, להפסקת השגשוג התאי, להשרות התמיינות של התא, או לגרום למותו במנגנון אפופטוזיס. בתאי סרטן רבים, חלק ממסלולי האיתות של TGFβ לוקים במוטציות, ולכן האחרון אינו שולט יותר בתא, כך שתאי סרטן אלה יכולים להמשיך לשגשג, ותאי הסטרומה הסמוכים (פיברובלסטים) משגשגים אף הם. TGFβ פועל על תאי הסטרומה, על תאי החיסון, על תאי האנדותל ועל תאי השריר החלק. כך יש דיכוי של מערכת החיסון, ולעומתו מתפתח תהליך האנגיוגנזה המאפשר לתאים הסרטניים להיות פולשניים יותר (Viahopoulos וחב' ב-Cytokine Growth Factor Rev משנת 2015). TGFβ הופך גם כן תאי T אֶפֶקטורים שבדרך כלל מתקיפים תאי סרטן לתאי T רגולטורים (suppressor) המשככים את התגובה הדלקתית. כאשר האיתות של TGFβ נכשל ביכולתו לפקח על הפעילות NF-κB בתאים הסרטניים, יש לעובדה זו לפחות שתי השפעות פוטנציאליות: ראשית, מתאפשר יכולת ההישרדות של תאי הסרטן בנוכחות תא חיסון משופעלים, ושנית, תאי הסרטן מושפעים פחות מתאי החיסון, כיוון שהתאים הסרטניים שורדים את הפעילות האפּופּטוטית ואת התווכים האנטי-דלקתיים (Bonecini-Almeida וחב' ב-Infect Immun משנת 2004).

TGFβ ותאי גזע סרטניים:

התקדמות במחקר בתחום של תאי-גזע סרטניים מצביעה על כך שמסלולי איתות של TGFβ חיוניים לשמירה על תאי גזע אלה, האחראים להישנות המחלה לאחר תרפיה אנטי-סרטנית (Naka ב-Nihon Rinsho משנת 2015). איתותים תוך-תאיים וחוץ-תאיים אחדים מאפשרים לתאי אָב קַדְמוֹן (progenitors) לחזור למצב של תאי גזע. ראיות מצביעות על כך ש-TGFβ משרה את הביטוי של CD133 המהווה סמן של תאי-גזע סרטניים בשורות תאי סרטן הכבד, וכן מגביר את אתחול התהליך הסרטני בעכברים, זאת בהשוואה להשפעה המתונה יותר ובת החלוף של IL-6 (על פי You וחב' ב-Hepatolog משנת 2010). יתרה מכך, מקרופאגים הכרוכים בסרטן הנמצאים בקרבת התהליך הסרטני, נמצאו מסייעים לתאי הגזע סרטניים במסלול המרה אפיתליאלית במזנכימאלית המושרית על ידי TGFβ1 בקרצינומה של תאי-כבד (HCC) (Fan וחב' ב-Cancer Lett משנת 2014). ישנם הבדלים אפּיגנטיים בגנים המושפעים מאיתות על ידי TGFβ, בין תאים דמויי תאי גזע סרטניים לבין תאי סרטן שעברו התמיינות. בעבר דווח שרמות מתילציה של גנים המקודדים לחלבונים הכרוכים באיתות של TGFβ, יכולים לווסת את ההתמיינות של תאי-גזע של סרטן שד (El Helou וחב' ב-Stem Cells משנת 2014). ראיות מצביעות על כך שמספר חברים במסלול TGFbeta, ממוקדים על ידי non-coding RNAs ועל ידי תווכי מפתח אפי-גנטיים, מה שעשוי להסביר לפחות חלקית את הקשר בין תופעת תאי הגזע הסרטניים לבין האיתות על ידי TGFβ (Wang וחב' ב-Cancer Lett משנת 2016). ממצאים אלה עשויים לסייע ספציפית בפיתוח של תכשירים חדשים המסוגלים להגביר או להחליש את מסלולי האיתות של TGFβ בתחום תאי הגזע הסרטניים ובכך למנוע או לטפל בממאירות סרטנית.

איתות על ידי TGFβ ברגולציה של אנגיוגניות והתפשטות הנגע הסרטני:

היכולת של תאים סרטניים להשרות יצירה של כלי דם קריטית לאספקת מזון לתאים אלה וממילא לשגשוגם , ליכולתם להתפשט לרקמות סמוכות ולתהליך הגרורתי. TGFβ הוא מתווך מפתח בתהליך האנגיוגניות במיקרו-סביבה של הגידול, על ידי תרומתו לאנגיוגניות בהשריית פקטורים תומכי-אנגיוגניות (Kalluri ב-Nature Rev Cancer משנת 2003). ביטוי מוגבר של רמות TGFβ נכרך עם צפיפות מוגברת של תאי-דם זעירים (microvessels) במספר סוגי סרטן (Hasegawa וחב' ב-Cancer משנת 2001). מנגנון האנגיוגניות שמעודד TGFβ, נסמך על השרייה בתאי אפיתל ובפיברובלסטים של פקטורים אנגיוגניים חיוניים כגון connective tissue growth factor כמו גם vascular endothelial growth factor, ו-insulin-like growth factor-binding protein 7 (על פי Kang וחב' ב-Cancer Cell משנת 2003, ו-Sanchez-Elsner ב-J Biol Chem משנת 2001). בנוסף, TGFβ יכול להשרות את הביטוי, ההפרשה והשפעול של MMP2 ושל MMP9, ולעומת זאת להפחית את הביטוי של המעכב של metalloproteinase בתאי אנדותל ובתאים סרטניים (Zhao וחב' ב-Exp Gerontol משנת 2016, Hua וחב' ב-J Mol Neurosci משנת 2016, ו-Sekerci וחב' ב-J Urol משנת 2014). יחד עם זאת, ל-TGFβ ישנן גם תכונות אנגיו-סטטיות. לדוגמה, בסרטן הלבלב וכן ב-diffuse-type gastric cancer, משרה TGFβ את היצירה של thrombospondin1, שהוא מעכב פוטנטי של אנגיוגניות, בעוד שהפרעה לתהליך האיתות של TGFβ גורמת להחשת האנגיוגניות ולשגשוג של הגידול הסרטני (Schwarte-Waldhoff וחב' ב-Proc Natl Acad Sci USA משנת 2000).

הוראות לביצוע הבדיקה:

את הבדיקה מבצעים בנסיוב, לכן יש ליטול דם במבחנה כימית (פקק צהוב או אדום), ולאחר סרכוז יש להקפיא את הנסיוב המופרד, ולשלוח למעבדה 1 מ"ל של נסיוב קפוא במבחנת פלסטיק. יציבות הדגימה הקפואה היא 12 חודשים. יש לפסול דגימת נסיוב מאוד המוליטית או מאוד ליפמית, אך ניתן לבצע את הבדיקה בדגימות נסיוב המוליטיות או ליפמיות באופן קל. יש לפסול דגימת נסיות מזוהמת או כזו שעברה אינאקטיבציה בחימום. הבדיקה מתבצעת בשיטת quantitative multiplex bead assay.