פיקולין - Ficolin

הדפס

מדריך בדיקות מעבדה
פיקולין
Ficolin
מעבדה	ביוכימיה בדם
תחום	מערכת החיסון
טווח ערכים תקין	4-5 מיקרוגרם/מ"ל
יוצר הערך	פרופ' בן-עמי סלע

מערכת החיסון ההגנתי הטבעי (innate immune system) חיונית לספק לגוף קו הגנה ראשון לפני כניסתה לפעולה של מערכת החיסון האדפטיבית. מערכת ה-innate משפיעה גם באופן מעמיק על התפתחות התגובה החיסונית הקלונלית (Janeway ו-Medzhitov ב-Ann Rev משנת 2002). נקודה מרכזית למערכות החיסונים ה-innate והקלונלית, היא היכולת להבדיל בין self לבין מיקרואורגניזמים מזיקים.

מערכת המשלים משחקת תפקיד קריטי בהגנה מפני מיקרו-אורגניזמים פולשים, והיא פועלת דרך שלושה מסלולי שפעול: המסלול הקלאסי, המסלול האלטרנטיבי ומסלול הלקטינים, כאשר המסלול האחרון הוא גם המסלול שהתגלה מאוחר יותר. לקטין קושר mannose (להלן MBL) והפיקולינים מייצגים את המרכיבים הראשונים של סעיף הלקטין במערכת המשלים. הפעילות האנטי-מיקרוביאלית של MBL נחקרה בהרחבה, והיא מזהה מיקרו-אורגניזמים רבים ושונים, כולל פטריות, חיידקים, נגיפים ומיקרואורגניזמים חד-תאיים פרוקריוטיים (protozoa) (Dommett וחב' ב-Tissue Antigens משנת 2006, ו-Jack וחב' ב-J immunol משנת 1998). MBL ופיקולינים הם חלבוני הגנה אוליגומריים מסיסים עם פעילות דמויית לקטינים, והם מסוגלים לזהות מתווים מולקולרים פתוגניים, שהם מולקולות קרבוהידרטיות על שטח הפנים של פתוגנים ושל תאים ממאירים, נקרוטיים או אפופטוטיים. ה-MBLs והפיקולינים מופרשים או קשורים לממברנה של תאים, כאשר המולקולות המופרשות קרויות גם opsonins, והן כוללות גם את C-reactive protein (להלן CRP) ואת serum amyloid protein (להלן SAP) (Medzhitov וחב' ב-Nature משנת 2007). מולקולות אלו מזהות ליגנדים טעונים, ומסיעות לפגוציטוזה ולהרחקת תאים אפופטוטיים, והן משמשות לעזר למערכת החיסון ה-innate באופסוניזציה, פגוציטוזה, השריית אפופטוזיס, ושפעול של מערכת המשלים, הקואגולציה והדלקת.

הפיקולינים זוהו במקור כחלבונים הקושרים TGF-1 על פני ממברנה של רחם בחזיר (Ichijo וחב' ב-J Biol Chem משנת 1993). מספר חברים במשפחת הפיקולינים באדם זוהו, כולל L-ficolin-2/P35 (להלן FCN2 או ficolin 2) (Matsushita וחב' ב-J Biol Chem משנת 1996), M-ficolin (FCN1 או ficolin 1) (Endo וחב' ב-Genomics משנת 1996, ו-Lu וחב' ב-Biochem J משנת 1996), ו-H ficolin/Hakata antigen (להלן FCN3 או ficolin 3 (Akaiwa וחב' ב-J Histochem Cytochem משנת 1999). כמו כן בודדו פיקולינים A ו-B מעכבר (Fujimori וחב' ב-Biochim Biophys Res Commun משנת 1998), ופיקולינים α ו-β מחזיר. כל הפיקולינים מתפקדים כמולקולות הכרה, ומגרים או את מסלול הלקטין של המשלים, או או מנגנונים אחרים בתלות בליגנדים אליהם הם נקשרים.

L-פיקולין של אדם מסונתז בעיקר בכבד ומופרש לתוך הצירקולציה, ואילו H-פיקולין מבוטא בעיקר בכבד ובריאות, ויכול להימצא גם בנסיוב. פיקולין אנושי נוסף, M-פיקולין הוא חלבון המופרש ממונוציטים ונויטרופילים וכן מתאי אפיתל אלבאולריים ((type II בריאות. פיקולינים ו-MBL כרוכים עם סרין פרוטאזות, כאשר פיקולינים כמו גם MBL, משפעלים את את מסלול הלקטינים של המשלים (Matsushita וחב' ב-Int Immunopharmacol משנת 2001, Zhang וחב' ב-Adv Exp Med Biol משנת 2008). פיקולינים פועלים גם כאופסונינים כאשר הם נקשרים בשל הפעילות הלקטינית שלהם לאוליגוסוכרים מסוימים על פני פתוגנים (Liu וחב' ב-Immunol משנת 2005).

המבנה המולקולרי של פיקולינים

כל הפיקולינים הם חלבוני הגנה אוליגומריים, שנוצרו ממקטע דמוי-קולאגן (להלן CLD), וממקטעים דמויי פיברינוגן (להלן FBG) שמסוגלים לחוש איתותים מסוכנים הנשלחים מפתוגנים ומתאים אפופטוטיים. האיתותים של השרשראות הפולי-פפטידיות של חלבונים אלה, מקנים לפיקולינים את צורת "זר הפרחים" האופיינית (תמונה למטה).

המקטע דמוי הפיברינוגן יוצר מבנה גלובולרי הדומה למקטע המזהה קרבוהידרטים של לקטין type C.‏ L-ficolin מקודד על ידי הגן FCN2 הממוקם בכרומוזום 9 בעמדה 9q34 והוא שובט לראשונה ומבנהו תואר כדומה לזה של MBL‏. L-ficolin שמשקלו המולקולרי 35,000 דלטון, הוא בעל פעילות של לקטין הספציפי ל-N-acetyl-D-glucosamine (להלן GlcNAc), לליפופוליסכרידים, ל-1,3-β-D glucan, ל-lipoteichoic acid וכן למספר תרכובות עם שיירי אצטיל (Lynch וחב' ב-J Immunol משנת 2004). ספציפיות הקישור של פיקולין שונה מזו של MBL בכך ש-L-ficolin נקשר בעיקר לשיירי GlcNAc הסמוכים ל-galacose בקצה הלא מחזר של האוליגוסכריד, בעוד ש-MBL נקשר בעיקר ל-mannose.

H-ficolin מאדם דומה במבנה שלו ל-C1q ול-MBL (Holmskov וחב' ב-Ann Rev Immunol משנת 2003, ו-Zhang וחב' ב-Adv Exp Med Biol משנת 2008). H-ficolin המקודד על ידי הגן FCN-3 הממוקם על כרומוזום 1 בעמדה p36.111, מורכב מתת-יחידות מבניות הדומות לאלו של L-ficolin. כל תת-יחידה (trimer) מכילה מקטע CLD ושלושה מקטעי הכרה C-טרמינליים, הנקשרים לשיירי acetyl על שטח הפנים של חיידקים (Sugimoto וחב' ב-J Biol Chem משנת 1998, ו-Schlapbach וחב' ב-Clin Exp Immunol משנת 2009). ל-H-ficolin יש מקטע קולאגן קצר יותר מאלה ב-2 הפיקולינים האחרים. M-ficolin מקודד על ידי הגן FCN1 הממוקם על כרומוזום 9. בדומה למבנים של H-ficolin ו-L-ficolin,‏ M-ficolin מכיל מספר תת-יחידות שכל אחת מהן מכילה מקטע דמוי-קולאגן ושלושה מקטעי הכרה C-טרמינליים. M-ficolin נקשר לשטח פני החיידקים לשיירים GlcNAc ו-GalNAc, וכן לשיירי חומצה סיאלית (Teh וחב' ב-Immunology משנת 2000). M-ficolin מאדם הוא גם חלבון מפריש המשפעל את מסלול הלקטין של המשלים, והוא נמצא בגרנולות של נויטרופילים באדם, ויכול להיקשר לשטח פני מיקרו-אורגניזמים פולשים (Matsushita ב-J Innate Immun משנת 2010, ו-Rorvig וחב' ב-J Leukoc Biol משנת 2009).

פיקולינים ומחלות נגיפיות

מספר הולך וגדל של דיווחים מצביע על כך שתפקוד לקוי של פיקולינים עלול לשחק תפקיד קריטי במחלות נגיפיות רבות.

פיקולינים ונגיף hepatitis C

ההנחה היא שנגיף hepatitis C (להלן HCV) מדביק 170 מיליון בני-אדם ברחבי העולם, כאשר 80% מהמודבקים עם נגיף זה מפתחים הפאטיטיס כרונית עם סיכון להתפתחות של צירוזיס ואף קרצינומה הפאטו-צלולרית. מחקר עדכני הראה ששפעול מסלול הלקטין של המשלים יכול לתרום להדבקה עם HCV (Hu וחב' ב-Scand J Immunol משנת 2013). במטופלים עם הדבקה כרונית של HCV, הריכוזים של L-ficolin היו גבוהים באופן משמעותי במטופלים עם הדבקה כרונית ב-HCV עם רמות א-נורמליות מעל 40 יח'/לליטר של אלנין אמינוטרנספראז (ALT) בהשוואה למטופלים עם ערכי ALT נורמליים הנמוכים מ-40 יח'/לליטר, או בהשוואה לאנשים בריאים. הרמה הממוצעת של L-ficolin בנסיוב של מטופלים עם הדבקה כרונית של HCV היא בערך 6.0-7.2 מיקרוגרם/מ"ל, בעוד שרמתו באנשים בריאים 4.5-4.6 מיקרוגרם/מ"ל. לאחר תרפיה, ריכוזי L-ficolin ירדו לתחום הנורמה, ונמצאו במתאם טוב עם רמות ALT ו-HCV mRNA. מטופלים עם רמות גבוהות של L-ficolin בדגימות נסיוב בשלב מעקב מוקדם השיגו תגובה מהירה אנטי-נגיפית, מה שמצביע על כך של-L-ficolin יש in vivo השפעה anti-HCV (Liu וחב' ב-Cell Mol Immunol משנת 2009).

HCV מכיל שני חלבוני שטח פנים ברמת גליקוזילציה גבוהה, E1 ו-E2, ונמצא ש-L-ficolin נקשר לשני גליקופרוטאינים אלה. עם זאת, אם שני מרכיבים אלה (E1 ו-E2) היו מטופלים מראש על ידי N-glycanase, או אם התאים המבטאים את E1 ואת E2 היו מטופלים מראש על ידי מעכב של N-גליקוזילציה כגון deoxynojirimycin‏-1 (להלן DMN),‏ L-ficolin לא היה מסוגל להיקשר ל-E1 ול-E2. לכן, האינטראקציה בין L-ficolin לבין הגליקופרוטאינים E1 ו-E2 של HCV מיוחסת ל-N-glycans של E1 ושל E2. לאחר ש-L-ficolin נקשר לשני המרכיבים הללו של HCV, מסוגל L-ficolin לגרות רִבּוּץ (deposition) של C4 לסיוע בשפעול של מסלול הלקטין של המשלים בהפטוציטים מודבקים עם HCV (Endo וחב' ב-Int J Biochem Cell Biol משנת 2011). L-ficolin יכול גם להיקשר ביעילות ולעכב הדבקה של תאי HuH7.5.1 על ידי VCH בתרבית תאים, מה שתואם את השפעות ה-anti-HCV של L-ficolin בניסויים in vivo.

פיקולינים והנגיף הפאטיטיס B

הדבקה עם HBV עלולה לגרום למחלה חריפה או כרונית, שיכולה להתדרדר לדלקת כרונית או צירוזיס. מחקר במטופלים בווייטנאם הראה שאלה עם הפאטיטיס B חריפה היו עם רמות L-ficolin גבוהות יותר בנסיוב מאשר במטופלים עם קרצינומה הפטוצלולרית (להלן HCC) או אלה עם צירוזיס, או אלה עם הדבקה א-תסמינית עם HBV (Hoang וחב' ב-PLoS One משנת 2011). לאחר סריקת הגנוטיפ ל-snp תפקודי באזור הפרומוטר (-986G>A, -602G>A, 4A>G+) ובאקסון 8 (+6424G>T) על ידי rt-PCR במדגם הווייטנאמי שהיה מורכב מ-423 חולים מאובחנים עם HBV, ו-303 אנשי ביקורת בריאים, לא נמצאו הבדלים משמעותיים בגנוטיפ או בחלוקה האללית בין חולים ובריאים, או אף בתוך קבוצת המודבקים בנגיף.

פיקולינים ונגיף influenza A ונגיפים אחרים

נגיף influenza A (להלן IAV) הוא פתוגן אנושי חשוב הגורם מדי שנה מגיפות גלובליות. נגיף זה נושא על פניו 2 גליקופרוטאינים, המאגלוטינין (HA) ו-neuraminidase (NA), החיוניים להתרבות הנגיף בתאים המודבקים. L-ficolin ו-H-ficolin נמצאו מסוגלים לעכב את ההדבקה עם IAV in vivo ו-in vitro (Pan וחב' ב-J Innate Immun משנת 2012, ו-Verma וחב' ב-J Immunol מאותה שנה). רמת H-ficolin בדם היא בערך 20 מיקרוגרם/מ"ל, והיא גבוהה יותר מרמותיהן של שני הפיקולינים האחרים. נמצא ש-H-ficolin הוא בעל תפקיד בהגנת ה-innate כנגד IAV בדרכי האוויר בריאות.

בתרומה לנדירות של viremia בהדבקה עם IAV, ‏L-ficolin מזהה ונקשר ל-HA ול-NA ולתת-סוגים שונים של IAV, כאשר אינטראקציות אלו נמצאו מעוכבות באופן תחרותי על ידי GlcNAc. בנוסף, הקישור של L-ficolin ו-ficolin A הביא לשפעול של מסלול הלקטין של המשלים. L-ficolin נמצא חוסם הדבקות של influenza, הן in vivo כמו גם-in vitro. נמצא שהלקטין הכימרי הרקומביננטי (להלן RCL) שהוכן על ידי שחלוף המקטע הקולאגני MBL עם המקטע של L-ficolin, הוא בעל פעילות אנטי-נגיפית עדיפה על זו של MBL לבדו (Chang וחב' ב-Biochem Pharmacol משנת 2011). חלבונים כימריים המכילים את המקטע ה N-טרמינלי של L-ficolin ואת ה-CRD של MBL, מעכבים בחוזקה הן את IAV וכן את הנגיף Ebola‏ (Michelow וחב' ב-J Biol Chem משנת 2010). RCL יכול גם להיקשר לנגיפי NIPA ו-Hendra. הלקטין הכימרי של MBL ו-L-ficolin יעיל בשיפור ממצאי ההדבקה עם הזן H1N1 על ידי צמצום הכמות של מולקולות מקדמות דלקת ושדרוגן של מולקולות אנטי-דלקתיות (Takahashi וחב' ב-Virus Res משנת 2010). גם HIV מזוהה ונקשר על ידי L-ficolin המזהה את ה-N-glycan של הגליקופרוטאין gp120 של מעטפת הנגיף, תוך שפעול מסלול הלקטין של המשלים. עם זאת, מחלת ציטומגלו (CMV) לא כרוכה עם MBL (Egli וחב' ב-PLoS One משנת 2013). בנוסף, פיקולין מפלזמה של חזיר, נמצאה מפחיתה את כושר ההדבקה של reproductive & respiratory porcine syndrome virus (Keirstead וחב' ב-Antiviral Res משנת 2008).

פיקולינים ומחלות בקטריאליות

פיקולינים וMycobacterium tuberculosis

דווח שרמת L-ficulin (הידוע גם כ-ficolin-2) בנסיוב של 107 מטופלים עם TB פולמונרי, היו נמוכות בהרבה מאלו של נבדקים בריאים (Luo וחב' ב-PLoS One משנת 2013). אנליזה in vitro הראתה ש-L-ficolin נקשר לזן האלים H37Rv של חיידק השחפת באופן חזק יותר מאשר לחיידקים הלא-אלימים M. bovis BCG ו-M. Smegmatis. ‏L-ficolin נקשר לגליקוליפיד שעל פני השטח של H37Rv ובכך חסם את ההדבקה על ידי זן זה של תאי A549 בריאות אדם. גם תהליך האופסונו-פגוציטוזה הסתייע על ידי L-ficolin. הזרקה של L-ficolin אקסוגני הייתה בעלת השפעה מגינה בולטת כנגד חיידק השחפת האלים H37Rv בהדבקה של עכברים מסוג BALB/c ו-C57BL/6J. עכברי knockout עם חסר של Ficolin-A (שהיא מולקולה דמויית L-ficolin בעכברים) היו חשופים יותר להדבקה על ידי H37Rv.

מודל היפותטי של המנגנונים בתיווך L-ficolin, המעודדים הפרשה של ציטוקינים דלקתיים על ידי מקרופאגים, במהלך הדבקה עם מיקובקטריום טוברקולוזיס (על פי Luo וחב' ב- PLos Oneמשנת 2013).

פיקולינים וחיידקים גראם-שליליים

L-ficolin יכול להיקשר לקרבוהידרטים על פני שטח הפנים של חיידקים דרך מקטע FBG. נמצא שפיקולין זה נקשר לחיידקים גראם-שליליים כגון הזן Salmonella typhimurium TV119 וכן ל-Pseudomonas aeruginosas Kilpatrick) וחב' ב-Clin Respir J משנת 2009). נמצא ש-L-ficolin נקשר ל-זן TV119 שהוא Ra כמוטיפי המכיל GlcNAc חשוף בקצה הלא-מחזר של הפוליסכריד, אך אינו נקשר ל- ,LT2 שהוא זן חלק של S. typhimurium עם O-polysaccharide נוסף המכסה את ה-GlcNAc (Taira וחב' ב-Fukushima J Med Sci משנת 2009). הקישור של L-ficolin ל-TV119 מגביר את הפינוי של פתוגנים עם GlcNAc על פני שטח הפנים, מה שמרמז לכך ש-L-ficolin משמש כאופסונין המגביר את הפגוציטוזה על ידי לויקוציטים פולי-מורפו-נוקלאריים או על ידי מונוציטים, אך חסר פעילות אופסונית כנגד LT2 . L-ficolin יוצר קומפלקס תפקודי עםMBL- associated serine proteases וכן עם .small MLB-associated protein על ידי אימונו-פרציפיטציה תוך שימוש בנוגדן ל-L-ficolin, קומפלקס זה משפעל בדיעבד את מערכת המשלים, מה שמראה שפיקולין זה יכול לסייע בפינוי יעיל של פתוגנים על ידי שפעול מערכת המשלים ופגוציטוזה (Matsushita וחב' ב-J Immunol משנת 2000). גם M-ficolin ו-H-ficolin נמצאו נקשרים למבנים סוכריים על פני חיידקים גראם-שליליים (Akaiwa וחב' ב-J Histochem Cytochem משנת 1999, ו-Teh וחב' ב-Immunology משנת 2000). על בסיס הזיקה של שני הפיקולינים האחרונים ל-GlcNAc הם נקשרים ל-S. typhimurium ל-S. minnesota ול-E. coli.

פיקולינים וחיידקים גראם-חיוביים:

L-ficolin ו-M-ficolin נמצאו כרוכים עם מחלות מדבקות של חיידקים גראם-חיוביים. L-ficolin נמצא משפעל את מסלול הלקטין של המשלים על ידי קשירתו לשיירים סוכריים על פני חיידקים אלה, והמרצה של הפעילות האופסונית של נויטרופילים פולי-מורפו-נוקלאריים (Aoyagi וחב' ב-J Immunol משנת 2005). ההתקשרות של L-ficolin לסטרפטוקוקים type III group B או ל-Staph. aureus מביאה לשפעול של מסלול הלקטין (Lynch וחב' ב-J Immunol משנת 2004). פיקולין אנושי אחר, ,M-ficolinנמצא ממוקם בגרנולות המפרישות בציטופלזמה של נויטרופילים, מונוציטים ותאים אפיתליאליים אלבאולריים type II בריאות. M-fucolin נקשר ל-,S. aureus שהוא גראם-חיובי, ול-S.typhimurium LT2 (חיידק גראם-שלילי) (Fredriksen וחב' ב-Scand J Immunol משנת 2005). M-ficolin נקשר למספר נאו-גליקופרוטאינים המכילים ,GalNAc ,GlcNAc ו-sialyl-N-acetyllactosamine , ונראה ש-M-ficolin מסוגל לזהות את הקרבוהידרטים השכיחים הממוקמים על פני חיידקים. הודגם גם ש-M-ficolin נקשר ספציפית לחומצה סיאלית בקפסולה של Strep agalactiae (Kjaer וחב' ב-J Leukoc Biol משנת 2011). L-ficolin ממקור חזיר נקשר ל-Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 5B (Nahid וחב' ב-Developmental & Comperative Immunology משנת 2006). כן נמצא שהחיידק הגראם-חיובי היחיד ש-H ficolin נקשר אליו הוא Aerococcus vitridans (Tsujimura וחב' ב-Clinical Diagnosis Laboratory משנת 2001).

פיקולינים ודלקת:

נמצא שפיקולינים מעודדים ביטוי של ציטוקינים דלקתיים על ידי מקרופאגים. הודגם ש-L-ficolin יכול להגן מפני הדבקה של M. tuberculosis H37Rv האלים, לפחות חלקית על ידי שפעול של פוספורילציה על ידי Jun kinase (להלן (JNK, ועידוד של הפרשה של אינטרפרון-γ, אינטרלוקינים IL-17 ו-IL-6 כמו גם TNF-α וכן גם יצירת NO על ידי מקרופאגים.

Munthe-Fog וחב' דווחו בשנת 2009 ב-New England Journal of Medicine על מטופל עם היסטוריה של הידבקויות חמורות נשנות והתברר שהוא הומוגני למוטציה FCN3-1637DELc, והיה חסר לחלוטין H-ficolin בנסיוב, מה שמרמז שחסר של-H-ficolin היא מחלת חסר-חיסוני חדשה. דווח גם שרמות-H-ficolin נמוכות באופן קל במטופלים עם מחלת Crohn או עם קוליטיס כיבית בהשוואה עם אנשים בריאים. כן נמצאו רמות גבוהות של H-ficolin בשלייה של נשים הרות עם ,pre-eclampsia אם כי רמות פיקולין זה בנסיוב של אותן נשים היו נמוכות (Wang וחב' ב-Clin Chem משנת 2007). רמות L-ficolin היו במתאם עם מספר הנויטרופילים בדם של תורמי-דם בריאים כמו גם בדמם של מטופלים עם דלקת פרקים שגרונית (RA) (Ammitzboll וחב' ב-Rheumatol Int משנת 2012). חוקרים אלה דיווחו שרמת M-ficolin הייתה גבוהה פי-30 בנוזל הסינוביום של מטופלים עם RA פעילה, בהשוואה לרמתו במטופלים עם .osteoarthritis

הוראות לביצוע הבדיקה: אין צורך בצום או בהכנות מיוחדות. את הדם יש לאסוף במבחנה כימית (פקק אדום או צהוב), ולאחר הסרכוז יש להקפיא את הנסיוב בקירור (יציב 4 ימים), או בהקפאה (יציב 30 יום), עד לביצוע הבדיקה בשיטת .ELISA