פוספטידיל-אינוזיטול - Phosphatidylinositol

הדפס

מדריך בדיקות מעבדה
פוספטידיל-אינוזיטול
Phosphatidylinositol
שמות אחרים	inositol phospholipid ,PI
מעבדה	כימיה בדם
תחום	איתות תאי על ידי ליגנדים ומגע בין-תאי.
יוצר הערך	פרופ' בן-עמי סלע

היסטוריה

PI התגלה בסוף המאה ה-19 על ידי Léon Maquenne (Maquenne ב־Comptes rendus hebdomadaires des séances de l'Académie des Sciences משנת 1887, ו-Johann Joseph von Scherer בחיידקים, אך בהמשך התגלה באאוקריוטים, והתברר כמולקולת איתות. PI יכול להופיע ב 9 איזומרים שונים, והוא ליפיד המכיל קבוצת פוספאט, שתי שרשראות של חומצות שומן, ומולקולת סוכר אינוזיטול. כיוון שקבוצת הפוספאט טעונה שלילית בערכי pH פיזיולוגיים, מולקולת PI היא אמפיפילית. הייצור של המולקולה מוגבל לרטיקולום האנדופלזמטי. במקור PI נודע כ-inosite בגלל טעמו המתוק, והבידוד והאפיון של inositol הביאו להבנת המבנה של .cyclohexanol המחקר של Théodore Posternak הביאו להבנת הקונפיגורציה של myo-inositol שהיא הצורה המרכזית שמוצאים ברקמות אאוקריוטיות (Posternak ב-Helv Chim Acta משנת 1942).

ביוסינתזה

הסינתזה של PI מוגבלת לרטיקולום האנדופלזמטי (להלן ER), שהוא מרכיב הממברנה הגדול ביותר בתא (Schink וחב' ב-Ann Rev Cell Develop Biol משנת 2016). ה-ER גם תורם לסינתזה של רוב הפוספוליפידים, כלומר פוספטידיל סרין, פוספטידיל כולין, פוספטידילאתנולאמין ו-טריאצילגליצרול (Choy וחב' ב-BioAssays משנת 2017). הסינתזה כורכת סדרה של ריאקציות אנזימטיות. הביוסינתזה והפוספורילציה של PI מוגבלת בעיקר לצד הציטוזולי של האורגנלים על ידי קינאזות, אך לא ב-PI ספציפית. סינתזה de novo של PI מתחילה עם שלב האצילציה של glyceraldehyde-3-phosphate (להלן G-3-P) על ידי אנזימי GPAT בעמדת שרשרת sn-1 acyl (Ridgway ב-Biochem Lipids משנת 2016). תהליך זה מלווה על ידי אצילציה שנייה עם אנזימי LPAAT1, LPAAT2 ו-LPAAT3 בעמדת שרשרת sn-2 acyl (Chatterjee וחב' ב-Biochemistry משנת 2021). תהליך דו-שלבי זה גורם לאצילציה של G-3-P לחומצה פוספטידית (להלן PA), שעוברת לתרכובת הביניים CDP-diacylglycerol (CDP-DG) על ידי האנזים synthase. סינתזה זו מקוטלזת על ידי האנזימים CDS-1 ו-CDS-2. בשלב האנזימטי האחרון, CDP-DG ו-inositol מקוטלזים על ידי האנזים PI synthase ליצירת PI (Bunney ו-Katan ב-Trends Biochem Sci משנת 2011, ו-Ivanova ו-Atyakpa-Adajil ב-Biochim Biophys Acta משנת 2023).

מבנה ופיזיולוגיה

PI שייך למשפחת ה־phosphatidylglycerides ונמצא באופן אופייני כמרכיב מינורי בצד הציטוזולי של ממברנות תאים אאוקריוטיים. קבוצת הפוספאט מעניקה מטען שלילי ל-PI שיכול להתקיים ב-9 צורות שונות: scyllo ,muco ,epi ,neo ,allo ,D-chiro ,L-chiro ,cis-inositol ו-myo. איזומרים אלה שכיחים בביולוגיה ויש להם תפקידים רבים, לדוגמה רגישות לטעם, בקרה על רמות פוספאט, שעתוק, ייצוא של mRNA וזרימה מטבולית. הצורה האסטרית של inositol בליפידים, בעיקר PI, נמצאה לראשונה בחיידקים ומאוחר יותר ביצורים אאוקריוטיים על ידי Clinton Ballou (Pize וחב' ב-J Am Chem Soc משנת 1959, ו-Ballou וחב' באותו כתב עת מאותה שנה, ועל ידי Dan Brown ב־J Chem Soc משנת 1961). הגילוי של PI ושל הנגזרות שלו לצד תפקידן המורכב באיתות תאי, מהווה פרק משמעותי בביוכימיה של התא (Irvine ב-J Lipid Res משנת 2016). Cis-inositol הוא האיזומר היחיד שאנו נמצא באופן טבעי בטבע. טבעת ה-inositol יכולה לעבור פוספורילציה על ידי מגוון של קינאזות בעמדות 3, 4 ו-5 של קבוצות ההידרוקסיל ב-7 קומבינציות אפשריות. עם זאת, קבוצות הידרוקסיל 2 ו-6 אינן מזורחנות באופן אופייני בגלל הפרעה סטרית (Falkenburger וחב' ב-J Pathol משנת 2010). כל 7 הווריאציות של הפוספו-אינוזיטידים הבאים נמצאו בבעלי חיים:

• PI-מונופוספאטים: 3-phosphate ו-PI-5-phosphate.
• PI דו-פוספאטים: Phosphatidylinositol 3,4-bisphosphate ,Phosphatidylinositol 3,5bisphosphate, ו-Phosphatidylinositol 4,5-bisphospha.
• PI תלת-פוספאטים: .Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate

פוספואינוזיטידים אלה נמצאים גם בתאי צמחים, פרט ל־Tabaei) PIP3 חב' ב־Anal Chem משנת 2016).

הידרוליזה

המשמעות של המטבוליזם של PI קשורה לתפקידו בטרנסדוקציה פוטנציאלית המשתמעת ממחקרים המראים את ההידרוליזה המושרית על ידי נוירו-טרנסמיטורים. הידרוליזה זו מתחילה עם האנזים PI 4-kinase α (להלן (PI4Kα, המסב את PI ל-PI-4-phosphate (להלן PI4P), שמוסב לאחר מכן ל־PI biphosphate (להלן (PI(4,5)P2 על ידי האנזים PI 4-phosphate-5-kinase (להלן PI4P5K).PI(4,5)P2 עובר אז הידרוליזה על ידי phospholipase C ליצירה של inositol (1,4,5) triphosphate (IP3) ו-diacylglycerol. בהמשך, diacylglycerol עובר פוספורילציה לחומצה פוספטידית על ידי DG kinase, אך חומצה פוספטידית יכולה להיווצר ישירות מפוספטידילכולין על ידי האנזים phospholipase D.

Phosphatidylinositol 3-kinase וסרטן

הגילוי של phosphatidylinositol 3-kinase (להלן PI3K) שינתה את דרך ההתבוננות וההבנה שלנו על האיתות של גורמי גדילה. כבר משלב מוקדם היה ברור ש-PI3K משחק תפקיד חשוב במצבי מחלה רבים. עם זאת, הגילוי של אונקוגן בעת שהביולוגיה של סרטן החלה להיות מובנת יותר, חיזקה של האסוסיאציה של PI3K עם סרטן. בתנאים רגילים, PI3K משחק תפקיד אינטגרלי בתרגום של איתותי גדילה חוץ-תאיים לפעילות תוך-תאית המעודדת גדילה על ידי קישור של ביוסינתזה של מאקרו-מולקולות עם האתחול של התקדמות מחזור חיי התא. תאים סרטניים מנצלים את PI3K כגורם רגולטורי על ידי יצירת אסטרטגיות להגביר את פעילותו.

הגילוי של אונקוגן

PI הוא ליפיד אמפיפילי (דהיינו ליפיד עם תכונות הידרופיליות והידרופוביות (או ליפופיליות)) המשחק תפקיד קריטי בתא, אף על פי שהוא מהווה רק פרקציה קטנה בממברנת התא. מבחינת מבנהו PI הוא די-אציל-גליצרול, המורכב משתי שרשראות של חומצות שומן, הקשורות למולקולת גליצרול על ידי קשרים אסטריים, עם קבוצת ראש אינוזיטולית.

המטען של ראש האינוזטול יכול להשתנות על ידי הוספה של קבוצות פוספאט לשרשראות ההידרוקסיל הצדדיות של טבעת האינוזיטול. בשנות ה-50 היה ידוע שעמדות הידרוקסיל 4 ו-5 יכלו לעבור פוספורילציה כדי ליצור שני סוגים של PI: (להלן PI4P), ו־phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (להלן PI-4,5-P2). הסוג האחרון נמצא בשנות ה-80 להיות הקודמן של inositol 1,4,5-trisphosphate (להלן IP3), המפקח על רמות סידן הציטוזוליות ועל רמות diacylglycerol, המשפעלות את המשפחה של פרוטאין קינאזות C של סרין ותראונין הידועה כ-Cantley) PIK3R1 וחב' ב-Ann NY Academy Sci משנת 1986). PIK3R1C מקודד את תת-היחידה הרגולטורית p85α. תגליות אלו חשפו את החשיבות של הצורות המזורחנות של PI (הפוספואינוזיטידים) ותגובתם למספר הורמונים.

המבנה של PI

חלבון עם פעילות של PI kinase נמצא שהוא מבודד ביחד עם v-Src ו-Ros-1 (Sugimoto וחב' ב-Proc Natl Acad Sci USA משנת 1984, ו-Macara וחב' באותו כתב עת משנת 1986), ואותה פעילות של kinase PI נמצאה מאוחר יותר קריטית לטרנספורמציה של התא על ידי חלבון polyoma middle-T (Whitman וחב' ב-Nature שנת 1985). קינאזה זו, שהוסב כינויה ל-PI3K, כרוכה באופן ספציפי לטירוזין קונאזה המשופעל, יכולה לזרחן את עמדה 3 של טבעת הטירוזין, מה שמביא לגילוי של הפוספוליפידים הבאים: phosphatidylinositol 3-phosphate (להלן PI3P) (Auger וחב' ב-Cell משנת 1989). שלושת ליפידים אלה הוחמצו במחקרים מוקדמים, מסיבת היותם מעטים בהשוואה ל־PI-3,5-P2, ול-PI4P. שני פוספואינוזיטידים נוספים, PI5P ו-PI-3,5-P2, שהם אף בריכוז נמוך יותר, התגלו אף הם (Rameh וחב' ב-Nature משנת 1997, ו-Whiteford וחב' ב-Biochem J מאותה שנה). כלאחד מפוספואינוזיטידים אלה ידוע כמשחק תפקיד ייחודי בהעברת איתותים. PI-3,4-P2 ו-PIP3, נמצאו בדיעבד מתווכים את תגובות של התא לאינסולין.

איתות על ידי PI3K

מאז זיהויו נמצא ש-PI3K מהווה קבוצת ליפאזות שניתנות לחלוקה ל-3 קבוצות על בסיס העדפת המצע שלהן (Courtney וחב' ב-J Clin Oncol משנת 2010). Class I PI3Ks משופעלים על ידי אינסולין וגורמי גדילה אחרים, וכרוכים ישירות בשגשוג תאי סרטן. קבוצה זו מתחלקת לשתי קטגוריות: class IA kinases הקשורה ל-RTKs, ו־class IB kinases הקשורה ל-קולטנים המחוברים לחלבוני G.‏ Class IA PI3K הם הטרודימרים, המורכבים מתת-יחידה קטליטית אחת (pI10β, PI10α ו-PI10δ), ותת-יחידה רגולטורית אחת (p50α, 85β, p85α ,5γ או- p55α) (Thomas וחב' ב-Angewandte Chemie משנת 2016). האיזופורם PI10α, המקודד על ידי PIK3CA, מבוטא ברקמות רבות (Hoener ו-Brodbeck ב-Eur J Biochem משנת 1992), והוא חיוני לפרוליפרציה במהלך האמבריוגנזה (Falkenburger וחב' ב-J Pathol משנת 2010), ולהתמרה אונקוגנית. בסרטן אנושי, PIK3CA וחברי משפחת PI3K, עוברים מוטציות או אמפליפיקציה בשיעורים גבוהים בסוגי הסרטן השונים (תמונה).

סקירה של איתות על ידי PI3K

PIP3 הוא אחד ה־second messengers החשובים ביותר בתא. כאשר הוא נוצר, הוא מגייס מגוון של חלבונים ממברנליים על ידי קישור לאזור של 100 חומצות אמינו על חלבון היעד, אזור הקרוי pleckstrin-homology (PH) domain (Harlan וחב' ב-Nature משנת 1994). בערך 40 חלבונים ביונקים מכילים מקטעי PH אלה הקושרים PIP3 (Park וחב' ב-Mol Cell משנת 2008), כולל משפחת AKT של סרין-תראונין קינאזות (Burgering ו-Coffer ב-Nature משנת 1995, ו-Franke וחב' ב-Cell משנת 1995). הקישור של AKT ל-PIP3, מאפשר לו להגיע לקרבה עם קינאזות PH, ועם 3-phosphoinositide–dependent protein kinase 1 (להלן (PDK1). ‏PDK1 מזרחן ומשפעל את AKT המשומר על שייר תראונין (T308) (Alessi וחב' ב-Curr Biol משנת 1997). AKT המשופעל מדרבן את איתות הגדילה על ידי זרחון ישיר של שני חלבונים הקשורים בקליטת גלוקוז (AS160 ו-TXNIP), בסינתזה של גליקוגן (GSK3), בשגשוג תאים (TSC2) ו-(PRAS40, ובהישרדות תאים (FOXO ו-BUD) (Manning ו-Cantley ב-Cell משנת 2007, ו-Waldhart וחב' ב-Cell Rep משנת 2017). אף על פי ש-PIP3 משתמע כ־phosphoinositide הקריטי ביותר לאתחול קסקדה זו של אירועים, גם PI-3,4-P2 מגיב עם AKT ועם PDK1 ועשוי לשחק תפקיד מרכזי בתגובות התא (Franke וחב' ב-Science משנת 1997). PI שכיח במיוחד ברקמת המוח, שם הוא מהווה עד 10% מהפוספוליפידים, אך ניתן למצוא אותו גם בכל הרקמות, בכל סוגי התאים, וכן בממברנות בריכוזים נמוכים בהשוואה לפוספוליפידים אחרים.

הוראות לביצוע מדידת PI

דם נלקח וסורכז בקור תוך 30 דקות מלקיחתו: לאחר הפרדת הנסיוב מהתאים יש לאחסן את דגימה בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס, ויש להעביר למעבדה עם קרח יבש. השיטה המקובלת והמדויקת ביותר לקביעת ריכוז PI בדם היא על ידי LC משולבת עם liquid chromatography צולב עם triple quadrupole mass spectrometers ‏ (Triple Quad 6500 LC-MS/MS System).

.