חלבון ספטין-5 - Septin-5

הדפס

מדריך בדיקות מעבדה
ספטין 5
Septin 5
מעבדה	כימיה בדם והמטולוגיה
תחום	ביולוגיה של התא.
יוצר הערך	פרופ' בן-עמי סלע

Septin-5 הוא חלבון שמקודד באדם על ידי הגן SEPT5, כאשר משפחת גן זה מקודדת לחלבונים קושרי נוקלאוטידים. במקור חלבונים אלה תוארו באצות כרגולטורים של מחזור החלוקה. הספטינים משומרים מאוד באצות, בדרוזופילה ובעכברים, ונראים מתפקדים לוויסות הארגון של ה-cytoskeleton. פגיעה בתפקוד הספטינים פוגעת בציטוגנזה וגורמת להיווצרות של תאים רב-גרעיניים או פוליפלואידים. הגן האמור ממוקם בעמדה 22.2, q11. האזור החסר לרוב בתסמונת DiGeorge עם תסמינים ולו-קרדיו-פציאליים (McKie וחב' ב-Hum Genet משנת 1997). טרנס-לוקציה של הגן MLL והגן SEPT5 נמצאה בחולים עם לויקמיה מייאלואדית חריפה. שני עותקים של זן זה, עותק עיקרי בגודל של 2.2kb ועותק מינורי בגודל של 3.5kb התגלו. מקור העותק 2.2kb בניצול של סיגנל poly A (AACAAT).

Septins הם קבוצה של חלבונים הקושרים GTP המבוטאים בכל התאים ה-eukaryotic פרט לצמחים (Neubaue ו-Zieger ב-Front Cell Develop Biol משנת 2017, Weirich וחב' ב־Nat Rev Mol Cell Biol משנת 2008, ו-Douglas וחב' ב־Eukaryotic Cell משנת 2005). ניתן למצוא ספטינים בשמרים, בבעלי חיים ובמספר אצות אאוקריוטות.

באדם, ספטינים כרוכים בציטוקינזה, ביצירת ריסים ובנוירוגנזה, דרך היכולת לגייס חלבונים נוספים או לשמש כמחסומי דיפוזיה. ישנם 13 גנים שונים באדם המקודדים לספטינים. חלבוני הספטין המקודדים על ידי גנים אלה, מרוכזים ב-4 תת-משפחות:

1. משפחת SEPT2 הכוללת את SEPT4 ,SEPT1 ו-SEPT5
2. משפחת SEPT3 הכוללת את SEPT12, SEPT9
3. משפחת SEPT6 הכוללת את SEPT10, SDEPT11 ו-SEPT13
4. משפחת SEPT7

קומפלקסים של חלבוני ספטין נאספים כדי לייצר או הטרו-הקסמרים הנאספים מכל אחת משלושת הקבוצות ומונומר מכל אחת מהקבוצות הנמצא בשני עותקים, או לייצר הטרו-אוקטמרים (המורכבים ממונומרים של אחת מ-4 הקבוצות, כאשר כל מונומר מופיע בשני עותקים. הטרו-אוליגומרים אלה יוצרים מבנים מורכבים יותר כגון פילמנטים ומבנים טבעתיים (Mostowy ו-Cossart ב-Nat Rev Mol Cell Biol משנת 2012, ו-Kinoshita ב-Curr Opin Cell משנת 2006). ספטינים יוצרים מעין כלובים סביב פתוגנים בקטריאליים, תוך שהם מונעים את תנועת החיידקים ומונעים את חדירתם לתאים בריאים. מנגנון הגנה זה עשוי להיות מנוצל ליצירת תרפיה כנגד דיזנטריה ומחלות אחרות, כגון Shigella שהיא חיידק העלול לגרום לשלשולים קטלניים באדם (Mostowy וחב' ב-Cell Host Microb משנת 2010). חיידקים הלכודים ב"כלובים" שיוצרים כנגדם ספטינים, מתפרקים על ידי אוטופגיה (Mostowy וחב' ב-J Biol Chem משנת 2011). מוטציות בגנים המקודדים לספטינים עלולות לגרום ללויקמיה, לסרטן המעי הגס ולמצבים נוירו-דגנרטיביים כפרקינסון ומחלת אלצהיימר (Mascarelli ב-Nature משנת 2011).

היסטוריה

הספטינים התגלו בשנת 1970 על ידי Leland Hartwell בחיפוש אחר מוטנטים רגישים לטמפרטורה המשפיעים על חלוקת תאים באצה Sac cerevisiae. חיפוש זה זיהה 4 מוטנטים המונעים ציטוקינזה, דינמיקה של הממברנה ומורפולוגיה של התא בטמפרטורות המונעות אותה. הגנים המושפעים מייצגים ארבעה ספטינים מקוריים, ScCDC11 ,ScCDC10 ScCDC3 ו-ScCDC12 (Douglas וחב' ב-Embryonic Cell משנת 2005). למרות ציטוקינזה פגועה, התאים ממשיכים להנץ, לסנתז DNA ולהתחלק, מה שגרם ליצירת תאים רב-גרעיניים עם נִיצָּנים או נֶבטים רבים ומוארכים. בשנת 1976, אנליזה בעזרת מיקרוסקופ אלקטרוני, גילתה בערך 20 תלמים (straiations) של פילמנטים באורך של 10 ננומטר סביב "צוואר" הנבט האימהי בתאים wild-type, אך לא בתאים עם מוטציה של ספטין (Gladfelter ב-Nat Rev Microbiol משנת 2006). המיקום של כל ארבעת הספטינים משובש במוטנטים ScCDC3 ו-ScCDC12. תמיכה מחוזקת לממצא זה התקבלה ממחקרים ביוכימיים: ארבעת הספטינים המקוריים בודדו על עמודת-זיקה (affinity column) ) יחדיו עם חלבון ספטין חמישי המקודד על ידי ScSEP7 ו-ScSHS1. ספטינים מנוקים מאצה מניצה, מזבוב דרוזופילה ומתאי יונקים מסוגלים להתמזג in vitro ליצירת פילמנטים.

אינטרפרטציה: Septin-5 הוא סמן של צורה המתקדמת במהירות של אטקסיה מוחונית (cerebellar) אוטואימונית (Honorat וחב' ב-Neural Neuroimmunol Neuroinfamm משנת 2018). מדובר בהפרעה בקואורדינציה של התנועות הרצוניות, והיא נחשבת לתסמין האופייני ביותר של פגיעה במוח הקטן (צרבלום). הביטוי הבולט ביותר הוא הליכה בלתי יציבה, המלווה בתחושת סחרחורת סיבובית או אי-יציבות עם נטייה לנפילות. בנוסף תנועות הגפיים העליונים אינן נשלטות. אטקסיה נרכשת יכולה להופיע באופן פתאומי וזמני כתוצאה מחומרים שפוגעים בתפקוד הצרבלום (אלכוהול, תרופות, הרעלות עם כספית או דבק), או על רקע מחלות נגיפיות (אנצפליטיס). אטקסיה תורשתית מתחילה בילדות על רקע התפתחות חלקית או ניוון מוקדם של המוחון. המחלה עלולה להופיע כ־Friedrich's ataxia, ונמשכת לאורך מספר שנים. המחלה מפגיעה בחלקים אחרים של מערכת העצבים המרכזית שמתקשרים במסלולים ישירים לצרבלום, כגון פגיעה בחוט השדרה (כמו בעגבת, חוסר בוויטמין B₁₂ או בגזע המוח. בתסמונת אטקסיה המופיעה בגיל מבוגר עם מעורבות של מערכת הראייה ושל מערכות אחרות, קיימות צורות של אטקסיה ספינוצרבלרית (spinocerebellar). מדובר במחלות אוטוזומיות דומיננטיות עם התפתחות איטית ועם תגובה לטיפול. אטקסיה יכולה להיגרם גם מפגיעה במערכת העצבים ההיקפית בתזונה (נוירופתיה) על רקע מחלות שגורמות לכך כמו חסר ויטמינים. מטופלים עלולים להופיע עם צורה א-תסמינית של אטקסיה עם תנועות עיניים מהירות (oscullopasia), אך מצב החולה עשוי להשתפר עם טיפול אימונותרפי.

תוצאה סרו-פוזיטיבית של נוגדנים כנגד septin על ידי צביעה אימונו-פלואורסצנטית בלתי-ישירה, תואמת את האבחון של מחלה אוטו-אימונית של מערכת העצבים המרכזית. צביעת CBA ל-septin-5 IgG מאששת את האבחון. עם זאת, תוצאה שלילית של septin-5 IgG בשיטת CBA אינה שוללת אוטו-אימוניות נוירולוגית או סרטן. בשיטת CBA דגימת הנסיוב מונחת על זכוכית הנושא המכילה תאי HEK-293 שעברו טרנספקציה ושלא עברו טרנספקציה. לאחר אינקובציה של 30 דקות בטמפרטורת החדר, ושטיפת ה-slide, מוסיפים נוגדנים ממקור עז מסומנים עם פלואורסצאין כנגד IgG אנושי, לגילוי של ה-IgG הנבדק. אותן בדיקות ושיקולים הם בתוקף כאשר מחפשים אימונו-נוגדנים כנגד septin-5 בנוזל השדרה (CSF).

ספטינים הם בעלי תפקודים מגוונים (Asada וחב' ב-J Neuroscience Res משנת 2010, ו-Neubauer ו-Zieger ב-Front Cell Dev Biol משנת 2017). נמצא שהביטוי של הגן המקודד ל-septin-5 פעיל בלבלב אנושי בריא וסרטני (Capurso וחב' ב-Neuroendocrinol משנת 2005). ב-CNS ספטינים משחקים תפקיד באקסוציטוזיס ובהסתעפות של דנדריטים (Bartsch וחב' ב-Thromb Hemost משנת 2011). בסינפסות, ספטינים מספקים שלד כרוך לממברנה, ומאפשרים רגולציה של התגובה של אקסוציטוזיס שיכולה להיות סטימולטורית על ידי septin-2 או מעכבת על ידי septin-5 (Tokhtaeva וחב' ב-J Biol Chem משנת 2015, Amin וחב' ב-J Neurosci משנת 2008, ו-Yang וחב' ב-Neuron משנת 2010). בנוסף לביטויו בקצוות הבתר-סינפטיים ב-CNS‏, septin-5 ממוקם יחד עם septin-7 ו-septin-11 בנקודות הסתעפות של הדנדריטים הנוירונליים (Kaplan וחב' ב-Front Cell Dev Biol משנת 2017).

זיהוי ואישור של septin-5 כאנטיגן

בשיטה של immunoblotting של תמצית מוח עכבר עם נסיוב, התגלה פס אימונו-ריאקטיבי משותף, עם משקל מולקולרי של 45 אלף דלטון, בקרב דגימות באדם. נסיוב של מטופל ו-IgG מנוקה מוצו מאותו פס של 45,000 דלטון, הדגימו את אותו מתווה על ידי צביעה פלואורוסצנטית. על מנת לזהות את אנטיגן היעד, בוצעה השקעה אימונית של תמצית מוח העכבר, תוך שימוש ב-IgGs ממטופלים. אנליזה על ידי מס-ספקטרומטריה של חלבונים שנקשרו על ידי IgGs שעברו קישור על ידי זיקה ל-,affinity gel הדגימה את הקשר בין הפוליפפטידים לבין septin-5. על מנת לאשש את היות septin-5 אנטיגן בעל עניין, נעשה שימוש בריקוביננט של החלבון septin-5 באנליזה ב-Western blot שנוסתה בנסיוב. הודגם שהנסיוב של מטופלים אך לא נסיוב ביקורת, היה בעל immuno-reactivity חזקה עם septin-5.

אינטראקציה של septin-5 בטסיות ובתאים אנדותליאליים

בטסיות, מספר ספטינים (2, 4, 5, 7, 8, 9 ו-11) מבוטאים מה שנראה חיוני לרגולציה של ספטינים אלה את פעילות הטסיות (Yagi וחב' ב-Gene משנת 1998, Zieger וחב' באותו כתב עת משנת 2000, Blaser וחב' ב-Thromb Hemost משנת 2004, Bartsch וחב' באותו כתב עת משנת 2010, ו-Sandrock וחב' ב-Biol Chem משנת 2011). מיקרוסקופ אלקטרוני גילה ש-SEPT4 ו-SEPT8 מקיפים את גרנולות α, כמו שנמצא גם לגבי SEPT5, כלומר אלה משמשים מרכיבים של אותו קומפלקס בטסיות המווסת את הביולוגיה של תאים אלה. שפעול של טסיות על ידי אגוניסטים גרם לטרנסלוקציה של SEPT4 ושל SEPT8 לשטח הפנים של הטסיות מה שעשוי להיות חלק מהפרשת חלבונים אלה (Dent וחב' ב-Proc Natl Acad Sci USA משנת 2002, ו-Martinez וחב' ב-Thromb Hemost משנת 2006). טסיות מעכברים החסרים SEPT5 הן בעלות שוני בהפרשה גרנולרית של סרוטונין מה שמצביע על מעורבותם של ספטינים בפיזיולוגיה של הטסיות. עכברים החסרים SEPT5 הם בעלי הגדלה משמעותית בתרחישי דימום בהשוואה לעכברים wild-type. האינטראקציה בטסיות בין SEPT5 לבין synaxin-4, הקשורה לטרנספורט של שלפוחיות, מרמז למשמעות של SEPT5 בהפרשה של השלפוחיות התאיות. נמצא גם ש-SEPT5 ממוקם ביחד עם SEPT6 בפריפריה של הטסיות, וכן בציטופלזמה שלהן, וכן בקומפלקס המיקרוטובולרי שלהן. בטסיות, SEPT5 זוהה כמי שקשור ל-SEPT11 בוויסות ההפרשה מהשלפוחיות (Blaser וחב' ב-J Pathol משנת 2006).

ספטינים רבים מבוטאים ברקמות גוף רבות, ולדוגמה SEPT6 (Ono וחב' ב-Cancer Res משנת 2002), ספטינים 7, 9 ו-11 (Hanai וחב' ב-FEBS Lett משנת 2004), מבוטאים בטסיות, במוח ובלב (McKie וחב' ב-Human Genet משנת 1997). בנוסף, חסר של SEPT5 גורם להשפעות פליאוטרופיות על התנהגויות רגשניות ועל תפקודים קוגניטיביים, כפי שהודגם בעכברי knock-out החסרים SEPT5. בתאי HIT-T15 עם מוטציות ב-SEPT5 בתוך המקטע הקושר GTP, יש הגברה של הפרשה גרנולרית (Beites וחב' ב-Nature Neurosci משנת 1999). כפי שכבר נאמר, בתאים אנדותליאליים באדם, SEPT4 ו-SEPT11 כרוכים בתהליכים אנדו-ואקסוציטוטיים על ידי אינטראקציה עם חלבוני שלפוחיות התא (Bartsch וחב' ב-THromb Hemost משנת 2010). מחקרים אלה מאשרים את העדפות הקישור של תת-הקבוצה SEPT2 המורכבת מ-SEPT4 ו-SEPT5 עם חברים בתת-הקבוצה SEPT6 המורכבת מ-SEPT8 ו-SEPT11. ביטוי יתר של SEPT5 כרוך במספר קטן יותר אך גרנולות-α גדולות יותר בטסיות. הגן המקודד ל-SEPT5 ממוקם באתר הכרומוזומלי 2.2q11.2 הקשור לתסמונת DiGeorge (עיוותים בפנים) (McDermid ו-Morrow ב-Am J Hum Genet משנת 2002).

הספטינים קבלו את שמם בגלל המעורבות של יצירת septum במהלך הנצת השמרים. המספר של 13 הספטינים משתנה בתאים האאוקריוטיים מ-1 במספר אצות ל-13 באדם (Cao וחב' ב-Cell Mol Life Sci משנת 2009, ו-Nishihama וחב' ב-Biol Chem משנת 2011). כל הספטינים הידועים בעלי משקל מולקולרי של 30–65 קילו-דלטון, הם בעלי מבנה מקטעים משותף: המקטע המרכזי המאוד משומר הקושר GTP, ומקטעים –N טרמינלי ו-C- טרמינלי וריאביליים, הקשורים כנראה בתיווך של אינטראקציות עם חלבונים (Trimble ב-J Membrane Biol משנת 1999). בין הקצה ה-N-טרמינלי והמקטע הקושר GTP נמצא מקטע polybasic קצר ברוב רצפי ספטין, ומקטע זה נקשר ישירות ל-phosphatidylinositol biphosphate (להלן PIP2) ועשוי להיות אחראי לקישור לממברנות תאים (Casamayor ו-Snyder ב-Mol Cell Biol משנת 2003). מקטע הקרוי septin-unique domain (להלן SUD) בעל תפקיד לא ידוע ממוקם בקרבת הקצה ה-C-טרמינלי (Pan וחב' ב-BMC Evol Biol משנת 2007). למקטע ה-GTPase (להלן G domain) יש מבנה משני מעורב (α -helix/β-shee)t המכיל שלושה motifs, מתאפיין על ידי נוכחות של לולאת P והוא מסוגל להיקשר עם קבוצות של נוקלאוטיד-פוספאט. שניים מה-motifs (G3 ו-G4) כרוכים ישירות עם הקישור ל-GTP (Sirajuddin וחב' ב-Proc Natl Acad USA משנת 2009). בהתבסס על ההומולוגיה של הרצף של חומצות האמינו ועל מספר מקטעי coiled-coil, ספטינים של יונקים יכולים לעבור תת-חלוקה לארבע קבוצות שונות-SEPT6, SEPT3, SEPT2 ו-SEPT7. מקטע SEPT2 המכיל את SEPT1,2,4,5 מכיל שני מקטעי coiled-coil. לתת-קבוצה SEPT3 המכילה את SEPT3,9,12 אין מקטעי coiled-coil. תת-קבוצה SEPT6 המכילה את SEPT6,8,10,11,14, ותת-קבוצה SEPT7 המכילה רק את SEPT7 מורכבים ממקטע coiled-coil יחיד (Macara וחב' ב-Mol Biol Cell משנת 2007, ו-Kinoshita ב-Genome Biol משנת 2003).

הספציפיות של אינטראקציות של ספטינים

שלא בדומה לחלבונים דמויי-RAS הנקשרים ל-GTP, הספטינים יכולים להתלכד לקומפלקסים multimeric הכוללים שניים או יותר תת-יחידות בתלות באורגניזם (Field וחב' ב-J Cell Biol משנת 1996, John וחב' ב-EMBO J משנת 2007, ו-Sellin וחב' ב-Mol Biol Cell משנת 2011). החלוקה של הספטינים לארבע תת-קבוצות רלוונטית ליצירת הקומפלקסים שלהם כיוון שספטינים אינדיבידואליים מכל תת-קבוצה יכולים לעבור פולימריזציה למגוון של מבנים בדרגת סדר גבוהה יותר, כגון פילמנטים, צרורות או טבעות (Mostowy ו-Cossart ב-Nat Rev Mol Cell Biol משנת 2012). מספר מחקרים הראו העדפת קישור המוגבלת לתת הקבוצות, ואת העובדה שצורות פילמנטיות אופייניות כרוכות בהטרו-טרימר כלִיבָּת הקַשְׁרִיר (nodule) (Sirajudin וחב' ב-Nature משנת 2007, Nakahira וחב' ב-PLoS One משנת 2010, ו-Sandrock וחב' ב-Biol Chem משנת 2011). Sirajuddin וחב' פתרו ראשונים את המבנה הגבישי של קומפלקס הספטינים ביונקים המכיל את SEPT2,6,7, והדגימו שהמבנה ההקסמרי של קומפלקס זה כטרימר "ראש לראש" הוא לפי הסדר של 7-6-2-2-6-7 (Sirajuddin וחב' ב-Nature משנת 207). בספטינים מאדם מתלכדים מעצמם קומפלקסים אלה ליצירה של הטרו-הקסמרים או הטרו-אוקטמרים, כאשר ההטרו-אוקטמרים מכילים בנוסף גם חברים בתת-הקבוצה SEPT3 (Sellin וחב' ב-Mol Biol Cell משנת 2014). נמצא גם ש-SEPT9 מכסה את הקצוות של הקומפלקסים האוקטמרים עם SEPT7 בצורת 9-7-6-2-2-6-7-9 (Sandrock ב-Biol Chem משנת 2011, ו-Kim וחב' ב-J Cell Biol משנת 2011).

המבנה של קומפלקסים של ספטין והפילמנטים: המבנה האופייני של ספטין המכיל מקטע קושר GTP עם ה-motifs G3,G1 ו-G4. בין הקצה ה--N-טרמינלי ומקטע ה-GTPase, נמצא אזור משומר ביותר polybasic הנחוץ לאינטראקציות עם ממברנות. הקצה ה-C-טרמינלי של הספטין מכיל לרוב מקטע coiled coil הכרוך באינטראקציות של חלבון-חלבון. בנוסף, ספטינים כוללים אלמנט אופייני של 53 חומצות אמינו, שתפקידיו אינם ידועים עדיין.

הוראות לביצוע הבדיקה

נוגדנים כנגד septin-5 בנסיוב: זיהוי של septin-5 על ידי CBA (או cell binding assay) בדגימות נסיוב: יש ליטול דם במבחנה כימית (פקק אדום או צהוב), ולאחר סרכוז של להעביר את הנוזל העליון למבחנת פלסטיק לצורך העברה למעבדה. יש לפסול דגימות נסיוב מאוד המוליטיות, ליפמיות או איקטריות. היציבות של הדגימות בטמפרטורת החדר - 72 שעות, בהקפאה - 28 יום, ובקירור (מועדף) למשך 28 יום. נורמלית תוצאת הבדיקה שלילית.