אלפא-2-מאקרוגלובולין

הדפס

מדריך בדיקות מעבדה
אלפא-2-מאקרוגלובולין
שמות אחרים	AMG; αMG
מעבדה	כימיה בדם
תחום	acute phase protein, מעכב פרוטאזות
טווח ערכים תקין	בגברים-108-297 מיליגרם/דציליטר, ובנשים-144-315 מיליגרם/דציליטר. ביילודים ערכי AMG גבוהים ב-50% בהשוואה לערכיו בגברים, וערכים אלה הולכים וקֽטֵנים בשנות העֶשׂרֶה. במבוגרים מעל גיל 70 יש שוב עלייה ברמת AMG. בנוזל מי השפיר רמת AMG בשבועות ה-15-39 להריון היא 0.1-0.15 מיליגרם/דציליטר.
יוצר הערך	פרופ' בן-עמי סלע

מטרת הבדיקה

הערכה של מטופלים עם תסמונת נפרוטית ופנקראטיטיס.

חלבוני מאקרו-גלובולין

משפחת חלבוני (α-macroglobulin (aM כוללת מעכבי פרוטאזות (Sottrup-Jensen ב-J Biol Chem משנת 1989), המיוצגת על ידי AMG, כאשר חלבונים אלה שייכים למשפחת MEROPS של מעכבי פרוטאזות מתת-משפחת CLAN-IL ‏ 139. מעכבי פרוטאזות אלה הם בעלי מספר תכונות משותפות הכוללות

1. היכולת לעכב פרוטאזות מכל תכונות הקטליטיות כולל סרין פרוטאזות, אלנין פרוטאזות, אספרטאט פרוטאזות ו-metalloproteinases או MMPs (על פי de Boer וחב' ב-Infect Immun משנת 1993);
2. AMG מכיל במבנה שלו מקטע בן 35 חומצות אמינו הידוע כ-bait" region" או מקטע "פיתוי" שהוא בר-ביקוע על ידי פרוטאזות רבות. כאשר פרוטאזות אלה מבקעות במקטע ה"bait" הן נקשרות ל-AMG, והקומפלקס AMG-פרוטאזה מזוהה על ידי קולטנים על פני מקרופאגים ומורחק מהדם;
3. AMG מעכב פרוטאזות שונות במנגנון עיכוב דומה של "עיכּוב סֽטֵרי" או steric hindrance (על פי Enghild וחב' ב-J Biol Chem משנת 1989).

במנגנון פעילות זה, כאשר AMG מבוקע במקטע ה-bait, סגמנט של החלבון המעכב הרגיש במיוחד לביקוע הפרוטאוליטי, מאתחל שינוי בקונפורמציה של AMG, הגורם לחלבון ל"עטוף" את האנזים הפרוטאוליטי. בקומפלקס AMG-פרוטאזה שנוצר, האתר הקטליטי של האנזים מכוסה באופן סטרי, מה שמונע ממנו גישה למצע החלבוני. שני אירועים נוספים מתרחשים כתוצאה מביקוע מקטע bait, דהיינו:

1. התיול-אסטר h-cysteinyl-g-glutamyl הופך מאוד ראקטיבי;
2. שינוי קונפורמציה משמעותי חושף את המקטע-הנקשר-לקולטן של AMG בחלק ה-C טרמינאלי של AMG (על פי Enghild וחב' ב-Biochemistry משנת 1989). חשיפת המקטע-הנקשר-לקולטן מאפשרת לקומפלקס AMG-פרואטזה להתפנות מהצירקולציה באופן יעיל על ידי תאי Kupffer של הכבד, וכן על ידי מקרופאגים אלבאולאריים. באופן זה AMG נקשר ומפנה את הצורות הפעילות של האנזים gelatinase (או MMP-2 ו-MMP-9) מהצירקולציה בעזרת קולטנים על פני פגוציטים.

אלפא-2-מאקרוגלובולין ידוע ביכולתו לקשור אבץ כמו גם נחושת בפלזמה, אף בזיקה גדולה יותר מאשר אלבומין, וכיוון שכך חלבון זה ידוע גם כ-transcuprein (על פי Liu וחב' ב- J Nutr Biochem משנת 2007). מכמות הנחושת בפלזמה, 10-15% עוברים כּלציה על ידי AMG (על פי Liu וחב' ב-FASEB J משנת 2006).

תכונותיו של AMG

אלפא-2-מאקרוגלובולין (להלן AMG) הוא חלבון מעכב פרוטאזות, ואחד מחלבוני הפלזמה הגדולים ביותר. Borth בסקירתו משנת 1992 ב-FASEB J, קובע על סמך העובדה ש-AMG נקשר לרוב המכריע של פרוטאזות שניתן להתייחס לחלבון זה כאלpanproteinase inhibitor.

החלבון מהווה אחד משני המרכיבים העיקריים של ה-peak של α-2-globulns באלקטרופורזה של חלבוני הפלזמה, בנוסף ל-haptoglobin. הוא נוצר בעיקר בכבד, אך גם מסונתז על ידי מקרופאגים, פיברובלסטים ותאים אדרנו-קורטיקאלים. באדם הוא מקודד על ידי הגן A2M הממוקם על הזרוע הקצרה של כרומוזום 12 בעמדה 12p13.31, גן המכיל 36 אֶקסוֹנים. AMG מסוגל לעכב ולנטרל מגוון גדול ביותר של פרוטאזות. הוא מתפקד כמעכב של פיברינוליזה, על ידי עיכוב האנזימים plasmin ו-kallikrein, ומעכב מרכיבים של מערכת המשלים ושל המערכת ההֶמוסטאטית. הוא מתפקד כמעכב של קואגולציה על ידי נטרול פעילות תרומבין (Ignjatovic וחב' ב-Br J Haematol משנת 2007). AMG עשוי לפעול גם כחלבון-נשא, כיוון שהוא נקשר למספר ניכר של הורמונים, אנזימים, גורמי-גדילה כגון platelet-derived growth factor או PDGF, וכן basic fibroblast growth factor (Dennis וחב' ב-J Biol Chem משנת 1989), TGF-β, NGF, אינסולין, IL-6 ו-IL-1β (Crookston וחב' ב-Biochem J משנת 1993). כמו כן נקשר AMG לציטוקינים (LaMarre וחב' ב-Lab Invest משנת 1991, ו-Crookston וחב' ב- J Biol Chemמשנת 1994) כמו גם לטריפסין וכימוטריפסין של בלוטת הלבלב. Sunderic וחב' הראו ב-Exp Mol Pathol משנת 2015 את היכולת AMG ליצור קומפלקסים עם insulin-like growth factor. AMG מכיל גם אזור קישור ל-transglutaminase.

הפעילויות של AMG תלויות באופן מובהק בצורת הקונפורמציה של החלבון, אם זו צורתו הטבעית הטטרמרית או המותמרת הדימרית. בנוזלים ביולוגיים צורת AMG הטבעית היא הדומיננטית, בהשוואה לצורה המותמרת העוברת פינוי מאוד מהיר דרך LRP (Abbink וחב' ב-Thromb Haemost משנת 1991). המשמעות הפיזיולוגית של דימרים של AMG באדם עדיין לא ברורה: יחד עם זאת הודגם באדם ש-AMG יוצר בקלות דימרים לאחר חשיפה להיפוכלוריט, חומר מחמצן חזק הנוצר על ידי תא חיסון משופעלים. ממצא זה תומך בדעה שהדימרים של AMG עשויים להיות בעלי חשיבות מיוחדת במצבי דלקת (Reddy וחב' ב-J Biol Chem משנת 1994, ו- Wuוחב' באותו כתב עת משנת 1997).

המבנה של AMG

חלבון זה באדם הוא בעל משקל מולקולארי של 725 קילו-דלטון, ומורכב מ-4 תת-יחידות זהות בנות 180 קילו-דלטון כל אחת: שתי תת-יחידות קשורות ביניהן בקשר קו-ולנטי די-סולפידי (-S-S-) על פי Andersen וחב' ב-J Biol Chem משנת 1995, ו-Sottrup-Jensen וחב' ב-J Biol Chem משנת 1984, כאשר הדימר הנוצר קשור לדימר השני בקשר שאינו קו-ולנטי. לאחרונה זוהו גם צורות דימריות ואף מונומריות של AMG (Armstrong וחב' ב-Dev Comp Immunol משנת 1999). כל מונומר של AMG באדם, מורכב ממספר מקטעים (domains) תפקודיים, כולל מקטעים מאקרוגלובוליניים, מקטע המכיל thiol ester, ומקטע הנקשר לקולטן (Doan ו-Gettins ב-Biochem J משנת 2007). בסך הכול, AMG הוא החלבון שאינו אימונו-גלובולין הגדול ביותר בפלזמה. ל-AMG יש 2 איזופורמים המתגלים באלקטרופורזה כצורה "מהירה" וצורה "איטית" (Barrett. 1979 וחב' ב- Biochem Jמשנת 1979, ו-Banks וחב' ב- J Immunol Methods משנת 1990).

מידע קליני

AMG הוא מרכיב "עתיק" של מערכת החיסון הטבעית (innate), שהשתמרה בבעלי חיים רבים במהלך האבולוציה. התפקיד הידוע ביותר של חלבון זה הוא יכולתו ללכוד באופן קו-ולנטי מגוון רחב של אנזימים פרוטאוליטיים, ולסייע בפינוי שלהם מהצירקולציה, בין השאר על ידי אינטראקציה עם LRP או LDL receptor-related protein (Strickland וחב' ב-J Biol Chem משנת 1990). AMG ידוע גם כמסייע לפינוי של מגוון רחב של ליגנדים שאינם נקשרים אליו קו-ולנטית, כוללamyloid β-peptide (Aβ) הכרוך במחלת אלצהיימר (Fabrizi וחב' ב-J Neurochem משנת 2001, Narita וחב' באותו כתב עת משנת 1997, Lauer וחב' ב-Exp Neurol משנת 2001, Du וחב' ב-J Neurochem משנת 1997, Wyatt וחב' ב-FEBS let משנת 2013, Hughes וחב' ב- Proc Natl Acad Sci USA משנת 1998 ו-Mettenburg וחב' ב-J Biol Chem משנת 2002).

חסר של AMG לא נכרך עם שום מחלה ספציפית, ואף שלב במחלות ידועות מיוחס לרמות נמוכות שלו. לעומת זאת, הריכוז של AMG עלה פי-10 ויותר בתסמונת נפרוטית, כאשר חלבונים בעלי משקל מולקולארי נמוך אובדים בשתן (Stevenson וחב' ב-Kidney International משנת 1998). החלבון AMG עצמו אינו מופרש בשתן בשל גודלו, וכך ריכוזיו בנסיוב מגיעים לאלה של אלבומין או אף גבוהים יותר בתסמונת נפרוטית (עד 6 גרם/ליטר), ובכך הוא בעל השפעה על שמירת הלחץ האונקוטי (שהוא הלחץ התפיחתי או הבדל הלחצים בין הלחץ האוסמוטי של הדם לבין זה של הלימפה או של נוזל הרקמה החשוב לוויסות זרימת מים בין הדם לבין נוזל הרקמה). גם באלה עם שחמת הכבד, לייפת הכבד (fibrosis) וסוכרת, רמות AMG מוגברות. הגדלת ריכוז AMG היא בעלת השפעה שלילית נמוכה על מהלך המחלה, אך יכולה לשמש למטרות אבחוניות. תקופת מחצית החיים של AMG בדם היא 5 ימים. עלייה מתונה ברמת AMG נרשמת בטיפול באסטרוגנים (כמו גלולות למניעת הריון), בנשים הרות, בסוכרת, שחמת הכבד הפאטיטיס, חסר ב-α1-antitrypsin, אוטם מוחי, ובפעילות גופנית נמרצת. רמות AMG בנסיוב מוגברות בצריכת Mestranol.

לא ידוע על חסר AMG על רקע גנטי. רמות חלבון זה נמוכות באופן שניוני במצבי שפעול של אנזימים פרוטאוליטיים, כולל פנקראטיטיס חריפה (במתאם טוב עם חומרת התרחיש על פי McMahon וחב' ב-Am J Surg משנת 1984), ומחלת כיב פפטי. רמות AMG נמוכות ברבים מבין הגברים בגיל 30-50 שנה, ייתכן כתוצאה מעקה נפשית או גופנית, או בגין השפעות הורמונאליות. AMG נמוך גם במצבים חסימתיים כרוניים, במחלת ריאות, באי-ספיקת כבד חמורה, בספטיסמיה, במצבים היפר-פיברינוליטיים, ב-multiple myeloma, ב-pre-eclampsia, וב-juvenile rheumatoid arthritis, וכן בניתוחי לב פתוח או לאחר ניתוחים משמעותיים, ובשלבים סופניים של חולים במחלות קריטיות. רמות AMG נמוכות בצריכת dextran, או מטיפול בסטרפטו-קינאזה. באלה עם אוטם חריף של שריר הלב, רמות נמוכות של AMG כרוכות בפרוגנוזה טובה יותר של שנות הישרדות Haines וחב' ב-Thromb Haemost משנת 1983. Rehman וחב' בסקירה משנת 2013 ב-Journal of Cellular Physiology , מגדירים את AMG כ"physiological guardian" כיוון שפרט לתפקידיו ברגולציה, עיכוב פרוטאזות וטרנספורט הוא פועל בעוד מספר תפקידים כגון קשירת defensin (Panyutich וחב' ב- Am J Respir Cell Mol Biolמשנת 1991( ו-myelin basic protein, ואף ווסות הקישור של טרנספרין לקולטן שלו, והגנה על הגוף מפני זיהומים. מספר מחקרים מציעים שוואריאנט פולימורפי שכיח (29.5%), מוביל להגדלת הסיכון של מחלת אלצהיימר (Blacker וחב' ב-Nature Genet משנת 1998, ו-Kovacs ב-Exp Gerontol משנת 2000). מבחנים תפקודיים של AMG:

א) מבחן קשירת טריפסין- פעילות טריפסין ממקור בקר נמדדה תוך שימוש בערכתBAPNA או Nα-benzoyl-L-arginine 4-nitroanilide hydrochloride. פעילות טריפסין נמדדה לפני ואחרי הוספה של AMG לתערובת הריאקציה, תוך ניטור הפיכת המצע BAPNA לתוצר הריאקציה p-nitroaniline באורך גל של 405 ננומטר. ההפרש בין תוצאות ביקוע BAPN ללא הוספת AMG או לאחר הוספתו, מתורגמות להערכה על כושר הניטרול של טריפסין על ידי AMG. ב) מבחן צימות (אגרגציה) של חלבון: האנזים CPK (Creatine phosphokinase), הודגר בנוכחות או בהיעדר AMG, בתמיסת PBS בטמפ של 43 מעלות ב-.OPTIMA platereader העכירות של התמיסה נמדדה באופן רציף באורך גל של 595 ננומטר.

הוראות לביצוע הבדיקה

רצוי להיות בצום של 8-10 שעות לפני הבדיקה. הדם נלקח במבחנה כימית (פקק אדום או פקק צהוב וכן ניתן להשתמש במבחנת ג'ל), או במבחנת ספירת-דם (פקק סגלגל המכילה EDTA). הנסיוב או הפלזמה המופרדים בסרכוז נשמרים בקירור (מועדף) שם הוא נשמר עד 14 יום, או בהקפאה שם יציבותם עד 28 יום. בטמפרטורת החדר הדגימה יכולה להישמר עד 72 שעות. דגימות נסיוב המוליטיות או איקטריות באופן משמעותי ראויות לבדיקה; לעומת זאת, דגימות ליפמיות באופן קל מתאימות לבדיקה, אם כי דגימות נסיוב מאוד ליפמיות יש לפסול. שיטת הבדיקה היא נפלומטרית- כמותית. כאשר מתבצעת הבדיקה במי-שפיר יש לסרכז את הנוזל ולהקפיד שהדגימה לא תהיה דמית. יש לבדוק בנוזל טרי ככל האפשר, או לשמור בקירור עד 72 שעות, כאשר הדגימה יציבה בהקפאה במינוס 20 מעלות עד 6 חודשים, ובהקפאה במינוס 70 מעלות לזמן בלתי מוגבל.

AMG יכול להימדד באופן פונקציונאלי, אך מדידה אימונו-כימית מהירה ופשוטה יותר לביצוע. בגלל משקלו המולקולארי הגדול, שיטות מדידה בג'ל כגוןradial immunodiffusion דורשות זמני הדגרה מאוד ארוכים, ולכן שיטות אימונו-נפלומטריות וטורבידומטריות מועדפות.