ריסטוצטין - Ristocetin

הדפס

מדריך בדיקות מעבדה
ריסטוצטין
Ristocetin
שמות אחרים	RCo
מעבדה	מעבדת קרישה
תחום	מפגעי קרישה בתפקוד לקוי של טסיות-דם.
טווח ערכים תקין	טווח ערכים תקין של ristocetin cofactor (על פי Klarmann וחב' ב-Transfusion משנת 2010, ו-Appel וחב' ב-Thromb Hemost משנת 2012): יילודים ותינוקות מתחת גיל 6 חודשים - 50-200% או IU/dL; ילדים מגיל 1-10 שנה - 40-130% (לסוג דם O) או 50-180% (לסוג דם שאינו O); מבוגרים - 50-150% (לסוג דם O) או 60-180% (לסוג דם שאינו O).
יוצר הערך	פרופ' בן-עמי סלע

מטרת הבדיקה

קביעת הכמויות הקטנות ביותר של ristocetin הנדרשות לאיגור טסיות. אבחון של מחלת von Willebrand ודיפרנציאציה של תת הסוגים של מחלה זו. הבדלה בין מחלת von Willebrand מהמופיליה A (בשילוב עם מבחן קואגולציה של פקטור קרישה VIII). ניטור של יעילות התרפיה עם desmopressin או עם תרכיזים של vWf בחולים עם מחלת von Willebrand.

Ristocetin הוא חומר אנטיביוטי שמקורו בחיידק Amicolatopsis lurida ששייך למשפחת החיידקים מהם מופק גם vancomycin. בעבר השתמשו ב-ristocetin לטיפול בזיהומים של סטפילוקוקים, אך טיפולים אלה הופסקו בגלל תכונת חומר זה לצמת טסיות-דם ולגרום לתרומבוציטופניה. השימוש ב-ristocetin הוא בבחינה in vitro לאבחון מצבים כגון מחלת von Willebrand (להלן vWd) או תסמונת Bernard-Soulier. אגלוטינציה של טסיות-דם הנגרמת על ידי ristocetin יכולה להתרחש רק במולטימרים של von Willebrand factor (להלן vWf), לכן אם מוסיפים ristocetin לדגימת-דם החסר את vWf או את הקולטן של vWf, טסיות הדם לא יצומתו. למרות שהמנגנון המדויק אינו ברור, נראה ש-ristocetin גורם ל-vWf להיקשר על פני טסיות הדם לקולטן glycoprotein Ib (להלן GpIb), בדרך לצימות תאים אלה.

במספר סוגים של vWD כגון סוג 2B, אפילו כמויות קטנות ביותר של ristocetin יכולים לגרום לאגלוטינציה של טסיות-דם כאשר משתמשים בפלזמה עתירת-טסיות (Coller ו-Gralnick ב-J Clin Invest משנת 1977). פרדוקס זה מוסבר בכך שסוגי vWD אלה הם בעלי מוטציות gain of function הגורמות למולטימרים הגבה-מולקולריים של vWd להיקשר בצורה חזקה יותר לקולטנים שלהם על פני טסיות הדם (שרשרות α של GpIb). במקרה של type 2B vWD מוטציית gain of function כורכת שיתוף של vWf. קישור חזק באופן מוגבר גורם ל-wWD כיוון שהמולטימרים הגבה-מולקולריים מורחקים מהצירקולציה, כיוון שהם נותרים קשורים לטסיות הדם של המטופלים. לפיכך, אם משתמשים בפלזמה דלת-טסיות, מבחן ristocetin cofactor לא יצמת טסיות שעברו סטנדרטיזציה (דהיינו טסיות שהתקבלו מתורמים נורמליים שעברו קיבוע בפורמלין), בדומה לסוגים אחרים של vWD. בכל הצורות של מבדק ristocetin, הטסיות עוברות קיבוע בפורמלין לפני הבדיקה, כדי למנוע מ-vWf האגור בגרנולות בתוך טסיות הדם מלהשתחרר ולהשתתף באגלוטינציה של הטסיות. לפיכך, הפעילות של ristocetin factor תלויה רק במולטימרים הגבה-מולקולריים של פקטור זה הנמצאים בצירקולציה.

ריאגנט ristocetin זמין לבחינת האיגור של טסיות-דם המושרית על ידו (מבחן RIPA). באופן יותר ספציפי, ristocetin יכול לשמש לבחון את הזיקה המוגברת של von Willebrand facor (או vWf) לקולטן GpIb במחלת von willebrand type 2B, ולסייע בזיהוי תסמונת Bernard-Soulier, בה RIPA מופחתת. ריאגנט ristocetin יכול תוך שילוב עם טסיות-דם שעברו ליופיליזציה (AG006A) במבחן הפעילות של קו-פקטור של ristocetin (או vWF:RCo) במסגרת הבירורים של מחלת vov Willebrand. עיקרון הבדיקה הוא כדלקמן: כאשר מוסיפים ristocetin לפלזמה עתירת-טסיות, הוא מסייע לאינטראקציה בין vWF והקולטן שלו על פני טסיות, שהוא גליקופרוטאין GpIb-v-IX. הבדיקה מתבצעת על ידי הוספת ristocetin ב-2 ריכוזים לפלזמה עתירת הטסיות.

מחלת von Willebrand היא מפגע הדימום השכיח ביותר הפוגע ב-1% מהאוכלוסייה (Federici ב-Semin Thromb Hemost משנת 2006), ומקורה בפגם ביצירת vWf המתווך בספיחת טסיות על ידי קישורו ל-GpIb על פני הטסיות, וכן קישור vWf לקולאגן בכלי-דם פגועים. בנוסף, vWf נקשר גם לגורם קרישה VIII ומגן על האחרון מפני פרוטאוליזה. vWf, המסונתז על ידי תאי אנדותל ועל ידי מגקריוציטים, נע בצירקולציה כגליקופרוטאינים מולטימריים, שגודלם נע בין 500,000 עד 20 מיליון דלטון (Sadler וחב' ב-Thromb & Hemost משנת 2004). מולטימרים גבה-מולקולריים נקשרים ל-GpIb ולקולאגן באופן חזק יותר, ולכן הם מתווכים בספיחת טסיות באופן יעיל יותר בהשוואה למולטימרים קטנים יותר (Federici וחב' ב-Br J Haematol משנת 1989). במחלת von Willebrand, רמות נמוכות יותר של vWf או פעילות ירודה יותר של vWf גורמות לספיחה לא תקינה של הטסיות ולהגנה מופחתת על factor VIII מפני פרוטאוליזה, ובהמוסטאזיס פגוע.

הרמה הממוצעת של vWf באנשים עם סוג דם O, נמוכה בערך ב-30% מזו של אלה עם סוגי-דם A, B או AB‏ (Keeney וחב' ב-שנת 2008), זאת כיוון ש- vWf מופרש מהר יותר בשתן של אלה עם קבוצת דם O‏ (Nichols ב-Hemophilia משנת 2008). רמות ממוצעות של vWf גבוהות יותר באפרו-אמריקנים בהשוואה לקבוצות אתניות אחרות. תקופת מחצית החיים של vWf היא 12 שעות. הבדיקות השגרתיות להערכת vWf ristocetin cofactor‏ (vWf:RCo) הן בדיקת איגור טסיות, בדיקת אגלוטינציה של latex ובדיקת chemiluminescent (או CLIA).

בדיקת RIPA מתבצעת על ידי הוספת ristocetin לבחון פלזמה עתירת-טסיות. רוב סוגי מחלת von Willebrand הם בעלי תגובה נמוכה ל-ristocetin, אך הערך העיקרי של RIPA הוא באבחון המבדיל של הווריאנטים type 2 של המחלה. באופן ספציפי, מטופלים עם type 2A של המחלה, מגיבים באופן נמוך במיוחד ל-ristocetin, בהוספתו לפלזמה עתירת טסיות שלהם, זאת בגלל החסר של מולטימרים תפקודיים גבה-מולקולריים של vWf בפלזמה שלהם. לעומתם, מטופלים עם מחלת von Willebrand type 2B, מתאפיינים על ידי תגובה מוגברת לריכוזים נמוכים של ristocetin בגין זיקה מוגברת של מולטימרים גבה-מולקולריים של vWf לקומפלקס GpIb/factor IX/factorV של הטסיות.

אבחון מעבדתי של פגמים תפקודיים של טסיות-דם על ידי שימוש ב-ristocetin

ירידה סלקטיבית בתגובה ל-ristocetin היא לרוב כתוצאה מחסר או פגם של vWf במחלת von Willebrand. לרוב טסיות-דם מצומתות באופן נורמלי על ידי אגוניסטים אחרים, אך הן מגיבות באופן מופחת ל-ristocetin. אותו מתווה של צימות מופחת אופייני גם בתסמונת Bernard-Soulier, בעוד שבמחלת von Willebrand ניתן לתקן את הפגם בצימות הטסיות על ידי הוספה של פלזמה נורמלית, תיקון כזה אינו מתאפשר בתסמונת Bernard-Soulier. התסמונת האחרונה מתאפיינת גם על ידי טסיות גדולות, ועל ידי תרומבוציטופניה מתונה. בניגוד לרוב הצורות של מחלת von Willebrand, type B2 vWD ו-platelet-type vWD, מגיבים באופן מוגבר ל-ristocetin אפילו במינונים נמוכים. מחלת von Wiilebrand type 1 כרוכה ברמת vWf הנעה בין 10-50% של רמותיו הנורמליות כאשר המתווה האלקטרופוטי שלו נורמלי. רוב המאובחנים עם מחלה זו (80-85%) הם מסוג type 1. אם האנטיגן vWf ופעילות ristocetin cofactor מופחתים באופן דומה, סביר שמדובר ב-type 1 vWD, ולפיכך אין צורך באלקטרופורזה או בבדיקת איגור טסיות מושרה על ידי ristocetin. מטופלים אחרונים אלה מגיבים ל-desmopressin.

אבחון מעבדתי של תסמונת von Willebrand נרכשת (או AVWS)

מדידה של ristocetin cofactor נחשבת לבדיקה הרגישה ביותר, למרות שמבדקים אחרים של פעילות vWf יכולים גם כן לשמש למטרה זו. בניגוד למחלת von Willebrand תורשתית, למעלה מ-80% ממקרי AVWS מאופיינים על ידי אובדן של מולטימרים גבה-מולקולריים של vWf. אוטו-נוגדנים מעכבים המכוונים כנגד vWf או כנגד הקומפלקס factorVIII/vWf מתגלים ב-פחות מ-20% מהמקרים של AVWS על ידי עיכוב של vWf:RCo או של vWf:CB במחקרים בהם יש ערבוב של גורמים אלה. בערך ב-40% מהמקרים מגלים נוגדנים בעזרת ELISA. הנוכחות של קומפלקסים חיסוניים המכילים vWf הודגם לעתים על ידי טכניקות של שימוש בג'ל, כגון cross immunoelectrophoresis, או על ידי ספיחתם ל-staphylococcal protein A. הספיחה של vWf לתאים, יכולה להיות מודגמת רק כאשר יש איבוד של מולטימרים גבה-מולקולריים. ברוב המקרים נמצא הגברה של VWFpp/VWF:Ag אפילו כאשר VWF:Ag נמצא בתחום הנורמלי, מה שעשוי להיות שימושי לניטור הצלחת הטיפול.

בערך 10-15% מאלה עם vWf לוקים במחלת von Willebrand type 2. בדרך כלל חולים type 2 סובלים מדימומים קשים יותר מאשר אלה מחלה type 1, והם גם אינם מגיבים ל-DDAVP (או 1diamino-8-arginine-vasopressin באופן שחולי type 1 מגיבים. הפעילות של ristocetin cofactor נמוכה יותר באופן דיס-פרופורציונלי מאשר vWf antigen (יחס נמוך מ-0.6). אישור נוסף לאבחון של type 2 כורך מבחן ש איגור טסיות המושרה על ידי ristocetin, המצביע על איגור מוחלש, מה שמתאים ל-type 2A או ל-type 2M. הגברה של איגור טסיות מושרה על ידי ristocetin, מתאים ל-type 2B הכרוך לעתים קרובות עם תרומבוציטופניה, עם אלקטרופורזה המראה ירידה במולטימרים הגבה-מולקולריים.

בדיקות לזיהוי מחלת von Willebrand כוללות את מדידת vWf antigen, את vWf ristocetin cofactor activity, ואת המולטימרים של vWf. רוב ההמטולוגים יבצעו בדרך כלל את מדידת vWf antigen, את vWf ristocetin cofactor, ואת פעילות factor VIII כבדיקות סריקה התחלתיות, ורק בהמשך יבצעו בדיקת מולטימרים וסוג דם. התחום הבלתי-נורמלי של vWf antigen, של ristocetin cofactor ושל פעילות factor VIII, הוא בדרך כלל פחות מ-0.5IU/dL, שהוא לרוב פחות ב-2 סטיות תקן מהערך הממוצע. ה-vWf ristocetin cofactor נמוך בדרך כלל באפרו-אמריקאים, כתוצאה מפולימורפיזם שכיח. בדיקת הקישור של vWf לקולאגן יכולה לבוא בחשבון כאשר vWf ristocetin cofactor הוא נורמלי, אך תסמיני הדימום בעינם (Hillarp וחב' ב- J Thromb Haemostמשנת 2010, ו-Pavaloro וחב' באותו כתב-עת מאותה שנה).

Ristocetin-induced-platelet-aggregation (להלן RIPA)

זה מבדק ex vivo לבדיקת התפקוד של טסיות-דם, המודד צימות טסיות בעזרת vWf ו-ristocetin אקסוגני, המוסף באופן מדורג. RIPA דומה למבדק של ristocetin cofactor, אך הוא בעל היתרון הנוסף שהוא עשוי לסייע באבחון של type 2B vWd ותסמונת Bernard-Soullier כיוון שהוא עושה שימוש בטסיות אנדוגניות חיות, בעוד שמבדק ristocetin cofactor בוחן את התפקוד של vWf בלבד, ולא את תפקוד הטסיות. מטרת הבדיקה היא למדוד את איגור (aggregation) של טסיות הדם בעזרת von Willebrand factor. הבדיקה נועדה לבחון מחלת von Willebrand לסוגיה השונים, או לגלות מפגעים שונים בתפקוד טסיות הדם. מבחן ristocetin cofactor עושה שימוש בפלזמה דלת-טסיות של הנבדק (עם vWf אך ללא טסיות), תוך הוספת ristocetin וטסיות אקסוגניות מקובעות בפורמלין, שיכולות לעבור אגלוטינציה באופן פסיבי, אך לא לצמת אקטיבית, בהיות התאים מתים. הפורמלין אינו מאפשר לטסיות האקסטרינזיות להפריש vWf מהגרנולות שלהם, ולפיכך רק נמדדת רק הפעילות של vWf האינטרינזי. במנגנון בלתי ידוע ristocetin גורם ל-vWf להיקשר לקולטן GpIb על פני הטסיות, וכך כאשר מוסיפים ristocetin לדם נורמלי הוא גורם לאגלוטינציה של טסיות מקובעות, ומאתחל את תהליך הצימות של טסיות חיות.

התוצאות של צימות טסיות המושרה על ידי ristocetin בסוגים שונים של מחלת von Willebrand הן כדלקמן: מחלת von Willebrand type 1: מתרחשת אגלוטינציה היפו-אקטיבית (בהתאמה עם תוצאות מבחן ristocetin cofactor). מחלת von Willebrand type 2A: מתרחשת אגלוטינציה היפו-אקטיבית בדומה למחלה type 1. מחלת von Willebrand type 2B: מתרחשת אגלוטינציה היפר-אקטיבית (כאשר נעשה שימוש במבדק ristocetin cofactor האגלוטינציה היא היפו-אקטיבית). מחלת von Willebrand type 2M: מתרחשת אגלוטינציה היפו-אקטיבית (בהתאמה עם תוצאות מבחן ristocetin cofactor (על פי Riddell וחב' ב-Br J Haematol משנת 2002). מחלת von Willebrand type 2N: מתרחשת אגלוטינציה נורמלית (בהתאמה עם תוצאות מבחן ristocetin cofactor). מחלת von Willebrand type 3: לא מתרחשת אגלוטינציה (בהתאמה עם תוצאות מבחן ristocetin cofactor). מחלת pseudo-von Willebrand: מתרחשת אגלוטינציה היפר-אקטיבית (כאשר נעשה שימוש במבדק ristocetin cofactor האגלוטינציה היא היפו-אקטיבית). תסמונת Bernard-Soulier: מתרחשת אגלוטינציה היפואקטיבית (האגלוטינציה נורמלית כאשר נעשה שימוש במבדק ristocetin cofactor) (על פי Pham ו-Wang ב-Arch Pathol Lab Med משנת 2007).

הוראות לביצוע בדיקת RIPA:

יש ליטול דם מלא במבחנת סודיום-ציטראט (פקק בצבע תכלת). לא ניתן להשהות את הבדיקה לאחר נטילת הדם, והדגימה חייבת להיות מועברת מיד למעבדת הקרישה בהתאמה מראש. ערכת חברת Quest לביצוע הבדיקה: כאשר הבדיקה נועדה לפרש תרחיש של תרומבוציטופתיה, הנבדק אינו אמור להיות מטופל עם תכשירים כגון אספירין האמורים להשפיע על תפקוד של טסיות, משך 10 ימים לפני הבדיקה. כמו כן יש להימנע מאכילת מזון שמנוני, קפה, ומוצרי חלב לפחות 12 שעות לפני נטילת הדם. אמפולה של ריאגנט R1 מכילה ristocetin שעבר ליופיליזציה מכילה Tris ומרכיבים מייצבים. לצורך ביצוע הבדיקה ב-aggregometer יש להוסיף לאמפולה בדיוק 0.5 מ"ל של מים מזוקקים, ולטלטל באופן נמרץ עד להתמוססות מוחלטת של תכולת האמפולה. יש להמתין 30 דקות עד להתייצבות הריאגנט בטמפרטורת החדר. לצורך ביצוע הבדיקה ב-analyzer (מומלץ על Sysmex סדרה CS), יש להוסיף לאמפולה בדיוק 0.625 מ"ל של מים מזוקקים. לאחר טלטול והתמוססות תכולת האמפולה יש להמתין 30 דקות בטמפרטורת החדר. היציבות של הריאגנט לאחר הוספת המים היא למשך 7 ימים בקירור, למשך 8 שעות בטמפרטורת החדר, ולמשך חודשיים בהקפאה. יש להפשיר את הדגימה המוקפאת פעם אחת בלבד.

קיימים מספר גורמים מודולטוריים המשפיעים על האינטרפרטציה של מדידת vWF. הגורם החשוב ביותר הוא סוג הדם. ידוע שדם מסוג O יכול להיות כרוך ברמות נמוכות יותר של vWF כתוצאה מפינוי מהיר יותר של vWF. לכן ההערכה של תסמיני דימום עם רמת vWF נמוכה חיונית באבחון של מחלה אמיתית. גורמים מודולטוריים נוספים כוללים מצבים פיזיולוגיים כגון הריון (בשלישים השני והשלישי שלו על פי Pottinger וחב' ב-Thromb Res משנת 1989, ו-O'Donnell וחב' ב-Thromb Hemost משנת 1997, מחזור חודשי ופעילות גופנית בעצימות גבוהה, שכל אחד מהם עשוי להעלות את רמת vWF. גיל מתקדם יכול גם הוא להעלות את רמת vWF, כאשר כל עשור נוסף בגיל מעבר לגיל 40 שנה, מעלה את רמת vWF בערך ב-6%. בנוסף, כיוון ש-vWF הוא מגיב של הפאזה החדה (acute phase reactant), הוא יכול להיות מוגבר בתרחישים של עקה או טראומה כלשהם, כמו גם במצבי דלקת, המסוגלים להפוך type 1 vWD למצב הנורמלי. כיוון שבנשים אחדות רמות vWF יכולות להשתנות בנקודות זמן שונות במהלך המחזור החודשי, יש צורך לחזור על הבדיקה כדי לבסס את האבחון. גם ממאירות, obesity, טרשת או פקקת עורקים מגבירים את פעילות vWf:RCo.

12 - בדיקת תפקודי קרישה