בדיקת שתן להערכת תהליכי פראוקסידציה

F2-isoprostane

כינויים נוספים: F2IsoPs, 8-isoprostane, PGF2α.

מעבדה: כימיה בשתן. תחום: מאזן העקה החמצונית בגוף. תחום הריכוז הנורמלי בשתן בגיל 18 שנה ומעלה: פחות מ-0.93 ננוגרם/מ"ג קראטינין.

מטרת הבדיקה: הערכה של רמת הפראוקסידציה של ליפידים בגוף; נחשבת בדיקת מדד של עקה חמצונית סיסטמית לאורך זמן.

יצירת isoprostanes:

חמצון של ליפידים יוצר מגוון של מולקולות ביו-פעילות כולל רדיקלים ליפידיים, פראוקסידים, isoprostanes ו-אפוקסידים. מבין אלה אלדהידים הנוצרים מפירוק של הידרוקסי-פראוקסידים ליפידיים, הם תוצרי הקצה העיקריים (Esterbauer וחב' ב- Free Radical Biology & Medicine משנת 1991). ה-isoprostanes הם תרכובות דמויות-פרוסטגלנדין הנוצרות in vivo בתהליך הפראוקסידציה של חומצות שומניות הכרחיות (בעיקר חומצה אראכידונית) המקוטלז על ידי רדיקלים חופשיים, ללא פעולה ישירה של אנזימי cyclooxygenase (COX) (Roberts ו-Morrow ב- Free Radic Biol Medמשנת 2000, ו-Lawson וחב' ב-J Biol Chem משנת 1999). Isoprostanes התגלו בשנת 1990 על ידי Jackson Roberts ו- Jason Morrowמאוניברסיטת Vanderbilt. Eicosanoids לא-קלאסיים אלה הם בעלי פעילות ביולוגית פוטנטית כתווכים דלקתיים המגבירים לדוגמה תחושות כאב. Isoprostanes הם סמנים מדויקים של פראוקסידציה של ליפידים במודלים של עקה חמצונית באדם ובבעלי חיים (Morrow וחב' ב- Proc Natl Acad Sci USA משנת 1992). מחקרים אחדים מצאו קשר בין רמות מוגברות של F2-isoprostanes לבין תחלואה קרדיו-וסקולרית (Davies ו-Roberts ב- Free Radic Biol Medמשנת 2011, Vasssale וחב' ב- Coron Artery Dis משנת 2003, Milne וחב' ב- Nature Protמשנת 2007, ו-Zhang ב- Ann Clin Biochemמשנת 2013). רמות מוגברות של isoprostanes חשודות כתורמות לסיכון מוגבר להתקפי-לב במטופלים הצורכים coxibs (Schwedheim וחב' ב-Circulation משנת 2004). Isoprostanes והמטבוליטים שלהם נמצאו מוגברים בשתן של מעשני סיגריות, והוצעו כסמנים של עקה חמצונית במעשנים (Seet וחב' ב-Free Radical Biology and Medicine משנת 2011). חומצות שומניות רב-בלתי-רוויות מלבד חומצה אראכידונית רגישות אף הן לתרכובת ROS ((reactive oxygen species ויוצרות אף הן isoprostanes. לדוגמה, בנוסף לארבעת הקבוצות של F2-isoprostanes שיכולות להיווצר מפראוקסידציה של חומצה אראכידונית, הפראוקסידציה של EPA (eicosapentaenoic acid) יכולה להביא ליצירת 6 קבוצות של F3 isoprostanes, פראוקסידציה של חומצה α-linolenic ושל חומצה γ-linolenic יכולה להביא ליצירה של isoprostanes מסוג E1 ו-F1, ופראוקסידציה של DHA (docosahexaenoic acid) יכולה להביא ליצירה של 8 קבוצות של D4-isoprostanes ושל 8 קבוצות של E4-isoprostanes. כל אחת מהקבוצות האלו מכילות עד 8 איזומרים רצמיים, מה שמוביל למספר רב מאוד של מולקולות isoprostane (Janssen ב- Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol משנת 2001). הדרישה המינימלית ליצירת isoprostaneהיא חומצת שומן רב בלתי רוויה עם שלוש קשרים כפולים המופרדים ביניהם על ידי שייר מתילן. רקמת המוח מכילה רמות גבוהות במיוחד של חומצות שומן שנוצרו מ-DHA (C22:6 n-3). על ידי אותו תהליך של פראוקסידציה, DHA בממברנות של נוירונים מומר למספרneuroprostanes . מתוך אלה, F4-neuroprostane הוא סמן של מספר מחלות נוירו-ניווניות. בניגוד לפרוסטגלנדינים הנוצרים באופן קובנציונלי-אנזימטי התוך התא, ומשתחררים ממנו באופן מיידי, isoprostanes נוצרים בממברנת התא, מבוקעים על ידי פוספוליפאזות משתחררים לצירקולציה ומופרשים בשתן. כיוון ש-isoprostanes הם תוצרים סופיים של פראוקסידציה של ליפידים, יצירתם האנדוגנית הופכת אותם לסמנים שימושיים של עקה חמצונית.

פיזיולוגיה של isoprostanes:

Isoprostanes הן מולקולות יציבות המשתחררות לצירקולציה לפני שהצורה שלהן שעברה הידרוליזה הופרשה בשתן בהידרוליזה זו נוצרים תוצרי-קצה רבים, אך ההתמקדות העיקרית היא ב-F2-isoprostanes, שאינם מושפעים מתכולת הליפידים המזון, ולפיכך המדידה שלהם בנוזלים ביולוגיים (בעיקר בשתן) יכולה לשקף הערכה של סך יצירתם בגוף. מספר מחקרים הראו שמטופלים עם obesity או עם סוכרת הם בעלי רמות גבוהות יותר של isoprostanes בדם או בשתן. תוצאות ממחקר Framingham הדגימו שקיים מתאם טוב בין ה-BMI לבין הרמות בשתן של isoprostanes. מחקר אחר מצא שאנשים עם השמנה אנדרואידית מכילים רמות גבוהות יותר של isoprostanes מאשר אנשים עם השמנה גנואידית, מה שמצביע על כך שבאנשים עם השמנה "מרכזית" העקה החמצונית גבוהה יותר. שני המונחים האלה מסווגים השמנה על פי התפלגות השומן. בסוג של ההשמנה אנדרואיד, האדם מאחסן שומן סביב אזור הבטן שלו או שלה. על פי מחקר שנערך על ידי המכון למחקר מזון ותזונה, אלה אשר סובלים מהשמנת יתר של אנדרואיד נמצאים בסיכון גבוה יותר למחלות הקשורות להשמנת יתר כמו מחלות לב, תסמונת מטבולית, gout, וסוכרת פופולרית. בנוסף, הסיכוי לפתח מחלות הקשורות לעורקים, לחץ דם מוגבר וסוגים רבים של סרטן קשורים להשמנה אנדרואידית. השמנת יתר גנואידית, מתייחסת לעודף שומן באזור הירך והישבן.

Isoprostanes הם בעלי השפעות ביולוגיות חשובות בבריאות ובמצבי מחלה (Janssen וחב' ב-Antioxidants & Redox Signaling משנת 2005). מולקולות אלו נמצאות בדם בריכוזים ננומולריים בתנאים פיזיולוגיים נורמליים (Jannsen ב-J Clin Endocrinol Metab משנת 2008), ויש להם השפעות מעוררות ברקמה הווסקולרית, כולל אבי העורקים ועורקי הריאות. השפעת isoprostanes מתבצעת דרך הקולטנים ל-thromboxane (להלן קולטני TP), אך כנראה גם דרך קולטני EP ו-FP של פרוסטגלנדין (Janssen ו-Tazzeo ב-J Pharmacol Exp Ther משנת 2002, ו-Kang וחב' משנת 1993). Isoprostanes מווסתים את הטונוס של השריר החלק בדרכי האוויר (Janssen ב-Am J Resp Cell Mol Biol משנת 2008. שתי המולקולות, 8-iso-PGE2α, ו8-iso-PGF2-, משרות התכווצות של השריר החלק בדרכי האוויר, על ידי חדירה של סידן בתיווך קולטני TP. בניגוד לכך, 8-iso-PGF3α מביא להרפיית השריר החלק בדרכי האוויר שלא בסיוע של הקולטן TP (על פי Janssen וחב' משנת 2000). ה-isoprostanes מווסתים גם את הטונוס של השריר החלק בדרכי האוויר על ידי מודולציה של הפרשת אצטילכולין בקדם הצומת של שריר-נוירון במודלים של חיות, אך מנגנון זה לא הודגם בדרכי האוויר באדם Spiccuza וחב' ב-Br J Pharmacol משנת 2001).

Isoprostanes מווסתים גם את הטונוס הדלקתי בריאות. מקרופאגים בריאות משחקים תפקיד חשוב במודולציה של תגובות מערכת החיסון הטבעית (innate) למזהמים סביבתיים ולפתוגנים בריאות (Hogg ו-van Eeden ב-J Compilation משנת 2009). חשיפה של מקרופאגים בבועיות הריאה לחלקיקי פחמן אלמנטלי, משרה יצירת 8-isoPGF2α, מה שמעודד תאים אלה להיקשר לתאי אנדותל ולייצר את הציטוקין IL-8 (על פי Leitinger וחב' ב-J Leukoc Biol משנת 2001, ו-Scholz וחב' משנת 2003). Isoprostanes יכולים גם לתרום לדלקת על ידי הגברת ספיחה של נויטרופילים לתאי אנדותל של ורידי אדם ועל ידי הגברת החודרנות של תאי אנדותל בתגובה לעקה חמצונית (Hart וחב' משנת 1998, ו-Zahler ו-Becker ב-Lab Invest משנת 1999). בניגוד לPGF2α-8-iso, cyclopemtenone isoprostanes חוסמים את הקסקדה הדלקתית המתווכת על ידי NF-κB, כנראה בעזרת תקיפה של שיירי ציסטאין חשופים ואינאקטיבציה של IκK, ועל ידי כך פגיעה בדגרדציה של IκBα. מסתבר שבעוד שמספר isoprostanes משרים ציטוקינים דלקתיים וכימוטקסיס של נויטרופילים, cyclopentenone isoprostanes מזרזים יכולת אנטי-דלקתית ומעכבים דלקת בריאות (Rossi וחב' משנת 2000, ו-Sawyer וחב' משנת 2010).

Isoprostanes ומפגעים גנטיים: מפגעים גנטיים יכולים להיגרם ממוטציה בגן בודד או שהיא פוגעת בכרומוזום השלם. עקה חמצונית נכרכה בפתו-פיזיולוגיה של מספר מחלות גנטיות באדם. רמותF2-isoprostanes מוגברות במטופלים עם מפגעי הספקטרום האוטיסטי (Gorrindo וחב' ב- PLoS One משנת 2013, ו-Ming וחב' ב- Leukot Essent Fat Acidsב-Protaglandins משנת 2003), במטופלים עם תסמונת Smith-Lemli-Opitz (Korade וחב' ב J Inherit Metab Dis-משנת 2013), במטופלים עם אנמיה חרמשית (Akohoue וחב' ב-Pediatr Res משנת 2007), במטופלים עם cystic fibrosis (Collins וחב' ב-Lipids משנת 1999, Montuschi וחב' ב-Thorax משנת 2000, ו-Ciabattoni וחב' ב- Am J Respir Crit Care Medמשנת 2000), ובמטופלים עם inborn errors of metabolism (McGuire וחב' ב- Mol Genet Metabמשנת 2009). מעניין שרמות F2-isoprotanes מוגברות בנוזל מי השפיר בהריונות הנושאים עוברים עם תסמונת Down ( Perroneוחב' ב-Clin Biochem משנת 2007). תסמונת Rett שהיא מפגע חמור בספקטרום האוטיסטי הנגרמת ממוטציה בגן X-linked MECP2, המקודד ל- methyl-CpG-binding protein-2ברוב המקרים. התסמונת בעיקר בילדוֹת ומתחילה להתבטא בגיל 6-18 חודשים. נמצא שהרמות של F2-isoprostane מוגברות בפלזמה של אלה עם תסמונת Rett (De Felice וחב' ב- Free Radic Biol Med משנת 2009, וכן ב- J Lipid Resמשנת 2011, ו-Durand וחב' ב- Biochimieמשנת 2013). מספר מחקרים הראו שרמת F2-isoprostanes מוגברת ב-CSF של חולי אלצהיימר (Montine וחב' ב-Ann Neurol משנת 1998, Montine וחב' ב-Neuromolecular Med משנת 2010, Pratico וחב' ב-FASEB J משנת 1998, ו-Grossman וחב' ב-Ann Neurol משנת 2005). למעשה, עלייה ברמות F2-isoprostane ב-CSF הייתה כרוכה בדעיכה קוגניטיבית בנשאי APOE4 (על פי Duits וחב' ב-J Alzheimers' Dis משנת 2013). רמת F2-isoprostane ב-CSF נמצאת במתאם עם אטרופיה של קליפת המוח, ועם חומרת השיטיון (Practico וחב' משנת 2000). רמות F2-isoprostane ב-CSF עשויות להיות בעלות ערך ניבויי, כיוון שנשאים קדם-תסמיניים של מוטציות הכרוכות במחלת אלצהיימר משפחתית, היו בעלי רמות מוגברות של F2-isoprostane בנוזל השדרה (Ringman וחב' ב-Neurology משנת 2008).

פעילות פתולוגית של F,-isoprostane:

כיוון שרדיקלים חופשיים כל כך פעילים וקצרי-חיים המדידה הישירה שלהם אינה אפשרית. לכן משמשת מדידת F2-isoprostane בשתן כתחליף מעולה לשמש סמן מולקולרי. F2-isoprostanes מוגברים גורמים לכיווץ כלי-דם (Minuz וחב' ב- Arterioscler Thromb Vasc Biol משנת 1998), לפרוליפרציה של תאי שריר חלק וסקולריים, להיצרות של עורקים כליליים, לעלייה בלחץ הדם, וליצירת קרישי דם, למחלת עורקים היקפיים, ולהגברת הסיכון של פרפור פרוזדורים. בנוסף, מולקולות אלו עולות כנראה בשלבים המוקדמים של יצירת רבדים רשתיים (plaques), ויש ראיות לכך שאנשים עם רמות גבוהות של F2-isoprostane מצויים בסיכון הגבוה משמעותית לפתח מחלת לב (Schwedhelm וחב' ב-Circulation משנת 2004). מדידת רמת F2-isoprostane מקובלת בחוגים נרחבים כסטנדרט הזהב של עקה חמצונית (Morrow וחב' ב- Arterioscler  Thromb Vasc Biol משנת 2005, וכן ב- Prostaglandinsמשנת 1992).

-Isoprostane8 (או 8-iso-PGF2α), תרכובת השייכת לקבוצת ה-F2 של ה-isoprostanes שניתן לגלות ב- exhaled breath condensate (להלן (EBC באנשים בריאים שאינם מעשנים, ומוגברים ב-EBC של אנשים בריאים מעשנים, או אף יותר במטופלים עם COPD. רמות 8-isoprostane ב- EBCיכולות לשקף את חומרת ה-empysema שנתן לאשש בהדמיית CT ברזולוציה גבוהה. במטופלים עם החמרה ב-COPD ריכוזי ה-8-isoprostane הננשף גבוהים יותר מאשר באנשים בריאים, וריכוזים אלה פוחתים לאחר טיפול אנטיביוטי.

Isoprostanes מוגברים במספר מחלות כולל תסמונת acute respiratory distress בה לויקוציטים פולי-מורפו-נוקלאריים מייצרים ROS הפוגעים באפיתל הפולמונרי. תאי החיסון ברקמות דלקתיות נחשפים מיד לתוצרי ביניים פעילים של חמצן המיוצרים על ידי נויטרופילים ותאים פגוציטים אחרים. תרכובות מחמצנות נוצרות גם כתווכים במסלולי איתות תוך-תאיים על ידי ציטוקינים כדוגמת IL-1β ו-TNF. Isoprostanes חשובים כסמנים דלקתיים במפגעים כ-vasculitis ו-Rheumatoid arthritis. ייתכן שדלקת שאינה מגיבה ל-NSAIDs נגרמת בגין עיכוב של isoprostanes. חלק מ-isoprostanes מדכאים את ההפרשה של תווכי דלקת ממקרופאגים, מדכאים יצירת IL-12 על ידי תאים דנדריטים משופעלים, ומפחיתים יצירה של ציטוקינים על ידי תאי Th1 ו-Th2. בנוסף, isoprostanes יכולים לעודד שחרור של TxA2 ושל endothelin-1 מתאי אנדותל שיכולים כתוצאה מכך לתפקד כ- endothelium-dependent contracting factor(להלן EDCF) (Daray וחב' ב- Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol משנת 2006, ו-Fukunaga וחב' ב-J Cardiovasc Pharmacol משנת 1995). הוראות לביצוע הבדיקה: אין צורך להיות בצום. יש ליטול דגימת שתן נקודתית אקראית לתוך מבחנת פלסטיק ללא חומרים משמרים. עדיף לאחסן את השתן בקירור ואז יציבותו למשך 7 ימים, או כדגימת שתן מוקפאת ואז יציבות הדגימה 30 יום. בטמפרטורת החדר יציבות הדגימה היא למשך 48 שעות. שיטת המדידה של F2-isoprostane בשתן על ידי Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS) הנחשבת שיטה רגישה ביותר. ניתן גם להיעזר במדידה אנזימטית קולורימטרית. שיטות מדידה שונות פותחו כגון HPLC/GC–MS ו-לצורך אנליזה של F2-isoprostaneו- GC-tandem ולאחרונה גם מדידה בעזרת immunoassay. אינטרפרטציה של התוצאות: רמות F2-isoprostane בשתן פוחתות בפעילות גופנית אירובית, לאחר הפסקת עישון, או טיפול תרופתי עםfenofibrate . טיפולים פרמקולוגיים עם תכשירים נוגדי-חמצון, תכשירים מפחיתי רמת סוכר בדם או הפחתת משקל גוף גורמים ליצירה מופחתת של .F2-isoprostane

חומצה אראכידונית יכול להתחמצן לצורות רבות שונות של isopostanes. ה- F2-isoprostanesמשמשות לרוב כסמים ביולוגיים של עקה חמצונית במחלות האדם.Isothromboxanes כמו גם A2/J2-isoprostanes ו-deoxy-J2- A2/J2-isoprostanes גם כן נוצרים.