בטא לקטוגלובולין - Beta lactoglobulin

הדפס

מדריך בדיקות מעבדה
בטא לקטוגלובולין
Beta lactoglobulin
שמות אחרים	BLG, B-Lactoglobulin
מעבדה	אימונולוגיה בדם
תחום	חלבון המופיע במי-גבינה ומשמעותו בתהליכים חיסוניים ואלרגיים רבים.
טווח ערכים תקין	<0.10 kU/L
יוצר הערך	פרופ' בן-עמי סלע

Beta lactoglobulin (להלן (BLG הוא חלבון עיקרי ב-whey (מי גבינה) של חלב פרות וכבשים (3 גרם/ליטר). ונמצא גם במי-גבינה של מיני יונקים רבים פרט לזה של חלב אדם (Sawyer ו-Kontopidis ב-Biochim Biophys Acta משנת 2000, ו-Kontopidis ו-Sawyer ב-J Dairy Res משנת 2004). BLG נחשב כאלרגן של חלב (Wei וחב' ב-Sci Rep משנת 2018). כאמור, BLG נחשב לחלבון עיקרי ב-whey בו הוא מהווה 65%, α-lactabumin מהווה 25%, אלבומין מהווה 8%, וכל שאר החלבונים מהווים כ-2%. BLG נחשב חלבון ממשפחת lipocalins המסוגל לקשור מולקולות הידרופוביות רבות ומאפשר להן טרנספורט. BLG נמצא מסוגל לקשור ברזל דרך siderophores, ועל ידי כך בעל יכולת להשמיד פתוגנים (Roth-Walter וחב' ב-PLoS One משנת 2014). תוך צריכתו, BLG מסוגל להחדיר ברזל מורכב לתוך תאי חיסון באדם, תוך אספקת תזונה לתאים אלה והשתתפות בעמידות חיסונית (Roth-Walter וחב' ב-J Allergy Clin Immunol משנת 20121, ו-Afify וחב' ב-Front Immunol משנת 2021).

המבנה של BLG

מספר וריאנטים של BLG זוהו, בעיקר באלה מפרה והם סומנו כ-A ו-B. בגלל ריכוזו הגבוה הוא נחשף למספר ניכר של מחקרים ביופיזליים. המבנה שלו נקבע פעמים אחדות בעזרת קריסטלוגרפיה של קרינת X ועל ידי NMR (Qin וחב' ב-Biochemistry משנת 1998). BLG חיוני בתעשיית מוצרי חלב שכן משמעותו בהם חיונית (Jost ב-Trends Food Sci & Technol משנת 1993). BLG של בקר היא מולקולה עם 162 חומצות אמינו משקל מולקולרי של 18,400 דלטון. BLG-1 מסוסים הוא בעל משקל מולקולרי של 18,500 דלטון והנקודה האיזואלקטרית שלו ב-pH של 4.85, ואילו BLG-II הוא בעל משקל מולקולרי של 18,262 דלטון אף על פי שיש לו חומצת אמינו נוספת ו-pH איזואלקטרי של 4.7. הרצף המלא של 162 חומצות אמינו הסתבר מבחינה של 8 וריאנטים גנטיים (A, B, C, D, E, F, G ו-Dr)‏ (Creamer et al ב-Arch Biochem Biophys משנת 1983), BLG עשוי לשחק תפקיד במטבוליזם של פוספאט בבלוטת החלב (Farrel וחב' ב-J Dairy Sci משנת 1987), או בהעברת חסינות פסיבית בוולדות (Warme וחב' ב-Biochemistry משנת 1974). תוך התבססות על מבנה ה-BLG נראה שהוא מסוגל לקשור ליגנדים ולסייע לטרנספורט של ליגנדים הידרופוביים קטנים (Perez ו-Calvo ב-J Dairy Sci משנת 1995). כיוון שיש ל-BLG מספר אתרי קישור, הוא מסוגל להעביר ויטמינים A ו-D, חומצה פלמיטית, ומולקולות הידרופוביות נוספות. בנוסף, BLG הוא בעל זיקת קישור חזקה לחומצות שומניות, פוספוליפידים, ותרכובות ארומטיות (Tai וחב' ב-Int Biomed Res משנת 2016). BLG הוא חלבון קושר רטינול ויכול להיות יעיל בטרנספורט של רטינול (Puyol וחב' ב-J Dairy Res משנת 1993). Papiz וחב' הדגימו ב-J Mol Graphics משנת 1986 ש-BLG מגביר את הקישור לרטינול במעי של וולדות בקר.

BLG טבעי עמיד לעיכול בקיבה אך הוא מעוכל על ידי אנזימי מעיים. עם זאת, BLG טבעי יכול להתגלות ברמת ה-ileum‏ (Sanchon וחב' ב-Food Chem משנת 2018). כיוון ש-BLG אינו מרכיב של חלב אדם, החלבון הטבעי הוא אלרגן למספר קטן של וולדות (Chatterton וחב' ב-Sci Res משנת 2013). שלא בדומה ל-BLG של בקר, ל-BLG של סוס אין קבוצה סולפהידרילית. בחלב של מעלי גרה BLG מופיע כדימר ב-pH נורמלי כאשר בחלב סוסים BLG מופיע כמונומר. בתנאים פיזיולוגיים BLG מופיע כדימר, אך עובר דיסוסיאציה למונומר ב-pH נמוך מ-4.3 תוך הבנת מצבו הטבעי כפי שנקבע על ידי NMR (Urlinova וחב' ב-Biochemistry משנת 2000). עם זאת, BLG יכול להופיע כטטרמר (Timasheff ו-Towmsend ב-Nature משנת 1964), כאוקטמר (Gottschalk וחב' ב-Protein משנת 2003), וכצורות מולטימריות תחת מצבים שונים (Rizzutti וחב' ב-Langmuir משנת 2010). BLG יוצר ג'ל במצבים שונים, כאשר המבנה הטבעי הוא בלתי יציב במידה מספקת, באופן המאפשר אגרגציה (Bromley וחב' ב-Faraday Discusions משנת 2005). לאחר חימום ממושך ב-pH נמוך וחוזק יוני נמוך, נוצר ג'ל בו מולקולות החלבון מסתדרות בצורת סיבים ארוכים ונוקשים. BLG הוא המרכיב העיקרי של חלב לאחר הרתחתו. ברגע שהוא עובר דנטורציה, BLG יוצר פילם ג'לטיני דק על פני החלב. על ידי שימוש בספקטרוסקופיית אור, ניתן ללמוד על צורות ביניים מקופלות, וכך נמצא לדוגמה צורות ביניים המורכבות בעיקר מ-α helices, למרות העובדה שהצורה הטבעית שלהם היא זו של β sheets.

המשמעות הקלינית של BLG

כיוון שחלב הוא אלרגן ידוע, מעבדות לבדיקת מזון עשויות להשתמש ב-enzyme linked immunosorbent assay לזהות ולכמת את BLG במוצרי מזון. אף על פי ש-BLG נחשב אלרגן משמעותי, ההגנה שעשויה להתקבל משתיית חלב בתחום זה תלויה בכמות BLG הנצרכת (Loss וחב' ב-J Allergy Clin Immunol משנת 2011). כאשר BLG נושא איתו מיקרו-נוטריינטים הוא פועל כחומר טולרוגני ומגן מפני התפתחות אלרגיה. אלא שכאשר BLG אינו נושא מיקרו-נוטריינטים הוא עלול לפעול כאלרגן (Roth-Walter וחב' ב-J Allergy Clin Immunol משנת 2021, Afify וחב' ב-Front Immunol משנת 20121). פולימריזציה של BLG על ידי טרנסגלוטמינאזה מיקרוביאלית מפחיתה את האלרגיות שלו (Olivier וחב' ב-Clinics משנת 2012).

BLG הוא חלבון גלובולרי המופיע בחלב של מינים רבים כולל מעלי גרה כפרות כבשים, אך גם במספר מינים שאינם מעלי גרה כגון חזירים וסוסים (Kontopidis וחב' ב-J Dairy Sci משנת 2000), קופים כבבונים, רזוס, קופי cynomolgus וקופי vervet, ובופלו, עזים וכבשים, בקנגורו ובדולפינים. BLG מהווה כ-10% מכלל החלבונים בחלב פרות, אך אינו מופיע בחלב אדם, בחזירי-ים, במכרסמים, בארנבות, בגמלים, בלמות (llamas) ובאלפקות, בהם αLa הוא החלבון העיקרי במי הגבינה. אף על פי ש-BLG התגלה ובודד בשנות ה-30 של המאה ה-20 לא יוחסו לחלבון זה תפקודים ספציפיים (Kontopidis וחב' ב-J Mol Biol משנת 2002 ו-Perez ו-Calvo ב-J Dairy Sci משנת 1995). הוצע ש-BLG הוא חלבון טרנספורט של מולקולות קטנות כגון חומצות שומניות, פוליפנולים ורטינואידים. הרצף של 26 חומצות אמינו בקצה ה-N טרמינלי של BLG של קופי cynomolgus הוא בעל 54% הומולוגיה עם זה של BLG בבקר. BGL של בבונים מכיל 168 חומצות אמינו בהשוואה ל-162 חומצות אמינו ב-BLG של בקר, כאשר ההבדל נובע מהחדרת 8 חומצות אמינו, בין חומצות אמינו 61 ו-62, וההשמט של חומצות אמינו 109 ו-112. BLG של בבונים דומה יותר לזה של glycodelin A אנושי, מאשר לזה של glycodelin A של בקר. יתרה מכך, נוגדנים חד-שבטיים שיוצרו כנגד BLG הגיבו עם glycodelin A.‏ BLG של מספר מינים מכיל קבוצת -SH חופשית שאינה קיימת במינים אחרים; חלק מה-BLG מופיעים כדימרים ב-pH נויטרלי, וחלקם לא.

בצורתו הטבעית, BLG הוא בעיקרו בעל מבנה של β-sheet, אם כי בחימום BLG מסוגל לעבור self assembly למגוון של מבנים סופרה-מולקולריים (Perez וחב' ב-Food Chem משנת 2014). הסיבים של הג'לים הנוצרים לאחר אינקובציה מתחת לנקודה האיזו-אלקטרית pH 5.1) ) Sava) וחב' ב-Commun Agricul Appl Biol Sci משנת 2004), זוהו כפיברילות עמילואידיות (Chen וחב' ב-Journal Dairy Sci משנת 2005). BLG הוא בעל חשיבות גדולה לתעשיית מוצרי החלב, והוא במיוחד חיוני לשמירה על המרקם של פריטי מזון אלה (Yang וחב' ב-Protein Structure Function Bioinformat משנת 2008). באותו זמן, שינויי המבנה שלו, הופכים את BLG ליעד של מדע חומרים (Song וחב' ב-J Biol Chem משנת 2005). בנוסף, BLG הפך לחלבון מודל משמעותי במחקר של self assembly של של סיבים עמילואידיים (Yang וחב' ב-FEBS J משנת 2009).

ה-BLG של בקר מורכב מ-162 חומצות אמינו למונומר עם משקל מולקולרי של 18,000 דלטון. בנקודה האיזואלקטרית שלו היא pH 5.2, והוא מורכב משני קשרים די-סולפידיים ומולקולת ציסטאין אחת למונומר. שייר הציסטאין חשוב במיוחד כיוון שהוא מגיב לאחר דה-נטורציה טרמלית, עם הציסטאין של κ-casein והוא חיוני ליציבות הטרמלית של חלב. הוא גם אחראי לארומה של חלב מחומם. מספר BLGs כמו זה של חזיר, חסרה את שייר הסולפהידריל. BLG עמיד מאוד לפרוטאוליזה בצורתו הטבעית, ויש לו שתי פעילויות ביולוגיות:

1. הוא קושר רטינול בגומחה ההידרופובית שלו, ומגן עליו מפני חמצון, ומעביר אותו דרך הקיבה למעי הדק, מקום בו הרטינול נקשר ל-retinol-binding protein שיש לו מבנה דומה לזה של BLG.
2. על ידי יכולתו לקשור חומצות שומן, BLG מעודד פעילות lipase, שעשויה להיות פעילותו הפיזיולוגית החשובה ביותר. BLG הוא החלבון האלרגני ביותר בחלב בקר לתינוקות אדם, ויש עניין רב בהכנת תוצרי whey protein חופשי מ -BLG להכנת פורמולה לתינוקות

BLG משפיע על חסינות האדם ומעודד שגשוג תאים

BLG נחשד כמעודד או מאפנן (modulate) תגובה חיסונית. נמצא ש-BLG הוא מעודד פוטנטי של שגשוג תאים תוך שימוש במודל של תא היברידומה (ספלנוציט שעבר איחוי עם תא myeloma). על מנת לחקור את השפעת הקונפורמציה של BLG על שגשוג תאים, בוצעה מודפיקציה כימית של BLG או על ידי קרבוקסי-מתילציה או על ידי אצטילציה, שגרמו לירידה בשגשוג תאים. יתרה מכך, הוכח ש-BLG מעודד שגשוג תאים על ידי שינוי בקולטן הממברנלי של IgM. הנתונים מצביעים על כך ש-BLG הוא המרכיב העירי בחלב המאפנן את שגשוג התאים. בנוסף, כיוון שיש ל-BLG זיקת קישור חזקה לחומצות שומן, לפוספוליפידים ולתרכובות ארומטיות, הקישור של מולקולות אלו ל-BLG יכול לשנות את תכונותיהן הביולוגיות. דוגמאות להיגד האחרון כוללות עיכוב פעילות angiotensun-converting enzyme, השפעות היפר-כולסטרולמיות ועוד (Chatterton וחב' ב-Int Dairy J משנת 2006). בגלל יכולתו להיקשר למולקולות הידרופוביות, BLG שימש לשפר את תכונות האנקפסולציה של ליפוזומים ולשמש כמערכת יציבה להעברת ויטמין E (Rovoli וחב' ב-J Liposome Res משנת 2014). בנוסף ליכולתו לקשור ליגנדים, BLG יכול גם לתרום להגנה מפני מחלות חמורות כגון ספסיס (Mayr וחב' ב-Virulence משנת 2014). השוואת רצפים בין חברים של משפחת ה-lipocalin, מגלה ש-glycodelin המצוי באנדומטריום האנושי במהלך שלבי היריון מוקדמים, דומה במיוחד ל-GLB. נמצא שביטוי-יתר של BLG בבלוטות החלב של מינים רבים, אם כי לא בכולם, מהווה מקור חשוב של חומצות אמינו לצאצאים היונקים. מספר מחקרים מצביעים על תכונות נוספות של BLG הכוללות תכונות אנטי-בקטריטליות וכן פעולות נוגדות חמצון (Power וחב' ב-Amino Acids משנת 2013, ו-Andez-Ledesma באותו כתב-עת משנת 2013). Chaneton וחב' זיהו את הפעילות האנטי-מיקרוביאלית של BLG במחקרם על הפעילות האנטי מיקרוביאלית של BLG בבלוטות החלב ב-J Dairy Sci משנת 2011).

BLG יכול לפעול באופן פוטנציאלי כחומר מזון נוגד-חמצון. ניסוי מוקדם הראה שייר הציסטאין החופשי של BLG, משחק תפקיד הגנתי בפעילות האנטי-חמצונית של חלב, ו-BLG תורם ל-50% מפעילות זו של החלב (Liu וחב' ב-J Dairy Sci משנת 2007). BLG נקשר ל-curcumin ובכך הוא מחזק את הפעילות האנטי-חמצונית של האחרון (Li וחב' ב-Food Chem משנת 2013). כיוון שמחקרים מוקדמים הצביעו על יכולת BLG להגביר את התגובה החיסונית של הגוף, כגון יכולתו לתווך בפעילות הלימפופויאטין של סטרומת התימוס דרך מסלול ה-NF-κB (Yoo וחב' ב-J Agri Food Chem משנת 2015). חלבון ה-whey המהווה בערך 20% מסך החלבון הנמצא בחלב, משפיע על תהליכים ביולוגיים נרחבים החל מבניית עצם, ריפוי פצעים, וויסות מערכת החיסון, שליטה על הדבקות ומטבוליזם (Krissansen ב-J Amer Coll Nutr משנת 2007). במודלים של חיות, חלבוני whey מדווחים לשפר את חסינות הרירית ושל תאים טבעיים (innate) במהלך יניקה (Perez-Cano וחב' ב-Br J Nutr משנת 2007). יתרה מכך, הם מסוגלים לעודד את השגשוג של תאי החיסון ואת נדידתם לאיברי חיסון משניים (Badr וחב' ב-J Nutr Biochem משנת 2012). זאת ועוד, הודגם ש-whey של בקר הוא מקור פוטנטי של פעילות מעודדת שגשוג לכל התאים המזודרמליים, כולל תאי עור של אדם, פיברובלסטים מתאי ריאות עובריות של אדם, פיברובלסטים של Balb/C 3T3, ומיובלסטים מסוג L6 מחולדה (Belford וחב' ב-In vitro Cell Develp Biol משנת 1995).

חלבונים של חלב בקר ושל whey מבקר שימשו בתרבית של תאי היברידומה ונמצא שחלבוני whey הם המרכיבים החשובים ביותר בחלב המודדים שגשוג של תאי היברידומה (Pakkanen וחב' ב-Appl Microbiol Biotechnol משנת 1992, ו-Capiaumont וחב' ב- In vitro Cell Develp Biol משנת 1996). חלבוני whey מכילים מספר מרכיבים המעודדים את מערכת החיסון, כגון lactoferrin ו-BLG, המסוגלים לעודד תגובות חיסוניות (Beaulieu וחב' ב-Therapy משנת 2006, ו-Fleming וחב' ב-J Dairy Sci משנת 2016).

הכנת מקטע של חלבוני whey מחלב בקר

חלב בקר טרי, שקורר מיד עם איסופו לטמפרטורה של 10 מעלות. הפיכתו לחָלָב דַּל-שֻׁמָּן בוצעה על ידי סרכוז למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות במהירות של 8.000g ובהמשך הפרדת השומן הושגה על ידי יציקת החלב מעל צמר זכוכית. Casein הושקע ב-pH 4.6 על ידי תמיסת 1M HCl. לאחר סרכוז למשך 15 דקות נוספות במהירות g8,000, הנוזל העליון נאסף ועבר פילטרציה דרך cartridge filter עם חורים בקוטר 0.45 מיקרון. כרומטוגרפיה של anion exchange :DEAE-Sepharose נדחס ב-XK 16/20 ‏ (Amersham) לצורך כרומטוגרפיית anion exchagge חלשה. ג'ל מורחף ב-20% אתנול, נרכש מ-Sigma Aldrich, והקולונה הוכנה עם 15 מ"ל של שארית נפח הג'ל. תמיסת whey (חמישה מ"ל) המכילה חלבונים בריכוז של 2.6 מיליגרם/מ"ל, הוזרקה לקולונה בקצב של 1 מ"ל/דקה. חלבונים שלא נקשרו לקולונה נשטפו עם 60 מ"ל של בופר (20mM Tris-HCl ב-pH 7.0). החלבונים שנקשרו לקולונה נשטפו באלוציה תלת-שלבית, עם 30 מ"ל עם הבופר הראשוני המכיל NaCl בריכוזים של 0.25 מולר, 0.50 מולר ר-1 מולר באותו קצב. פרקציות של 1.5 מ"ל נאספו ונחקרו באלקטרופורזה ב-SDS-PAGE. כרומטוגרפיה ב-gel filtration. תמיסת Sephadex G-75 עברה degassing ונדחסה לקולונת XP16/20 . הקולונה עברה שיווי משקל בתמיסת בופר Tris בריכוז 0.02 מולר ב-pH 7.0. פרקציה של 1 מ"ל נאספה על ידי כרומטוגרפיה אניונית והוטענה על קולונת GF בקצב של 0.5 מ"ל /דקה. קריאת הבליעה של הפרקציות נוטרה באורך גל 280 ננומטר. ניקיון הפרקציה החלבונית התבצע על ידי אלקטרופורזה ב-SDS-PAGE.

הוראות לביצוע הבדיקה

איסוף דם במבחנה כימית (פקק אדום או צהוב) או במבחנת ג'ל. יש להפריד את הנסיוב מכדוריות הדם תוך שעתיים מנטילת בדם והסרכוז. יש להעביר את הדגימה למעבדה בקירור, אך יש לפסול דגימות נסיוב המוליטיות, איקטריות או ליפמיות. לאחר הסרכוז הדגימה יציבה בטמפרטורת החדר למשך 48 שעות, באחסון בקירור הדגימה יציבה למשך שבועיים, ובהקפאה למשך שנה. ביוסנסור של resonance-enhanced adsorption (או REA) שימש במבחן סנדוויץ' אימונולוגי, תוך שימוש בנוגדנים מסומנים עם צברים מוזהבים כנגד BLG. בשיטה זו ניתן היה לזהות BLG בריכוז של 100 ננוגרם/מ"ל. ביוסנסור מסוג SPR (surface plasmon resonance) במבחן סנדוויץ' היה מסוגל לזהות את האלרגן בריכוז של 1-12.5 מיקרוגרם/מ"ל.