האיגוד הישראלי לרפואת משפחה

גלקטוז-1-פוספאט באריתרוציטים - Galactose-1-phosphate

מתוך ויקירפואה
     מדריך בדיקות מעבדה      
גלקטוז-1-פוספאט באריתרוציטים
Galactose-1-phosphate
 שמות אחרים  Gal1P
מעבדה כימית
תחום גלקטוזמיה
Covers bdikot.jpg
 
טווח ערכים תקין ראו טבלה מס' 1
יוצר הערך פרופ' בן-עמי סלע
טבלה מס' 1 - טווח ערכים תקין
סוג הנבדקים n [Gal1P] גיל
מתנדבים בריאים 100 0 – 0.2 25 – 50 שנה
מטופלים לא-גלקטוזמיים 40 0 – 0.2 50 – 20 שנה
תינוקות גלקטוזמיים 10 10.5 – 17.1 0 – 7 חודשים
ילדים ומבוגרים גלקטוזמיים 48 0 – 3.5 1-45 שנה

הפיזיולוגיה של Gal1P

D-galactose-1-phosphate (להלן Gal1P) הוא תוצר ביניים בהפיכה ההדדית של גלוקוז ושל uridine-diphsphate-galactose. הוא נוצר מ-galactose על ידי galactokinase. המטבוליזם הבלתי סדיר של Gal1P מאופיין בגלקטוזמיה (Gitzelmann ב-Eur J Pediatr משנת 1995). המסלול של Leloir אחראי למטבוליזם של גלקטוז ושל תוצר הביניים שלו, Gal1P. חסר באנזימים של מסלול זה, גורם לגלקטוזמיה, ולפיכך בירור המחלה הגנטית הזו מתבצע על ידי מדידת הריכוז של אנזימים אלה (McCorvie וחב' ב-Biochim Biophys Acta משנת 2013). אחד האנזימים הללו הוא galactose-1-phosphate uridyltransferase (להלן GALT) המקטלז את הטרנספר של קבוצת ה-UDP activator מ-UDP-galactose ל-Gal1P. מספר מחקרים מראים שהתקפלות (misfolding) שגויה של GALT, עלולה לגרום לשינויי קונפורמציה לא נכונים, מה שפוגע ביציבות הטרמית ובכושר הזיקה של האנזים למצעיו, ולפגוע בחסר של GALT בגלקטוזמיה type 1. הגברה בריכוז galactitol מופיעה בחולי גלקטוזמיה, מה שעלול לגרום להופעת ירוד (cataract) קדם-סנילי (Ficicioglu וחב' ב-Clin Chem משנת 2010).

מטרת הבדיקה: ניטור של תרפיה דיאטתית של מטופלים עם גלקטוזמיה, בגין חסר באנזימים gal-1-phosphate uridyltransferase או uridine diphosphate galactose-4-epimerase.

גלקטוזמיה היא מפגע אוטוזומלי-רצסיבי הנובע מחסר של כל אחד מארבעת האנזימים המקטלזים את ההמרה של גלקטוז לגלוקוז:,galactose-1-phosphate uridyltransferase (GALT) ,galactokinase (GALK) uridine diphosphate galactose-4-epimerase (GALE) ו-galactose mutarotase (GALM). החומר galactose-1-phosphate (Gal1P) מצטבר באריתרוציטים של חולי גלקטוזמיה בגין חסר של GALT או של GALE, או בתינוקות עם חסר של GALM. המדידה הכמותית של Gal1P חיונית לנטר את ההיענות הדיאטתית של המטופלים. Gal1P נחשב גורם קובע בהתפתחות המחלה בכבד, וריכוז Gal1P באריתרוציטים הוא המדד הרגיש ביותר של בקרה דיאטתית. חסר ב-GALT היא הסיבה השכיחה ביותר של גלקטוזמיה וההתייחסות לחסר זה נחשבת לגלקטוזמיה קלאסית. חסר שלם או כמעט שלם של GALT מסכן חיים אם אינו מטופל, וסיבוכים בתקופת הילדות המוקדמת כוללים פיגור בגדילה, כשל של הכבד, ספסיס ומוות.

גלקטוזמיה בגין חסר ב-GALT מטופלת על ידי דיאטה דלה בגלקטוז, מה שמאפשר התאוששות מהירה מהתסמינים החריפים ובדרך כלל מאפשר פרוגנוזה טובה. למרות טיפול הולם מגיל הינקות, אלה עם גלקטוזמיה נמצאים בסיכון מוגבר לעיכוב התפתחותי, בעיות בדיבור, ואי-סדירות של תפקוד מוטורי. נשים עם גלקטוזמיה נמצאות בסיכון מוגבר לכשל שחלתי מוקדם. בהתבסס על נתונים מסקרי יילודים, השכיחות של גלקטוזמיה קלאסית בארצות הברית היא 1 ל-30,000, אף על פי שעל פי הדיווחים בספרות השכיחות היא 1 ל-10,000 עד 1 ל-60,000 לידות חי. חסר של epimerase בגלקטוזמיה יכול להיות מחולק ל-3 סוגים: כללי, היקפי ומעורב. הסוג הכללי מתבטא בחסר חמור של פעילות האנזים בכל הרקמות, בעוד שהחסר ההיקפי של epimerase מתבטא בפעילות נמוכה של אנזים בכדוריות דם אדומות ולבנות, אך בפעילות נורמלית של האנזים בכל הרקמות האחרות. זאת בהשוואה לסוג המעורב של חסר epimerase בגלקטוזמיה, שגורם לחסר באנזים בכדוריות אדומות ולבנות, ולפעילות נמוכה מ-50% מרמות האנזים הנורמלי בכל הרקמות האחרות.

קלינית, תינוקות עם גלטקוזמיה על בסיס חסר כללי של epimerase מפתחים תסמינים כגון תפקוד לקוי של הכבד והכליות, כמו גם ירוד מתון כאשר הם נמצאים בדיאטה תקינה של חלב, בעוד שתינוקות עם חסר חלקי של epimerase אינם מפתחים כל תסמינים. גלקטוזמיה על רקע של חסר כללי של epimerase, מטופלת בדיאטה דלה בגלקטוז ובלקטוז, שעשויה למנוע את אי התפקוד של הכבד והכליות, ואת הירוד המתון. אלה עם גלקטוזמיה על בסיס חסר כללי של epimerase, מצויים בסיכון מוגבר לפיגור התפתחותי ואינטלקטואלי. בניגוד לאלה עם גלקטוזמיה קלאסית על בסיס חסר ב-GALT, נשים עם גלקטוזמיה על רקע חסר כללי ב-epimerase הן בעלות התפתחות מינית תקינה, ואינן בסיכון של כשל שחלתי מוקדם. על פי נתוני סקרי יילודים התדירות של גלקטוזמיה על רקע של חסר epimerase בארצות הברית נע בין 1 ל-6,700 תינוקות ממוצא אפריקני ל-1 לכל 70,000 תינוקות ממוצא אירופי. חסר GALM היא צורה נדירה של גלקטוזמיה, בגין חסר באנזים galactose mutarotase, שיכול להתבטא קלינית בירוד דו-צדדי. תינוקות עם חסר GALM הם בעלי רמות מוגברות של גלקטוז בדמם, עם רמות של Gal1P הנעות בין 0.3 עד 10.8 מיליגרם/דציליטר (Wada וחב' ב-Genet Med משנת 2019). תינוקות עם חסר GALM מכילים רמות מוגברות של Gal1P, אך חומר זה יורד במהירות בגיל מבוגר יותר. נכון להיום תינוקות תוארו רק עם חסר GALM, כך שהתסמינים של חסר זה במבוגרים אינם ידועים. התדירות של חסר GALM דווחה כ-1 ל-10,000 באוכלוסייה אפרו-אמריקנית, ו-1 ל-80,000 באוכלוסייה היפנית, ומוערכת כ-1 ל-228,000 בכל האוכלוסיות (Iwasawa וחב' ב- Mol Genet Metab משנת 2019). הריכוז המומלץ של Gal1P בחולים עם גלקטוזמיה הוא 4.9 מיליגרם/דציליטר או פחות מכך (Timson ב- Genet Med משנת 2019).

אף על פי שאנשים עם גלקטוזמיה מטופלים על ידי דיאטה עם כמות מוגבלת של גלקטוז, מטבוליטים כגון Gal1P יכולים להצטבר באריתרוציטים ומדידתם היא פרקטיקה סטנדרטית לניטור שלהם. נכון ל-2022, אין שיטות מסחריות למדידת Gal1P באריתרוציטים, והשיטה המעבדתית המקובלת היא גז כרומטוגרפיה-מס ספקטרומטריה. שיטה זו עברה אופטימציה ותיקוף לשימוש קליני בתורמי דם בריאים וכן בתינוקות, בילדים ובמבוגרים גלקטוזמיים. השיטה נמצאה מתאימה לניטור של היענות דיאטתית. רמות של Gal1P נמצאו במתאם טוב עם הסימנים הקליניים של חולי גלקטוזמיה, במהלך המעקב.

שכיחות גלקטוזמיה במערב אירופה היא בין 1 ל-23,500 או 1 ל-44,000 ‏(Honeyman וחב' ב-Arch Dis Child משנת 1993). אבחון קליני של גלקטוזמיה בתינוקות מבוסס על תסמינים כגון קשיי אכילה ועלייה מוגבלת במשקל, שלשולים, הקאות, פגיעה במערכת העצבים המרכזית, ירוד דו-צדדי, ומחלת כבד עם היפר-בילירובינמיה, עלייה ברמת טרנסאמינזות בכבד, הפרשת גלקטוז מוגברת בשתן, חמצת וספסיס. כתוצאה מחסמים בפעילות אנזימטית במטבוליזם של גלקטוז, הצטברות של Gal1P באריתרוציטים וברקמות אחרות גורמת לטוקסיות ברמת המטבוליזם התאי (Schwarz ב-Arch Dis Child משנת 1960). אכן, התפקיד הפתוגנטי של Gal1P אושר על ידי חוקרים אחדים שתיעדו את הפעילות המעכבת של Gal1P על מספר ריאקציות מפתח במטבוליזם של גלוקוז (Gitzelmann ב-Pediatr Res משנת 1969). לפיכך, הטיפול במקרים מאושרים של גלקטוזמיה, היא הגבלה דרמטית בצריכת גלקטוז. האבחון המעבדתי הראשוני מתבסס על זיהוי הפעילות הנמוכה של GALT המתבצעת באופן שגרתי על ידי spot test‏ (Beutler ו-Baluda ב-J Lab Clin Med משנת 1966), וכן על ידי גילוי סוכרים בשתן. מספר שיטות בלתי-ישירות פותחו בעבר למדידה של Gal1P באריתרוציטים. הגישות האנזימטיות המקוריות היו קשות לביצוע וגוזלות זמן רב בביצוען (Donnell וחב' ב-Pediatrics משנת 1963). בשנת 2002 Chen וחב' ביצעו ניסויים בזיהוי כימי ישיר של Gal1P תוך שימוש בשיטת מיהול איזוטופים על ידי GC-MS לאחר trimethylsylation של שייר הפוספט בסוכר (Chen וחב' ב-Clin Chem משנת 2002).

מדידה של Gal1P באריתרוציטים

דם של נבדקים שאינם בצום, נלקח במבחנות ( עם פקק ירוק) המכילות סודיום הפארין. בדגימות טריות, אריתרוציטים הושגו לאחר הרחקת הפלזמה ולויקוציטים על ידי סרכוז של 5 דקות במהירות 1,200g ונשטפו 3 פעמים עם בופר פוספאט-סליין (PBS ) והאריתרוציטים הדחוסים נשמרו בהקפאה עד לאנליזה שלהם.

שיטת GC-MS למדידה של GC-MS:

בשיטה זו (Chen וחב' ב-Clin Chem משנת 2002), מדידה של Gal1P בוצעה על ידי electron ionization ב- ev70 על מכשיר Agilent 6890/5973 מצויד בקולונת HP-5MS בממדים של 30mX250micromX0.25microm, מצומדת עם phenylmethylsiloxane 5%. קצב הזרמת הליום היה קבוע (1.2 מ"ל/דקה). הדגימה הוזרקה לקולונה בנפח של 5 מיקרוליטר. ברַמְפָּה-1טמפרטורת התנור החלה ב-50 מעלות צלזיוס למשך 12 שניות, והוגברה עד ל-250 מעלות בקצב של 30 מעלות/דקה, והושארה בטמפרטורה זו למשך 3 דקות. ברַמְפָּה 2 הטמפרטורה הועלתה ל-300 מעלות בקצב של 40 מעלות/דקה, והושארה בטמפרטורה זו למשך 5.5 דקות. Gal1P ו-13C Gal1P התגלו בתוך אותו peak כרומטוגרפי, על ידי מדידת העוצמות היוניות של יוני היעד m/z 204 ו-m/z 205. כמו כן, נמצא שהפרגמנט העיקרי עם m/z 299 המתאפיין על ידי נוכחות גבוהה, התגלה רק בנוכחות Gal1P Taverniers) וחב' ב-Trends Analyt Chem משנת 2004). על מנת להעריך את הספציפיות של הבדיקה, נאספו דגימות מ-140 מתנדבים בריאים, ודיוק הבדיקה נלמד על ידי הוספת Gal1p בריכוזים נמוכים (1.3 מיליגרם/דציליטר), ממוצעים (6.5 מיליגרם/דציליטר), וגבוהים (26 מיליגרם/דציליטר) למאגר של אריתרוציטים דחוסים. דיוק הבדיקה בוטא על ידי קרבת ההסכמה בין תוצאות הבדיקה לבין התוצאות הצפויות שלה.

למדידה של ריכוז GaliP באריתרוציטים דחוסים נעשה שימוש בעקומת כיול. נמצא מתאם משמעותי ביותר בין ריכוז Gal1P לבין היחס של m/z 204 לזה של m/z 205ב-10 רפליקטים שנמדדו במהלך תקופה של חודשיים. ה-CV התוך בדיקתי וה-CV החוץ-בדיקתי, והדיוק עבור ריכוזי Gal1P נמוכים, ממוצעים וגבוהים, תוך מציאת השיפור בגבול הגילוי LOD)) ובגבול יכולת הכימות LOQ))נמצא שה-LOD היה 0.0013 מיליגרם/דציליטר, עם יחס של signal/noise של 4.1. כן נמצא LOQ של 0.013 מיליגרם/דציליטר עם אי-דיוק של (CV) 11% וסטייה מהמטרה של 15% (על פי Cangemi וחב' ב-Scand J Clin Lab Invest משנת 2012). כיוון שמולקולות נוספות פרט ל-Gal1P יכולות להופיע ב-peaks ב-m/z 204 ו-m/z 205, שימוש ב-m/z 299 יכול לתרום לזיהוי Gal1P. אפיון של נגזרת trimethylsilyl של פוספטים סוכריים על ידי GC-MS כיוֹן מַגְדִּיר עם retention time של m/z 204 ו-m/z 205, מאפשר זיהוי מדויק של Gal1P.

תחומי נורמה של Gal1P בנבדקים בריאים וגלקטוזמיים: (על פי Honeyman וחב' ב-Arch Dis Child משנת 1993, ו-Lowber באותו כתב עת משנת )1960.

תרכובת תחום ערכים נורמלי

Galactose-1-phosphate (mg/dL)	0.0-0.9 mg/dL
Galactose-1-phosphate (ug/g Hb)	0-53 μg/g Hb
Galactose-1-phosphate (umol/g Hb)	0.00-0.20 μmol/g Hb

הוראות לביצוע הבדיקה:

את דגימת הדם יש ליטול במבחנת ספירת-דם (EDTA, פקק סגלגל, או במבחנת סודיום הפארין (פקק ירוק). טילת דם מיד לאחר ארוחה, עלולה לתת תוצאות מוגברות. בתינוקות, יש ליטול את הדם לפני ארוחה. יציבות דגימת דם שנלקחה במבחנת EDTA היא למשך 3 ימים. יש לפסול דגימות בהן הפלזמה המוליטית מאוד. אין לקבל דגימות מוקפאות או כאלו בטמפרטורת החדר.