כניסה 
עקבו אחרינו בפייסבוק Eosinophil-derived neurotoxin
| מדריך בדיקות מעבדה | |
| ' | |
|---|---|
| Eosinophil-derived neurotoxin | |
| שמות אחרים | EDN |
| מעבדה | כימיה בדם. |
| תחום | מדד של אסתמה. |
 | |
| טווח ערכים תקין | מדידת רמת EDN בנסיוב של 60 גברים ו-60 נשים בבריאות מלאה, העלתה שטווח ריכוז EDN בנסיוב של גברים הוא 2.1 עד 26.10 ננוגרם/מ"ל, ואילו של נשים 1.98 עד 25.71 ננוגרם/מ"ל. |
| יוצר הערך | פרופ' בן-עמי סלע |
הקשר של EDN לפיזיולוגיה של אסתמה
בשנת 2015 מספרם הגלובלי של הסובלים מאסתמה הוערך כ-352 מיליון איש, עלייה של 10% במספר חולי אסתמה 10 שנים קודם לכן (דו"ח שהתפרסם ב-Lancet בשנת 2016). אסתמה מאופיינת על ידי דלקת כרונית של דרכי האוויר במגוון של תסמיני נשימה הכוללים קוצר נשימה, נשימה שורקנית (wheezing), צמידות חזה (tigthtness) ) ושיעול. מוסכם שאסתמה היא מחלה הטרוגנית מטבעה, המורכבת מפנוטיפים קליניים רבים ושונים ומאנדוטיפים מולקולריים (Wenzel ב-Lancet משנת 2006, ו-Agache ו-Akdis ב-J Clin Invest משנת 2019). ההטרוגניות והמורכבות של אסתמה תומכות בגישות הטיפוליות המגוונות, הדורשות גישות טיפוליות מדויקות לזיהוי וטיפול בתת-האוכלוסיות של חולי אסתמה (Bonfield ו-Ross ב-Curr Opin Allergy Clin Immunol משנת 2012, ו-Drazen וחב' ב-Br Med Bull משנת 2000).
אסתמה כרוכה במספר מוגבר של אאוזינופילים ברקמות, בנוזלי גוף ובמח העצם. בנוסף, בחולי אסתמה נצפו רמות מוגברות של eosinophilic cationic protein או ECP. רמות מוגברות של EDN או של ECP כרוכות גם הן במצבים של התקפי אסתמה, ולכן שני סמנים אלה יכולים לסייע באבחון ובניטור של המחלה. מספר חוקרים מציעים ש-EDN יעיל יותר מאשר ECP בהערכת חומרת המחלה. זאת יכולה להיות תוצאה של העובדה שיכולת השחזור של EDN היא כמעט של 100% בהיותו חלבון לא דביק, בה בשעה ש-ECP הוא חלבון דביק וטעון יותר (Kim וחב' ב-Korean Journal of Pediatrics משנת 2013). במושגים של שימושיות קלינית, רמת EDN היא סמן מדויק יותר מאשר ECP כאשר עושים אנליזה של הפתו-פיזיולוגיה של אסתמה. ככלי של ניטור EDN, נתן תוצאות טובות בילדים אסתמטיים ובמחלות אלרגיות אחרות. בילדים צעירים מדי להשתתף באופן מלא בטסטים של תפקודי ריאות, רמות EDN עשויות להיות יעילות במדידה של דלקת אאוזינופילית. EDN יכול לשמש גם בחולים מבוגרים בסוגי נוזלי גוף שונים כגון נסיוב, רוק, הפרשה ברונכואלבאולרית ונוזל הפרשה מהאף.
לסיכום, EDN יכול לשמש סמן ביולוגי לאבחון, טיפול, וניטור של אסתמה או של מחלה אלרגית. EDN שהוא תוצר הפרשה מגרנולות של אאוזינופילים מצטייר כסמן חדש לאבחון וניטור של אסתמה בילדים ובמבוגרים. ל-EDN יש תפקיד ב-postbronchiolitis ,wheezing, באסתמה ובריניטיס אלרגית, ובשיעול כרוני ובאסתמה במבוגרים. ללא קשר לפנוטיפ של האסתמה, כאשר אאוזינופילים משופעלים על ידי הדבקה או אלרגיה, הם מפרישים EDN. לפיכך רמות EDN עשויות לשמש באבחון וניטור של פנוטיפים שונים של אסתמה. אאוזינופילים הם שחקני מפתח במחלות אלרגיות (Hogan וחב' ב-Clin Exp Allergy משנת 2008). לכן, המדידה הישירה של דלקת אאוזינופילית נדרשת לאבחון, טיפול, וניטור חולי אסתמה. עם זאת, החלטות בהתנהלות עם המחלה היו באופן מסורתי מבוססות על תסמינים, תפקוד דרכי האוויר, והתגובה לטיפול התרופתי (דו"ח של ה-British Thoracic Society משנת 2011). מדידה עכשווית של דלקת בדרכי האוויר אינה תואמת יפה עם דלקת אאוזינופילית (Crimi וחב' ב-Am J Respir Crit Care Med משנת 1998). לכן, קלינאים לא יכולים תמיד לנבא את האופי והעוצמה של דלקת בדרכי האוויר התחתונות (Parameswaran וחב' ב-Eur Respir J משנת 2000). לדוגמה, אאוזינופיליה מתפתחת שבועות לפני החמרת המחלה (Pizzichini וחב' באותו כתב עת משנת 1999). מבחנים אבחוניים אמורים לשקף בבהירות את הפתו-פיזיולוגיה, אך רבים מהם אינם מתבצעים.
הניטור של דלקת אאוזינופילית כורך ספירה של תאים אאוזינופילים, המספקת רק הבנה מוגבלת של פעילות תאים אלה. הפעילות ההפרשתית של אאוזינופילים שווה לריכוז אאוזינופילים מוכפל בנטייה שלהם להפריש תווכים כגון EDN ו-ECP (Venge ב-Allergy משנת 2004). דרך אחת לפיה אאוזינופילים פועלים כתאים משפיעים, היא על ידי הפרשה של חלבונים גרנולריים, הגורמים נזק לרקמות ולפגיעה בתפקוד, כמו גם להגברת התהליך הדלקתי של דרכי האוויר.
דלקת אאוזינופילית היא מאפיין שכיח בחולי אסתמה רבים, והיא כרוכה עם סיכון מוגבר של מחלה יותר חמורה (De Groot וחב' ב-Eur Respir J משנת 2015), בה ניתן למצוא רמות מוגברות של אאוזינופילים בריאות ובדם. אאוזינופילים משופעלים מפרישים ציטוקינים, תווכי ליפידים, פוליפפטידים כמוטקטיים וחלבונים ציטו-טוקסיים מתוך הגרנולות שלהם, המנטרלות פתוגנים כמו גם מגבירים תגובה מקדמת-דלקת של הלוקים במחלה (Carr וחב' ב-World Allergy Organization J משנת 2016). החלבונים הציטו-טוקסיים כוללים חלבון בסיסי עיקרי, פראוקסידזה אאוזינופילית, חלבון קטיוני אאוזינופילי ונוירוטוקסין שנובע מהאאוזינופילים (eosinophil-derived neurotoxin (להלן EDN). ה-EDN הוא RNAse עם פעילות נרחבת אנטי-נגיפית ואנטי-חיידקית, שעשויה לעודד שפעול של לויקוציטים הקשור בפתו-פיזיולוגיה של אסתמה (Rosenberg ב-Int J Mol Sci משנת 2015, ו-Gleich ו-Adolphson ב-Lung Biol Health Dis משנת 1999). EDN יכול לשמש כסמן שימושי של שפעול תאים על ידי אאוזינופילים, ול-degranulation בחולי אסתמה. מדידה של דה-גרנולציה של חולי אסתמה, עשויה להיות יותר חשובה מבחינה ביולוגית מאשר אאוזינופיליה באסתמה, ולכן המספר של אאוזינופילים אינו המדד החשוב, אלא אם הם משופעלים (Kim וחב' ב-J Asthma משנת 2011).
מספר מחקרים בחנו את התפקיד של EDN והשימוש בו כסמן קליני לאבחון וניטור של אסתמה. רמת EDN בנסיוב נמצאת בתאום עם חומרת המחלה (Lee וחב' ב- Immunol Res Allergy Asthma & משנת 2019), ועם ההיפר-ריאקטיביות של דרכי האוויר (Agache וחב' ב-Allergy משנת 2016). רמות מוגברות של EDN נצפו בחולי אסתמה, עם רמות גבוהות עוד יותר שנמדדו בשעת משברים במחלה בהשוואה לאלה עם אסתמה יציבה (Kim ב-Korean J Ped משנת 2013). יתרה מכך, חשיפה ממושכת לרמות גבוהות של EDN עלולה להיות בעלת השפעות מזיקות עם רקמות סמוכות עם EDN כרוך ב-remodelling של דרכי האוויר, ב-rhinosinusitis אאוזינופילי כרוני, על ידי השרייה של יצירת MMP9 (Tsuda וחב' ב-Int Immunol משנת 2018). עובדה זו מרמזת לכך שחשיפה ממושכת לרמות מוגברות של EDN, עלולה להיות גורם סיכון להתקדמות ההליך הפתולוגי במחלה. מדידת רמות EDN יכולה גם להועיל בניטור ההשפעה התרפויטית והבקרה של המחלה. רמות של EDN נמצאו גם פוחתות לאחר טיפול עם budesonide (Pedersen וחב' ב-Am J Respir Crit Care Med משנת 1996), או עם benralizumab (Pham וחב' ב-Respir Med משנת 2016).
EDN הוא פוטנציאלית סמן אטרקטיבי אנליטי שניתן לכמת אותו באופן אמין, בניגוד לחלבונים אחרים המופרשים מהגרנולות של אאוזינופילים, שהם דביקים אינהרנטית בגלל תכונותיהם הפולי-קטיוניות החזקות (Gleich ו- Adolphson ב-Adv Immunol משנת 1986). המדידה הכמותית של EDN יכולה להתבצע במספר נוזלי גוף כולל נסיוב, פלזמה, שתן, רוק והפרשה ברונכו-אלבאולרית (Cottin וחב' ב-J Allergy Clin Immunol משנת 1998, ו-Panzer וחב' באותו כתב עת משנת 2003). עם זאת, ההתאמה של תוצאות EDN בכל הנוזלים הביולוגיים אינה ברורה. כדי לפרש סמן ביולוגי כלשהו, חשוב קודם כל להבין את הגורמים הקדם-אנליטיים שיכולים להשפיע על היציבות של הסמן הנמדד, וכן את השונות הביולוגית הטבעית שיכולה להתרחש בגין היציבות של EDN בדימות הדם, את הנתונים של EDN, את השפעת עישון ואָטוֹפְּיָה (שהיא הנטייה התורשתית של תגובות אלרגיות במגע עם אלרגנים מסוימים), ואת ההשפעה של השינויים ברמת EDN בשעות היממה (circadian rhythm) ואת רמת EDN המופרשת מתאים שונים.
השוואת הביטוי של EDN בתאים שונים
באאוזינופילים - 2437.1 ± 407.9 ננוגרם/106 תאים; בנויטרופילים - 13.4 ± 2.1 ננוגרם/106 תאים; במונוציטים - 3.8 ± 4.7 ננוגרם/106 תאים; בהפטוציטים - 0.3 ± 0.2 ננוגרם/106 תאים; במקרופאגים אלבאולריים - 8.3. ± 2.3 ננוגרם/106 תאים. כד לבחון הבדלים בהפרשת EDN לאורך שעות היממה, נמדדה רמתם בנסיוב אחת ל-4 שעות לאורך 24 שעות. באלה עם אסתמה קלה עד מתונה רמת אאוזינופילים בדם נהגה על פי circadian rhythm עם רמה מוגברת בשעות הלילה והבוקר המוקדמות.
חלבוני דה-גרנולציה של אאוזינופילים
חלבונים האגורים בגרנולות של אאוזינופילים (EDN, ECP ו-MBP (או major basic protein) כמו גם EPO (או eosinophil peroxidase) הם חלבונים הנכרכים באופן חזק בפתו-פיזיולוגיה של אסתמה (Gleich ו- Adolphson ב-The eosinophil and bronchial asthma משנת 1999). MBP מופיע בליבה של הגרנולה, בעוד ש-ECP,EDN ו-EPO מופיעים במשתית (matrix) של הגרנולה, והם מופרשים באופן כמעט אקסקלוסיבי על ידי אאוזינופילים. לפיכך, כל שינוי ברמות של EDN או ECP בדם, וישקף ישירות שינויים במצב הדלקתי של אאוזינופילים. ככלי ניטור, ECP הניב תוצאות שונות (Kim וחב' ב-Lung משנת 2007, Taniuchi וחב' ב-J Dermatol Sci משנת 2001, Wilson וחב' ב-Thorax משנת 2000, ו-Wojnarowski וחב' ב-Clin Exp Allergy משנת 1999). ל-EDN ש מספר תכונות ביוכימיות, אנטי-נגיפיות ונוירטוקסיות משותפות עם ECP. יחד עם זאת, שלא בדומה ל-ECP, ל-EDN יש נוירוטוקסיות נמוכה אם בכלל, אך ניתן להשיגו מנוזלי גוף בגלל היותו פחות טעון (Gleich ו- Adolphson ב-ADV Immunol משנת 1986). EDN נדבק באופן קל לדופן בארות הפלטה. לעומתו, ECP טעון בחוזקה לפיכך התוצאה של מדידתו עלולה להיות מושפעת מפרק הזמן שחולף ממועד נטילת דגימת הדם, עד למועד בדיקת המדידה שלו. למרות זאת, ECP נותר חלבון דה-גרנולציה שימושי ביותר בשגרה הקלינית (Venge וחב' ב-Clin Exp Allergy משנת 1999). ככלי ניטור, מתקבלות עם EDN תוצאות טובות (Goto וחב' ב-Allergol Int משנת 2007, ו-Koller וחב' ב-Clin Exp Allergy משנת 1999). במחקר של Taniuchi וחב' בו השתתפו מטופלים עם atopic dermatitis. רמות EDN בנסיוב באלה עם תסמינים קלים, מתונים וקשים, הן גבוהות משמעותית בהשוואה לאלה בקבוצת הביקורת.
EDN ואסתמה בילדים - הקשר עם חומרת המחלה
סך כמות האאוזינופילים ורמות ECP הוצעו כסמנים לפעילות המחלה. יחד עם זאת, השימושיות של EDN כסמן באסתמה של הילדות, לא נחקרה דיה. מטרת המחקר דלהלן היא להשוות את ספירת אאוזינופילים ורמת ECP בנסיוב עם חומרת תסמיני אסתמה בילדים צעירים. לצורך המחקר, גויסו 43 ילדים חולי אסתמה בגיל הממוצע של 2.9 שנים (טווח גילים של 1.4 עד 5.0 שנים), ונערכה בהם הערכה של הפאזות היציבות והחריפות של המחלה (Cuhadar וחב' ב-OA Biotechnol משנת 2013). כקבוצת ביקורת שימשו 19 ילדים בריאים בגיל תואם. רמות ECP ו-EDN כמו גם ספירת אאוזינופילים נמדדו בפאזות היציבות של המחלה ובעת פאזות חריפות, וכן בילדים בקבוצת הביקורת. רק רמות EDN נמצאו שונות בין שתי הפאזות האמורות (p<0.0001), וכן בין הפאזה היציבה לבין קבוצת הביקורת p<0.0001). הילדים החולים חולקו ל-3 קבוצות בהתאם לחומרת המחלה, ורק רמת EDN בנסיוב נמצאה שונה בין שלושת הקבוצות (קל כנגד מתון p<0.01)), מתון כנגד חריף (p<0.0001), וקל כנגד חריף (p<0.0001). רמות EDN בנסיוב הראו את המתאם הגדול ביותר עם מדד חומרת התסמינים (Rs=0.850, p<0.0001) בשלב הפאזה החריפה בהשוואה לרמות ECP ומספר האאוזינופילים.
מטופלים עם אסתמה מאובחנת על ידי רופא מטופלים בדרך כלל על ידי אגוניסט β2 adrenergic קצר-טווח או על ידי שאיפת מינון נמוך של קורטיקוסטרואיד (פחות מ-250 מיקרוגרם fluticason) או על ידי פורמולה אקויוולנטית של אבקה יבשה של תכשיר להקלת התקפים, או על ידי שאיפת יומית עם אבקת קורטיקזון במינון נמוך של 100-250 מיקרוגרם בשילוב עם אגוניסט ארוך-טווח β2 adrenergic עם או בלי theophylline או על ידי מונטֶלוּקאסט (Montelukast) שהיא תרופה נגד אסתמה כרונית ואלרגיה עונתית מסוג leukotriene receptor antagonist, אשר נמנית עם קבוצת תרופות מניעתיות, לא-סטרואידליות ואנטי-דלקתיות. מונטלוקאסט פועלת כאנטגוניסט באמצעות מניעת שחרור קולטני לאוקטוריאנים D4 ציסטנילים שמכווצים וחוסמים את הסימפונות בריאה (תעלות הברונכיטיס). קולטנים אלו מהווים תווכים פוטנטיים של הדלקת האסתמטית, אשר פעולתם אינה נחסמת על ידי סטרואידים. עקב חסימת שחרור הקולטנים נמנע הלחץ בדרכי הנשימה, ועימו הדלקת על סימניה. מאחר שמדובר בתרופת מנע, היא אינה אפקטיבית בעת התקף אסתמטי, ועל-כן אינה מחליפה תרופות כגון ונטולין.
שורקנות בתר-ברונכיליטית מהווה קודמן להתפתחות אסתמה (מחקר ELBIS)
רוב הילדים מתאוששים מברונכיוליטיס חריפה, אך חלקם מפתחים שורקנות נשנית. בברונכיוליטיס הנגרמת מנגיף סינסיטיאלי (RSV) יש ראיות לשפעול אאוזינופילים, אשר במהלכו יש הפרשה של חלבונים גרנולריים (ECP ו-EDN, לויקוטריאנים וציטוקינים. המטרה הראשונית של בחינת ההתערבות המוקדמת עם אנטגוניסט של הקולטן ללויקוטריאנים (LTRA) לטיפול בברוניוליטיס על ידי RSV בעיר סיאול (מחקר ELBIS), הייתה לבחון את השפעת montelucast שהוא LTRA על הדה-גרנולציה של אאוזינופילים, בשורקנות בתר-ברונכיוליטית, ואילו המטרה השנייה היא להחליט האם טיפול עם montelucast יפחית את הישנות שורקנות זו. הילדים שנכללו במחקר זה היו בגילים שבין 6 ו-24 חודשים, אשר אושפזו מאז האפיזודה הראשונה של ברונכיוליטיס, שבאה לביטוי בשורקנות נגיפית חריפה. כל משתתף בניסוי טופל על ידי גרגירי monelucast במשך 3 חודשים כנגד מטופלי פלצבו. ממצאי הניסוי הראו רמות מוגברות בנסיוב של EDN בקרב הילדים עם ברונכיוליטיס לעומת הילדים מטופלי פלצבו. בתום תקופת 3 החודשים, 71 ילדים חולים היו בעלי רמות מוגברות משמעותית של EDN (0.0001 <P) בעוד שמטופלי פלצבו הראו רמה נמוכה משמעותית של EDN בהשוואה לרמתם בבסיס הניסוי (0.01). השפעת הטיפול עם montelucast נותרה בעינה 12 חודשים לאחר תחילתו, (Cottin וחב' ב-J Allergy Clin Immunol משנת 1998). ההדבקה הנגיפית עשויה הייתה להשרות הפרשה של גריינים של אאוזינופילים כגון eotaxin מתאי האפיתל של דרכי האוויר מה שגרם להגברת ההפרשה של EDN (Panzer וחב' באותו כתב עת משנת 2003). ממצאים אלה מצביעים על כך שרמות EDN הם סמן שימושי לבחון ולניטור של שורקנות בתר-נגיפית. יתרה מכך, רמות מוגברות של EDN בתום 3 חודשי הטיפול עשויות להיות סמן ביולוגי מנבא להופעה נשנית של שורקנות. זאת ועוד, eotazin ברוק, נמצא תואם משמעותית עם רמת EDN, ECP ומספר האאוזינופילים ברוק. עם זאת, רמת IL-5 ברוק נמצאה במתאם רק עם EDN אך לא עם רמות ECP או מספר האאוזינופילים (Kwon וחב' ב-World Allergy Organization J משנת 2020).
תיאור שיטת המדידה בדגימות נסיוב
טווח רמות EDN הנורמלי בנסיוב, נקבע על ידי נטילת דגימות דם מ-120 מתנדבים בריאים. לקביעת רמת EDN במעשנים וסובלים מאָטוֹפְּיָה, גויסו אנשים נוספים משני המגדרים בגיל שבין 18-75 שנה, משתתפים בריאים ללא היסטוריה של תסמונת היפר-אאוזינופילית, גרנולומטוזיס אאוזינופילי עם פוליאנג'יטיס (להלן PGA) שהיא דלקת הפוגעת בכלי דם שונים בגוף, בהם האף ומערותיו, הריאות והכליות. המחלה מאופיינת בהימצאות נוגדנים עצמיים כנגד החלבון פרוטאינאז-3, ו-eosinophilic esophagitis/gastritis. אנשים המקבלים פומית קורטיקוסטרואידים, או טיפולים אנטי-אאוזינופיליים במהלך 1-6 החודשים האחרונים לא נכללו במחקר. בקטגוריה של לא-מעשנים נכללו אלה עם היסטוריה של פחות משנת חפיסה אחת, ואילו המעשנים הם אלה עם היסטוריה של יותר מ-10 שנות חפיסה. משתתפים אטופיים היו אלה עם תוצאה חיובית בבדיקת נעיצה בעור, תגובה אריתמית בקוטר של יותר מ-3 מ"מ לאלרגן שכיח אחד מתוך שלושה אלרגנים (עשב, קַרְדִּית או אֲקָרִית האבק הביתי, או שיער חתולים). להכנת נסיוב לבדיקה דם ורידי נלקח לתוך vacutainer והורשה להיקרש בטמפרטורת החדר למשך 30-60 דקות. לאחר סרכוז של הדם הקרוש ב-1,500g למשך 10 דקות ב-4° הנסיוב הופרד מהתאים והוכנס להקפאה ב--20°C או ב--80°C.
היציבות של EDN
דגימות של מתנדבים בריאים נבדקו מדי יום ליציבותם בטווח הקצר וכן לאח הקפאה והפשרה, וכן נבחנו אחת ל-3 חודשים ליציבותם בטווח הארוך. לטווח הקצר בקירור של 4 מעלות ביום 7, תוצאת הבדיקה הייתה נמוכה ב-5.5% בהשוואה לרמת EDN ביום 1. לבדיקת היציבות לאחר הקפאה של מינוס 20 לאחר 12 חודש נמצא ש-רמת EDN הייתה נמוכה ב-7.6%, לעומת רמתו ביום 1. לבחינת רמתו של EDN שהוקפא במינוס 80 מעלות לאחר 12 חודש נמצאה ירידה של 4.9% לעומת רמתו ביום 1. לבחינת השפעת הקפאות במינוס 20 מעלות ו-3 הפשרות נמצאה ירידה של 3.3% ברמת EDN בהשוואה לרמתו ביום 1. לבחינת השפעת הקפאות במינוס 80 מעלות ו-3 הפשרות נמצאה ירידה של 4.7% ברמת EDN בהשוואה לרמתו ביום 1.
Immunoassay של EDN:
EDN EDN בדם מלא או בנסיוב נמדד בין השאר על ידי ערכת EDN מסחרית של ELISA כגון זו המשווקת על ידי ALPCO, US . פלטת המיקרוטיטר מצופה עם נוגדן חד-שבטי כנגד EDN, נשטפת 5 פעמים עם 250 מיקרוליטר של בופר שטיפה. לאחר השטיפה האחרונה, יש להרחיק את שרידי בופר השטיפה על ידי הפיכת הפלטה והספגתה על נייר סופג. סטנדרטים של כיול עוברים רה-קונסטיטוציה ב-500 מיקרוליטר של מים מזוקקים פעמיים. מאה מיקרוליטר של הסטנדרטים של הכיול בריכוז של 0.25-16.0 ננוגרם/מ"ל' והביקורות (C1 0.55 ננוגרם'מ"ל, ו-C2 2.63 ננוגרם/מ"ל), והדגימות מהולות פי-20 בבופר הבדיקה מאפשרים טווח מדידה אנליטית עליונה של 320 ננוגרם/מ"ל. אלה הוספו לבארות בפלטת המיקרוטיטר. הפלטה כוסתה והודגרה למשך שעה בטמפרטורת החדר על מטלטל פלטות. לאחר מכן נשטפו הבארות עם בופר שטיפה ולאחר הרחקת הבופר, הוספו לכל באר 100 מיקרוליטר של תמיסת אנטי-EDN פוליקלונלית ממקור ארנבת אליה קשור האנזים פראוקסידאזה לשעה נוספת של הדגרה. לאחר מכן הוסף לבארות 100 מיקרוליטר של תמיסת מצעtetramethylbenzidine) ) והפלטה הודגרה למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. לאחר הדגרה זו הוספה לכל באר תמיסת "עצירה" חומצית, והצבע שהתקבל נמדד על קורא פלטות SpectraMax באורך גל של 450 ננומטר כנגד 620 ננומטר כ- .referenceריכוז EDN של הדגימות חושב לאחר אינטרפולציה של עקומת הסטנדרט תוך שימוש ב-Softmax Pro GxP v5.0 software.