כניסה 
עקבו אחרינו בפייסבוק חלבון קושר רטינול - Retinol binding protein
| מדריך בדיקות מעבדה | |
| חלבון קושר רטינול | |
|---|---|
| Retinol binding protein | |
| שמות אחרים | RBP, RBP4 |
| מעבדה | כימיה בדם ובשתן |
| תחום | הערכת פרוטאינוריה במצבים של פגיעות כליתיות, וכן כמדד מדויק להערכת סטאטוס של רטינול. |
 | |
| טווח ערכים תקין | בדם-(בערכי מיליגרם לד"ל): בגיל 1-10 שנים-2.2-4.5, בגיל 10 שנים ומעלה, בגברים 3.4-7.7, בנשים 2.2-6.0.
בשתן-פחות מ-140 מיקרוגרם ל-24 שעות. מעל גיל 50 שנה ערכים של RBP בשתן-פחות מ-163 מיקרוגרם ל-24 שעות, או פחות מ-172 מיקרוגרם/גר' קראטינין לפני 50 שנה ומעלה, או פחות מ-130 מיקרוגרם/גר' קראטינין לפני 50 שנה ומטה. |
| יוצר הערך | פרופ' בן-עמי סלע |
מטרת הבדיקה
קביעת רמת RBP בדם טובה להערכת סטאטוס רטינול בנסיוב. קביעת רמת RBP בשתן יכולה לשמש להערכת נזק או פגיעה בתפקוד טובולארי.
בסיס פיזיולוגי
חלבון הקושר ויטמין A בפלזמה, ידוע כ-retinol-binding protein (להלן RBP) שייך למשפחת ה-lipocalins, ומקודד על ידי הגן RBP4 הממוקם באתר 10q23.24. זהו גליקופרוטאין מונומרי המכיל 182 חומצות אמינו עם משקל מולקולארי של 20,960 דלטון, השייך למשפחת ה-α1 של גלובולינים בפלזמה, ומעביר רטינול שהוא הנגזר אלכוהולי של ויטמין A, מהכבד אל הרקמות ההיקפיות (Sopranno וחב' משנת 1994). ל-RBP ברקמות יש משקל מולקולארי של 14 אלף דלטון. RBP קושר מולקולת רטינול בסטויכומטריה של 1:1, שנועדה לא רק לאפשר העברת ויטמין מסיס-שומן בפלזמה אלא גם להגן עליו מפני חמצון. RBP נמצא בדרך כלל כשהוא קשור לחלבון prealbumin (או transthyretin שהוא חלבון טטרמרי עם משקל מולקולארי של 55 אלף דלטון) גם כן ביחס של 1:1, וקומפלקס משולש זה אינו עובר דרך הכליות, מה שמונע איבוד ויטמין A בשתן.
הקומפלקס RBP-transthyretin מייצב את קישור רטינול (כאשר לקומפלקס משולש זה משקל מולקולארי של 80-90 אלף דלטון), וכך מתאפשר הטרנספורט של הוויטמין לתאי רשתית העין, העור, הגונאדות, הריאות, בלוטות הרוק ותאי רקמות אחרות. הקישור לקולטנים שעל פני התאים ספציפי לרטינול. ברשתית העין פגם בקולטנים לרטינול ול-RBP עלול להתבטא ב-retinitis pigmentosa.
RBP הוא החלבון הנשא היחיד של רטינול בפלזמה, ובדרך כלל במצב נורמאלי 75% מ-RBP רווי עם רטינול. תקופת מחצית החיים של הקומפלקס BP-transthyretin בדם היא 12 שעות, ואילו תקופת מחצית החיים של RBP חופשי היא של 3.5 שעות.
רטינול וחומצה רטינואית הם בעלי תפקידים חיוניים במודולציה של ביטוי גנים וההתפתחות של העובר. חסר באחת משתי צורות אלה עלולה להביא למות העובר, או לפגמים מולדים. גם בשלבים העובריים, תפקידו של RBP חיוני להשלמת הריון תקין. אכן, ניתן לזהות נוכחות של RBP בתוך הרחם, וברקמות העובריות.
משמעות מדידת RBP בנסיוב
כיוון שהיחס בין החלבון RBP לרטינול הנקשר אליו הוא 1:1 מדידת ריכוז RBP בנסיוב משקפת את ריכוז רטינול בנסיוב ועשויה לשמש כמדד תחליפי להערכת הסטאטוס של ויטמין A. הערכת RBP קלה יותר מזו של מדידה ישירה של רמת רטינול בנסיוב: ראשית, RBP הוא חלבון שניתן לגלותו בפשטות יחסית ב-immunoassay בעזרת נוגדן ספציפי. שיטה זו קלה וזולה יותר לביצוע מאשר מדידת ישירה של מולקולת רטינול בשיטת HPLC. שנית, ההתנהלות עם הנסיוב פשוטה יותר, כיוון ש-RBP יציב יותר מאשר רטינול בהקשר של רגישות רטינול לאור ולטמפרטורה; שלישית, אנליזה של RBP דורשת כמות קטנה מאוד של נסיוב, לא יותר מ-10-20 מיקרוליטר, שניתן אפילו להשיגה ממספר טיפות דם הנובעות מדקירת אצבע, בה בשעה שהכמות הנדרשת לאנליזה של רטינול בשיטת HPLC דורשת לפחות 100 מיקרוליטר נסיוב, המחייבת נטילת דם מהווריד.
אך למרות היחס התיאורטי של 1:1 בין רטינול ו-RBP, אין הסכמה גורפת לגבי ערכי cut-off עבור RBP שעשויים לשמש בהערכת חסר רטינול., שהרי לא כל מולקולות RBP בנסיוב אמנם נמצאות בכל רגע נתון קשורות ל-apo-RBP ליצירת holo-RBP, כאשר אחוז המולקולות של apo-RBP תלוי בריכוזי retinol. המבדקים בשיטת immunoassay אינם יכולים להבדיל בין holo-RBP לבין apo-RBP. זאת ועוד, הקישור של רטינול ל-RBP, מושפע על ידי מספר גורמים כגון נוכחות של תגובת פאזה-חריפה (acute phase response) ועוצמתה (אם כי Gamble וחב' במאמרם משנת 2001 ב-Am J Clin Nutr לא מצאו ראיות להשפעת תגובת פאזה-חריפה על יחס הקישור בין רטינול ו-RBP), תזונה לקויה של חלבונים, מחלת כבד, כשל כליות כרוני, ומצבי עקה שונים.
מחקר של Baeten וחב' משנת 2004 ב-Am J Clin Nutr בחן את יעילות של מדידת RBP כמדד-עזר להערכת רטינול בהקשר של הדבקה עם HIV, תזונה לקויה של חלבונים, או מצב תגובת פאזה-חריפה. במחקר זה נכללו 599 נשים קנייתיות, ונמצא במדגם זה מתאם Spearman טוב בין רמותRBP ואלו של רטינול (r=0.88). במדגם זה RBP ניבא רמה גבולית של רטינול בנסיות (פחות מ-1.05 מיקרומול' לליטר) עם רגישות של 93% וספציפיות של 75%, וכן ניבא רמות חסר של רטינול (פחות מ-0.70 מיקרומול' לליטר) עם רגישות של 91% וספציפיות של 94%.
רמות גבוהות דומות של רגישות וספציפיות נמצאו בתת קבוצות של הנשים הנבדקות המודבקות ב-HIV, וכן באלו מתוכן עם תזונת חלבונים לקויה או עם תגובת פאזה חריפה. שני התרחישים האחרונים נמצאו שכיחים באוכלוסיית נשים זו, בעיקר באלו מתוכן המודבקות עם HIV, והם היו כרוכים עם רמות נמוכות יותר של RBP, המשקפות רמה נמוכה יותר של רטינול בנסיוב.
ערכי cut-off של RBP בנסיוב והיחס בינם לבין ריכוזי רטינול נמוכים
קיימת אי-הסכמה לגבי ערכי cut-off של RBP שעשויים לתת הערכה הולמת של סטאטוס חסר של רטינול, בערכי ויטמין שמתחת 0.7 מיקרומול' לליטר. Gibson הציע ב-1990 בסקירתו Principles of Nutritional Assessment, ערך של 1.14 מיקרומול' לליטר (או 24 מיליגרם לד"ל) כ-cut-off, ואילו Bakerman הציע בשנת 1984 ערך cut-off לגבי RBP של 0.7 מיקרומול' לליטר (או 15 מיליגרם לד"ל), כאשר הוא מתבסס על רוויון של 100% של RBP עם רטינול.
מספר חוקרים הציעו ערכי cut-off עבור ערכי RBP בנסיוב, שישקפו ערכי רטינול נמוכים מ-0.70 מיקרומול' לליטר. על פי Samba וחב' במאמרם ב-J Trop Pediatr משנת 2002, הוצעו ערכי cut-off של 14.5 מיליגרם לד"ל לילדים בגיל 3-6 שנים, ואילו de Pee וחב' המליצו על ערך cut-off של 27 מיליגרם לד"ל לגבי נשים מניקות במאמרם משנת 1997 ב-Am J Clin Nutr.
כאמור, דרגת הרוויון של RBP עם רטינול, מושפעת מאד מריכוזו של האחרון, בייחוד בערכי חסר של הוויטמין. אכן, Gamble וחב' במאמרם שהוזכר, מצאו בילדים באיי מרשל שדרגת הרוויון הזו הייתה של 79% בילדים עם ערכי רטינול נמוכים שמתחת ל-0.35 מיקרומול' לליטר, ולעומת זאת דרגת הרוויון הייתה 96% בילדים עם ערכי רטינול הגבוהים מ-0.70 מיקרומול' לליטר.
השפעת מצבים פתולוגיים על רמת RBP בנסיוב
ירידה ברמת RBP תופיע בתרחיש כמו פרוטאינוריה, במחלה הפאטו-צלולארית (במקביל לחסר ב-transthyretin), ב-hyperparahtyroidism, בלייפת כיסתית (cystic fibrosis), במחלת kwashiorkor, ובמצבים של חסר באבץ. עליה ברמת RBP בנסיוב ניתן למצוא במחלת כליה כרונית (עם רמה נורמאלית של transthyretin). עליה ברמת RBP בשתן אופיינית למחלה טובולארית של הכליות.
החלבון RBP4 תואר לאחרונה על ידי Yang וחב' ב-Nature משנת 2005 כ-adipokine התורם לעמידות לאינסולין במודל AG4KO בעכברים, בהם הושרתה סוכרת type 2 והם סובלים מהשמנת-יתר. Herman ו-Kahn תארו בשנת 2006 ב-J Clin Invest ש-RBP4 מופרש על ידי אדיפוציטים ויכול לאותת לתאים אחרים, כאשר מתרחשת ירידה בריכוז גלוקוזה בפלזמה.
מעבר RBP לשתן
מקטע קטן של RBP (פחות מ-10%) שאינו קשור ל-transthyretin עובר בחופשיות דרך הממברנות של פקעיות הכליה, ונספג מחדש על ידי תאי אבוביות הכליה הקריבניות (proximal), שם הוא עובר תהליכים קטבוליים. כתוצאה מהספיגה מחדש הנמרצת, בתנאים נורמאליים מעט מאוד מחלבון RBP המסונן מופיע בסופו של תהליך בשתן. לכן, הגברה של הפרשת RBP בשתן, מעידה על נזק לאבובית הקריבנית, ופגיעה בתפקודה של אבובית זו. מדידת רמת RBP בשתן, היא לכן בדיקת עזר בניטור ואבחון מחלת כליות.
רמות מוגברות של RBP המופרשות בשתן, יכולות להצביע כאמור על נזק טובולארי הקשור לנפריטיס טובולו-אינטרסטיציאלית, או לנזק טוקסי לאבוביות שנגרם על ידי מתכות כבדות, או חשיפה לתרופות נפרו-טוקסיות (על פי Norden וחב' ב-Kidney Int משנת 2000). גם נזקים גלומרולאריים עלולים להתבטא בהפרשה מוגברת של RBP כפי שסיכמו Kirsztajn וחב' ב-Nephron משנת 2002. מדידת הפרשה בשתן של alpha-1-microglobulin, אף הוא חלבון קטן-מולקולארי, היא חלופה למדידת RBP. עדיין אין מחקרים משכנעים להעדיף מדידה של אחד מ-2 חלבונים אלה, על זו של האחר.
משפחת החלבונים קושרי רטינול
מוכרים מספר חלבונים קושרי רטינואידים שהם שלוש הצורות של ויטמין A (רטינול או נגזרת ההידרוקסיל, רטינל שהיא צורת האלדהיד וחומצה רטינואית שהיא הנגזרת הקרבוקסילית של ויטמין A). מולקולת האם של הוויטמין-retinol, נעה בדם קשורה ל-RBP הידוע גם כ-RBP4. בתוך התאים, רטינול וצורתו המחומצנת-retinal, נכרכים עם אחד מתוך שני האיזופורמים של חלבונים קשורי רטינול בתאים, הידועים כ-cellular retinol binding proteins או CRBP-1 ו-CRBP-2, אך גם עם 2 חלבונים נוספים, CRBP5 ו-CRBP7. החלבון התוך-תאי CRBP-1 קושר רטינול ורטינל, ואילו CRBP-2 קושר חומצה רטינואית. שני החלבונים התאיים האחרונים שייכים למשפחת iLBPs. החלבונים התאיים קושרי הרטינואידים הם בעלי משקל מולקולארי של 14-15 אלף דלטון.
בנוסף ל-RBP בפלזמה ובתוך התאים, מוכר גם RBP-3 הידוע גם כ-IRBP או interstitial RBP3 או גם interphotoreceptor RBP, שהוא גליקופרוטאין גדול בעל משקל מולקולארי של 136,000 דלטון, והוא מצוי בעיקר ב-interphotoreceptor matrix של רשתית העין, בין שכבת האפיתל הפיגמנטרי של הרשתית לבין התאים הפוטו-רצפטורים שלה. סבורים שתפקיד חלבון זה הוא לבצע טרנספורט של רטינואידים בין 2 שכבות אלה, מה שמקנה לו חשיבות רבה בתהליך הראייה. בתהליך זה, הפיגמנט הויזואלי 11cis-retinal והקודמן שלו 11cis-retinol נקשרים בעין ל-CRALBP או cellular retinal-binding protein שמשקלו המולקולארי 36,000 דלטון.
החלבון IRBP יוצא דופן בין שאר החלבונים קושרי-הרטינואידים, בכך שהוא מכיל 3 אתרי קישור לרטינואידים במקום אתר בודד. החלבון IRBP מכיל 4רצפים הומולוגיים חוזרים, שכל אחד מהם מורכב מ-300 חומצות אמינו.
תפקודו של RBP
RBP מסונתז בעיקר בכבד, אם כי גם ברקמות אחרות דוגמת רקמת השומן, הכליות, הריאות, הלב, שריר השלד, הטחול, העיניים והאשכים. מידת הסינתזה של RBP בכבד מושפעת על ידי משוב מדרגת הזמינות של רטינול. כאשר יש חסר של ויטמין A, נחסמת הפרשת RBP לדם, והחלבון מצטבר ברטיקולום האנדופלזמי של תאי הכבד. כאשר יש נוכחות עודפת של רטינול, RBP נקשר אליו, עובר ל-Golgi של תאי הכבד ומופרש איתו לדם כ-holoprotein, המובל אל רקמות ותאי המטרה. ה-retinol חודר לרוב התאים האלה כרטינול חופשי ללא החלבון הנשא. יחד עם זאת, יש מקרים בהם חודר לתאים הקומפלקס רטינול-RBP, כמו שהדגימו Vieira ו-Schneider ב-Biochim Biophys Acta משנת 1993, וכן Malaba וחב' באותה שנה ב-Biochem J.
לגבי המנגנון המדויק שבו מוחדר רטינול לתאים, קיימות שתי גישות: על פי גישה אחת, קולטן הטבוע בממברנת התא מתווך בטרנספר של רטינול מ-RBPדרך הממברנה אל תוך הציטוזול, או אולי אף ישירות לחלבון הקושר רטינול בתוך התא, CRBP (על פי Bavik וחב' ב-Exp Cel Res משנת 1995, וכן על פי Sivaprasadarao וחב' ב-Biochem J משנת 1994 ו-Sundaram וחב' ב- Biol Chem משנת 1998). הקולטן הממברנאלי של holo-RBP הוא חלבון בעל משקל מולקולארי של 65 אלף דלטון, שזוהה לראשונה בתאי פיגמנט אפיתליאליים של הרשתית (וכונה Rpe65).
יחד עם זאת, הועלו ספקות באשר ליכולתו של RPE65 לשמש קולטן ל-RBP, כיוון שבדיקת הרכב חומצות האמינו של Rpe65 אינה מגלה רצף הידרופובי שיאפשר לו את החדרת רטינול לתוך התא. בנוסף, מחקר של Redmond וחב' שהופיע ב-1998 ב-Nature Genet, הראה שבעכברים החסרים את Rpe65, האפיתל הפיגמנטרי של הרשתית צובר ביתר את ה-all-trans-retinyl-esters, אך חסר לחלוטין את ה- 11cys-retinyl-esters. ממצאים אלה מצביעים על אפשרות ש-Rep65 אינו חיוני לקליטה של רטינול על האפיתל הפיגמנטרי, אלא חיוני להסבה של all-trans-retinoids לאיזומרים 11cys בתאים אלה.
גישה חלופית באשר למנגנון בו ניתק רטינול מ-RBP בפלזמה וחודר לתאי היעד, נובעת מהשיקול לפיו כיוון שמולקולת רטינול הידרופובית באופייה, ממברנות תאים אינן משמשות מחסום למעבר מולקולה זו. אכן, הודגם שמולקולת רטינול יכולה לחצות את הממברנה תוך פרק זמן בסדר גודל של אלפיות שנייה (mSec), והדיסוסיאציה של רטינול מה-lipid bilayer היא בעלת t1/2 של בערך 1 שנייה (על פי Noy ו-Xu ב-Biochemistry משנת 1990).
כמו כן הודגם שקישור ל-RBP אינו נדרש לתנועה של רטינול לתוך התאים, והחוצה מהם. נתון זה נובע ממחקרם של Hodam וחב' משנת 1998 ב-Exp Cell Res עם קרטינוציטים של אדם בתרבית רקמה, וכן ממחקרם של van Bennekum וחב' עם תאי פרנכימה של כבד in vitro משנת 1993 ב-Biochemistry. משתמע אם כן שהקליטה של רטינול מ-RBP בדם, מתרחשת באופן ספונטני על ידי גרדיאנט הריכוזים של רטינול חופשי בתוך תאים ומחוצה להם ( על פי Fex ו-Johannesson ב-Methods Enzymol משנת 1990, ו-Noy ו-Xu ב-Biochemistry באותה שנה).
נתונים חשובים על תפקידו הביולוגי של RBP התקבלו ממחקרים בעכברים ובאדם, בהם הגן המקודד לחלבון זה פגום. בעכברים טרנסגניים עם חסר של RBP, נמצא כצפוי ערכי רטינול נמוכים בדם שבאו לביטוי בתפקוד ראייתי לקוי בחודשי חיים הראשונים. למרות זאת, עכברים אלה הם בעלי רמת חיות ופוריות תקינות כאשר הם הוזנו בדיאטה המכילה ויטמין A, וראייתם משתפרת בהגיעם לגיל של 5 חודשים, למרות שרמות רטינול בדמם נותרות נמוכות (על פי Quadro וחב' ב-EMBO J משנת 1999).
בשנת 1999 התפרסמו ב-Am J Clin Nutr וב-Ophthalmol Vis Sci מחקריהם של Seeliger ו-Biesalski וחב', על 2 אחיות שהיו בטיפולם, ואשר בשתיהן התגלתה מוטציה נקודתית בגן RBP4. שתי ילדות אלה שבדמן רמת רטינול הייתה מתחת לסף הגילוי, סבלו מעיוורון לילה ומאטרופיה קלה של הרשתית, אך לא נמצאו בהן תסמינים קליניים אחרים שנובעים מחסר ויטמין זה. נתונים אלה מצביעים על כך ש-RBP קריטי אמנם להעברת רטינול ממאגריו בכבד במצבים של חסר וטימין A במזון, אך גם על העובדה שחלבון אינו קריטי להעברה של רטינול לרוב רקמות היעד שלו. ייתכן שאספקת ויטמין A בחסר של RBP, מושגת דרך ספיגה של retinyl esters במנגנון נוסף, או אולי בסיוע של בתא-קרוטן הנכלל בכילומיקרונים בצירקולציה.
דעיכה בביטוי RBP5 כרוכה באגרסיביות של קרצינומה של הכבד
רטינואידים הוזכרו בעבר כבעלי פוטנציאל לשמש כתכשירים מונעי-סרטן בתרחיש של קרצינומה של הכבד בעיקר לאחר ניתוחים להרחקת נגע סרטני קיים. הוצע שהשפעה חיובית זו מסתייעת על ידי RBPs במנגנון של בקרה על שגשוג תאים והתמיינותם.
בשנת 2007 דווחו Ho וחב' ב-J Cancer Res Clin Oncol על מחקר בו נבחנה המשמעות הקלינית של RBP5 בקרצינומה של הכבד. במחקר זה נמדדו רמות mRNA של RBP5 בשיטת PCR, ברקמה סרטנית בכבד כו גם ברקמות כבד נורמליות. במקביל נמדד גם הביטוי של החלבון RBP5 ברקמה סרטנית ובריאה בכבד בשיטות Western blot ואימונו-היסטוכימיה.
מחקרם של HO וחב' מצא אמנם down-regulation של RBP5 ברקמה הסרטנית בכבד הן ברמת RNA כמו גן ברמת החלבון עצמו, כאשר הפחתה זו בביטוי RBP5הייתה כרוכה בדרגת התמיינות דלה יותר ובנגע סרטני גדול יותר. בנבדקים עם דעיכה זו ברמת RBP5, נמצא מתאם טוב עם הישרדות נמוכה יותר (p=0.02).
הוראות לביצוע הבדיקה
בדיקת RBP בשתן: מומלץ לעשות איסוף של 24 שעות. יש להחמיץ את השתן בחומצה בורית, ולהשתמש בחומרים משמרים (preservatives) דוגמת toluene, או thymol. לפי גרסה אחרת יש דווקא להתאים את השתן המעט חומצי ל-pH 7.0. יש לאחסן את השתן אם הבדיקה לא מתבצעת בזמן אמת בקרור (מועדף), לפרק זמן שלא יעלה על 7 ימים, או בהקפאה בה הדגימה יציבה עד חודש. כיוון שהבדיקה בשתן בדרך כלל נפלומטרית, עכירות של השתן וחלקיקים כגון תאים וגבישים עלולים להפריע לבדיקה, ולכן מומלץ לסרכז את דגימת השתן בטמפרטורת החדר לפני ביצוע הבדיקה.
בדיקת RBP בדם: הבדיקה יכולה להתבצע או בשיטה נפלומטרית, או בשיטת radial immunodiffusion באגר. לפני נטילת הדם יש להיות בצום של 10-12 שעות. בשיטת RID ניתן לקחת את הדם במבחנה כימית (פקק אדום). יש לבצע את הבדיקה לאחר הסרכוז מייד, או לאחסן את הדגימה בקרור עד 72 שעות. הדגימה יציבה בהקפאה במינוס 20 מעלות עד 6 חודשים, או במינוס 70 מעלות לזמן בלתי מוגבל. יש להימנע מדגימות המוליטיות או ליפמיות במיוחד (שכן עכירות יכולה לפגוע בבדיקה הנפלומטרית). לביצוע הבדיקה בשיטה הנפלומטרית יש ליטול דם במבחנה כימית.
תרופות שיכולות להביא לתוצאות מוגברות כזובות של RBP הם אסטרוגנים, גלולות למניעת הריון, פנוברביטאל ו-phenytoin.
מדידת RBP יכולה להתבצע על דגימת שתן נקודתית או על איסוף של 24 שעות, אם כי האפשרות השנייה נחשבת בדרך כלל ל"מדד הזהב". אם מדידת RBP מתבצעת בשתן נקודתי, התוצאה תבוטא ברמת RBP ביחס לריכוז קראטינין.