בדיקת דם ל-Circulating tumor DNA

הדפס

מדריך בדיקות מעבדה
בדיקת דם ל-ctDNA
circulating tumor DNA
שמות אחרים	ctDNA
מעבדה	ביולוגיה מולקולארית בדם
תחום	סיוע בזיהוי ממאירות בשלביה המוקדמים
יוצר הערך	פרופ' בן-עמי סלע

Circulating tumor DNA (להלן ctDNA) הוא DNA מקוטע ממקור גידול שמופיע בדם ואינו כרוך בתאים. אין לטעות בין ctDNA לבין cfDNA או cell-free DNA, שהוא מושג רחב יותר המתאר DNA הנע בחופשיות בצירקולציה, אך אינו בהכרח ממקור של גידול. כיון ש-ctDNA יכול לשקף את הגנום השלם של הגידול הסרטני, הוא זוכה להתעניינות בשל השימושיות הפוטנציאלית שלו, באופן שדגימות דם הנלקחות בנקודות זמן שונות יכולות לשמש לניטור ההתפתחות או הנסיגה של התהליך הסרטני לאורך הטיפול האנטי-סרטני. יש המכנים דגימות דם אלו כ-"liquid biopsies".

מקורו הישיר של ctDNA הוא מהגידול עצמו או מתאי הגידול הנושרים לצירקולציה, שהם בדרך כלל תאים סרטניים חיים שנפלטו/נשרו מהגידול הראשוני ומוצאים דרכם לזרם הדם או למערכת הלימפטית (Akca וחב' ב-Cancer Genet משנת 2013). המנגנון המדויק על פיו ctDNA משתחרר אינו ברור, אך נראה שהתהליך הביולוגי הרלוונטי לשחרור ctDNA כולל apoptosis ונמק של תאי סרטן מתים, או שהוא נובע מהפרשה אקטיבית מתאי גידול חיים (schwarzenbach וחב' ב- Nature Rev Cancer משנת 2011, Stroun ו-Anker ב-Biochem J משנת 1972, Stroun וחב' ב-Clin Chim Acta משנת 2001, Anker וחב' ב-Cancer Res משנת 1975 ו-Rogers וחב' ב-Proc Natl Acad Sci USA משנת 1972).

מחקרים באנשים חולי סרטן ואנשים בריאים וכן בעכברים מושתלי xenograft (Heitzer וחב' ב-Int J Cancer משנת 2013) הראו שגודל ה-ctDNA המקוטע הוא בעיקרו באורך של 166bp, המתאים לגודל של DNA המקיף nucleosome. הפרגמנטציה של אורך DNA זה מרמזת תהליך ביקוע DNA שמתרחש באפופטוזיס, וזו אולי הסיבה העיקרית לשחרור של ctDNA. ברקמה בריאה, הסננה של פגוציטים אחראית לפינוי של פסולת תאית הנגרמת מאפופטוזיס או מנמק תאים, פסולת הכוללת גם cfDNA. הרמות של cfDNA באנשים בריאים נמוכות מאוד, ואילו רמות ctDNA בחולי סרטן יכולות להתגלות.

השימוש ב-סמן ctDNA

השימוש ב-ctDNA כ"ביופסיה נוזלית" בשגרה הקלינית הוא בעיקר בניטור של התקדמות המהלך הסרטני. ביופסיות קונבנציונאליות הן תהליך חודרני, וקשות ליישום כאשר הגידול הסרטני קטן באופן שקשה לאתרו, או כאשר כמות החומר המתקבל בביופסיה אינה מספקת לצורך של genotyping. לעומת זאת ctDNA יכול לעבור אנליזה ומאפשר זיהוי של תרחיש סרטני בראשיתו. יש מספר יתרונות בשימוש במדד ה-ctDNA למטרות אבחון או הערכה פרוגנוסטית בהשוואה לביופסיה רגילה. אנליזה של ctDNA אינה נכללת בשגרת הפרוצדורות, כנראה בגלל חוסר בשיטות סטנדרטיות למיצוי ה-DNA, לאחסנתו, לגילויו, וכן אי האחידות בשיטות האנליזה שלו. כמו כן אין עדיין נתונים מוסכמים על הכול לגבי רגשיות וספציפיות השיטה.

השימושים של ctDNA כסמן סרטני יכולים להסתכם כדלקמן:

• זיהוי מוקדם של מחלה ראשונית
• זיהוי של מוטציות ספציפיות לגידול הסרטני וזיהוי של הטרוגניות סרטנית במחלה ראשונית וגרורתית
• הערכה של גודל השאת ותגובת השאת לטיפולים בשלב ראשוני וגרורתי
• זיהוי של minimal residual disease או MRD לזיהוי מוקדם של הישנות המחלה.

יישום פוטנציאלי של ctDNA בשגרה הקלינית

למרות שאנליזת ctDNA עדיין לא התקבלה כבדיקת שגרה, בדיקת ctDNA לגלות מוטציות ב-EGFR בסרטן ריאות מסוג NSCLC אושרה על בסיס ניסוי קליני בפאזה מתקדמת משנת 2014, שהתמקד ביעילות של gefitinib בטיפול בחולים עם NSCLC עם מוטציה ב-EGFR (על פי Douillard וחב' ב-Br J Cancer). המחקר כלל דגימות פלזמה של גידולים תואמים, והגיע למסקנה שאנליזה של-ctDNA יכולה לשמש במקרים שדגימות גידולים אינם זמינים לאנליזה מוטציונית. לממצאים דומים הגיעו במחקר שבחן מוטציות סומטיות בגידולים מוצקים שנלקחו מ-105 מטופלים שגויסו לניסויים קליניים בהם נבחנו תכשירים שכוונו ליעדים מולקולאריים בתאים הסרטניים (Perkins וחב' ב-PLos One משנת 2012). במחקר זה נמצא שאנליזת-ctDNA הייתה תועלתית במקרים בהם לא ניתן היה לקבל ביופסיות חוזרות.

היישום של ctDNA בעשייה הקלינית מתעכב בגלל אי-אחידות בשיטות סטנדרטיות באשר לשעת נטילת הדם, שיטת מיצי ה-DNA והאמפליפיקציה שלו. יתרה מכך, קיימת שלה לגבי אפשרות של "זיהום" ה-ctDNA עם חומצת גרעין זו מתאים בריאים בפלזמה, מה שעלול להניב תוצאות מוגברות-כזובות (false positive) שלו (Heitzer וחב' ב-Clin Chem משנת 2015).

בדיקת ctDNA לא חודרנית רגישה לגילוי סרטן בשלביו המוקדמים

חוקרים מארצות הברית הולנד ודנמרק שתפו פעולה בפיתוח בדיקת דם שמגלה cell-free DNA (להלן cfDNA) בנבדקים עם מחלות סרטן המעי הגס, השד, הריאות והשחלות בשלביהם המוקדמים. היכולת המוגבלת לגילוי תהליכים סרטניים בראשיתם, היא בעיה בוערת באונקולוגיה. אנליזה של ctDNA, היא חלופה לא חודרנית העושה שימוש ב-next generation sequencing ובשיטות מחשב לבצע genotyping של גידולים. עם זאת, אנליזה של ctDNA מתבצעת בדמם של אלה עם מחלת סרטן מתקדמת. במחקר של Phallen וחב' ב-Sci Trans Med משנת 2017, החוקרים עשו שימוש בשיטה המאוד רגישה של targeted error correction sequencing, הידועה כ-Tec-Seq, להעריך את שינויי הרצף ב-ctDNA ב-58 גנים קשורים לסרטן, בפלזמה של 44 אנשים בריאים ובפלזמה של 200 חולי סרטן השד, השחלות והריאות ב-stage 1 או stage 2.

במחקר זה נעשתה אנליזה ב-194 דגימות פלזמה, מתוכן 45 ממקרי סרטן שד, 42 מקרים של סרטן המעי הגס, 65 מקרי סרטן ריאות ו-42 מקרים של סרטן השחלות, כל אלה עם מחלה מקומית או מפושטת. רמות ממוצעות של cfDNA היו הרבה יותר גבוהות בדגימות של חולי הסרטן (29 ננוגרם/מ"ל) בהשוואה ל-ממוצע של 7 ננוגרם/מ"ל באנשים בריאים. אנליזת TEC-Seq של 194 דגימות הפלזמה של חולי הסרטן, מצאה שבערך 75% מהדגימות חולי סרטן המעי הגס, ב-66% של הדגימות מסרטן השחלות, וברוב הדגימות של סרטן השד והריאות, התגלו מוטציות driver gene.

הערה: במטרה להבהיר בקצרה את המושג האחרון, מחלות סרטן למיניהן הן בעלות מרכיב גנטי משמעותי, הנגרם על ידי הצטברות של מוטציות סומאטיות אם באונקוגנים או בגנים המדכאים סרטן. בין הגנים שהשיבוש בהם עלול לאתחל תהליך סרטני אנו מבחינים בין גנים משמעותיים יותר (או מה שמכנים driver genes) לבין גנים משניים בחשיבותם (המוגדרים passenger genes).

הכמות של ctDNA משתנה בין סוגי סרטן שונים. בדומה למגמה שמוצאים עם cfDNA, נמצא ש-ctDNA היה גבוה יותר במחלה גרורתית בהשוואה לשלבים המוקדמים בכל ארבעת סוגי הסרטן שפורטו (p<0.0001), בהשוואה של מוטציות ב-ctDNA בפלזמה, עם מוטציות שמוצאים בגידול עצמו או בביופסיה של רקמה בריאה (בחינה של 152 דגימות), תוך שימוש בגישה של NGS, נמצא אישור ש-ctDNA יכול לשמש לגילוי שינויים בקו הנבט (germline) העוברים בתורשה. מחקר זה הראה שזיהוי מוקדם של סרטן מתאפשר על ידי מציאת שינויים ב-DNA בדם בשיטות ריצוף מדויקות במיוחד.

בסך הכול בדיקה זו הייתה מסוגלת לגלות 86 מתון 138 מקרי סרטן בדרגות I ו-II, או למעלה מ-62%, לפי הפירוט הבא: מתוך 42 מקרי סרטן המעי הגס, הבדיקה ניבאה נכון סרטן ב-4 מתוך 8 מקרים בדרגה I או (50%), 8 מתוך 9 מקרים בדרגה II (או 89%), 9 מתוך 10 מקרים בדרגה III (או 90%) ו-14 מתוך 15 מקרים בשלב IV). מבין 71 המטפלים עם סרטן הריאות TEC-Seq זיהה סרטן ב-13 מתוך 29 חולים בדרגה I של המחלה (45%), ב-23 מתוך 32 מתוך אלה עם דרגה II של המחלה (72%), ב-ב-3 מתוך 4 עם דרגה III של המחלה (72%) וב-5 מתוך 6 חולים בדרגה IV של המחלה (83%).

במקרים של סרטן השחלות, הבדיקה גילתה 16 מתוך 24 מקרים בדרגה I של המחלה (67%), כמו גם 3 מתוך 4 מקרים בשלב II של המחלה (75%), וכן 6 מתוך 8 מקרים בשלב III של המחלה (75%), ו-5 מתוך 6 מקרים בשלב IV של המחלה (83%). במקרים של סרטן השד, גלתה הבדיקה במדויק מוטציות אופייניות לסרטן ב-2 מתוך 3 מקרים בדרגה I (או 67%), ב-17 מתוך 29 מקרים בדרגה II (המהווים 59%), וב-6 מתוך 13 מקרים בדרגה III של המחלה (59%).

רובם המכריע של גדולים סרטניים נושאים מוטציות סומטיות ב-DNA, בניגוד למוטציות העוברות בתורשה מהורים לילדיהם ומופיעים בכל תא בגוף, מוטציות סומטיות הנוצרות ב-DNA של תאים אינדיבידואליים במהלך חיי האדם. כיוון שמוטציות סומטיות אלו מופיעות רק ב-DNA של תאים סרטניים, הן מספקות סמן ספציפי ביותר שניתן להתגלות. למרות שהגידול הסרטני עצמו הוא מקור עיקרי של DNA סרטני, השגת DNA זה על ידי ביופסיה הוא הליך חודרני, מסוכן ולעיתים אף בלתי-אפשרי. אך מחקר גילה שתאים סרטניים מתים, מפרישים פיסות קטנות של ה-DNA שלהם לזרם הדם. פיסות DNA אלו מוגדרות כ-cell-free circulating tumor DNA או ctDNA. מאמר שהתפרסם בפברואר 2014 ב- Sci Traslt Med, הראה של-ctDNA יש פוטנציאל לסייע בגילוי מוטציות סומטיות כאמצעי למעקב אחר התפתחות הגדול הסרטני.

החוקרים החלו על ידי זיהוי של לפחות מוטציה סומטית אחת בגידולים של 187 מטופלים עם 17 סוגי סרטן שונים בשלבים מתקדמים של המחלה. הם עשו ריצוף של מספר גנים בהם מופיעות מוטציות לעיתים תכופות, ואם לא נמצאו מוטציות, הם הרחיבו את הבדיקה וריצפו את כל אזורי הגנום המקודדים לחלבון, או אף את כל הגנום עצמו. ה-ctDNA שנמצא בדמם של הנבדקים, נבחן לנוכחות של מוטציות סומטיות שזוהו בגידול הסרטני שלהם. החוקרים היו מסוגלים לזהות את המוטציות הסומטיות ב-ctDNA של 82% מחולי הסרטן עם גידולים גרורתיים מחוץ למוח. לשם השוואה, 55% מהנבדקים עם שלבים מוקדמים של סרטן, הכילו בדמם רמות ניתנות לגילוי של ctDNA. המסקנה מתוך ממצאים אלה הייתה שאחוז הנבדקים עם רמות ברות-גילוי של ctDNA בדמם, היה במתאם טוב עם דרגת הגידול. בעוד ש-47% מהנבדקים עם גידולים ב-stage I הכילו בדם ctDNA בר-גילוי, האחוז של נבדקים עם מחלה בדרגה III, II או IV, בהם ניתן היה לגלות את ctDNA היה 55%, 69% ו-82%, בהתאמה. יתרה מכך, נמצא שריכוזי ctDNA בדם, גדלו ביחס ישר לדרגת הגידול. למעשה, כאשר נמדדו ריכוזי ctDNA בדמם ש 206 חולים בסרטן המעי הגס, ריכוזים נמוכים יותר של ctDNA היו במתאם טוב עם תקופת הישרדות ארוכה יותר.

יציבות ופינוי של ctDNA

לא הרבה ידוע על היציבות של ctDNA בזרם הדם, אך נראה שהיא קצרה יחסית. ctDNA חופשי יכול להתפרק על ידי הטחול, הכליות או הכבד (Chan וחב' ב-Proc Natl Acad Sci USA משנת 2013). למרות שלא נחקרה באופן ספציפי הדינמיקה של פינוי ctDNA מהדם במחלות סרטניות, מחקר המבוסס על DNA עוברי שאינו קשור לתאים, מצא שהפינוי מתבצע בשתי פאזות, כאשר תקופת מחצית החיים של ה-DNA בפאה הראשונה היא בת שעה אחת, ותקופת מחצית החיים שלו בפאזה השנייה היא של 13 שעות. בהקשר של liquid biopsy, פינוי יחסית מהיר זה הוא בעל יתרון בקבלת תמונת מצב מדויקת של התקדמות המחלה (Yu וחב' ב-Clin Chem משנת 2013).

ctDNA כסמן פרוגנוסטי

השימוש ב-ctDNA כסמן פרוגנוסטי, תואר בזמנו בגידולים באגן, במעי הגס, בלבלב וכן במלנומה (Rapisuwon וחב' ב-ComputStruct Biotechnol J משנת 2016). לדוגמה, במחקר על מוטציות KRAS והיפר-מתילציה של CDKN2A בחולי סרטן המעי הגס, נמצא שיעור של 100% הישרדות לתקופת שנתיים בנבדקים עם רמות ctDNA הנמוכות מסף הגילוי (Lecomte וחב' ב-Int J Cancer משנת 2002). ממצאים דומים התגלו לגבי נבדקים עם סרטן המעי הגס בהם רמות ctDNA היו ניתנות לגילוי, בהם נשנתה המחלה תוך שנה. ממצא זה מרמז לערך הפרוגנוסטי של רמת ctDNA בסרטן המעי הגס (Diehl וחב' ב-Nature Med משנת 2008).

אחת מהאינדיקציות הפרוגנוסטיות היותר אמינות היא בהערכה של דרגת המחלה (Crowley וחב' ב-Clin Oncol משנת 2013). באופן כללי, גידולים סרטניים בדרגה נמוכה, כרוכים בפרוגנוזה טובה יותר. למרות שמספר מחקרים הראו שלרמות גבוהות יותר של ctDNA יש נטייה להיות כרוכים בשלב מחלה גרורתי, רמת ctDNA אינה כרוכה תמיד בדרגת החומרה של הגידול (Bratman וחב' ב-Expert Rev Mol Diagn משנת 2015). מסיבה זו, אין זה סביר ש-ctDNA יחליף את השיטות המקובלות לריבוד (stratification) המטופלים, תוך התבססות על מחלה יותר אגרסיבית או פחות אגרסיבית. השיטות המקובלות לאשש את דרגת ואת שלב המחלה, הן multi-factorial, וכוללות נתונים המבוססים על אנליזה היסטולוגית, אימונו-היסטוכימית ומולקולארית. בנוסף, במקרה של סרטן שד וסרטן המעי הגס, ישנם מבחנים המאושרים על ידי ה-FDA להבדיל בין מצבי סרטניים בסיכון גבוה או בסיכון נמוך, וזאת על ידי בחינה של ביופסיות שמקורן בגידול (Maak וחב' ב-Ann Surg משנת 2013, ו-Van't Veer וחב' ב-Nature משנת 2002, ו-Paik וחב' ב-N Eng J Med משנת 2004 ו-Nygaard וחב' ב-Lung Cancer משנת 2013). אמנם, אין סבירות גבוהה ש-ctDNA יוכל לשמש כמנבא פרוגנוסטי יחיד, אך יוכל לסייע במקרים בהם אין אפשרות להפיק ביופסיה, או שבהם חומר מהגידול אינו מתאים לאנליזה גנטית.

הופעתם של גידולים סרטניים עמידים לתרופות בגלל הטרוגניות של תאים בתוך הגידול היא תופעה קריטית ליעילות הטיפול. שבט (clone) גנטי קטן בתוך הגידול יכול להתרחב בממדיו לאחר טיפול תרופתי אם הוא נושא מוטציה המקנה לו עמידות לטיפול תרופתי זה. ביופסיות התחלתיות עלולות להחמיץ את הקלונים הללו או כיוון ששכיחותם נמוכה או כיוון שמיקומם המרחבי בתוך הגידול החמיץ את הכללתם בביופסיה. לדוגמה, כיוון שביופסיה דוגמת רק חלק קטן של הגידול, קלונים חריגים הממוקמים באזורי גידול אחרים אינם נכללים בביופסיה ואינם מובחנים. נתון זה עלול להטעות מחקר על תפקיד ההטרוגניות של הגידול בהתקדמות המחלה או בהישנותה. השילוב של ctDNA במחקר עשוי למנוע את המגבלות האחרונות כיוון שהוא עשוי לספק תמונת מצב המשקפת יותר את השונות הגנטית של התהליך הסרטני הן בגידול הראשוני כמו גם בחלקיו הגרורתיים. לדוגמה, נמצא ש-ctDNA מועיל בחקר האבולציה של קלונים חריגים אלה בגידול הסרטני לפני וגם אחרי מתן הטיפול התרופתי (Murtaza וחב' ב-Nature Commun משנת 2015).

זיהוי של DNA "נורמאלי" בהשוואה ל-DNA סרטני

שיקול חשוב בשימוש ב-ctDNA כסמן סרטני הוא ביכולתו להבדיל בין cfDNA של תאים בריאים לזה של תאים סרטניים. cfDNA מופרש על ידי תאים לא-ממאירים במהלך turnover תאי נורמאלי, אך במהלך פרוצדורות כמו ניתוחים, כימותרפיה ורדיו-תרפיה. יש סברה שלימפוציטים הם התורמים העיקריים ל-cfDNA בנסיוב. מספר מחקרים הראו שרמות מוגברות של cfDNA נמצאו בחולי סרטן בהשוואה לאנשים בריאים, וכן שבמספר הקשרים רמות cfDNA נמצאות במתאם טוב עם התקדמות המחלה (Perkins וחב' ב-PLos One משנת 2012). בדומה, גם Koffler וחב' (J Clin Invest משנת 1973) מצאו מתאם טוב של רמות cfDNA בחולי סרטן בהשוואה לאנשים בריאים. עם זאת, קשה להחליט את היחס בין DNA ממקור תאי הסרטן, כיוון שישנם מצבים פיזיולוגיים בהם cfDNA מוגבר, כמו במצבי דלקת או פציעה.

ctDNA בבדיקות סריקה של סרטן

השימושיות הקלינית של ctDNA בגילוי גידול סרטני ראשוני מוגבלת באופן חלקי בגלל הכמויות הקטנות של ctDNA (Pisetsky ו-Fairhurst ב-Autoimmunity משנת 2007). חוקרים ב-John Hopkins העריכו את היכולת לגלות ctDNA על ידי שימוש ב-PCR דיגיטלי ב-640 מטופלים עם סוגי סרטן שונים. ctDNA התגלה רק ב-48-73% מהנבדקים. חשוב לציין, שבמחקר על ידי Kopreski וחב' ב- J Natl Cancer Inst משנת 2000, מוטציות ב-KRAS, שהוא אונקוגן בעל מוטציות אחדות בסרטן המעי הגס, התגלו ברקמת המעי הגס של נבדקים בריאים. למעשה, ב-58% מבין אלה עם מוטציות ב-KRAS לא התגלתה בקולונוסקופיה כל עדות לממאירות, מה שיכול להביע על תוצאות חיוביות-כזובות עם בחינת ctDNA. עם זאת ייתכן שמדובר בנגעים קדם-ממאירים.

רובם המכריע של גדולים סרטניים נושאים מוטציות סומטיות ב-DNA, בניגוד למוטציות העוברות בתורשה מהורים לילדיהם ומופיעים בכל תא בגוף, מוטציות סומטיות הנוצרות ב-DNA של תאים אינדיבידואליים במהלך חיי האדם. כיוון שמוטציות סומטיות אלו מופיעות רק ב-DNA של תאים סרטניים, הן מספקות סמן ספציפי ביותר שניתן להתגלות. למרות שהגידול הסרטני עצמו הוא מקור עיקרי של DNA סרטני, השגת DNA זה על ידי ביופסיה הוא הליך חודרני, מסוכן ולעיתים אף בלתי-אפשרי. אך מחקר גילה שתאים סרטניים מתים, מפרישים פיסות קטנות של ה-DNA שלהם לזרם הדם. פיסות DNA אלו מוגדרות כ-cell-free circulating tumor DNA או ctDNA. מאמר שהתפרסם בפברואר 2014 ב- Sci Traslt Med, הראה של-ctDNA יש פוטנציאל לסייע בגילוי מוטציות סומטיות כאמצעי למעקב אחר התפתחות הגדול הסרטני.

החוקרים החלו על ידי זיהוי של לפחות מוטציה סומטית אחת בגידולים של 187 מטופלים עם 17 סוגי סרטן שונים בשלבים מתקדמים של המחלה. הם עשו ריצוף של מספר גנים בהם מופיעות מוטציות לעיתים תכופות, ואם לא נמצאו מוטציות, הם הרחיבו את הבדיקה וריצפו את כל אזורי הגנום המקודדים לחלבון, או אף את כל הגנום עצמו. ה-ctDNA שנמצא בדמם של הנבדקים, נבחן לנוכחות של מוטציות סומטיות שזוהו בגידול הסרטני שלהם. החוקרים היו מסוגלים לזהות את המוטציות הסומטיות ב-ctDNA של 82% מחולי הסרטן עם גידולים גרורתיים מחוץ למוח. לשם השוואה, 55% מהנבדקים עם שלבים מוקדמים של סרטן, הכילו בדמם רמות ניתנות לגילוי של ctDNA. המסקנה מתוך ממצאים אלה הייתה שאחוז הנבדקים עם רמות ברות-גילוי של ctDNA בדמם, היה במתאם טוב עם דרגת הגידול. בעוד ש-47% מהנבדקים עם גידולים ב-stage I הכילו בדם ctDNA בר-גילוי, האחוז של נבדקים עם מחלה בדרגה III, II או IV, בהם ניתן היה לגלות את ctDNA היה 55%, 69% ו-82%, בהתאמה. יתרה מכך, נמצא שריכוזי ctDNA בדם, גדלו ביחס ישר לדרגת הגידול. למעשה, כאשר נמדדו ריכוזי ctDNA בדמם ש 206 חולים בסרטן המעי הגס, ריכוזים נמוכים יותר של ctDNA היו במתאם טוב עם תקופת הישרדות ארוכה יותר.

השימוש של ctDNA לניטור סרטן

גם אם ctDNA עלול להיות בהווה לא שימושי באבחון סרטן הוא יכול להיות יעיל בניטור התקדמות המחלה והתגובה לטיפולים, כאשר אבחנה ש המחלה כבר נעשתה. לגבי רוב הגידולים, שיטות הדמיה כ-CT, PET או MRI נחשבים "סטנדרט זהב" לניטור המחלה. עם זאת, שיטות ההדמיה יקרות, ואף מוגבלות ביכולת הגילוי שלהן, וקיימת רזולוציה דלה לגבי גידולים בקוטר הקטן מ-1 ס"מ (Huang וחב' ב-Practical Rad Oncol משנת 2013). ניטור מספר סוגי סרטן נעשה גם על ידי מדידת של סמנים חלבוניים ספציפיים לסוגי סרטן אלה, כאשר הדוגמה הבולטת ביותר היא PSA המשמש כסמן של סרטן הערמונית. אך סמנים אלה הם לעיתים לא אמינים, מה גם שלרוב סוגי הסרטן אף אין סמנים ספציפיים (Velonas וחב' ב-Int J Mol Sci משנת 2013). לכן, ctDNA עשוי לספק אמצעי לניטור מסת הגידול למגוון גדול יותר של סוגי סרטן, כולל סרטן השד (Umetani וחב ב-J Clin Oncol משנת 2006), סרטן פּריאמפולארי של הלבלב (Umetani וחב' ב-Clin Chem משנת 2006), סרטן המעי הגס, סרטן הראש והצוואר (Nawroz וחב' ב-Nature Med משנת 1996), מלנומה (Pinzani וחב' ב-Clin Chim Acta משנת 2011), סרטן תאי clear בכליה (Gang וחב' ב-Urology משנת 2010), וסרטן הערמונית (Hanley וחב' ב-Clin Cancer Res משנת 2006).

יתרון נוסף של ctDNA הוא בכך שיש בו הפוטנציאל לשקף התפתחות הגידול ב"זמן אמת"; נטילת מספר דגימות לפני התחלת הטיפול, במהלכו ולאחריו, עשויה לתת נתונים על התגובה לטיפול ויעילותו שיש בה להשפיע על המשך הטיפול. הסטיות הגנטיות שעלולות להוביל לעמידות לטיפולים אינן אמורות להיות מיוצגות בלקיחת ביופסיה מהגידול, לפני התחלת הטיפול. לכן, ctDNA מייצג חלופה אטרקטיבית לגילוי של עמידות לטיפול. לדוגמה, במחקר של Spindler וחב' ב-Int J Cancer משנת 2014, נוטרו המוטציות KRAS/BRAF בדגימות פלזמה של 108 מטופלים עם סרטן מעי גס מפושט, לפני ואחרי מספר מחזורי טיפול כימותרפי עם cetuximab ו-irinotecan. הריכוז של מוטציות KRAS בדגימות הפלזמה פחת עם מחזורי הטיפול, והעלמות של מוטציות ניתנות לגילוי היו במתאם טוב עם יעילות הטיפול. חוקרים אלה הבחינו גם בהופעתן של מוטציות חדשות, שיכולות לשקף עמידות נרכשת לטיפול. מחקר זה סיפק ראיות לכך ש-ctDNA עשוי להיות סמן ביולוגי לניטור ההתפתחות של סרטן המעי הגס.

עדות למחלה על ידי שיטות הדמיה מסורתיות, כגון CT, PET ו-MRI עלולה להיעלם לאחר הרחקה ניתוחית של השאת. לכן, אנליזה של ctDNA מבטאת מסלול פוטנציאלי לגילוי של minimal residual disease או MRD, והתלקחות מחודשת של המחלה, באותם מקרים בהם גוש הגידול העיקרי הורחק, ושיטות ההדמיה הקונבנציונאליות אינן יעילות. השוואה של גילוי MRD על ידי CT או בשיטת ctDNA בוצעה במטופלים בדרגה II של סרטן המעי הגס. מחקר זה על ידי Hanleyוקבוצתו, הם הצליחו לגלות ctDNA במטופלים בהם CT נכשל בזיהוי המחלה. עם זאת, חוקרים אלה מציינים שאנליזה של ctDNA סובלת ממספר מגבלות, וכך דגימות פלזמה שנאספו 36 חודשים לאחר ניתוח היו מסוגלות לנבא הישנות המחלה רק ב-48% מהמקרים.

שיטות אנליטיות לגילוי ctDNA

אנליזות לגילוי ctDNA משתרעות בסקאלה שבין מוטציות בודדות לגנום השלם. גישות מתודולוגיות עכשוויות לגילוי ctDNA, מתחלקות ל-2 סוגים עיקריים:

1. שיטות מכוונות לבחינה של מוטציות hot spot ברגישות גבוהה
2. שיטות שאינן מכוונות המאפשרות ריצוף סימולטני של מיליוני מקטעים של DNA ללא מידע ריצוף קודם, אך דורשות שכמות ctDNA תהיה בערך 5-10% מכלל פרקציית ה-DNA.

שיטת הריצוף של Sanger לאנליזה של ctDNA בפלזמה פותחה בשנת 1997, ויש לה חסרונות רבים כגון תפוקה נמוכה, השחתת זמן יקר, עלות גבוהה ואף פוטנציאל לזיהוי מוטעה (Vendrell וחב' ב-Int J Mol Sci משנת 2017).

שימוש במערכת של amplification refractory mutation לזיהוי של מוטציות hot spot (כגון מוטציות ב-KRAS, BRAF ו-EGFR) בנסיוב ובפלזמה עם רגישות אנליטית בין 0.001% ל-2%, מאושרת לשימוש קליני (Mouliere וחב' ב-Transl Oncol משנת 2013 וכן ב-Mol Oncol משנת 2014, Newton וחב' ב- Nucleic Acids Res משנת 1989, Spindler וחב' ב- Clin Cancer Resמשנת 2012, Douillard וחב' ב- Clin Cancer Resב -2014, Aung וחב' ב- J Mol Diagn משנת 2014, ו-Schreuer וחב' ב- Melanoma Resמשנת 2016). אף על פי כן, בדיקות שלdigital droplet PCR הן שטות כמותיות ומאוד רגישות, המסוגלות לסרוק מולקולות-יעד בודדות ולהעשיר אללים מוטנטיים (Taly וחב' ב-Clin Chem מ-2013, Oxnard וחב' ב-Clin Cancer Res משנת 2014, Toro וחב' ב-Clin Biochem משנת 2015, Baker ב-Nat Methods משנת 2012, Day וחב' ב- Methodsמשנת 2013, Chang וחב' ב-Mol Oncol משנת 2016 ו-Shoda וחב' ב- Gastric Cancerמשנת 2017). לכן, שיטות אלו מתאימות באופן כללי לזיהוי של מוטציות hot spot בסרטן (Oshiro וחב' ב- Breast Cancer Res Treat משנת 2015).

כאשר cfDNA משמש כחומר התחלתי, אמפליפיקציות והֶשמטים (deletions) של ctDNA יכולים להתגלות על ידי whole exome sequencing או WGS, שיש לו היתרון שאין צורך בשום מידע ריצוף קודם (Chan וחב' ב- Proc Natl Acad Sci USAמשנת 2013, Lo וחב' ב- Sci Transl Medמשנת 2010, Murtaza וחב' ב-Nature משנת 2013, Jamal-Hanjani וחב' ב-Ann Oncol משנת 2016 ו-Pereira וחב' ב- PLoS One משנת 2015.

גישות לאנליזה של ctDNA

בידוד והעשרה של cfDNA הוא אתגר גדול בהינתן דרגת הפרגמנטציה הגבוהה של cfDNA וריכוזו הנמוך בזרם הדם (Norton וחב' ב- J Clin Lab Analמשנת 2013). לפיכך, יש להקפיד על עקביות והקפדה לגבי מספר פרמטרים קדם-אנליטיים כדלקמן:

נסיוב כנגד פלזמה: מספר מחקרים שהשוו רמות cfDNA בדימות פלזמה או נסיוב של אותם מטופלים, מצאו רמות גבוהות משמעתית של cfDNA בדגימות הנסיוב (Lee וחב' ב-Transfusion משנת 2001, ו-Jung וחב' ב- Clin Chim Acta משנת 2013). הרמות המוגברות של cfDNA בנסיוב הן כתוצאה מתהליך קרישת הדם על ידי צימות תאי דם לבנים המתרחש במבחנת לקיחת הדם וגורם ל-lysis שלהם. כתוצאה מכך, cfDNA מזדהם על ידי germline DNA המופרש מהתאים המפורקים, ולכן ctDNA נמהל על ידי נוכחות של ריכוזים גבוהים של DNA לא ספציפי מתאי הגידול. למרות שהשימוש בפלזמה לבידוד ואנליזה של ctDNA הוא בעל מספר יתרונות על השימוש בנסיוב, כגון ריכוז גבוה משמעותית של cfDNA, אך יש לו גם חסרונות שעלולות להפחית את השימושיות שלו. לדוגמה, המוליזה של כדוריות דם אדומות ולבנות יכולה להתרחש באיסוף לא מוקפד של הדם ומביא להפרשת תוכן הכדוריות כולל DNA לנוזל בו הן מצויות (Ko וחב' ב-Ann Lab Med משנת 2015, ו-Volik וחב' ב- Mol Cancer Res משנת 2016). הזיהום על ידי DNA מתאים מגורענים עלול להפחית את דיוק הבדיקה. עם זאת, מספר מחקרים תומכים בשימוש בפלזמה על פני נסיוב (Umetani וחב' ב- Ann N Y Acad Sciמשנת 2006, ו-Vallée וחב' ב-Lung Cancer משנת 2013).

עיבוד אופטימאלי של הדם

לצורך אנליזה של cfDNA הפלזמה או הנסיוב חייבים להיות חסרי תאים לחלוטין, ולכן חיוני שהסרכוז הראשון של הדם יתבצע תוך זמן קצר ככל האפשר לאחר נטילת הדם להרחיק תאי דם שעלולים להתפרק ולהפריש DNA גנומי. הסרכוז השני מתבצע כדי להביא לריכוזים טובים יותר של cfDNA ולשפר את ניקיון הדגימה. הפרוטוקול האופטימאלי ממליץ על סרכוז ראשון למשך 10 דקות במהירות של 1,200 g, וסרכוז שני למשך 10 דקות במהירות של 16,000 g (El Messaoudi וחב' ב-Clin Chim Acta משנת 2013, וב- Clin Cancer Res משנת 2016).

מספר הקפדות נוספות שיש לתת עליהן את הדעת:

• אין להקפיא את דגימות הדם לפני מיצוי הפלזמה לצורך האנליזה של ctDNA
• אם הדם נלקח במבחנת EDTA יש להקפיד על עיבוד הדגימה תוך 2–4 שעות
• איסור להשתמש במבחנות הפארין שכן הפארין מעכב את תהליך ה-PCR על ידי שהוא מחקה את המבנה הסלילני של DNA
• למרות ראיות לכאן ולאן, עדיין כדאי להעדיף דגימות פלזמה על דגימות נסיוב.

שיטות המיצוי של ctDNA

מגוון של שיטות אוטומטיות יכלו לשפר את ההדירות והיעילות של תהליך המיצוי (Fong וחב' ב-Clin Chem משנת 2009, ו-Malentacchi וחב' ב- Clin Chem Lab Med משנת 2015). שיטות מיצוי קונבנציונאליות כגון פנול-כלורופורם, או שיטת salting-out בדרך כלל ממצות ריכוז גבוה יותר מאשר ערכות מיצוי DNA מסחריות. עם זאת, אלו שיטות גוזלות זמן ומורכבות. מיצוי של cfDNA ניתן לביצוע בעזרת סינון דרך עמודות-זיקה, המבוססות על חלקיקים מגנטיים או על פולימרים. יש מחקרים שהעדיפו מיצוי על עמודת Qia gen's, בה הושגו 82-92% יעילות מיצוי של cfDNA מהנסיוב, בעוד שאחרים המליצו על עמודת Macherey-Nagel, מבחינת כמות ה-DNA שמוצה, דרגת הניקיון שלו והיעילות של קבלת מקטעים קצרים של DNA. עם זאת, הערכה של Roche המבוססת על חלקיקים מגנטיים (MagNA Pure), הפיקה פי-2 עד פי-3 יותר DNA בהשוואה לעמודת Macherey-Nagel, ופי 5 עד פי-10 יותר DNA בהשוואה לעמודת Qiagen (Jorgez וחב' ב- Genet Med משנת 2006).

השפעה של תנאי אחסון הפלזמה ושל מספר מחזורים של הקפאה והפשרה

מספר מחקרים בחנו טמפרטורה אופטימאלית של אחסון הפלזמה לפני מיצוי חומצת הגרעין, והשפעת הטמפרטורה על יציבות cfDNA. אחד המחקרים קבע שאחסון דגימת הפלזמה למשך שבועיים לא השפיעה על רמות cfDNA בפלזמה, וכן שאיכות ושלמות cfDNA פחתו משמעותית לאחר 3 מחזורים של הקפאה והפשרה (Chan וחב' ב-Clin Chem משנת 2011). בגלל ההשפעה על ריכוזי ושלמות cfDNA, יש לפתח פרוטוקול קדם-אנליטי אופטימאלי (Devonshire וחב' ב-Anal Bioanal Chem משנת 2014, Mauger וחב' באותו כתב עת משנת 2015 ו-Goldshtein וחב' ב- Ann Clin Biochemמשנת 2009).

המלצות עכשוויות הן כדלקמן: פלזמה עדיפה על נסיוב כיוון שהיא מונעת זיהום של cfDNA על ידי DNA גנומי של תאי דם, וכן שהדם חייב להיות מעובד תוך 4 שעות מנטילת הדם במבחנות EDTA, או תוך 96 שעות מנטילת הדם כאשר משתמשים במבחנות Streck’s BCT או במבחנות CellSave; סרכוז מוודא היעדרות של תאים כלשהם בפלזמה, והסרכוז השני מומלץ במיוחד; יש להקפיד על אחסון הפלזמה בטמפ. של C° 80- תוך הימנעות מהקפאות והפשרות חוזרות. למרות שהקפאה בטמפ' של -20°C אינה משפיעה על ריכוז ה-DNA היא גורעת מאיכותו (Bronkhorst וחב' ב-Clin Chim Acta משנת 2015).

ראו גם

• חזרה לדף מדריך בדיקות מעבדה
• בדיקות מעבדה - סמנים סרטניים

המידע שבדף זה נכתב על ידי פרופ' בן-עמי סלע, המכון לכימיה פתולוגית, מרכז רפואי שיבא, תל-שומר;
החוג לגנטיקה מולקולארית וביוכימיה, פקולטה לרפואה, אוניברסיטת תל-אביב (יוצר הערך)