Galactocerebrosidase

הדפס

מדריך בדיקות מעבדה
'
galactocerebrosidase
שמות אחרים	β-Galactosidase galactosylceramide hydrolase, cerebroside β-galactosidase, GALC. Galactosylceramidase
מעבדה	כימיה בדם
תחום	אבחון מחלת Krabbe
טווח ערכים תקין	רמת Psychosine בדם נמוכה מ- nmol/L ‏3. רמת הפעילות האנזימטית של GALC בדם: or =1.20 nmol/h/mg protein ‏<.
יוצר הערך	פרופ' בן-עמי סלע

מטרת הבדיקה

מסייעת באבחון הביוכימי של מחלת Krabbe ובחסר של Saposin A cofactor; מעקב אחר מאובחני המחלה וניטור תוצאות הטיפול בה; מעקב אחר יילודים עם תוצאה בלתי תקינה בסקר יילודים המחשידה לקיום המחלה, כגון פעילות נמוכה של האנזים גלקטוזילצראמידאז - galactocerebrosidase.

האנזים GALC

לקומפלקס של האנזים GALC ו-galactose, משקל מולקולארי של 74,668 דלטון, עם נקודה איזואלקטרית של 6.11. האנזים GALC הוא מונומר הנקשר לשייר galactose על ידי יצירת קשר מימן, בנוסף לאינטראקציה הידרופובית לייצוב הקשר. שיירים Trp-135, Thr-93, Ser-261, Arg-380, Glu-182, Glu-258 ו-Asn-181, יוצרים קשרי מימן עם galactose. כמו כן, השיירים Trp-291, Tyr-238 ו-Tyr-303 יוצרים אינטראקציות הידרופוביות עם הסוכר. סך המבנה התלת-ממדי של האנזים אינו משתנה בעת ההתקשרות עם הסוכר. GALC מורכב משלושה מקטעים (domains):

• מקטע מרכזי הידוע כ-TIM או triosephosphate isomerase
• מקטע β-sandwich
• מקטע lectin.

כל שלושת מקטעים אלה תורמים שיירים ליצירת הכיס הקושר סוכר. הלולאות הארוכות בקצה ה-C-טרמינאלי של מקטע TIM, ואלה של מקטעי β-sandwich ו-lectin תורמים לייצוב הכיס קושר הסוכר. אינטראקציות אלו מזהות את השיירים הקטליטיים Glu-258 שהוא נוקלאופיל פעיל, ו-Glu-182 שהוא תורם הפרוטון.

מקטע ה-lectin אינו מאופיין ואינו נמצא באנזימים הידרוליטיים אחרים, אם כי הוא חיוני לזיהוי והכרת מבנים קרבוהידרטיים, מה שמצביע על חיוניותו לקישור לשיירים סוכריים. יון סידן קשור למקטע ה-lectin, בקונפיגורציה פנטגונאלית-דו-פּירמידאלית בין השיירים Asp-660, Asn-479, Asp-477 ו-Phe-511. מקטע ה-lectin של GALC הוא בעל דמיון מבני ללקטינים קושרי סוכרים אחרים דוגמת galectin-8. בנוסף, שיירים Asn-363, Asn-387, Asn-284 ו-Asn-542, מפגינים אף הם זיקה למבנים סוכריים, מה שתומך בחיוניות של מקטע ה-lectin לקישור האנזים למבנה סוכרי (Deane וחב' ב- Proc Natl Acad Sci USA משנת 2011).

האנזים GALC מקטלז את ההידרוליזה של שייר galactosyl מגליקוספינגוליפידים. המבנה של GALC מגלה כיצד נקשר האנזים לגלקטוליפידים, כאשר הקבוצה הידרוקסילית יוצרת קשר מימן עם שיירThr-93 על פני האנזים. קשר מימן עם הקרבוניל של Gly-47 בשלד האנזים מייצב את הקונפורמציה של Trp-291. שייר galactose אינו נגיש תמיד, שכן האתר הפעיל של האנזים אינו מסוגל תמיד להתאים עצמו ל"זנבות" ליפידיים המופיעות על מצעים טבעיים כ-galactosphingolipids. על מנת לסייע בקישור אנזים זה למצע שלו נזקקים ל-saposins שהם חלבונים ליזוזומלים המשפעלים אנזימים הגורמים להידרוליזה של ליפידים (Muford וחב' ב- J Lipid Res משנת 1995). מבין ארבעת ה-saposins הידרוליזה של גלקטוליפידים דורשת פעילות של sapA וכנראה גם את זו של sapC (Spiegel וחב' ב-Genet Metab משנת 2005).

שני מנגנונים הוצעו באשר לסיוע של saposins לפעילות האנזים GALC:

• המנגנון הראשון משער שה-saposins ממצים ליפידים מה-bilayer ליצירה של קומפלקסים של ליפידים-חלבונים מסיסים במים, המקלים על נגישות המצע הליפידי לאנזים.
• המנגנון המוצע השני מציע קישור של האנזים על פני ה-bilayer במקום בו מולקולות saposin מאפשרות גישה של האנזים למצע שלו על ידי עיוות ה-bilayer.

קיימת אפשרות ש-sapA ו-sapC קשורים לשני המנגנונים הללו. יתרה מכך, ל-saposins יש משטחים טעונים באופן מאוד שלילי, שצריך לנטרל אותם כדי לאפשר את הקישור שלהם לממברנה. המטען של פני האנזים GALC ב-pH4.8 הוא +10 e- עם אזור טעון מאוד חיובי המקיף את נקודת הקישור למצע. אזור זה מנטרל את המטען השלילי של הליפיד, מה שמקל על ההיספחות של GALC למצע שלו.

שייר קריטי נוסף של מולקולת GALC, הוא Arg-380, הנקשר למולקולת galactose באזור הפעיל שלו. שייר Arg-380 נמצא בקצה של הלולאה הארוכה הנמשכת ממקטע ה- β-sandwich ויוצרת חלק חשוב מאזור קישור GALC למצע. מוטציה המסבה Arg-380 ל-tryptophan נמצאה במקרה אחד של מחלת Krabbe אינפנטילית חמורה, מה שמעיד על חשיבות השייר Arg-380.

מחלת Krabbe

זוהו למעלה מ-200 מוטציות בגן GALC שיכולות לגרום למחלת Krabbe, כאשר המוטציה השכיחה ביותר במאובחני המחלה ממוצא אירופי, (המוגדרת לעיתים כמוטציית large 30kb deletion), מאובחנת על ידי חסר של מקטע גדול של הגן GALC. יש מוטציות אחרות בהן יש הוספה (insertion) של נוקלאוטידים ל-DNA של GALC, או שיש שינוי נקודתי של נוקלאוטיד מסוים בגן זה.

חומרת הנזק הנגרם במחלת Krabbe למערכת העצבים מתבטאת במוות המתרחש בילדים עם המחלה עוד טרם הגיעם לגיל שנתיים. באופן נורמאלי, קומפלקס הרטיקולום האנדופלזמי ומערכת Golgi מייצרים, גורמים לגליקוזילציה ומעבירים את GALC לליזוזומים שם האנזים מקטלז את ההידרוליזה של יחידות galactose טרמינאליות מ-galactosphingolipids כולל psycosine והמרכיב הליפידי העיקרי של מיאלין, galactocerebroside. אלא שלמעלה מ-70 מוטציות ידועות גורמים לפנוטיפים הקליניים החמורים, כאשר בשלב זה הטיפול מוגבל להשתלת תאי-גזע המאטו-פויאטיים, וגם זאת רק אם ההשתלה מתבעת בשלבים הקודמים להופעת התסמינים.

מחלת Krabbe הידועה גם כ-globoid cell leukodystrophy היא מפגע תורשתי ליזוזומלי בו מתרחש הרס של שכבת מיאלין המגוננת על האקסונים העצביים במערכות העצבים המרכזית וההיקפית ובמוח. ברוב המקרים, תסמיני המחלה מתפתחים בתינוקות לפני גיל 6 חודשים, והמחלה מסתיימת בדרך כלל במוות עד גיל שנתיים, לרוב מכּשל נשימתי או מירידה דרמטית בטונוס השרירי. כאשר מחלת Krabbe מתפתחת בילדים מבוגרים יותר או במבוגרים, מהלך המחלה יכול להיות שונה באופן בולט, ומשך החיים בילדים בהם המחלה מופיעה מאוחר יותר, יכול להגיע עד 7 שנים לאחר האבחון. מחלה זו אינה ניתנת לריפוי, והטיפול הוא בעיקרו תמיכתי. עם זאת, השתלת תאי גזע הראתה הצלחה מסוימת בתינוקות בהם הטיפול החל לפני הופעת התסמינים, אך גם במספר ילדים בוגרים יותר ומבוגרים. המחלה פוגעת בערך ב-1 מכל 100,000 אנשים בארצות הברית, עם שכיחות נשאים של 1 לכל 150 איש.

בישראל שכיחות המחלה גבוהה יותר אם כי לא אותר אף מקרה בקרב יהודים. על פי Zlotogora וחב' בIsr J Med Sci משנת 1991, במעקב שנמשך 15 שנים נתגלו בסך הכול 18 מקרי Krabbe, מתוכם 6 דרוזים משבט גדול של משפחה מורחבת, 12 ערבים מוסלמים מתוכם 7 מ-2 כפרים סמוכים, שרובם היו בני משפחה מורחבת, בה שיעור המחלה היה גבוה במיוחד (1 ל-130 לידות-חי).

תסמיני המחלה

ברוב המקרים, תסמיני המחלה מופיעים בין החודשים 2–5 לחיים, הם מתחילים בהדרגה ומחמירים בחלוף הזמן. בתינוקות תסמיני המחלה הם כדלקמן: קשיים ביניקה והזנה, בכי בלתי מוסבר, נטייה בולטת לחוסר שקט ורגזנות, חום מוגבר ללא עדות לזיהום או הידבקות, ירידה בעֵרָנוּת, פיגור במאפיינים התפתחותיים אופייניים, התכווצויות שרירים, שליטה מועטה וחלשה על תנועות הראש, הקאות תכופות. ככל שהמחלה מתקדמת מאפייניה חמורים יותר, והם עלולים לכלול: פרכוסים, אובדן של יכולות התפתחותיות, איבוד מתקדם והולך של ראיה ושמיעה, שרירים מכווצים ונוקשים, יְצִיבָה נוקשה, איבוד הדרגתי ביכולת הבליעה והנשימה.

המחלה המופיעה בגיל מתקדם יותר (late-onset Krabbe disease)

כאשר מחלת Krabbe מתפתחת מאוחר יותר בילדות או בבגרות, תסמיניה יכולים להיות מגוונים עם דרגת שוני ניכרת. הם יכולים לכלול: אובדן הדרגתי של הראייה, קשיי הליכה (ataxia), דעיכה בכושר החשיבה, חולשת שרירים, איבוד של מְיֻומָּנוּת בביצוע פעולות ידניות. ככלל, ככל שמחלת Krabbe מופיעה בגיל צעיר יותר, היא מתקדמת מהר יותר ומסתיימת במוות מוקדם יותר. בחלק מאלה המאובחנים כחולי Krabbe בשנות הבחרות או הבגרות שלהם, התסמינים מתונים יותר, כאשר חולשת שרירים הוא התסמין העיקרי, בלי לסבול אפילו מחסכים חשיבתיים.

גורמים למחלת Krabbe

הומוזיגוטיות המתבטאת ב-2 עותקים של הגן המכיל מוטציות, המתקבלים מ-2 ההורים, גורמת לאי-יצירה או ליצירה מועטה של האנזים GALC. אנזים זה אחראי להידרוליזה בתוך הליזוזום של galacto-cerebroside, ובהיעדרו חלה הצטברות של galactolipids כגון galactosylsphingosine הידוע כ-הpsycosine ו-galactosylceramide שהשפעתם טוקסית, וחלקם אף מגרים תאים מייצרי-מיאלין לעבור השמדה עצמית (אפופטוזיס) (Suzuki ב-Neurochem J משנת 1998). גלקטוליפידים אחרים נקלטים על ידי מיקרוגליה, שהם התאים האחראיים במערכת העצבים לקליטת ופינוי פסולת, וכאשר אותם תאי גליה קולטים עודף של גלקטוליפידים, הם הופכים מתאים מועילים לתאים טוקסיים הידועים כתאי globoid המעודדים תהליכי דלקת המזיקים למיאלין, ופוגעים ביכולת של תאי עצב לשגר ולקלוט איתותים עצביים (Zaka ו-Wenger ב- Neurosci Lett משנת 2004).

מידע קליני

מחלת Krabbe היא מפגע אוטוזומאלי-נסגני, הנגרם מחסר של האנזים galactosylceramide β-galactosidase (להלן GALC), אנזים המקודד על ידי הגן GALC הממוקם על כרומוזום 14 בעמדה 14q31.3. המיקום המולקולארי הוא בין bp87,933,014 ל-bp87,993,665.(Luzi וחב' ב-Genomics משנת 1995).

חסר של פעילות GALC גורם להצטברות של galactosylceramide בתאי ה-globoid שהם מקרופאגים רב-גרעיניים, וההשפעה הטוקסית של הצטברות תוצר זה גורמת לדה-מיאלינציה חמורה ברחבי המוח. למעשה התרכובת הטוקסית היא galactosylsphingosine (psychosine), העלול לגרום לאפופטוזיס בהצטברו באוליגודנטרוציטים ובתאי Schwann, ולפתוגניות של המחלה. אחת הסיבות למוות של אוליגודנטרוציטים היא ההשריה על ידי psycosine של פעילות האנזים phospholipase A2 (על פי Giri וחב' ב-J lipid Res משנת 2006).

מדידת פעילות האנזים β-galactocerebrosidase

אבחון מחלת Krabbe מבוסס על הדגמת החסר של β-galactocerebrosidase: וזיהוי המוטציות בגן GALC. פעילות האנזים נמדדת ב-lysate של לויקוציטים תוך שימוש בכרומטוגרפיה בנוזל ו- tandem mass spectrometry ‏(LC-MS/MS). שיטה זו אינה אמינה לזיהוי נשאים, ואלה ניתנים לזיהוי על ידי אנליזה מולקולארית של GALC.

אנליזה של האנזים GALC אינה שוללת את האבחון של מחלת Krabbe בלתי-טיפוסית (atypical Krabbe disease) בגלל חסר של saposin A. אחוז קטן של אלה שהם נשאים של המחלה, מאובחנים כלוקים ב-Krabbe, יכולים לשאת מוטציה שאינה ניתנת לזיהוי בשיטות האבחון של המחלה, כמו שמט גנוֹמי גדול, או מוטציות ב-promoter. לפיכך, היעדר מוטציה אינו שולל את האפשרות של סטאטוס של נשא, או את האבחון של מחלת Krabbe. במספר מקרים שינויים ב-DNA עם משמעות בלתי ברורה יכולים להתגלות. קיימים גם פולימורפיזמים נדירים שיכולים לגרום לתוצאות כזובות-חיוביות או כזובות-שליליות. אם תוצאות בדיקות המעבדה אינן תואמות את הממצאים הקליניים, יש לשקול ביצוע בירורים נוספים.

אנליזה של עקומת ROC ‏(receiver operating characteristic) ב-6 חולי Krabbe ו-220 אנשים ללא מחלה זו, הפיקה שטח מתחת לעקומה (AUC) של 1.0, מה שמאפשר בחירה של ערך סף ממנו ניתן לקבל ערכי ניבוי חיובי (ppv) ושלילי (npv) מרביים של 1.0.

בדיקות הדמיה והולכה של סיגנל עצבי

ניתן לבדוק איבוד מיאלין בחומר הלבן באזורים פגיעים מוח, בשיטות MRI תלת ממדית או על ידי CT דו-ממדית. ניתן לבדוק את מהירות ההולכה החשמלית על ידי מדידת הזמן שאיתות חשמלי נודד בין 2 נקודות בגוף, כאשר במחלת Krabbe בה יש פגיעה במיאלין, וההוֹבָלָה העצבית איטית יותר.

בדיקת מחלת Krabbe במסגרת סקר ילודים

במספר מדינות בארצות הברית אבחון מחלת Krabbe מתבצע במסגרת הפאנל הסטנדרטי של סקר יילודים. הבדיקה הראשונית מודדת את פעילות האנזים GALC, ואם זו מתקבלת נמוכה, מתבצע בירור נוסף הרלוונטי למחלה זו. הכללת מחלת Krabbe במסגרת סקר יילודים חדשה יחסית. Orsini וחב' דיווחו ב-Clin Biochem משנת 2009 על תחומי הייחוס של פעילות GALC לאחר בחינת 139,074 דגימות מיילודים אנונימיים, 56 דגימות מנשאים ידועים, ו-16 דגימות חולי Krabbe. המדידה נעשתה בשיטת tandem MS spectrometry, כאשר הפעילות המוחלטת של האנזים בתינוקות ככלל הייתה בתחום שבין0.17-355 μmol/h, בעוד שפעילותו בקרב נשאים הייתה 0.28-2.71 μmol/h ואילו הפעילות ביילודים עם Krabbe נקבעה כ- 0.08-0.48 μmol/h (שני התרשימים למטה):

אחוז הפעילות הממוצעת היומית (DMA) של האנזים GALC בדם טבורי של יילודים עם Krabbe ובגיל 7 ימים, במעקב בגיל מאוחר יותר, לעומת נשאי המחלה.

אחוז הפעילות הממוצעת היומית (DMA) של האנזים GALC בטיפות דם מיובשות של יילודים עם מחלת Krabbe, נשאי המחלה ויילודים בריאים

מדידת רמת psychosine בטיפות מיובשות של דם יילודים

Turgeon וחב' פרסמו ב- J Inher Metab Disמשנת 2015 תוצאות מדידת psychosine בטיפות מיובשות כשיטת סקר יילודים משופרת לזיהוי מקרי Krabbe. המיצוי שלpshychosine מהדם המיובש נעשה עם מתנול המכיל N,N-dimethyl-D-erythrosphingosine ששימש כ-internal standard. בהמשך, LC-MS/MS שהתמשך 17 דקות הביא לתוצאות הבאות: ב-220 דגימות של יילודים בריאים רמת ה-psychosine נמצאה נמוכה מ-8 ננומול/ליטר; ב-18 דגימות של נשאי המוטציה רמת psychosine הייתה נמוכה מ-15 ננומול/ליטר; ב-26 דגימות שהתקבלו מיילודים עם המחלה תחום רמות psychosine נע בין 8–112 ננומול/ליטר (תרשים למטה):

בדיקות הקו הראשון המומלצות לאבחון מחלת Krabbe הן בדיקות LDSBS או Lysosomal Disorders Screen, Blood Spot; בדיקת CBGC או Galactosylceramide β-Galactosidase בלויקוציטים או בפיברובלסטים. אנשים עם פעילות GALC נמוכה מתחת לסף הפעילות התחתון שנקבע לבדיקות אלו, הם בסבירות גבוהה יותר למוטציות בגן GALC שניתנות לזיהוי בשיטות מולקולאריות גנטיות. אך שיטות אלו אינן אמינות לזיהוי נשאים של המחלה.

בדיקה גנטית

המידע של הבדיקה הגנטית כולל ריצוף מלא של DNA המקיף את כל 17 ה-exon המצויים בגן GALC, כמו גם הערכה של intron 10 שאורכו 30bp הנמצא בקצה הגן. שמט (deletion) ב-intron זה, אחראי לחלק גבוה יחסית ממקרי מחלת Krabbe במתכונת ה-infantile שלה (Richards וחב' ב-Genet Med משנת 2015). גם אם פעילות האנזים אינה יכולה לנבא את גיל תחילת התסמינים, ישנן קורלציות ידועות בין גנוטיפ לפנוטיפ. אלה שהם הומוזיגוטיים לשמט או שהם compound heterozygous לשמט זה ונושאים מוטציה שנייה ב-GALC, מועמדים לסבול מהצורה האינפנטילית של המחלה. לעומת זאת המוטציה c.857G>A (p.Gly286Asp, כרוכה רק בפנוטיפ ה-late-onset של המחלה (Luzi.וחב' ב- Hum Mol Genet משנת 1995).

קביעה ספציפית של פעילות β-galactocerebrosidase על ידי עיכוב תחרותי של β-galactosidase

השיטות הקיימות לקביעת פעילות האנזים β-galactocerebrosidase, מראות ספציפיות גבוהה אך דורשות בדרך כלל כמויות גדולות של חלבון ממקורות בהן רמת החלבון מוגבלת. Martino וחב' דיווחו בשנת 2009 ב-Clin Chem על פיתוח שיטה חדשנית, המבוססת על ההשערה שמדידות ספציפיות של פעילות האנזים האמור, יכולות להתבצע על ידי עיכוב מוחלט של פעילות האנזים β-galactosidase.

שיטת המדידה עשתה שימוש ב-2-7.5 מיקרוגרם חלבון בדגימות הנמדדות, כאשר מצע פלואורוגני מלאכותי, דוגמת methylumbelliferonebetagalactopyranoside‏-4 בריכוז 1.5 מילימול/ליטר, הומס בתמיסת 0.1/0.2 מול/ליטר של בופר ציטראט/פוספאט, pH4.0, ו-AgNO₃, ומשך האינקובציה היה 30 דקות בטמפרטורה של 37°C. הפלואורסצנציה של ה-methylumbelliferone-‏4 שהשתחרר נמדדה בספקטרו-פלואורומטר כאשר ה-Aex היה באורך גל של 360 ננומטר, וה-Aem היה באורך גל של 446 ננומטר.

תוצאות ניסוי זה היו כדלקמן: AgNO₃ הוא מעכב תחרותי של β-galactosidase עם קבוע עיכוב (Ki) של 0.12 מיקרומול/ליטר, ועיכב לחלוטין את פעילות β-galactosidase כאשר הריכוז של AgNO3 היה 11 מיקרומול/ליטר. בריכוז זה נשמרה לחלוטין פעילות galactocerebrosidase‏-4, והיא יכלה להימדד באופן ספציפי ומדויק. בשיטה זו ניתן למדוד פעילות β-galactocerebrosidase שהיא נמוכה ביותר ברמת תמצית חלבון תאי שאינה עולה על 2 מיקרוגרם של חלבון, או 7.5 מיקרוגרם של רקמה. תיקוף (validation) של השיטה התבצע תוך שימוש ברקמת מוח הלקוחה מעכבר בריא או מעכבר twitcher, שהוא המודל למחלת Krabbe באדם. מסקנת בעלי המחקר היא ששיטה זו ישירה, מהירה, והדירה. יש בהקשר הקליני, כדי להבדיל באופן שאינו משתמע לשתי פנים, בין אנשים בריאים לבין חולי Krabbe ולכן היא ישימה לאפליקציה אבחונית.

גם Escolar וחב' הגיעו למסקנה דומה, לפיה מדידת רמת psychosine בטיפות דם יבשות, היא השיטה הראויה וסמן טוב לקביעת הפנוטיפ של מחלת Krabbe (על פי Escolar וחב' ב-Mol Genet Metab משנת 2017).

הוראות לביצוע הבדיקות השונות במחלת Krabbe

• אנליזה מלאה של הגן GTALC וגילוי של מוטציית חסר Large 30kb בשיטת PCR יעילה כבדיקת קו-שני לזיהוי המחלה. בדיקה מומלצת לזיהוי נשאים עם היסטוריה משפחתית של Krabbe, בהיעדר מוטציות ידועות במשפחה. בדיקת המשך (Reflex test) היא CULFB או תרבית של פיברובלסטים מביופסיית עור לביצוע האנליזה הגנטית. החומר צריך להגיע למעבדה תוך 96 שעות מנטילתו. השתלת מח עצם קודמת לבדיקה מתורם allogenic תפריע לפענוח תוצאות הבדיקה הגנטית.
• בדיקה בדם לא קרוש על ידי נטילת דם במבחנת ספירת-דם (EDTA, פקק סגלגל), מבחנת הפארין (פקק ירוק) או מבחנת ציטראט (פקק תכלת). יש לערבב היטב את תכולת המבחנה, אין צורך לסרכז ויש לשלוח למעבדה כדם מלא במבחנה המקורית, בטמפרטורת החדר או כמבחנה מקוררת.
• פיברובלסטים בתרבית יש לשלוח בבקבוק T-25 כאשר התאים ממלאים אותו, בטמפרטורת החדר או בקירור תוך פחות מ-24 שעות מרגע שהתאים confluent. ביופסיית עור רצויה היא בקוטר מַקֵּב (punch) של 4 מ"מ.
• לצורך מדידת פעילות galactocerebrosidase בלויקוציטים, יש ליטול דם במבחנת ACD או acid citrate dextrose. גם דגימות דם במבחנת EDTA או הפארין ניתנות לשימוש. המבחנה אמורה להגיע למעבדה במבחנה מקוררת תוך 72 שעות לאחר נטילת הדם. אין להעביר את הדם מהמבחנה המקורית למבחנה אחרת. הבדיקה תיפסל אם הדם המוליטי באופן בולט, אך ניתן לבצעה בהמוליזה קלה. דגימת הדם יציבה בטמפרטורת החדר או בקירור (מועדף) למשך 72 שעות.
• כאשר נשלחת למעבדה ביופסיית-עור בקוטר 4 מ"מ, יש לשלחה במיכל סטרילי של תרבית תאים עם מדיום סטנדרטי כגון RPMI 1640. יש להוסיף למדיום 1% פניצילין וסטרפטומיצין. מועדף שהמיכל יגיע למעבדה בקירור, אם כי יציבות הדגימה בטמפרטורת החדר טובה אף היא.
• טיפת דם מיובשת על נייר סופג (רצוי נייר מסוג Whatman Protein Saver 903 Paper או נייר סופג מסוג Ahlstrom 226 filter paper. רצוי להטביע על הנייר 2–5 טיפות דם מדקירת האצבע עם דוקרן. הבדיקה מתבצעת בטמפרטורת החדר כאשר טיפת הדם מוטבעת על הנייר הסופג באופן אופקי, ויש לתת לטיפת הדם להתייבש משך 3 שעות. אין לחשוף את הדם המיובש לתנאי חום או קרינת שמש ישירה. אין לערום זה על גבי זה ניירות סופגים של עם טיפות דם שלא התייבשו באופן מוחלט. יש לשמור על הניירות הסופגים בתנאי יובש תוך הימנעות מלחות.