סוקציניל אצטון - Succinylacetone

הדפס

מדריך בדיקות מעבדה
סוקציניל אצטון
succinylacetone
שמות אחרים	SUAC
נוסחת succinylacetone
מעבדה	כימיה בדם מיובש וכימיה בשתן
תחום	אבחון tyrosinemia type 1
טווח ערכים תקין	בדם – למטה מ-2.4 מיקרומולר; בשתן - 0.013-0.27 מיקרומול/מילימול קראטינין.
יוצר הערך	פרופ' בן-עמי סלע

Tyrosinemia type 1 (להלן TYR1) ידועה גם כ-fumaryiacetoacetatase deficiency, היא מפגע אוטוזומלי-רצסיבי של מטבוליזם של חומצת אמינו. TYR1 נגרמת על ידי חסר בפעילות של fumarylacetoacetate hydrolase, האנזים הסופי במסלול הפירוק של טירוזין, מה שמביא להצטברות טוקסית של fumarylacetoacetate, של maleylacetoacetate ושל succinylacetoacetone (להלן SUAC) (Lindblad וחב' ב-Proc Natl Acad Sci USA משנת 1977). המפגע TYR1 מאופיין על ידי מחלה מתקדמת של הכבד, הכליות ומערכת העצבים (de Laet וחב' ב-Orphanet Journal of Rare Diseases משנת 2013). תוארו 3 צורות של המחלה: חריפה (המופיעה מתחת לגיל 6 חודשים), תת-חריפה (המופיעה בגיל שבין 6-12 חודשים) וכרונית (המופיעה לאחר גיל שנה) (De Laet וחב' ב-Orphanet J Rare Dis משנת 2013). ללא טיפול, הפרוגנוזה של הילדים עם TYR1 גרועה, עם רמת תמותה גבוהה בגיל הילדות מכשל של הכבד, מדימומים חוזרים, מקרצינומה הפאטו-צלולרית, ומתסמונת דמויית-פורפיריה עם כשל נשימתי (Van Spronsen וחב' ב-Hepatology משנת 1994). SUAC גם מעכב את האנזים ALA dehydratase (או PBG synthase). מה שמעלה את ריכוז ALA ומגביר תסמינים נוירופתיים חריפים, הדומים לאלה שמוצאים בפורפיריה. SUAC נוצר מחמצון של glycine והוא קודמן של methylglyoxal.

עם זאת, טיפול עם nitisinone ומגבלות דיאטתיות כרוכים בהפחתת התחלואה והתמותה (Bartlett וחב' ב-J Inherit Metab Dis משנת 2014, Larochelle וחב' ב-Mol Genet Metab משנת 2012, ו-McKiernan וחב' ב-Arch Dis Child משנת 2015). מנגנון הפעולה של nitisinone כורך עיכוב של hydroxyphenylpyruvate4 dioxygenase (להלן HPPD). טיפול זה באלה עם TYR1 מונע יצירת maleylacetoacetic acid ו-fumarylacetoacetic acid שהם בעלי פוטנציאל להפוך ל-succinylacetone הטוקסי לכבד ולכליות. השתלת כבד מוצעת אם הטיפולים האחרונים נכשלים, או אם מתפתחת קרצינומה הפאטו-צלולרית. ההיארעות של TYR1 מוערכת בערך כ-1:100,000 לידות-חי, אם כי ערך זה משתנה באוכלוסיות שונות בין 1:1,846 (על פי Debraekeleer ו-Larochelle ב-Am J Hum Genet משנת 1990), או 1:781,144 (על פי Therrell וחב' ב-Mol Genet Metab משנת 2014). ההיארעות של TYR1 גבוהה יותר בקוויבק-קנדה, כנראה בגלל founder effectכמו גם בילדים אסייתיים ב-West Midlands בבריטניה (Hutchesson וחב' ב-Arch Dis Child משנת 1996), וכן בצפון אפריקה ובמזרח התיכון כתוצאה מנישואי קירבה בקרב המוסלמים (Hadj-Taieb וחב' ב-La Tunisie Medicale משנת 2012).

מסלולים מטבוליים בטירוזינמיה type 1

מדידת רמת succinylacetone לאבחון TYR1

בתוכניות סקר מורכבות של יילודים בשיטת liquid chromatography/tandem mass spectrometry נמצאה בעיה של תוצאות שליליות-כזובות (false negativs) לזיהוי טירוזינמיה type 1.‏ la Marca וחב' פרסמו בשנת 2008 ב-Rapid Commun Mass Spectrom את שיטתם לשימוש ב-succinylacetone (או SUAC) כדי להימנע מתוצאות שליליות כזובות אלו. חוקרים אלה בחנו 13,000 טיפות דם יבשות של יילודים מאזור טוסקנה בין ינואר למאי 2007 כמו גם 10 טיפות יבשות של שישה יילודים עם TYR1. שיטת הסקירה המסורתית שונתה על ידי הוספה של dioxooctanoid acid או C2-succinylacetone‏13 כ-internal standard לתמיסה המתנולית של חומצות אמינו ו-deuterated acylcarnitines. גם פרקי הזמן של המיצוי, הבוטילציה והייבוש הוארכו רק במידה מעטה. המדידה הייתה ליניארית עד ל-100 מיקרומולר לגבי succinylacetone. ה-intra-CV וה-inter-CV לגבי דיוק הנתונים הייתה בתחום בין 1.34-7.09%, ו-3.5-4.49%, בהתאמה. מגבלת הסף התחתון של גילוי הסמן הייתה 0.2 מיקרומולר. בשיטה זו ניתן היה לשחזר בין 97-100% של succinylacetone. ב-9 מקרים של יילודים עם רמות טירוזין גבוהות, רמות succinylacetone נמצאו בתחום הנורמה שמתחת ל-2.4 מיקרומולר ביילודים בריאים. לעומת זאת, ב-10 טיפות הדם המיובשות של 6 יילודים עם TYR1 רמות succinylacetone נמצאו בין 3.3-35.0 מיקרומולר.

גם Stinton וחב' ב- Orphanet J Rare Dis https://ojrd.biomedcentral.com משנת 2017, בחנו את הדיוק של מדידת רמת succinylacetone בטיפות דם יבשות בשיטת tandem-MS/MS על ידי מטה אנליזה של 10 מחקרים שסיפקו נתונים על דיוק השיטה לאבחון של TYR1. נמצא שהרגישות ב-29 מקרים של יילודים שאובחנו עם המחלה, ו-34,403 יילודים בריאים הייתה של 100%, ערכי הניבוי החיובי (PPV) נקבעו כ-66.7% בסקר של כ-500,000 יילודים בהם נמצאו 2 מקרים חיוביים נכונים, ומקרה אחד של אבחון false positive. בסקר אחר של 856,671 יילודים ה-PPV נקבע כ-100%, עם מציאת 8 מקרים חיוביים אמיתיים, כאשר ערך הניבוי השלילי (NPV) לא ניתן כמובן במקרה זה לחישוב. יש לקחת בחשבון שהאישור הסופי לגבי דיוק השיטה בכימות של succinylacetone יכול להיקבע רק אם המעקב אחר היילודים בסקרים אלה נמשך לפחות עד גיל שנתיים כיוון שהמקרים התת-חריפים או הכרוניים של TYR1 יכולים להתגלות עד גיל שנתיים, גם אם בסקר המיידי לאחר הלידה הם נקבעו כשליליים.

Johnson וחב' פרסמו בשנת 2007 ב-Rapid Commun Mass Spectrom אנליזה של שיטות flow injection electrospray ionization tandem mass spectrometric של מדידת succinylacetone ב-250 מיקרוליטר שתן תוך שימוש ב--d5-SA כ-unternal standard, או ב-3 מ"מ של טיפות דם מיובשות תוך שימוש ב-13C4-SA כ-internal standard. מדידה של SUAC בשתן של יילוד בריא מוצאת תחום נורמה של 0.013-0.27 מיקרומול/מילימול קראטינין, ואילו תחום הנורמה של SUAC בטיפות דם מיובשות הוא 0-0.30 מיקרומול/ליטר. טיפות דם של יילודים עם TYR1 הפאטו-כלייתי, שנשמרו בטמפרטורת החדר עד 7 שנים, היו בעלות SUAC בריכוזים של 0.9-5.7 מיקרומול/ליטר.

גם Han וחב' פרסמו בשנת 2012 ב- Zhonghua Er Ke Za Zhi אפליקציה למדידת SUAC בדם בשיטה של tandem mass spectrometry, ובשתן בשיטה של gas chromatography-mass spectrometry לצורך אבחון של TYR1. החוקרים בחנו 190 מקרים חשודים לטירוזינמיה. שיטת tandem mass spectrometry בדם היא כדלקמן: לאחר ניקוב של דסקית בקוטר של 3 מ"מ מטיפת הדם המיובש, היא הונסה לבאר בפלטת 96 בארות, הוכנסה לכל באר תמיסת 80% אצטוניטריל בנפח של 100 מיקרוליטר. תמיסה זו הכילה hydrazine monohydrate וכן את ה-internal standard של succinylacetone. הנוזל העליון הועבר לפלטת 96 בארות אחרת, ויובש על ידי חנקן מחומם, לאחר שהפלטה עברה הדגרה משך 30 דקות בטמפרטורה של 65 מעלות. ריאגנט ה-hydrazine השיירי, הורחק על ידי הוספה של 100 מיקרוליטר מתנול לכל אחד מהבארות ונידוף על ידי חנקן מחומם. הפאזה המובילית (80% אצטוניטריל), הוספה לכל באר, ו-20 מיקרוליטר של הדגימה נמדדו על ידי tandem mass spectrometry.

תוצאות מדידה זו היו כדלקמן: אחד עשר מטופלים אובחנו עם TYR1 (9 ילדים ו-2 ילדות) בגילים שבין חודשיים עד 6 שנים. רמותsuccinylacetone בדם של המאובחנים עם TYR1 היו מוגברות באופן בולט (7.26-31.09 מיקרומול לליטר, ובממוצע 14.2 ± 7.8 מיקרומול לליטר. בשבעה מתוך אלה עם המחלה, רמת succinylacetone נמדדה בשתן על ידי gas chromatography-mass spectrometry, אך רק 4 מתוכם נמצאו חיוביים ושלושה נמצאו שלילים ל-succinylacetone. רמות טירוזין בדמם של הילדים המאובחנים עם TYR1, נמצאו בין 190-543 מיקרומול/ליטר עם ערך ממוצע של 327.3 ± 125.8 מיקרומול/ליטר, כאשר תחום הנורמה הוא 20-100 מיקרומול/ליטר. בכל הילדים עם מחלה מאובחנת הכבד היה מוגדל מאוד, ותשעה מתוך 11 המאובחנים נפטרו, ושניים הנותרים השתפרו לאחר טיפול. מסקנת החוקרים היא ששיטת הבדיקה של tandem mass spectrometry בדם מיובש היא שיטה טובה מאוד לאבחון TYR1, בעוד ששיטת MS-GC בשתן עלולה לתת תוצאות שלילות כזובות.

בדיקות סקר של יילודים לאיתור מקרים של TYR1 מבוצעות במדינות רבות, אך כאשר רמות טירוזין מוגברות שימשו כמדד ראשוני של TYR1 מתברר שטירוזין אינו מוגבר באופן גורף בילדים עם TYR1‏ (Goulden וחב' ב-Clin Biochem משנת 1987), וטירוזין יכול להיות מוגבר גם בתרחישים אחרים ובתינוקות ללא TYR1‏ (Morrissey וחב' ב-Mol Genet Metab משנת 2011, ו-Wilcken וחב' ב-Pediatrics משנת 2009). בשנת 2004 פרסמו Allard וחב' ב-Clin Biochem שיטה חלופית לזיהוי TYR1 תוך שימוש ב-tandem mass spectrometry (MS/MS) לקביעת SUAC שעובר מיצוי מטיפות דם יבשות. סקירה מהירה של הספרות שהתפרסמה עד שנת 2012, מראה שתוכניות סקר של יילודים תוך שימוש ב-succinylacetone כסמן דיווחו על רגישות וספציפיות של 100%, אם כי היו גם דיווחים שלא מצאו ערכי ניבוי חיוביים ושליליים גבוהים במיוחד עם סמן זה.

סקירה של עשרות רבות של מחקרים הצטמצמה בסופו של תהליך מוקפד על איכות המחקרים והיקפם, תהליך שהצטמצם לבסוף ל-10 מחקרים ששמשו למטה-אנליזה (la Marca וחב' ב- JIMD Rep משנת 2011, Lund וחב' ב-Mol Genet Metab משנת 2012, Sander וחב' ב-Clin Chem משנת 2006, Zytkovicz וחב' ב-Clin Biochem משנת 2013, ו-Dhillon וחב' ב-Clin Chim Acta משנת 2011). המחקרים שנכללו במטה-אנליזה זו דיווחו על ממצאים בתינוקות בני 16 שבועות ובילדים עד גיל 50 חודש. המחקר של Sander ואנשיו, בחן 61,344 דגימות ומצא בהן 2 מקרים של TYR1 , ואילו המחקר של Zytkocicz ואנשיו בחן 518,687 דגימות ומצא בהן 3 מקרים של TYR1. מחקר אחר בקוויבק בחן 13,532 דגימות ומצא בהן 11 ממקרים של TYR1. בסדרת מחקרים אלה נקבע תחום של 1.29-10.0 מיקרומול/ליטר לתינוקות/ילדים עם TYR1. לא ניתן לחשב רגישות וספציפיות בגלל שאלה שנקבעו כשליליים לא נמצאו במעקב של חודשים עד 5 שנים, על מנת להיווכח שלא מדובר ב-TYR1 תת-אקוטי או כרוני.

בדיקה כמותית של succinylacetone בשתן

הבדיקה מתבצעת על ידי Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS) בדגימת שתן אקראית ראשונה של הבוקר. לאחר נטילת השתן, יש להקפיא מיד את הדגימה. יש לפסול דגימות שתן שנשמרו שעות אחדות בטמפרטורת החדר, או דגימות שתן שהוקפאו והופשרו יותר מפעם אחת. יציבות דגימת השתן: בטמפרטורת החדר לא מתקבל; בקירור עד 24 שעות; בהקפא-עד חודש.