אדנילאט קינאז - Adenylate kinase

הדפס

מדריך בדיקות מעבדה
אדנילאט קינאז
Adenylate kinase
שמות אחרים	ADK, myokinase
מעבדה	המטולוגיה, כימיה בדם
תחום	ברור אנמיה המוליטית לא-ספרוציטית.
טווח ערכים תקין	מעל גיל 12 חודשים - 195-276 U/g Hb. ביילודים רמת הפעילות של AK יכולה להיות באופן נורמלי נמוכה באופן קל או מתון מהרמה במבוגרים.
יוצר הערך	פרופ' בן-עמי סלע

מטרת הבדיקה

הערכת פעילות האנזים adenylate kinase כחלק מהערכת תרחיש של אנמיה המוליטית לא-ספרוציטית כרונית.

מידע קליני

Adenylate kinase (להלן AK) הוא אנזים מונומרי המקטלז את ההמרה של nucleotide phosphoryl של adenosine triphosphate (להלן ATP) ו-adenosine monophosphate (להלן AMP) ל-2 מולקולות של adenosine diphosphate (להלן ADP), או ההמרה של 2 מולקולות ADP ל-ATP ול-AMP. באופן נורמלי, הרמה של אנזים זה ביילודים נמוכה מזו שבמבוגרים באופן קל עד מתון. חסר של AK היא סיבה נדירה של אנמיה המוליטית לא-ספרוציטית אוטוזומלית-רצסיבית (Toren וחב' ב- Brit J Haematol משנת 1994, Corrons וחב' ב-Blood משנת 2003, ו-Koralkova וחב' ב-Int J Lab Hematol משנת 2014). למרות נדירותה, אנמיה הנגרמת מחסר AK, תוארה במשפחות רבות ממוצא אתני שונה. הטרוזיגוטיות לגבי מפגע גנטי זה היא א-תסמינית עם פנוטיפ תקין. אלה שהם הומוזיגוטים או שהם compound heterozygous מפגינים אנמיה המוליטית לא-ספרוציטית כרונית עם רמות המוגלובין של 8-9 גרם/דציליטר, עם היפר-בילירובינמיה ואבני מרה. התסמינים מתגלים כבר בשנות הילדות המוקדמות, כאשר חלק מהלוקים בחסר AK סובלים מפגיעה פסיכו-מוטורית, אם כי הפתוגנזה של מפגעים אלה אינה מובנת. באלה עם חסר של AK הסובלים גם מחסר האנזים glucose 6-phosphate dehydrogenase (או G6PD). האנמיה חמורה יותר ורמת ההמוגלובין עלולה לרדת ל-6 גרם/דציליטר. הפעילות של AK במצבי חסר נעה בין 0-44% מהפעילות הנורמלית של האנזים, אך לרוב היא נמוכה מ-33% מהפעילות התקינה. בנשאים, פעילות AK יכולה להיות נורמלית או נמוכה רק באופן קל, ובאלה שהם הומוזיגוטים לחסר, פעילות האנזים נמוכה משמעותית. כריתת הטחול מסייעת למניעת אנמיה המוליטית הנגרמת על ידי החסר ב-AK (Nizuma וחב' ב-Pediatr Int משנת 2017).

האנזים AK זוהה גם במספר מיני חיידקים ושמרים (Cooper ו-Friedberg ב-Gene משנת 1992). מספר שיירים ב-AK משומרים באיזופורמים השונים, מה שמדגיש את חשיבותם לקטליזה. אחד השיירים המשומרים ביותר הוא ארגינין , שהמודיפיקציה שלו גורמת לאינאקטיבציה של האנזים. כמו כן חשוב שייר של חומצה אספרטית הממוקם בשקע (cleft) הקטליטי של האנזים. שייר משומר מאוד נוסף הוא Arg119, הממוקם באזור הקישור של האנזים לאדנוזין. רֶשֶׁת שיירים משומרים בעלי מטען חשמלי חיובי (Lys13, Arg123, Arg156 ו-Arg167) זוהו ב-AK של E. coli, והמטען השלילי של קבוצת הפוספוריל חיוני לטרנספר של קבוצה זו. האנזים AK נפוץ בגוף והוא כרוך המטבוליזם של תהליכי אנרגיה והומאוסטאזיס של יחסי adenine nucleotide באברוני תא שונים. AK מופיע בגרעין התא, בציטוזול או במיטוכונדריה של רקמות מגוונות. בערך 30-40% של פעילות AK מתקיימת במיטוכונדריה של שריר הלב. אנזים זה משחק גם תפקיד חשוב בהתאוששות ממצב של איסכמיה, וכן באפופטוזיס. מוטציה בגן של AK כרוכה ב-combined immunodeficiency חמור המכונה reticular dysgenesis.

מנגנון הפעולה

הטרנספר של פוטספוריל מתרחש רק כאשר יש הרחקה של מולקולות מים, מה שמפחית את המחסום האנרגטי הנדרש לצורך התקפה נוקלאופילית על ידי ה-α-phosphoryl של AMP על קבוצת ה-γ-phosphoryl של ATP, מה שמביא ליצירת ADP על ידי טרנספר של קבוצת ה-γ-phosphoryl ל-AMP. שני שיירים מרוחקים של חומצה אספרטית נקשרים לרשת של ארגינין, גורמים לאנזים להתקפל ומפחיתים את גמישותו. קו-פקטור של מגנזיום גם כן נדרש, כיוון שהוא חיוני להגברת האלקטרופיליות של הפוספאט על פני AMP (Müller ו-Schulz ב-J Mol Biol משנת 1992). מחקר אחר בחן את הקונפורמציות של AK בהיקשרו ל-ATP ול-AMP (Whitford וחב' ב-J Mol Biol משנת 2007). מחקר זה הראה שיש 3 קונפורמציות רלוונטיות של "ליבת AK", "ליבתית", "פתוחה" ו"סגורה". באנזים AK ישנם 2 מקטעים קטנים הקרויים LID ו-NMP (Daily וחב' ב-J Mol Biol משנת 2010). ATP נקשר בכיס הנוצר על ידי מקטעי LID ו-Core, ואילו AMP נקשר בכיס הנוצר על ידי מקטעי NMP ו-CORE.

היציבות הטרמודינמית המקומית של המקטעים הנקשרים למצע ATPlid ו-AMPlid נמצאה נמוכה משמעותית בהשוואה למקטע CORE ב-AK של E. coli (Rundqvist וחב' ב-Biochemistry משנת 2009). קישור למצעים גורם להעדפה של קונפורמציית האנזים "הסגורה", שתפקידה לסייע בהרחקת מים מהאתר הפעיל כדי למנוע הידרוליזה של ATP ובנוסף לסייע באופטימיזציה של הגישור בין האנזים למצע, לצורך הטרנספר של פוספוריל (Olsson ו-Wolf-Watz ב-Nat Commun משנת 2010).

תפקוד האנזים-ניטור מטבולי

היכולת של התא להעריך באופן דינמי רמות אנרגיה, מאפשרת לו לנטר תהליכים מטבוליים (Dzeja ו-Terzic ב-Int J Mol Sci משנת 2009). ניטור זה ושינוי רמות ADP , ATP ו-AMP, הופכים את AK לווסת חשוב של בזבוז אנרגיה ברמת התא (Dzeja וחב' ב-PLos One משת 2011). כאשר רמות האנרגיה משתנות בהשפעת עקות מטבוליות שונות, AK מסוגל אז לייצר AMP שמסוגל לדוגמה לעודד קולטנים שונים התלויים ב-AMP כגון אלה הכרוכים במסלולים גליקוליטיים, בתעלות K-ATP, וב-AMP activated protein kinase‏'5 (או AMPK). גורמים שכיחים המשפיעים על רמות אדנין נוקלאוטיד וממילא על פעילות AK, הם פעילות גופנית, עקה, שינויים ברמות הורמונים ודיאטה. האנזים AK נמצא במיטוכונדריה ובחלקי התא המיו-פיברילריים, והוא גורם ל-2 פוספורילים עתירי-אנרגיה (β ו-γ) של ה-ATP להיות זמינים לטרנספר בין המולקולות של אדנין נוקלאוטיד. למעשה, AK מוביל ATP לאזורים הצורכים אנרגיה גבוהה, ומסלק את ה-AMP הנוצר במהלך ריאקציות אלה. מעברי פוספאט אלה חיוניים מאוד על כלל ההומאוסטאזיס של התא.

חסר של האנזים nucleoside diphosphate kinase

האנזים NDP מקטלז in vivo את הסינתזה התלויה ב-ATP של ribo- ושל deoxyribonucleoside תלת פוספאטים. בחיידק E. coli מוטנט, עם חסר של nucleoside diphosphate kinase, האנזים AK מבצע את שתי הפונקציות, ומתקן את המצב של חסר nucleoside diphosphate kinase (על פי Lu ו-Inouye ב-Proc Natl Acad Sci USA משנת 1996). חסר של AK באריתרוציטים כרוך באנמיה המוליטית (Matsuura וחב' ב-J Biol Chem משנת 1989). זהו פגם אנזימטי נדיר באריתרוציטים שכרוך במספר מקרים בפיגור ובפגיעה פסיכו-מוטורית (Abrusci וחב' ב-Exp Hematol משנת 2007).

חסר באיזופורם AK2

חסר של AK2 באדם, גורם לפגמים המאטו-פויאטיים הכרוכים בחירשות סנסו-ריניוראלית (Agresle-Peyrou וחב' ב-Nat Genet משנת 2009). האיזו-אנזים AK2 מבוטא במיוחד ב-stria vascularis של האוזן הפנימית מה שמסביר מדוע אנשים עם חסר של AK2 סובלים מחירשות סנסו-ריניוראלית.

המיקום התוך-תאי של האיזופורמים השונים

המיקום התוך-תאי של האיזו-פורמים השונים של AK, והפיזור שלהם באיברים השונים יכול להסביר את הקשר בין הדיס-רגולציה שלהם לבין תחלואות רבות. ה-AK1 הציטוזולי, וה-AK2 המיטוכונדריאלי, הם 2 האיזופורמים העיקריים הכרוכים עם מודולטורים של דלקת. האיזופורם AK5 קשור לאנצפליטיס לימבית (כאשר המערכת הלימבית או מערכת הקצה, שהיא חלק ממערכת העצבים, כולל מבנים במוח האנושי המעורבים ברגשות, מוטיבציה, זיכרון, למידה, הרחה והקשרים ביניהם. מוטציה של Leu673Pro ב-AK7 גורמת בעיקר לאי-פוריות זכרית. פגיעה באיזופורמים המיטוכונדריאליים AK2 ו-AK4, מודגמת בנוירובלסטומה ובגליומה. למרות ש-ATP הוא המצע של רוב ה-AKs (Rogne וחב' ב-Proc Natl Acad Sci USA משנת 2018), AK3 משתמש ב-GTP כמצע. התכונות המבניות והביוכימיות של האיזופורמים של AK נחקרות זמן רב (Kuby וחב' ב-J Protein Chem משנת 1989), ומוטנטים רבים שהתגלו האירו את השינויים המבניים במהלך קטליזה (Rundqvist וחב' ב-Biochemistry משנת 2009, ו-Wang ו-Makowski ב-Proteins משנת 2018). המעורבות של AKs ברגולציה של ATP, קשורה עם תהליכים תוך-תאיים נוספים כגון עקה, circadian rhythm, ותהליכי התמרה סרטנית (Noma ב-J Med Invest משנת 2005, Dzeja ו-Terzic ב-Int J Mol Sci משנת 2009, ו-Fujisawa וחב' ב-J Exp Clin Cancer Res משנת 2016). יתרה מכך, הקישור למצע גורם בראשונה לשינוי מינורי באתר הקישור ל-AMP, ואחריו לשינוי גדול במקטע LID (Müller וחב' ב-Structure משנת 1996). המשמעות של אדנילאט קינאזות בפתולוגיה של האדם, כרוכה ברגולציה של רמות תוך-תאיות של AMP החיוני לתהליכים תאיים רבים (WuJak וחב' ב-Postepy Hig Med Dosw משנת 2015, ו-Dzeja וחב' ב-Mol Cell Biochem משנת 1998).

אדנילאט קינאזות ציטוזוליות

האיזופורם AK1 מכיל 194 חומצות אמינו והוא אחד האיזופורמים ההומניים הנחקרים ביותר. הגן המקודד ל-AK1 ממוקם על כרומוזום 9 בעמדה 9q34.11, ואיזופורם זה מבוטא מאוד ברקמת שריר, במוח ובאריתרוציטים. AK1 אנושי דומה לאיזופורם אנזימטי זה באורגניזמים רבים, ויש לו זהות של 88% עם האנזים של עכבר הבית, וזהות של 66% עם אנזים זה בתולעת Cenorhabditis elegans. הגן המקודד ל-AK1 אורכו 12kb והוא מורכב מ-7 exons. האיזואנזים AK5 מכיל 537 חומצות אמינו ואף הוא דומה מאוד לאנזים באורגניזמים שונים, עם זהות של למעלה מ-90% עם האנזים ביצורים אאוקריוטים, וזהות מעניינת של 58% עם AK1 של אדם, ו-49% זהות עם האנזים של Cenorhabditis elegans. הגן המקודד ל-AK5 ממוקם בכרומוזום 1 בעמדה 1p31.1.

האיזופורם AK7 מכיל 723 חומצות אמינו, ואילו AK8 מכיל 479 חומצות אמינו, ואף הם משומרים באאוקריוטים. הגן המקודד ל-AK7 ממוקם בכרומוזום 14 בעמדה 14q32.2. האיזופורם האנושי AK7 הוא בעל תכונות מבניות ותפקודיות בקרב משפחת אנזימי AK (על פי Panayiotou וחב' ב-Biochem J משנת 2011). הוא מבוטא במיוחד בסמפונות הריאות ובאשכים (Lonergran וחב' ב-Am J Respir Cell Mol Biol משנת 2006). האיזופורם AK7 מכיל שלושה מקטעים משומרים: ליד הקצה ה-N טרמינלי של האנזים בין חומצות אמינו 147 ו-310, ישנו מקטע WeaG השייך למשפחת העל nucleoside-diphophate-sugar epimerase, ובין חומצות אמינו 367 ו-548 מופיע מקטע ה-AK, ואילו בין חומצות אמינו 678 ו-720 ליד הקצה ה-C טרמינלי ממוקם ה-motif הידוע כ-Dpy-30, שייתכן והוא motif דימריזציה. איזופורם 8 הוא בעל מספר שיירי חומצות אמינו משומרים כאשר משווים אותו ל-AK בחיידקים אירוביים או אנארוביים: 31% של זהות רצף עם Streptococcus pneumoniae, 28% של זהות רצף עם Shewanella oneidensis, ו-29% זהות רצף עם Clostridium difficile. הגן המקודד ל-AK8 ממוקם בכרומוזום 9 בעמדה 9q34.13. המיקום התוך-תאי של AK9 אינו ברור לגמרי, אם כי מחקרים אחרונים מרמזים על דיפוזיה חופשית של AK9 בין הציטוזול והגרעין (Panayiotou וחב' ב-Int J Biochem Cell Biol משנת 2014).

אדנילאט קינאזות מיטוכונדריאליות

הגן המקודד ל-AK2 ממוקם בכרומוזום 1 בעמדה p35.1 והוא מבוטא באופן ניכר בחלל התוך-ממברנאלי של המיטוכונדריון בלב, בכבד, בכליות ובטחול (Notomi וחב' ב-PLoS One משנת 2013). האיזופורם AK2 מכיל 239 חומצות אמינו. למרות ש-AK2 משומר מאוד בין האאוקריוטים, הוא בעל זהות מרשימה עם איזופורמים אחרים: 45% זהות עם AK3 באדם, 39% זהות עם הזבוב דרוזופילה, 40% זהות עם AK4 באדם, 41% זהות עם AK4 של עכבר הבית, 55% זהות עם AK1 של הפרח תודרנית לבנה (Arabidopsis thaliana) 35% זהות עם AK של E.coli ו-50% זהות עם AK של החיידק Pseudomonas aeroginosa. האיזופורם AK3 שהוא GTP:AMP phosphotransferase עם 227 חומצות אמינו, ממוקם ב-matrix של המיטוכונדריה. הגן המקודד ל-AK3 ממוקם בכרומוזום 9 בעמדה 9p24.1 והוא נפוץ בכל הרקמות. הגן המקודד לאיזופורם AK4 ממוקם בכרומוזום 1 בעמדה 1p31.3. ה-AK4 הוא בעל 96% זהות עם AK3 הוא בעל 223 חומצות אמינו ואף הוא ממוקם ב-matrix המיטוכונדריאלי. פרט לדימיון שיש ל-AK4 עם AK3 ו-AK2, יש לו גם 40-42% זהות עם AK1 של תודרנית לבנה, ועם AK2 של Saccharomyces cerevisiae, של פסאודומונס, של E.coli, של Plasmodium falciparum ושל התולעת Caenorabditis elegans.

אדנילאט קינאזות הנמצאות בגרעין התא

הגן המקודד ל-AK6 ממוקם בכרומוזום 5 בעמדה 5q13.2, ויש לו 536 חומצות אמינו וזהות כמעט מלאה של 99% עם AK5. איזופורם זה נמצא בבלוטת האדרנל, ובשל מיקומו בגרעין התא, הוא יכול להיות מווסת באופן סימולטני על ידי היחסים ATP/ADP ו-GTP/GDP (Ren וחב' ב-Proc Natl Acad Sci USA משנת 2005). יש לשער ש-AK6 הוא בעל פעילות קטליטית נרחבת המווסת את ההתכנסות או אי-ההתכנסות של גופיפי Cajal בגרעין התא, שהם מבנים ספריים, בקוטר של 0.3-1.0 מיקרון, המופיעים בגרעיני תאים מתרבים כגון תאים אמבריונליים או תאי סרטן, או בנוירונים פעילים מטבולית (Drakou וחב' ב-Proteins משנת 2012). האיזופורם AK9 הוא nucleoside mono & diphosphate kinase אך גם בעל פעילות פוספטאזה נרחבת. המשפיעים על הפעילות הקטליטית שלו (Amiri וחב' ב-Int J Biochem Cell Biol משנת 2013). הגן המקודד ל-AK9 ממוקם בכרומוזום 6 בעמדה 6q21. באדם ישנם שני איזופורמים של AK9: איזופורם 1 המכיל 1911 חומצות אמינו, ואיזופורם 2 עם 421 חומצות אמינו שהוא בעל 29% זהות עם AK1 של Plasmodium falciparum, ו-26% זהות עם AK של פסאודומונס.

מצעים ותוצרי ריאקציה

הריאקציה המקוטלזת על ידי AK היא ATP + AMP ⇔ 2 ADP :. ה-ΔG^o של הריאקציה קרוב ל-0. בשריר של מגוון בעלי חוליות וחסרי חוליות, הריכוז של ATP הוא באופן רגיל גבוה פי-7-10 מריכוז ADP, וגדול פי-100 מריכוז AMP (Beis ו-Newsholme ב-Biochem J משנת 1985). קצב ה-oxidative phosphorylation מווסת על ידי הזמינות של ADP. לפיכך, המיטוכונדריון מנסה לשמור על רמות גבוהות של ATP על ידי פעולה משותפת של AK והבקרה על ה- oxidative phosphorylation.