כניסה 
עקבו אחרינו בפייסבוק נפרין - Nephrin
| מדריך בדיקות מעבדה | |
| נפרין | |
|---|---|
| Nephrin | |
| מעבדה | נפרולוגיה בשתן ובדם. |
| תחום | נזק כלייתי. |
 | |
| טווח ערכים תקין | רמות נפרין בנסיוב ובשתן במהלך הריון ואחריו |
| יוצר הערך | פרופ' בן-עמי סלע |
נפרין הוא חלבון הנדרש לתפקוד של מערכת הסינון הגלומרולרי. הגן המקודד לנפרין באדם ממוקם בכרומוזום 19q12-q13 (Kestila וחב' ב-Am J Hum Genet משנת 1994).
רמות נפרין בנסיוב ובשתן במהלך הריון ואחריו
| Serum nephrin (ng/mL) | Urine nephrin (ng/mL) | |
|---|---|---|
| <15 wks | 99.29±5.29 | 0.13±0.02 |
| 16–20 wks | 92.85±5.35 | 0.17±0.02 |
| 21–28 wks | 78.56±4.68 | 0.24±0.03 |
| 29–40 wks | 68.69±3.63 | 0.26±0.03 |
| Postpartum | 99.77±5.43 | 0.11±0.01 |
הפיזיולוגיה של נפרין
נפרין הוא חלבון טרנס-ממברנלי בעל משקל מולקולרי של 180 קילו-דלטון, המבוטא על ידי הפודוציטים הגלומרולריים. הוא התגלה לראשונה בילדים עם תסמונת נפרוטית תורשתית מהסוג הפיני (NPHS1). נפרין מהווה חלק אינטגרלי של הפודוציט, אשר ביחד עם תאי אנדותל וממברנת הבסיס יוצרים את המחסום לסינון דרך הגלומרולי (Makris ו-Spanou ב-Clin Biochem Rev משנת 2016). פתולוגיה של הפודוציט גורמת לגילוי נפרין בשתן. המצבים הקליניים השכיחים ביותר בהם בוצעה מדידת נפרין בשתן, הם כוללים נפרופתיה דיאבטית, גלומרולו-נפריטיס ו-pre-eclampsia. מדידת נפרין מבוצעת בטכניקת ELISA עם ערכות מסחריות, או ב-real-time PCR של mRNA (Wang וחב' ב-Nephron Clin Pract משנת 2018), או על ידי אלקטרופורזה (Luimula וחב' ב-Pediatr Res משנת 2000, Nakatsue וחב' ב-K Kidney Int משנת 2005). במחקר אחד כמות הפודוציטוריה נקבעה על ידי flow cytometry של השתן (Tchebotareva וחב' ב-Nephrol Dia Transplant משנת 2012). במחקרים אחדים, נמדדו רמות של חלבוני פודוציט אחרים כגון podocalyxin ו-podocin. רמת הנפרין בשתן, נמצאת במתאם טוב עם פרוטאינוריה, ועם דרגת הפגיעה בפודוציט. תסמונת נפרוטית של הסוג הפיני מועברת בהורשה אוטוזומלית-רצסיבית, הבאה לביטוי in utero ב-hydrops של העובר (שהיא בצקת כללית של העובר, במנגנון אימונוגני, או במנגנון שאינו אימונוגני, אשר קיים בכ-75% מן המקרים. זהו מצב בו מצטברים נוזלים במדורים שונים בגוף, כגון בית החזה, בטן, תת-העור וכן השליה עצמה. הוא גם מתבטא בתסמונת נפרוטית לתינוקות מיד לאחר הלידה, מחלה פרוגרסיבית הגורמת לפרוטאינוריה מסיבית ולמוות במהלך 2 שנות הבחיים הראשונות (Zhang ו-Huang ב-Int J Nephrol משנת 2012). התרחיש אמנם התגלה לראשונה בפינלנד, אך בהמשך התגלה באזורי עולם שונים (Tung וחב' ב-Nephropathy משנת 2018). באופן ספציפי, תוך שימוש באנליזת linkage במדגם של 17 מפחות פיניות, המיקום הגנטי של מפגע זה נקבע בכרומוזום 19q12-q13 (Caliskan ו-kityluk ב-Adv Chronic Kidney Dis משנת 2014). Nephrin התגלה גם בלבלב, במוח. בנוזל השדרה, וברקמות לימפואידיות (Macconi וחב' ב-Am J Pathol משנת 2006).
נפרין ו-preeclampsia
אנליזות של נפרין בשתן שימשו לנטר preeclampsia ויתר לחץ-דם בהיריון. Wang וחב' חקרו את התפקיד של הפרשת חלבון הפודוציט ב-preeclampsia תוך גיוס 34 נשים הרות, וחלוקתן ל-3 קבוצות: נורמו-טנסיביות, אלו עם יתר לחץ-דם כרוני, ואלו עם preeclampsia (Wang וחב' ב־Am J Physiol Ren Physiol משנת 2012). מידע קליני נאסף כגון משקל, לחץ-דם, ונתוני היריון, בנוסף לרמות קראטינין ואלבומין בשתן ביחד עם רמת נפרין. נמצא שנפרין התגלה בקושי בשתן של נשים הרות בריאות וכן באלו מתוכן עם יתר לחץ-דם כרוני. לעומת זאת, בשתן של נשים פראקלמפטיות רמת נפרין בשתן הייתה גבוהה משמעותית. תוצאות אלו מספקות ראייה חזקה שהפרשת חלבון פודוציטי מתרחשת ב-preeclampsia ברמות המצויות במתאם עם פרוטאינוריה. מחקר אחר השווה הפרשה בשתן במדגם של נשים הרות עם preeclampsia חמורה לזו של נשים הרות נורמו-טנסיביות (Son וחב' ב־Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol משנת 2013). מחקר זה מצא רמות נפרין בשתן גבוהות בנשים עם preeclampsia חמורה ורמת חלבון גבוהה בשתן. רמות נפרין בשתן תאמו גם לחץ-דם דיאסטולי וכן את רמות קראטינין בנסיוב של נשים הרות בקבוצת ה-preeclampsia, מה שמצביע על נפרין כאינדיקטור טוב לנזק כלייתי. מסקנה דומה נבעה במחקר אחר בו שותפו 67 נשים מטופלות בקליניקה (Mehta וחב' ב־Am J Kidney Dis משנת 2012). מחקר עדכני יותר של Jun וחב' ב-PLoS One משנת 2014), מצא שהרגישות והספציפיות של נפרינוריה לזיהוי preeclampsia הייתה רק של 57% ושל 58%, בהתאמה.
במחקר נוסף, Proletov וחב' ב-Nephrol Dial Transplant משנת 2014, חקרו הפרשה יומית של נפרין כסמן של אפופטוזיס בפודוציטים. במחקר זה, גויסו 71 מטופלים עם גלומרולו-נפריטיס מוכח על ידי ביופסיה. נמצא שהפרשת נפרין בשתן שנמדדה בשיטת ELISA, נמצאת במתאם טוב עם פרוטאינוריה (r=0.67, p<0.05). פרוטאינוריה ונפרינוריה היו נמוכים יותר במטופלים עם ציקלוספורין. מחקר זה הראה שככל שהנזק לפודוציטים היה חמור יותר, כפי שהעידה רמת נפרין, כך גם רמות פרוטאינוריה בשתן היו גבוהות יותר. מדידת נפרין בשתן נעשתה גם במטופלים עם lupus nephritis, ונמצא שאכן רמת נפרין תאמה את רמת הפרוטאינוריה במפגע זה. מחקר עדכני יותר שימש לנטר יתר לחץ-דם בהיריון ומצבי preeclampsia. Wang וחב' חקרו את תפקיד הפרשת חלבונים של הפודוציט בשתן במצב של preeclampsia, ב-34 נשים הרות ומצאו שרמת נפרין בשתן מוגברת בהרבה. במחקר אחר, הושוו החלבונים המופרשים בשתן באלו מתוכן עם preeclampsia לעומת נשים הרות נורמו-טנסיבות (Son וחב' ב-Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol משנת 2013). נמצא שרמת נפרין בשתן גבוהה בהרבה בנשים הרות עם preeclampsia חמורה,
נזק לגלומרולוס בא לביטוי על ידי הפרשת חלבונים ותאים לשתן (Benzing ו-Salant ב-N Eng J Med משנת 2021, ו-Kwiatkowska וחב' ב-Int J Mol Sci משנת 2020), המשמשים להערכת הנזק לגלומרולוס. ישנם מספר סמנים מסורתיים להערכת נזק זה (Cavanaugh וחב' ב-Am J Kidney Dis משנת 2021, Park וחב' ב-Am J Obstet Gynecol המשנת 2021, ו-Jim וחב' ב-PLoS One משנת 2014). אך אף לא סמן ביולוגי זוהה במקרים של נזק מוקדם של נזק גלומרולרי חריף (Gentile ו-Remuzzi ב-J Biomol Screen משנת 2016, ו-Ostermann וחב' ב-JAMA Newt משנת 2020). מחקרים עדכניים הציעו שחלבוני פודוציט עשויים להיות סמנים טובים יותר לנזק גלומרולרי מוקדם (Kostovska וחב' ב-J Med Biochem משנת 2020, Kerley ו-McCarthy ב-Pregnan Hypertens משנת 2018, ו-Son וחב' ב-Hypertens Pregnan משנת 2011). מטה-אנליזה של 15 מחקרים שכלל במקובץ 1,587 מטופלים, קבעה שהרגישות לזיהוי נזק גלומרולרי הייתה 0.86, והספציפיות הייתה 0.73, כאשר הדיוק האבחוני נקבע כ-0.90. כמנבא של preeclampsia, רמת נפרין בשתן נמצאה בעלת רגישות של 0.78, והספציפיות נקבעה כ-0.79. כמנבא של נפרופתיה הרגישות של נפרין בשתן נמצאה כ-0.90, והספציפיות כ=0.62. אנליזה של תת-קבוצה במחקר זה, מצאה בשיטת ELISA שרמת נפרין בשתן הייתה בעלת רגישות של 0.89 וספציפיות של 0.72.
חוסם הפילטרציה של הגלומרולוס מורכב מתאי אנדותל מְנֻקָּבים, מממברנת הבסיס הגלומרולרית, ומהפודוציטים של תאי האנדותל. נפרין הוא חלבון טרנס-ממברנלי המהווה מרכיב מבני של ה-slit diaphragm.
הנפרין ממוקם בקצות הפודוציטים ומספק מטען שלילי חזק הגורם לדחיית מעבר חלבונים דרך מרחב Bowman. Bowman’s space הוא מרחב בכליית האדם, המשמש כמערך סינון ראשוני לדם בתהליך הפילטרציה בכליית הגוף גם בגן המקודד לנפרין (NPSH1), כרוך בתסמונת נפרוטית תורשתית, של סוג המחלה הפינית, וגורם לכמות גדולה של חלבון לזלוג לשתן. נפרין נדרש גם להתפתחות קרדיו-וסקולרית (Wagner וחב' ב-Hum Mol Genet משנת 2011).
Proletov וחב' חקרו את הפרשת נפרין בשתן כסמן אפשרי לאפופטוזיס של פודוציטים (Nephrol Dial Transplant משנת 2014). במחקר זה השתתפו 71 מטופלים עם גלומרולו-נפריטיס מוכח על ידי ביופסיה. נמצא שהפרשת נפרין בשתן תאמה היטב עם הרמה היומית של פרוטאינוריה (r=0.7, p<0.05). במטופלים שקיבלו ציקלוספורין, התקבלו רמות נמוכות יותר של פרוטאינוריה ונפרינוריה. במחקר דומה נוסף, רמות נפרין בשתן של 74 מטופלים מאובחנים עם גלומרולו-נפריטיס כרוני, ונמצא מתאם טוב בין רמות נפרין בשתן לבין חומרת הפרוטאינוריה מדידות רמת נפרין שימשו גם במחקר עם מטופלים עם לופוס נפריטיס (להלן LN). מחקר זה גייס 49 מטופלים (מתוכם 32 עם מחלת LN פעילה, ו-17 ברמיסיה), ומצא מתאם חיובי עם הפרוטאינוריה (r=0.48), מה שהביא את החוקרים למסקנה שמדידת נפרין עשויה לסייע באבחון קליני של LN.
הדיוק האבחוני של רמות נפרין בשתן
הרגישות של רמת נפרין בשתן לזיהוי נזק גלומרולרי נקבעה כ-0.86, והספציפיות שלה נקבעה כ-0.73. השטח מתחת לעקומה (להלן AUC) שהושג מקביעת SROC (או summary receiver operating characteristics), הוא 0.90 מה שמצביע על כך שנפרין בשתן הוא בעל דיוק גבוה באבחון נזק גלומרולרי, על בסיס AUC גבוה מ-0.70 כמנבא פגיעה. ה-LR (להלן likelyhood ratio) החיובי נקבע כ-3.53, וה-LR השלילי נקבע כ-0.19.
מדידות נפרין בשתן בוצעו ב-3 מצבים קליניים: נפרופתיה סוכרתית, נפרוזיס ו-preeclampsia. נמצא שרמת נפרין בשתן שנמדדה על ידי ביטוי mRNA, הייתה במתאם עם הפרוטאינוריה, אך לא עם ה-eGFR. רמת נפרין בשתן הייתה גבוהה יותר בחולי סוכרת עם נפרופתיה, ומסקנת החוקרים היא שמדידת נפרין חיונית במפגע זה. מדידת mRNA סייעה למדידת נפרין בשתן במדגם של חולי סוכרת וקבוצת ביקורת בריאה. משתתפי המחקר חולקו ל-3 קבוצות שונות: אלה עם נורמו-אלבומינוריה (NO) עם רמת אלבומין בשתן של פחות מ-30 מיליגרם/גרם קראטינין; אלה עם מיקרואלבומינוריה עם רמות אלבומין בשתן של 30–300 מיליגרם/גרם קראטינין; ואלה עם מאקרואלבומינוריה עם רמות אלבומין בשתן של מעל 300 מיליגרם/גרם קראטינין. נמצא שרמת נפרין בשתן הייתה גבוהה יותר בסוכרתיים מאשר בלא-סוכרתיים, ונמצאה במתאם טוב עם אלבומינוריה הולכת וגדלה.
נפרינוריה ופודוציטופתיות
לפודוציטים יש 4 תפקידים עיקריים, כאשר תפקודים אלה הם: הוויסות של החדירות הגלומרולרית, תמיכה מבנית לקפילרות הגלומרולריות, עיצוב של ממברנת הבסיס של הגלומרולוס (GBM), והאנדוציטוזה של של חלבונים (Tonneijck וחב' ב-Journal of the Am Soc Nephrol משנת 2017, ו-Zhang וחב' ב-Int J Mol Sci משנת 2021). פודוציטים עלולים להיפגע באדם במחלות גלומרולריות. הוצע הביטוי של פודוציטופתיות מורשות (Hathon וחב' ב-Shock משנת 2021). נזקים מוקדמים בפודוציטים ניתנים לאבחון במיקרוסקופ אלקטרוני (Pesce וחב' ב-Front Med משנת 2021). שינויים מוקדמים בפודוציטים עלולים להביא לניתוקו של הפודוציט מה-GBM, ולפגיעה חמורה של הגלומרולוס אם התרחיש מתמשך.
Aaltonen חקר את תפקיד הנפרין בפתוגנזה של נפרופתיה סוכרתית (Aaltonen וחב' ב-Lab Invest משנת 2001). במחקר זה נעשה שימוש במודל הקלאסי של streptozotocin (להלן STZ) של סוכרת בחולדות, בו יש הפרעה סלקטיבית של יצירת אינסולין בתאי בטא של הלבלב, בדומה לסוכרת type 1, וכן בעברים לא-שמנים, המשמשים מודל לסוכרת תלויה באינסולין באדם. נמצא, שנפרין ניתן לגילוי בשתן של חולדות בנות 34 שבועות בהן המחלה מושרית על ידי STZ, והמחלה הגיעה לשיאה בגיל 6 שבועות. נפרין התגלה לפני שיא ההופעה של אלבומינוריה והמסקנה היא שנפרין קשור לשלב המוקדם נפרופתיה סוכרתית. במחקר של Alter וחב' שהתפרסם ב-Clin Lab משנת 2012, קבוצה של 23 חולדות Wistar עברה כריתה של כליה אחת, וחולקו לשתי קבוצות: קבוצה אחת טופלה עם STZ להשרות סוכרת, וקבוצת הביקורת קיבלה בופר ציטראט ללא STZ. המחקר הראה שבה בשעה שלא היה הבדל בתפקוד הכליות וברמות אלבומין בין שתי הקבוצות, ההפרשה בשתן של נפרין הייתה גבוהה משמעותית בקבוצה הראשונה. נפרין הופיע אפילו לפני אלבומינוריה, מה שמצביע על כך שמדידת נפרין בשתן מאפשרת זיהוי מוקדם של נפרופתיה. במחקר אחר, Chang וחב' הדגימו ב-PLoS One משנת 2012 תוצאות דומות בעכברי Akita (שהם עכברים המשמשים מודל לסוכרת type 1 הנובעת ממוטציה נקודתית בגן Ins2). במחקר זה, נמצא שהפרשת נפרין בשתן הייתה מוגברת משמעותית במצב של פרוטאינוריה בעכברים בני 16 ו-20 יום בשלב מוקדם של המחלה. ממצא דומה דווח על ידי O'Brien וחב' ב-J Diabetes Res משנת 2013).
השימוש ברמת נפרין בשתן כאינדיקטור של נזק גלומרולרי לניבוי של preeclamsia ושל נפריטיס גלומרולרי, נלמד היטב. מדגם בארצות הברית הראה שיש קשר חזק בין PE ונזק גלומרורי מאוחר יותר (Kristensen וחב' ב-Br Med J משנת 2019). מחקר אחר מצא שנפרינוריה מקדימה את הופעת אלבומינוריה, ושרמת נפרין תואמת את חומרת המחלה (Sun וחב' ב-World J Clin Cases משנת 2019). נפרין הוא חלבון טרנס-ממברנלי המבוטא בפודוציטים גלומרולריים בעל משקל מולקולרי של 180 אלף דלטון. הוא התגלה לראשונה בילדים עם תסמונת נפרוטית תורשתית מהסוג הפיני (NPHS1) (Norio ב־Ann Paediatr Fenn משנת 1966. נפרין יוצר חלק אינטגרלי של הפודוציט, אשר ביחד עם תאי האנדותל והבסיס (basement), יוצרים את מחסום הפילטרציה הגלומרולרית (Brinkkoetter וחב' ב־Nat Rev Nephrol. משנת 2013). במקרים של פודוציטופתיות מוצאים נפרין בשתן. מדידת נפרין מתבצעת בערכות מסחריות של ELISA, או אלקטרופורזה או ב-PCR של mRNA. מצב של נפרינוריה מראה מתאם חיובי עם פרוטאינוריה ועם חומרת הנזק לפודוציטים. תסמונת נפרוטית מהסוג הפיני הוא מפגע אוטוזומלי-רצסיבי המאופיין in utero על ידי fetal hydrops שהוא מצב בו כמויות גדולות של נוזל מצטברות ברקמות ובאיברים של תינוקות ליצירת בצקת. NPHS1 המופיע בתסמונת נפרוטית בתינוקות, מה שמביא לפרוטאינוריה ולעיתים למוות בשתי שנות החיים הראשונות (Kestila וחב' ב-Mol Cell משנת 1968). התרחיש אמנם התגלה לראשונה באוכלוסייה פינית, אך בהמשך נמצא גם באזורי עולם אחרים. נפרין התגלה גם בלבלב, במוח, בעמוד השדרה וברקמות לימפואידיות, אף על פי שתפקידו ברמות אלו אינו ברור (Astrom וחב' ב-. Cell Mol Life Sci משנת 2006).
מדידה של נפרין
השיטה המקובלת ביותר למדידה של נפרין בשתן היא שימוש בערכה מסחרית של ELISA של חברת R&D ממינאפוליס (Chang וחב' ב-PLoS One משנת 2012, O'Brian וחב' ב-J Diabetes Res משנת 2013, Wang וחב' ב-Am J Physiol Res Physiol nab משנת 2012, Mehta וחב' ב-Am J Kidney Dis משנת 2012 ו-Jim וחב' ב-PLoS One משנת 2014). במחקר אחד, כמות ה-podocyturia גם כן נמדדה על ידי flow cytometry של השתן (Tchebotareva וחב' ב-Nephrol Dial Transplant משנת 2012). מחקר אחר כלל שיטת RT-PCR של mRNA (Wang וחב' ב-Nephron Clin Pract משנת 2007, Do Nascimento וחב' ב-Diabetes משנת 2003 ו-Petrica וחב' ב-PLoS One משנת 2014), או בשיטת אלקטרופורזה. מדידת נפרין על ידי ELISA הפכה לשיטה המקובלת ביותר מאז שנת 2012. במספר מחקרים, מדידות של חלבוני podocyte אחרים (כגון podocalixin ו-podocyn בוצעו גם כן, אך לא נעשו ניסיונות להשוות את הרגישות והספציפיות של חלבונים אלה בינם לבין עצמם.