קלרטינין - Calretinin

קלרטינין -Calretinin

כינויים נוספים: calbindin 2. מעבדה: היסטו-פתולוגיה. תחום: זיהוי מחלת הירשפרונג, ומזותליומה.

Calretinin תואר לראשונה בשנת 1987 (על פי Rogers ב-J Cell Biol משנת 1987). פרט לכושרו לקשור +Ca2, מסוגל calretinin לקשור יון נחושת, +Cu2, (על פי Groves ו-Palczewska ב-Acta Biochim Pol משנת 2001), המונע את ההתקשרות ל-+Ca2. הריכוז הציטופלזמטי של נוירונים ביונקים, הוא בסדר גודל של מספר עשרות מיקרומולר (Hackney וחב' ב-J Neurosci משנת 2005), והוא מרוכז בעיקר מתחת לממברנה החיצונית של התא (Hack וחב' באותו כתב עת משנת 2000). נראה שבנוסף ליכולת הקישור שלו ליוני סידן, calretinin פועל גם כחיישן (sensor) של סידן (Billing-Marczak ו-Kuznicki ב-Pol J Pharmacol משנת 1999).

Calretinin (הידוע גם כ-calbindin 2) המקודד באדם על ידי הגן CALB2 באתר 16q22.q23 על כרומוזום 16(Parmentier וחב' ב-Cytogenet Cell Genet משנת 1991), וכן calbindin ו-secretagogin, מייצגים שלושה חברים בתת-משפחת ה-calbindin (Camp וחב' ב-Int J Biochem Cell Biol משנת 2009, Schmidt ב-Front Mol Neurosci משנת 2012, ו-Alpar וחב' ב-Cell Signal משנת 2012). שלושת חלבונים אלה מכילים שישה motifs מבניים המכונים EF-hand Ca2+ binding domains. כל אחד מהמקטעים הללו מכיל סלילון αל המורכב מ-10 חומצות אמינו בערך, מלולאה של 12 חומצות אמינו הקושרות +Ca2, ומסלילון α שני המכוון באופן נִיצָּב לסלילון α הראשון. Calretinin הוא בעל משקל מולקולרי של 29-31 אלף דלטון, התגלה לראשונה ברשתית העין , ומכאן נגזר שמו (Calcium + Retina) והוא מכיל 271 חומצות אמינו ב-species רבים, והוא משומר היטב עם 269 חומצות אמינו בתרנגולות ול-273 חומצות אמינו ב-opossum קצר-זנב. ב-calretinin חמשת המקטעים ה-EF-hand הראשונים מסוגלים לקשור יוני +Ca2, בעוד שהמקטע הששי הוא בלתי פעיל (Stevens ו-Rogers ב-Protein Exp Purif משנת 1997). יתרה מכך, זיקת הקישור ל-+Ca2 של המקטע החמישי נמוכה מאוד (KD=36μM) (על פי Faas וחב' ב-PLoS Biol משנת 2007). ארבעת המקטעים האחרים המתפקדים בקשירת +Ca2, יוצרים שני זוגות של מקטעים הדומים בקישורם ליון הסידן, עם KD של 1.4-1.5 מיקרומולר. תכונה זו גורמת לרגולציה לא-לינארית של +Ca2 בתאים בגין הנוכחות של calretinin. בעכברים טרנסגניים ללא calretinin, הירידה ב-long term potentiation ב-dentate gyrus נחשבת תולדה של אקסיטציה מוגברת של תאי mossy משוללי calretinin על תאי עצב הממוקמים ב-hilus המוחי (Schurmans וחב' ב-Proc Natl Acad Sci USA משנת 1997).

במצב בו הריכוז התוך-תאי של יוני סידן הוא ברמה הבסיסית של 50-100 nM, או כאשר רמה זו עולה באופן מוגבל לזמן קצר, calretinin נוהג כבּופר רגיל, אך כאשר רמת הסידן עולה לסדר גודל של 1μM אז פועל calretinin לקשירת הסידן העודף.

נוירונים המבטאים calretinin ב-neocortex

לאחר הגילוי של calretinin הדגימו מחקרים אחדים את פיזורו של חלבון זה באזורי מוח שונים של מכרסמים (Pochet וחב' ב-Adv Exp Med Biol משנת 1989, Winsky וחב' ב-Proc Natl Acad Sci USA משנת 1989, Rogers וחב' ב-Adv Exp Med Biol משנת 1990, Resibuis ו-Rogers ב-Neuroscience משנת 1992, Baimbridge וחב' ב-Trends Neurosci משנת 1992, ו-Andressen וחב' ב-Cell Tissue Res משנת 1993). בסקירה של Barinka ו-Druga ב-Physiol Res משנת 2010 תוארו שיטות לזיהוי calretinin בנוירונים כגון אימונוהיסטוכימיה או היברידיזציה in situ.

התפקיד הפיזיולוגי של calretinin

כפי שדווח במקור על ידי Schmidt וחב' בשנת 2012, ל-calretinin יש יותר מתפקיד אחד בתלות בסוג התאים (נוירונים כנגד תאים שאינם ניתנים לאקסיטציה כולל תאי סרטן), שלבי ההתפתחות (בוגרים כנגד שלבים התפתחותיים), וכנראה גם סוגי הנוירונים. באשר למספר תפקידים מוצעים של calretinin, כגון תפקידו בהגנה על נוירונים, יש חילוקי דעות (Schwaller וחב' ב-Cell Mol Life Sci משנת 2009). מספר מחקרים שהתבצעו בעיקר בתאים מבודדים או בתרביות רקמה, מצאו השפעה מגינה של calretinin על נוירונים מפני ציטו-טוקסיות מושרית על ידי סידן (Lukas ו-Jones ב-Neuroscience משנת 1994, Isaacs וחב' ב-Brain Res Mol Brain Res משנת 1996, Marini וחב' ב-Brain Res Bull משנת 1997, ו-D'Orlando וחב' ב-Brain Res משנת 2001 ו-2002). לעומת זאת, מחקרים אחרים באותן טכניקות נתנו תוצאות הפוכות (Mockel ו-Fisher ב-Brain Res משנת 1994, Kuznicki וחב' ב-Biochim Biophys Acta משנת 1996, ו-Bouilleret וחב' ב-Neuroscience משנת 2000). ראוי לציין שהשפעה נוירו-הגנתית של calretinin תוארה כנגד נזק תאי שעלול להיגרם על ידי ריכוזים נמוכים במיוחד של +Ca2, תוארה על ידי Lema Tome וחב' ב-Neuroscience משנת 1996, ו-Turner וחב' ב-Brain Res משנת 2007).

בנוסף להימצאותו של calretinin בנוירונים, ניתן למצוא אותו גם בתאי Leydig מייצרי טסטוסטרון, בזקיקי השיער (Poblet וחב' ב-Br J Dermatol משנת 2005), והוא הפך להיות סמן שימושי לאבחון מחלת Hirschprung ומזותליומה ממאירה. רוב הממצאים על תפקודו של calretinin מקורם במחקרים במוחון, שם מוצאים אותו בתאים גרגיריים ((granules. האקסיטציה של תאים אלה בהיעדר calretinin (Gall וחב' ב-J Neurosci משנת 2003) כרוכה להומאוסטאזיס של Ca2+ בתאי Purkinje, וגורמת לפגיעה מוטורית של תאים אלה (Schiffmann וחב' ב-Proc Natl Acad Sci USA משנת 1999). בתאים מזותליאליים המבטאים calretinin, ירידה ברמתו של חלבון זה גורמת לחסימה בשלב G1 במזותליומה מה שגורם לאפופטוזיס בתאים אלה (Blum ו-Schwaller ב-Int J Cancer משנת 2013). השפעה דומה נמצאת גם בתאי סרטן מעי גס המבטאים calretinin (Gander וחב' ב-Exp Cell Res וב-Cell Calcium משנת 1996), מה שמצביע על תפקידו של calretinin בוויסות של מחזור חיי התא, שגשוג התאים, כנראה גם בהתמיינותם, ובהתמיינותם ובמותם. ממצאים אלה נמצאים במתאם עם הביטוי הזמני של calretinin במהלך ההתפתחות, אם במערכת העצבים או ברקמות אחרות (Gangji וחב' ב-Dev Growth Differ משנת 1994).

הרגולציה של ביטוי calretinin

עדיין מעט ידוע על מנגנוני הרגולציה של ביטוי calretinin ברקמות השונות. בהתבסס על ההומולוגיה המשמעותית של רצף חומצות אמינו של חלבון זה באדם ובעכברים סביר להניח שמנגנון הרגולציה של ביטוי calretinin מתנהל באופן דומה בשני ה-species (על פי Strauss וחב' ב-Brain Res Mol Brain Res משנת 1997), אם כי יש טוענים שביטוי calretinin בתאים נוירונליים ולא-נוירונליים מווסת באופן שונה (Billing-Marczak וחב' ב-Biochim Biophys Acta משנת 2004). בתאי סרטן המעי הגס באדם, הביטוי של calretinin מופחת על ידי butyrate (על פי Marilley וחב' ב-Exp Cell Res משנת 2001), כאשר butyrate נובע מתסיסה של סיבים דיאטטיים המתבצעת במעי על ידי חיידקים, והוא ידוע כמודולטור של אצטילציה של histone, המעכב את מחזור חיי התא האנטרוציטי ומביא להתמיינותו, אם כי מודולציה זו רלוונטית לתאי סרטן המעי הגס אך לא לתאים ממוצא מזותליאלי (Haner וחב' ב-J Cell Biochem משנת 2010). נתון זה מאשש את הסברה של רגולציה של הגן CALB2 שהיא ספציפית לסוג התא. בנוסף, קיימים מספר transcripts של הגן CALB2 הנמצאים במספר שורות תאים של סרטן המעי הגס, כמו גם ברקמות ממקור של סרטן המעי הגס (Schwaller וחב' ב-Eur J Biochem משנת 1995, ו-Gander וחב' ב-Exp Cell Res משנת 1996). Calretinin נמצא גם בתאי פיטום (mast cells), ב-schwannoma, בתאי סרטן גרנולריים, בגידולים של הקורטקס באדרנל, וכן בגידולים של תאי סטרומה בשחלות.

הביטוי של calretinin כרוך בהתפתחות נוירונלית

אנליזה מפורטת של הביטוי הרקתי (temporal) או המרחבי (spatial) של calretinin במוח, בוצעה במספר מחקרים וסוכמה במספר סקירות (Arai וחב' ב-J Comp Neurol משנת 1991, Jacobowitz ו-Winsky באותו כתב עת מאותה שנה, Hof וחב' ב-J Chem Neuroanat משנת 1999, ו-Barinka ו-Druga ב-Physiol nRes משנת 2010). נוירונים של הקולטן האולפקטורי נוצרים במהלך כל החיים, והם מאופיינים על ידי תקופות קצרות של ביטוי calretinin בנקודת הזמן הסמוכה שנוירונים אלה בשלים לחלוטין (Wei וחב' ב-Neurosci Lett משנת 2013), אם כי המשמעות של התבטאות זו של calretinin אינה ברורה. בנוסף, בחינת הנוירוגנזה של ההיפוקמפוס בעכברים, מראה שבשלב הבתר-מיטוטי המוקדם של התפתחות תאי גרנולות ב-dentate gyrus, יש ביטוי זמני של calretinin (על פי Brandt וחב' ב-Mol Cell Neurosci משנת 2003). שלב זה תואם את תחילת ההתמיינות והיעדר של calretinin בתאי גרנולות לא-בשלים מוקדמים בתר-מיטוטיים בעכברים טרנסגניים נטולי calretinin (על פי Todkar וחב' ב-Front Mol Neurosci משנת 2012).

תאי Cajal-Retzius

סוג אחד של אוכלוסיית תאים נוירונליים המבטאים calretinin הם תאי Cajal-Retzius (להלן CjR), השונים משמעותית מתאים אחרים המבטאים calretinin במספר היבטים: מיקומם הבלעדי של תאי CjR בשכבה הקורטיקלית הראשונה, הפנוטיפ הגלומטרגי, תפקידם המיוחד בתַּבְנִיתיות של השכבות הקורטיקליות, ועוד. ראוי לציין שלמרות שמספרם של תאי CjR קטן בצורה דרמטית בשלב הבתר-נטלי המוקדם, והם כנראה נעלמים לחלוטין מהקורטקס של מכרסמים, ביונקים גבוהים יותר כולל פרימטים, מספר קטן אך משמעותי של תאי CjR יכול להימצא בנאו-קורטקס של מבוגרים (Martin וחב' ב-Histol Histopathol משנת 1999, Abraham וחב' ב-Neuroscience משנת 2005, ו-Soriano ו-Del Rio ב-Neuron משנת 2005).

נוירונים מבטאי-calretinin במפגעים נוירולוגיים ופסיכיאטריים

השינויים האפשריים בביטוי של חלבונים קושרי סידן במגוון של מפגעים נוירולוגיים ופסיכיאטריים נחקרו בפירוט רב במחקרים רבים. מעניין לציין שלמרות שפוחת מספרם של נוירונים המבטאים את calbidin D28K או נוירונים המבטאים את parvalbumun, הביטוי של calretinin אינו מושפע במצבים של סכיזופרניה, דיכאון משמעותי, מחלת אלצהיימר וטרשת נפוצה (Hof וחב' ב-Turk GNeurosci Lett משנת 1993, Fonseca ו-Soriano ב-Brain Res משנת 1995, Beasley וחב' ב-Biol Psychiatry משנת 2002, Hashimoto וחב' ב-J Neurosci משנת 2003, ו-Clements וחב' ב-Exp Brain Res משנת 2008). במצבים אפילפטיים שונים, הביטוי של calretinin או מספרם של נוירונים נאו-קורטיקליים המבטאים חלבון זה נמצא נורמלי או פוחת באופן פחות בולט מאשר הביטוי של calbindin D28K או של parvalbumin (על פי Garbelli נוחב' ב-Brain Pathol משנת 1999 , וב-Epilepsia משנת 2006, Zamecnik וחב' ב-Brain Res Bull משנת 2006, Aronica וחב' ב-Epilepsy Res משנת 2007, ו-Barinka וחב' באותו כתב עת משנת 2010). לא ברור עדיין האם ה"עמידות" של נוירונים חיוביים ל-calretinin נובעת מתפקידו המוצע של calretinin כחלבון הגנתי, או שמא מיקומם הספציפי של נוירונים אלה בקורטקס המגן עליהם מפני הִדַּרְדְּרוּת.

התפקיד האבחוני של calretinin במחלת Hirschsprung

מחלת Hirschsprung (להלן HD) היא מפגע מולד של מערכת העצבים במעי המאופיינת על ידי חסר של תאי גנגליון מהאזורים התת-ריריים והמייאנטריים של הפלקסוס העצבי. האבחון ההיסטו-פתולוגי של HD מבוסס על חסר של תאים אלה מהרקטום הדיסטלי וחשיבות האבחון קריטית במיוחד בתינוקות וילדים עם בעיות עצירות חמוורות (Kaçar וחב' ב-Turk J Gastroenterol משנת 2012). האבחון של מחלת יכול להיות מאתגר כיוון ששכיחותה נמוכה ולא רבים הפתולוגים המצליחים לאבחן אותה. האבחון אינו תמיד אפשרי עם צביעת המטוקסילין ואאוזין, בגלל מגבלות צביעה זו בזיהוי של תאי גנגליון בלתי בשלים בשכבה התת-רירית שהם קטנים ולא ממויינים במיוחד בתינוקות לאחר הלידה (Memarzadeh וחב' ב-J Indian Assoc Pediatric Surg משנת 2009, Mukhopadhyay וחב' ב-J Clin Diagn Res משנת 2015, Pease וחב' ב-Arch Dis Child משנת 1976, Rabah ב-Arch Pathol Lab Med משנת 2010, ו-Maⱡdyk וחב' ב-Pol J Pathol משנת 2014).

היסטוכימיה של האנזים אצטילכולין אסטראז שימשה רבות מאז שנות ה-70, אך לשיטה זו מגבלות כגון הדרישה לעיבוד של חתכים קפואים של רקמת המעי, קשיים באינטרפרטציה, נטייה לקבלת תוצאות חיוביות כזובות, וקשיים טכניים (Lim וחב' ב-World J Pathol משנת 2014). לפיכך, מעבדות רבות החלו לרכוש ניסיון בצביעה אימונו-היסטוכימית של calretinin, ככלי אבחוני נוסף של HD (על פי Alexandrescu וחב' ב-Int J Clin Exp Pathol משנת 2013, Kapur וחב' ב-Pediatr Dev Pathol משנת 2009, Hiradfar וחב' ב-Iran J Basic Med Sci משנת 2012, ו-Holland וחב' ב-Ann Diagn Pathol משנת 2011).

במחלה זו צביעה אימונו-היסטו-כימית היא בעלת ערך אבחוני בדגימות עם כמות לא מספיקה של submucosa עם מספר זעום של תאי גנגליון. הנוכחות של תאי גנגליון תאמה באופן עקבי עם פיברילים דקים של תאי-עצב חיוביים ל-calretinin ב-lamina propria, ב-muscularis mucosae ובתת-מוקוזה השטחית. במחקר של Barshack ואחרים ב-J Clin Pathol משנת 2004, בו בוצעה הערכה היסטופתולוגית, מקרים עם חסר של תאים גנגליוניים נחשבו אופייניים למחלת .Hirschsprung הגיל הממוצע של הנבדקים היה 19.43 חודשים, כאשר היחס בין זכרים לנקבות היה 2.34:1. כל התינוקות המאובחנים עם מחלה זו נמצאו חסרים ביטוי של calretinin בסיבי עצבים קטנים ב-lamina propria, ב- musularis mucosaeוב-submucosa. כל ערכי הרגישות, הספציפיות, ערך הניבוי החיובי (ppv) וערך הניבוי השלילי (npv) לאישוש האבחון של מחלת הירשפרונג, נקבעו כ-100%. לפיכך, צביעה אימונית של calretinin היא עזר אבחוני רגיש וספציפי בתוספת לבחינה היסטופתולוגית של מחלה זו. צביעת calretinin בוצעה במערכת האוטומטית-ממוחשבת BenchMark-XT VENTANA של חברת Roche עם ערכת זיהוי ultra View Universal DAB תוך שימוש בנוגדנים חד שבטיים כנגד calretinin ((clone SP65.

ערכת הזיהוי ultra View Universal DAB מגלה נוגדנים ממקור ארנבת או עכבר הקשורים לאנטיגן בחתכי רקמה שעברו embedding בפרפין. נוגדנים ראשוניים אלה ממוקמים על ידי נוגדנים שניוניים הקשורים לאנזים Horse reddish peroxidase, כאשר הקומפלקס נצבע על ידי הוספת המצע של האנזים פראוקסידאז והכרומגן DAB או 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride היוצר צבע חום-אדום שניתן לגילוי במיקרוקופ אור. ממצאים אלה אושרו על ידי Alexandrescu וחב' ב- Int J Clin Exp Pathol משנת 2013, ו-Zuikova וחב' ב- Int J Clin Exp Patholמשנת 2015).

השימוש ב-calretinin לאבחון מזותליומה

תוך שימוש באימונוהיסטוכימיה, ניתן להדגים נוכחות calretinin הן במזותליום שפיר כמו גם במזותליומה ממאירה (Saydan וחב' ב-Anticancer Res משנת 2001 ו-Gotzos וחב' ב-Pathol Res Practice משנת 1996, מה שיכול לסייע להבדיל בין מזותליומה וסרטני ריאות שונים (Marchevsky וחב' ב- Arch Pathol Lab Medמשנת 2008). נוגדנים כנגד calretinin יכולים לשמש להבדיל בין סוגי סרטן מוח שונים, תוך שהם צובעים רק תאים עם התמיינות נוירונלית ולא גליאלית. יתרה מכך, התפקיד החיוני של calretinin בשורות תאי מזותליומה הודגם in vitro, וחלבון זה יכול לשמש כיעד פוטנציאלי לגישות תרפויטיות (Blum ו-Schwaller ב-Int J Cancer משנת 2013). נמצא ש-calretinin מבוטא ביתר ברוב הסוגים של מזותליומה ממאירה. פתולוגים משתמשים ב-calretinin כסמן בררני לאבחון מזותליומה, ומתבצע מחקר הרואה בחלבון זה יעד אימונוהיסטוכימי לתרפיה במחלה זו. בשנת 2017 פרסם Selby ב-BMC Cancer מחקר שהראה ש-calretinin יעיל לזיהוי כל הסוגים העיקריים של מזותליומה פרט לסוג הסרקומטואידי. כבר בשנת 2013 התפרסם ב-Int J Cancer מחקרם של Blum ו-Schwaller שהראה ש-calretinin חיוני לשגשוג של תאי מזותליומה ולהישרדותם. השימוש ב-calretinin יעיל כדי להבדיל בין שני הסוגים השכיחים ביותר של סרטן זה, הסוג האפיתליואידי והסוג הדו-פאזי. Calretinin יעיל גם באבחון בין מזותליומה לבין אדנוקרצינומה. כמו סמנים רבים אחרים, calretinin אינו יעיל בזיהוי תאים סרקומטואידיים, אך מזותליומה סרקומטואידית היא הסוג הנדיר ביותר והקשה ביותר לטיפול. רק בערך 31% מתאי הסוג הסרקומטואידי נצבעים באופן חיובי ל-calretinin.

המחקר המצוטט האחרון נערך באוסטרליה ובגרמניה, וכלל 199 מקרים של מזותליומה פלאורלית, ונעשתה בו השוואה בין calretinin לבין mesothelin שהוא סמן מקובל שנמצא בכל תאי מזותליומה. נמצא שביטוי calretinin היה בר-השוואה לזה של מזותלין. שימוש משולב של 2 סמנים אלה הגדיל את הרגישות האבחונית מ66% ל-75%. מחקר משנת 2013 הראה שבמודל של עכברים טרנסגניים נטולי calretinin, הייתה תמותה של תאי מזותליומה תוך 72 שעות וחסימה של שגשוג תאי סרטן זה.

הוראות לביצוע הבדיקה

הבדיקה מתבצעת על ידי צביעה אימונוהיסטוכימית של רקמה ולצורך זה יש לשלוח למעבדה חתכים בעובי של 4 מיקרון, שעברו קיבוע בפורמלין ותהליך embedding בפרפין על גבי זכוכית נושא טעונה חיובית (7.52.5 X ס"מ), בטמפרטורת החדר (מועדף) או בקירור. יש לפסול דגימות רטובות או קפואות או משטחים ציטולוגיים. כמו כן יש לפסול דגימות שלא קובעו בפורמין, עברו embedding בפרפין או כאלו שנשלחו על זכוכית נושא לא טעונה (Cartun וחב' ב- Diagnostic Immunohistochemistry משנת 2019). יש לבצע את תהליך ה-embedding על דגימות שעברו קיבוע, לא מאוחר מ-6 שבועות לאחר הקיבוע.