תבחין שחרור אינטרפרון גמא - Interferon gamma release assay

הדפס

מדריך בדיקות מעבדה
תבחין שחרור אינטרפרון גמא
Interferon gamma release assay
שמות אחרים	IGRA. Interferon-γ release assay
מעבדה	אימונולוגיה בדם
תחום	בדיקה לזיהוי הדבקה סמויה בחיידק שחפת
טווח ערכים תקין	זיהוי שלילי של תגובה חיסונית.
יוצר הערך	פרופ' בן-עמי סלע

מטרת הבדיקה

בדיקה בלתי-ישירה לזיהוי הדבקה ב-M tuberculosis שצריכה להתבצע במשולב עם הערכת סיכון להדבקה זו, רדיוגרפיה של בית החזה, והערכות קליניות נוספות.

מידע קליני

הדבקה לטנטית בחיידק השחפת, אינה גורמת להדבקת אנשים קרובים, והיא תרחיש א-תסמיני שיכול להימשך שנים רבות שעלול להתפתח למחלה פעילה במיוחד באנשים עם מערכת חיסון מדוכאת. הסיבה העיקרית לאבחון של הדבקה לטנטית זו, היא הצורך לאתחל טיפול רפואי שימנע התקדמות למחלה פעילה. באופן היסטורי הגילוי של מחלה לטנטית התבצע בשיטת מבחן ה-tuberculin העורי. למבחן עורי זה יש מספר מגבלות, הכוללות אינטרפרטציה סובייקטיבית, רגישות נמוכה בנבדקים עם מערכת חיסון פגועה, והאפשרות של תוצאות false-positive בנבדקים שטופלו עם BCG, או באלה שנדבקו עם mycobacteria אחרים.

ב-25 ביוני 2010, פרסם CDC הנחיות מעודכנות לבדיקת הדבקה של מבוגרים וילדים עם חיידק השחפת, תוך שימוש ב-IGRAs שאושרו קודם לכן על ידי ה-FDA. הנחיות אלה התפרסמו ב-MMWR. על פי Jacek Mazurek איש ה-CDC, "לפני שנת 2001 מבחן הטוברקולין העורי היה המבחן האימונולוגי המעשי והמסחרי היחיד הזמין בארצות הברית להדבקה עם חיידק השחפת, אך ההכרה ש-INF-γ משחק תפקיד מרכזי בוויסות התגובה החיסונית התאית בתגובה להדבקה האמורה, הביאה לפיתוח IGRAs שיעילותם מוכחת". מאז שה-CDC פרסם בשנת 2005 הנחיות לשימוש ב-QuantiFERON-TB Gold test (או QFT-G), שני IGRAs חדשים אושרו על ידי ה-FDA, לסייע להבדיל בין צורת ההדבקה הגלויה והסמויה: QuantiFERON-TB Gold In-Tube test ו-T-Spot.TB test. לגבי שתי הבדיקות האחרונות, האנטיגנים, השיטות והקריטריונים של אינטרפרטציה של ה-IGRAs החדשים שונים מאלה שהיו בתוקף בבדיקות IGRAs הקודמות. בחינה של שתי הבדיקות החדשות הוכיחה עליונות ברגישות, ספציפיות בהשוואה לבדיקות הקודמות.

ההמלצות להשתמש בבדיקות IGRA מכילות את הנתונים הבאים: יש להעדיף IGRA כשבודקים אנשים מקבוצות אוכלוסייה בהם בדיקת טוברקולין עורית מתקבלת שלילית או גבולית, או אלה שטופלו ב-BCG כחיסון, או כחלק מטיפול אנטי-סרטני. בקבוצה האחרונה, בדיקת טוברקולין מתקבלת באחוז גבוה של false-positive. בדיקות IGRAs או טוברקולין, יכולות להיות מנוצלות במקרים של אנשים שהיו במגע קרוב עם אנשים חולי שחפת, או במקרים של עובדי מערכת הבריאות שהיו במגע קרוב עם מטופלים עם שחפת ידועה. לגבי ילדים מתחת גיל 5 שנים, בדיקת טוברקולין עדיפה על בדיקת IGRA.

בדיקות IGRA

IGRA היא בדיקה בשימוש לאבחון מספר מחלות מידבקות, ובעיקר שחפת. ההפרשה של IFN-γ, מבוססת על העובדה שלימפוציטים T יפרישו IFN-γ כאשר הם נחשפים לאנטיגנים ספציפיים. בדיקה זו פותחה בעיקר בהקשר לבחון הדבקה ב- tuberculosis, אך בתאוריה יכולה לשמש לאבחון מחלות אחרות בהן מופעלת חסינות-תאית, כגון cytomegalovirus ו-leishmaniasis. לדוגמה, במטופלים עם תגובות לא רצויות לתרופות שונות, גירוי של לימפוציטים היקפיים עם תרופה מסוימת הגורמת לתגובה עורית, מביאה לתוצאה חיובית בטסט זה במחצית של התרופות שנבחנו (Halevy וחב' ב-J Am Acad Dermatol משנת 2005). יש כרגע שני מבחנים למדידת שחרור של IFN-γ לאבחון שחפת: בדיקת QuantiFERON-TB Gold הידועה גם כ- QFT- Gold in tube (עם רישוי לשימוש בארצות הברית, אירופה יפן וסין), ובדיקת -TBT Spot.

הבדיקה הראשונה היא אנזימטית והתוצאה (חיובית או שלילית) נמדדת על בסיס עוצמת הצבע המתקבל, ועשויה לסייע באבחון של שחפת חבויה. בדיקת QFT- Gold in tube מודדת את כמות IFN-γ המיוצרת בתגובה ל-2 אנטיגנים של חיידק השחפת הידועים כ-EAST-6 ו-CFP-10, הנבדלים מהאנטיגנים המופיעים ב-BCG ובחיידקי מיקובקטריה אחרים שאינם tuberculous mycobacteria. דגימת הדם לביצוע בדיקה זו נאספת במבחנות ייעודיות.

הבדיקה השנייה, T Spot-TB, קובעת את המספר הכללי של מושבות של effector T cells אינדיבידואליים המבטאים ומפרישים INT-γ. התוצאה של מספר מושבות גבוה או נמוך מעל רף מסוים, מסייעת לאבחן האם הנבדק נושא את חיידק השחפת (דהיינו חיובי או שלילי לגילוי שחפת חבויה). ההוריות לביצוע הבדיקה האחרונה עדיין נתונות במחלוקת, והבדיקה נמצאת בהערכה לאבחון שחפת חבויה במטופלים נשאי HIV ולנבדקים מדוכאי מערכת החיסון מסיבות אחרות, בהם לרוב בדיקת Mantoux העורית מתקבלת שלילית (Lawn וחב' ב-BMC Infect Dis משנת 2007).

ביצוע בדיקת QuantiFERRON-TB Gold In-Tube test או QFT-GIT

בדיקה זו עושה שימוש ב-3 מבחנות מיוחדות שלכל אחת מהן מוכנס נפח של 1 מ"ל דם.

1. מבחנה אפורה: ביקורת שלילית
2. מבחנה אדומה: אנטיגנים של שחפת
3. מבחנה סגלגלה: ביקורת מיטוגן.

מיד לאחר נטילת הדם כל המבחנות אליהן מוסף הדם, צריכות לעבור במהירות טלטול מסיבי לפחות 10 פעמים, לוודא שכל הדופן הפנימית של המבחנות באה במגע עם הדם. טלטול ראוי חיוני לוודא שהאנטיגנים הספוחים לדופן המבחנות יבואו במגע ויגיבו עם הדם. לאחר פרק זמן שאינו עולה על 16 שעות מנטילת הדם, באה תקופת הדגרה של 16–24 שעות, ולאחריה ELISA מבוצעת על פלזמה מופרדת, תוך שימוש בפלטת microplate שהוכנה במיוחד. בשלב זה נמדדת ה-optical density, ותוכנה אלגוריתמית המתייחסת לערכי ה-cutoff של ה-FDA, משווה את תוצאות ה-OD בכל אחת משלוש המבחנות. תגובה איכותית חיובית, שלילית או בלתי מוחלטת, מתקבלת מניתוח ערכים אלה.

תוצאות בלתי מוחלטות יכולות לנבוע מסיבות שונות: ה-OD של מבחנת הביקורת החיובית יכול להיות מתחת לסף הגילוי, מה שמרמז שדמו של הנבדק לא הגיב עם המיטוגן. סיבה אחרת היא שה-OD של מבחנת הביקורת השלילית מתקבל גבוה מדי, מה שמצביע על רמות רקע גבוהות מדי של INF-γ. גם דיכוי מערכת החיסון של הנבדק יכול לגרום לתוצאות בלתי מוחלטות. גיל גבוה במיוחד, הדבקה פעילה, או טיפול כנגד מיקובקטריום, הן סיבות נוספות לתוצאה בלתי מוחלטת. סיבות טכניות שעלולות להניב תוצאות בלתי-מוחלטות הן שטיפות לא ראויות של פלטות ה-ELISA, זמן רב מדי החולף מנטילת הדם עד לתחילת הפרוצדורה, או טלטול לא ראוי בתחילתה.

הבדיקה הידועה כ-QuantiFERON-TB gold Plus (להלן QFT-Plus), היא בדיקת IGRA הבוחנת את התגובה החיסונית התאית ל-2 אנטיגנים של M tuberculosis, הידועים כ-ESAT-6 ו-CFP-10, על ידי מדידת רמת INF-γ בפלזמה. שני חלבונים אלה אינם מופיעים בכל הזנים של BCG, וכן הם אינם מופיעים ברוב ה-mycobacteria שאינם טוברקולוזיים, עם יוצאי הדופן של שלושה זנים, M szulagi ,M kansasii ו-M marinum. אנשים המודבקים עם חיידקים של קומפלקס M tuberculosis, הכוללים בנוסף לחיידק האחרון גם את M microti ,M caprae ,M canetti וכן את M bovis ואת M africanum, ואלה מכילים בדמם לימפוציטים המזהים את 2 האנטיגנים האמורים, מה שגורם גם להם להפריש INF-γ. ציטוקין זה מזוהה בדיעבד ומוערך באופן כמותי על ידי INF-γ enzyme-linked immunosorbent assay.

בהדבקה עם M tuberculosis, תאי T מסוג +CD4 משחקים תפקיד מרכזי בבקרה החיסונית על ידי הפרשת INF-γ. בגרסה קודמת של בדיקת QFT-Plus, בדיקת QuantiFERON-TB Gold In-Tube (להלן QFT-Gold) זיהתה רק INF-γ המופרש מתאי T +CD4. ראיות עדכניות תומכות כעת גם בתפקיד של תאי +CD8 המייצרים אף הם INF-γ בהגנה מפני חיידק השחפת, זאת על ידי גירוי של מקרופאגים לדכא את השגשוג של החיידק, להרוג תאי מודבקים ולהמיס ישירות את החיידק בתוך התאים המודבקים. תאי T +CD8, הספציפים לחיידק השחפת והמייצרים INF-γ, זוהו בנבדקים עם שחפת לטנטית, כמו גם באנשים עם שחפת פעילה. שני האנטיגנים, ESAT-6 ו-CFP-10, תוארו באופן שכיח יותר בחולים בשחפת פעילה מאשר בנבדקים עם הדבקה סמויה בחיידק, ונמצאו גם במבוגרים וילדים נשאי HIV החולים גם בשחפת.

מבחן QFT-Plus עושה שימוש בשתי מבחנות (TB1 ו-TB2) המכילות אחד משני האנטיגנים של שחפת: ESAT-6 ו-CFP-10,על מנת לגרום לתגובה של יצירת והפרשת INF-γ על ידי תאי T מסוג +CD4. אחת מ-2 המבחנות, (TB2), מכילה סדרה של פפטידים נוספים נגזרי ESAT-6 ו-CFP-10, שנועדים באופן ספציפי לעודד תגובה של תאי T מסוג +CD8.

הביצוע והעקרונות של בדיקת T-spot.TB

לצורך הבדיקה, דם מלא נאסף למבחנת ליתיום הפארין (פקק ירוק) או סודיום ציטראט (פקק תכלת), עד למילוי 8 מ"ל דם. לאחר נטילת הדם, יש לסיים את עיבוד הדגימה תוך 8 שעות, אלא אם כן הדם מעובד עם ראגנט T-Cell Xtend, המאפשר עיבוד הדגימה עד 32 שעות מנטילת הדם. במעבדה, התאים המונו-נוקלאריים של הדם ההיקפי המוגדרים כ-PBMCs או peripheral blood mononuclear cells מופרדים במדיום הידוע כ-Ficoll-Hypaque, נשטפים ונמנים.

תאי PBMC המבודדים, מוכנסים לבארות של פלטות microtiter שהוכנו במיוחד, שם הם נחשפים לביקורת חיובית, לביקורת שלילית ול-2 האנטיגנים של חיידק השחפת. בארות הביקורת החיובית מכילות את המיטוגן מ-phytohemagglutinin המגרה תאי-T באופן לא-ספציפי לייצר INF-γ. לאחר הדגרה של 16–20 שעות, INF-γ המופרש נקשר לנוגדנים כנגדו המצפים את תחתית הבארות. נוגדן שני המצומד לאנזים alkaline phosphatase, נקשר ל-INF-gamma-הקשור לנוגדנים כנגדו הספוחים לבארות, ואז מוסף המצע לאנזים המצומד ליצירה של נקודה בלתי מסיסה על פני הבאר. נקודות אלו נספרות באופן המאפשר לפרש את כמות ה-INF-gamma המופרשת מתאי PBMCs (על פי Mazurek וחב' ב-MMWR Recomm Rep משנת 2010). בדומה לבדיקת QFT-GIT, תוצאות בלתי מוחלטות עלולות להתקבל בגלל חוסר תגובה בבאר הביקורת החיובית, או כתוצאה מרמת רקע גבוהה של INF-γ. גורמים טכניים או קליניים עלולים לגרום לתוצאות בלתי מוחלטות, כגון ביצוע לא מדויק של הבדיקה כולל שטיפות לא זהירות, וכן במקרה של נבדק עם מערכת חיסון מדוכאת.

תיאור סכמטי של בדיקת T-spot.TB

צעד ראשון: דגימת דם ורידי למבחנת הפארין, (פקק ירוק) או למבחנת ציטראט (פקק תכלת), ומתוף הדם הנדגם מבודדת תת-קבוצה של תאי דם לבנים הידועים כ-peripheral blood mononuclear cells או PBMC. התאים עוברים שטיפה ונמנים.

צעד שני: מספר סטנדרטי של תאים מוספים לפלטה מיוחדת, ועוברים גירוי עם שני אנטיגנים ספציפיים לשחפת, ESAT-6 ו- .CFP10תאם המגיבים לאנטיגנים אלה מפרישים INF-γ.

צעד שלישי: נוגדנים כנגד INF-γ משמשים לצורך קישורם באופן ישיר ל- INF-γ כאשר זה מופרש מהתאים. נוגדן שניוני אליו מוצמד אנזים מוסף ונקשר ל- .INF-γ

צעד רביעי: ראגנט זיהוי מוסף ומגיב עם הנוגדן אליו מצומד האנזים. תגובה זו מייצרת נקודות שהן טביעת האצבעות לאתרי ההפרשה של INF-γ. נקודות אלה נספרות.

אינטרפרטציה

מבחן בלתי ישיר להדבקה עם M. tuberculosis, שצריך להתבצע בשילוב עם הערכת סיכונים, רדיוגרפיה של הריאות, והערכות קליניות ואבחוניות אחרות. תאי T מרוגשים כנגד אנטיגנים של חיידק השחפת, ותאי effector T המשופעלים מסוג +CD4 ו-+CD8, מייצרים את הציטוקין INF-γ, כאשר הם מגורים על ידי אנטיגנים אלה. מבחן T-spot.TB פועל על בסיס הטכנולוגיה הידועה כ-enzyme-linked immunospot (להלן ELISPOT) כדי למנות את תאי-T המרוגשים על האנטיגנים של החיידק, על ידי לכידת INF-γ בסביבה הקרובה של תאי T שהפרישו את הציטוקין הזה. המבחן מתבצע בבארות של פלטת microtiter, כאשר בכל באר 250 אלף תאי T.

תוצאה חיובית בודדת במבחן זה לא צריכה לשמש כשלעצמה לאבחון של שחפת לטנטית. כאשר התוצאה של הבדיקה מתקבלת חיובית, צריך להתעורר חשד של הדבקה סמויה בחיידק. תוצאה חיובית בנבדקים עם סיכון פחות לשחפת צריכה להישקל בזהירות, תוך חזרה על הבדיקה בדגימה חדשה כפי שהומלץ בשנת 2017 על ידי ה-ATS/IDSA/CDC. תוצאה false-positive יכולה להתקבל בנבדקים עם הדבקה קודמת עם M marinum ,M kanasaii או עם M szulgai.

תוצאה שלילית במבחן זה הבאה לביטוי בחסר הפרשה של INF-γ, עלולה להתקבל גם באלה שהודבקו עם M tuberculosis, אם כי תוצאה שלילית בודדת אינה שוללת הדבקה זו. בנבדקים עם דרגת סיכון גבוהה להידבקות בחיידק השחפת, ויש לחזור על הבדיקה לפי הנחיות ה- ATS/IDSA/CDC משנת 2017.

תוצאה בלתי-מוגדרת מסיבה של ערך מיטוגן נמוך: תוצאות בלתי מוגדרות בגין רמת הפרשה נמוכה של INF-γ, יכולות לנבוע ממספר נמוך של לימפוציטים, או מפעילות נמוכה של לימפוציטים, או בגלל אי היכולת של הלימפוציטים של הנבדק לייצר INF-γ.

תוצאה בלתי מוגדרת מסיבה של רמה גבוהה של INF-γ במבחנת הביקורת השלילית. תופעה זו יכולה להופיע בהשפעת נוגדנים הטרופיליים או מסיבה לא ספציפית של INF-γ בצירקולציית הדם של הנבדק. יש לחזור על הבדיקה במקרה כזה.

אמצעי זהירות שיש לנקוט: תוצאה שלילית בבדיקת QFT-Plus, אינה שוללת שחפת או לפחות הידבקות בחיידק השחפת. תוצאה שלילית כזובה (false negative) יכולה להתקבל בהתאם לשלב ההדבקה, (כלומר דגימה המתקבלת לפני להתפתחות של תגובה חיסונית תאית, או בגלל מצב של תחלואה נוספת מקבילה המשפיעה על התפקוד החיסוני, או בגלל כשל בביצוע הבדיקה). בנוסף, נוגדנים הטרופילים או ייצור לא ספציפי של INF-γ מסיבות דלקתיות אחרות, יכולים למסך תגובות ספציפיות לפפטידים ESAT-6 או CFP-10. עיכוב בהדגרה עלול לייצר תוצאות שליליות-כזובות, ואי-היצמדות לפרטים טכניים יכולה להשפיע על היכולת לגלות תגובת INF-γ משמעותית. לכן מומלץ לפרש תוצאה חיובית במבחן QFT-Plus בביצוע הערכה קלינית נוספת, למחלת שחפת פעילה כגון בדיקת משטח מתגים acid fast ותרבית, ובדיקת רנטגן של בית החזה.

ההשפעה של ספירת הלימפוציטים על אמינות הבדיקה אינה ידועה, ואף לא ברור מהו המספר המינימלי של לימפוציטים הנחוץ לקבלת תוצאה אמינה (Moon וחב' ב-J Clin Microbiol משנת 2017, ו-Telisinghe וחב' ב-Int J Tuberc Lung Dis משנת 2017).

מחקרים שהתבצעו בחולים מודבקים עם חיידק שחפת ולוקים גם בדלקת מפרקים שגרונית, בארתריטיס פסוריאטית או ב-ankylosing spondylitis, קבעו מבדיקת IGRA עדיפות על בדיקות טוברקולין לפני שמתחילים טיפול עם Golimumab, הנוגדן המכוון נגד TNF-α.

במדינות מערביות מתועשות עם רמת חיים גבוהה, מבחני IGRAs החליפו באופן ניכר את מבחן הטוברקולין העורי הקלאסי כדי לאבחן שחפת סמויה. עדיין בעייתי הפירוש של המשמעות הקלינית של הפרשת IGRAs ברמה נמוכה. במחקר שתפרסם הופיעו ממצאים על בדיקות חוזרות לזיהוי הדבקה עם חיידק השחפת בקרב עובדי מערכת הבריאות במרכז הרפואי Cleveland Clinic. בשנים 2007–2010 נבדקו 52 רופאים ואחיות שנמצאו שליליים בבדיקת IGRA טרם תחילת עבודתם במרכז רפואי זה, אך נמצאו חיוביים במבחן זה במהלך בדיקות שבוצעו בהם במהלך עיסוקם ב-Cleveland Clinic. התוצאות החוזרות של ערכי IGRA נמוכים או שווים מ-IU/ml ב-71% מתוך 52 העובדים האמורים, וערכים של 0.35-0.5IU/ml ב-37% מתוכם, עם ערך חציוני של 0.63IU/ml. ל-44% מתוך 52 עובדי מערכת הבריאות היה רקע של חיסון עם BCG, ובאף לא אחד מהם התגלתה מחלת שחפת פעילה. ארבעים ושלושה מתוך 52 העובדים האמורים, נמצאו בהערכה נוספת, ו-26 מהם (61%) הצטוו להתחיל טיפול עם isoniazid. בעשרה עובדים שלא טופלו עם isoniazid (עם ערך IGRA ממוצע של IU/ml0.42), חזרו על בדיקת IGRA בתקופה שבין 1–6 חודשים לאחר מכן, וב-8 מהם התקבלה תוצאה שלילית.

ראו גם

• חזרה לדף מדריך בדיקות מעבדה
• בדיקות מעבדה - בדיקות ביוכימיות
• בדיקות מעבדה - מחלות בקטריאליות/ זיהום בקטריאלי-אלח-דם

המידע שבדף זה נכתב על ידי פרופ' בן-עמי סלע, המכון לכימיה פתולוגית, מרכז רפואי שיבא, תל-שומר;
החוג לגנטיקה מולקולארית וביוכימיה, פקולטה לרפואה, אוניברסיטת תל-אביב (יוצר הערך)