כניסה 
עקבו אחרינו בפייסבוק Neuronal ceroid lipofuscinosis
| מדריך בדיקות מעבדה | |
| ' | |
|---|---|
| Neuronal ceroid lipofuscinosis | |
| שמות אחרים | CLN1 ,CLN2 ,NCL ,PPT1 ,TPP1, NCLs |
| |
| מעבדה | כימיה בטיפות מיובשות ובלויקוציטים. |
| תחום | פיגור התפתחותי. |
 | |
| טווח ערכים תקין | 1 Palmitoyl - protein thioesterase גדול מ-10.0 ננומול/מ"ל/שעה. Tripeptidyl peptidase 1 - גדול מ-27 ננומול/מ"ל/שעה. |
| יוצר הערך | פרופ' בן-עמי סלע |
מטרת הבדיקה
אישוש של האבחון הביוכימי של שני lipofuscinoses, CLN1 ו-CLN2 בדגימות דם מלאות. הבדיקה אינה מתאימה לגילוי נשאים. מעקב אחר תוצאות א-נורמליות ביוכימיות או כאלו המתקבלות חשודות על ידי מיקרוסקופ אלקטרוני ל-neuronal ceroid lipofuscinoses (NCL). ביסוס אבחון מולקולרי למטופלים עם NCL. זיהוי של וריאציות בגנים הידועים ככאלה הכרוכים עם NCL, מה שמאפשר ניבוי של בני משפחה בסכנה למחלה זו (Copper וחב' ב-Biochim Biophys Acta משנת 2015). בדיקת הדם ראויה לילדים בני 0-4 שנים עם תסמינים המתאימים ל-neuronal ceroid lipofuscinosis.
מידע קליני
ה-neuronal ceroid lipofuscinoses (להלן NCL) מהווה קבוצה של מפגעים נוירו-ניווניים העוברים הורשה רצסיבית הכרוכה בקטבוליזם של חלבונים ליזוזומליים. קלינית הם מאופיינים על ידי איבוד ראייה, פרכוסים, נסיגה התפתחותית, שינויים התנהגותיים, מפגעי תנועה, ובשוני ממפגעים נוירו-ניווניים אחרים יש בהם הצטברות של חומר פלואורסצנטי במוח וברקמות (Hofmann ו-Peltonen ב-The neuronal ceroid lipofuscinoses משנת, 2017). למרות שלפחות 13 גנים זוהו, ה-NCL מקוטלג מסורתית בהתבסס על גיל הופעת התסמינים: אינפנטילי, אינפנטילי מאוחר, ילדותי ומפגע במבוגרים. הצורה האינפנטילית (CLN1) והצורה האינפנטילית המאוחרת (CLN2) נגרמות על ידי מפגעים באנזימים palmitoyl-protein thioesterase 1 (להלן PPT1) וב-tripeptidyl peptidase 1 (להלו TPP1), בהתאמה, כמו גם חסר ב-cathepsin D. החסר של tripeptidyl peptidase הוא גם סיבה ל-7spinocerebellar ataxia אוטוזומלי רצסיבי. ילדים הנפגעים על ידי ה-NCL האינפנטילי הם בעלי גדילה נורמלית והתפתחותית עד גיל 6-12 חודשים. גדילה איטית של הראש מתרחשת בגיל 9 חודשים, ומלווה על ידי ניוון פסיכו-מוטורי, פרכוסים וניוון מתקדם של המקולה בעין המוביל לעיוורון בגיל שנתיים. CLN1 נגרם על ידי חסר באנזים הליזוזומלי palmitoyl-protein thioesterase 1, המבקע חומצות שומן ארוכות-שרשרת (בדרך כלל פלמיטאט) משיירי ציסטאין. בחינה במיקרוסקופ אלקטרוני מראה משקעים אוסמופיליים מגורגרים ברוב סוגי התאים. אנזים זה אמור לשחק תפקיד פעיל בתהליכים תאיים רבים כולל אפופטוזיס, אנדוציטוזיס ומטבוליזם של ליפידים. הצורה האינפנטילית המאוחרת של CLN הידועה כ-CLN2, נגרמת בראש ובראשונה על ידי חסר של האנזים הליזוזומלי tripeptidyl peptidase 1, המבקע תלת-פפטידים מהקצוות ה-N טרמינלים של פולי-פפטידים. הנזק הרקמתי נגרם מההצטברות של חומר אגירה הנצפה במיקרוסקופ האלקטרוני. מתרחש אובדן רחב של רקמה נוירונלית באזורי המוחון וההיפוקמפוס. תחילת התסמינים מתרחשת בגיל 2-4 שנים, ומלווה על ידי פרכוסים, שיגשון (אטקסיה) פיגור פסיכו-מוטורי, מיוקלונוס (או ריטוט שרירי ותנועה קצרה, פתאומית ולא רצונית של שריר או של קבוצת שרירים), איבוד ראייה והפרעות בדיבור. אסטרטגיית האבחון תלויה בגיל הופעת התסמינים, וכאשר אלה מופיעים בין הגילים 0-4 שנים, מדידת האנזימים PPT1 ו-TPP1 היא צעד ראוי התחלתי. במטופלים אחרים החשודים ל-NCL, זמינה בדיקה גנטית מולקולרית של הגנים הרלוונטיים ל-CLN, כגון הגן Neuronal Ceroid Lipofuscinosis gene (או NCLGP) הפגוע במחלת Batten. תוצאות א-נורמליות אינן מספיקות לבסס אבחון משל מחלה מסוימת, ויש צורך לבצע אנליזה מולקולרית-גנטית. חסר באנזים tripeptidyl peptidase 1 יכול להיות אינדיקציה של 7spinocerebellar ataxia אוטוזומלית-רצסיבית. מטופלים עם אללים פסאודו-חסרים יכולים להראות פעילות פחותה של אנזים זה. רמות האנזים עשויות להיות נורמליות במטופלים המקבלים אותו כתרפיה, או באלה עם השתלה של תאי-אב המטופויאטיים (Kohlschutter וחב' ב-CNS Drugs משנת 2019).
Neuronal ceroid lipofuscinosis היא משפחה של לפחות שמונה מחלות אגירה ליזוזומליות נוירו-ניווניות נפרדות, הנובעות מהצטברות יתרה של ליפו-פיגמנטים (lipofuscin) ברקמות הגוף (Mole ו-Williams ב-Neuronal Ceroid-Lipofuscinoses. University of Washington, Seattle משנת 1993). ליפופיגמנטים אלה בנויים משומנים וחלבונים, ונצבעים בגוון ירקרק-צהוב תחת מיקרוסקופ UV. ליפופוסקינים מופיעים בתאי עצב, ובאיברים רבים כגון בכבד, בטחול בשריר הלב ובכליות. המאפיין הקלאסי של קבוצת המפגעים של אגירה ליזוזומלית נוירו-דגנרטיבית הידועה כ-neuronal ceroid lipofuscinoses הוא התקדמות התסמינים כגון האיבוד של יכולת מוטורית ופסיכולוגית עם ההצטברות התוך תאית של lipofuscins (Pardo וחב' ב-Am J Pathol משנת 1994, ו-Narayan וחב' ב-Brain משנת 2004). בארה"ב ובצפון אירופה תדירות המקרים היא מעט יותר מאשר 1 לכל 10,000 איש (Vesa וחב' ב-Mol Biol Cell משנת 2002). ארבעה אבחונים קלאסיים זכו לתשומת הלב הגדולה ביותר של החוקרים, והם גיל הופעת התסמינים, משך התסמינים, הגיל הצעיר ביותר של התסמינים כגון עיוורון או פרכוסים, וצורות ההצטברות של lipofuscin. בווריאנט האינפנטילי המוקדם (הידוע גם כ-Santavuori-Haltia), המטופלים נראים נורמלים בלידתם, אך איבוד ראייה מוקדם המביא לעיוורון מוחלט של הרשתית בגיל שנתיים הוא האינדיקטור הראשון של המחלה, כאשר בגיל 3 שנים מגיע שלב וגטטיבי ובגיל 4 שנים מוכח מוות מוחי על ידי אנצפלוגרמים איזואלקטריים. הווריאנט האינפנטילי המאוחר בא לביטוי בדרך כלל בין הגילים 2-4 שנה עם פרכוסים ודעיכה בראייה. הגיל המקסימלי לפני המוות של וריאנט זה הוא 10-12 שנה (Hellstein וחב' ב-Eur Mol Bio Org J משנת 1996, Kim וחב' ב-Hum Mol Genet משנת 2006, Ju וחב' ב-J Med Genet משנת 2002, ו-Isosomppi וחב' ב-Hum Mol Genet משנת 2002). שכיחות וריאנט Juvenile NCL (או JNCL, מחלת Batten) היא 1 ל-100,000, ומתחילה לרוב בין הגילים 4-10 שנה, כאשר התסמינים הראשונים הם איבוד ראייה משמעותי כתוצאה מדיסטרופיה של הרשתית, עם פרכוסים, התנוונות פסיכולוגית, ולבסוף מוות בין שנות ה-20 או ה-30 (Persaud-Sawin וחב' ב-Hum Mol Genet משנת 2002). הווריאנט הבוגר של NCL (או ANCL, מחלת Kuf) מתבטאת בתסמינים מתונים יותר בסביבות גיל 30 עם מוות המתרחש 10 שנים מאוחר יותר. כל המוטציות הנכרכות עם מחלה זו קשורות לגנים הפועלים במטבוליזם של סינפסות עצביות. מחלות NCLs בילדות הן לרוב אוטוזומליות רצסיביות כאשר המוטציות השכיחות ביותר מופיעות בגן CLN3 הממוקם בזרוע הקצרה של כרומוזום 16 או 16p12.1. בהורשה אוטוזומלית דומיננטית, כל אלה המקבלים עותק אחד של הגן החולה, מפתחים את המחלה. כתוצאה מכך, הנשאים של גן זה הם פגועים.
מידע של בדיקה גנטית
הבדיקה עושה שימוש ב-next-generation sequencing לגלות נוקלאוטיד בודד ומספר וריאנטים ב-16 גנים הכרוכים עם neuronal ceroid lipofuscinosis כגון: ATP13A2 ,CLN3 ,CLN5 ,CLN' ,CLN8 ,CTSD ,CTSF ,CTSK ,DNAJC5 ,GRN ,KCTD7 ,MFSD8 ,PANK2, PPT1 ,SGSH ,TPP1 (על פי Mole ו-Cotman ב-Biochim Biophys Acta משנת 2015).
מדידות אבחוניות המשמשות במקרים של NCLs כוללות
דיגום של עור או של רקמות שונות תחת המיקרוסקופ כדי לזהות משקעים אופייניים של NCL. משקעים אלה יכולים להימצא ברקמות שונות רבות, כגון עור, שריר, עפעפיים, חלחולת. גם דם יכול לשמש לצורך אבחון. משקעים אלה יכולים להיות בעלי צורות אופייניות, בהתאם לווריאנט לו הם שייכים: משקעים אוסמופיליים גרנולריים הם לרוב אופייניים ל-INCL, בעוד שמשקעים curvilinear, או אלה דמויי טביעת אצבע, או כאלה בעלי צורה מעורבת נמצאים בדרך כלל ב-LINCL או ב-JNCL וב-ANCL, בהתאמה. בדיקת אלקטרואנצפלוגרם או EEG מתבצעת על ידי הדבקה של טלאים ייחודיים על הראש על מנת לקלוט זרמים חשמליים בתוך המוח, מה שמאפשר קליטת פעילות חשמלית בעת פרכוסים. מדידות חשמליות בעיניים: אלקטרו-רטינו-גרם מסוגל לגלות בעיות עיניים שונות, השכיחות ב-NCLs בילדות.
סריקות מוחיות: אמצעי הדמיה מאפשרות שינויים מוחיים, ואמנם CT היא בדיקה מקובלת. בדיקת MRI העושה שימוש בשדות מגנטיים ובגלי רדיו במקום קרינה האופיינית ל-CT, ונותנת תמונה של המוח.
מדידות אנזימטיות: מאפשרות לגלות חסר באנזימים ליזוזומליים ספציפיים, במקרים של סוגים אינפנטילים ואינפנטילים מאוחרים של NCL.
מוטציות
הצורה האינפנטילית: מוטציות nonsense ו-frameshift בגן CLN1, הממוקם ב-1p32 משרות תמיד ICLN קלאסי (Sharp וחב' ב-Hum Mol Genet משנת 1997), בעוד שמוטציות missense אחדות נכרכו עם ANCL בנוסף לצורות האינפנטיליות והאינפנטיליות המאוחרות. מוטציה זו גורמת לצורה חסרה של האנזים הליזוזומלי palmitoyl protein thioesterase 1 (Lyly וחב' ב-BMC Cell Biol משנת 2007). האנזים התקין PPT1 הוא פוליפפטיד בעל 306 חומצות אמינו שבצורה אופיינית מתועל לחדור לליזוזומים על ידי מסלול המתווך על ידי הקולטן של mannose 6-phosphate (או M6P). החלבון אמור לתפקד על ידי הסרת שיירי פלמיטאט על ידי ביקוע של קשרי thioester בחלבונים עם קבוצות s-acylated, ובכך שבירתם. פוליפפטידים פגומים אינם מסוגלים לצאת דרך הרטיקולום האנדופלזמטי כפי הנראה כתוצאה מ-misfolding. הגן PPT האנושי מראה הומולוגיה של 91% לזה של PPT מבקר, והומולוגיה של 85% לזה של חולדה, מה שמצביע על כך שהגן PPT משומר ביותר ומשחק תפקיד חיוני במטבוליזם התאי. בנוסף, הצטברות של PPT1 פגום ברטיקולום האנדופלזמטי גורם להפרשה מוגברת של +Ca2. אירוע משנה הומאוסטאזיס זה גורם להגברת החדירות של הממברנה המיטוכונדריאלית ולשפעול של caspase-9, מה שמביא להצטברות של poly(ADP-ribose) polymerase וכתוצאה מכך לאפופטוזיס.
הצורה האינפנטילית המאוחרת: הגן CLN2 מקודד לחלבון במשקל מולקולרי של 46 קילו-דלטון, הקרוי tripeptidyl peptidase I (או TPP1), המבקע תלת-פפטידים מקבוצות amine טרמינליות, של חלבונים בלתי מקופלים באופן חלקי (Gupta ו-Hofmann ב-Mol Psychiat משנת 2002). מוטציות בגן זה מביאות להופעת הפנוטיפ LINCL (Gao וחב' ב-Am J Hum Genet משנת 2002). באפריל 2017 ה-FDA אישר טיפול עם cerliponase alfa (שם מותג Brineura) כטיפול ל-NCL. מדובר בתרפיה של הכנסת אנזים בטכנולוגיה של recombinant DNA. תכשיר זה מכוון להאט את איבוד היכולת ללכת, בילדים תסמיניים בגיל 3 שנים ובמבוגרים עם הצורה האינפנטילית המאוחרת של neuronal ceroid lipofuscinosis type 2. תכשיר זה מוחדר ל-CSF על ידי אינפוזיה ועל ידי צנתר בראש (intraventricular access device).
כל המוטציות הגורמות לווריאנט ה-juvenile של NCL מתרחשות בגן CLN3 הממוקם בעמדה 16p12, ואלה מוטציות הידועות כגורמות JNCL, כאשר 85% נובעות משמט של 1.02kb עם אובדן של חומצות אמינו 154-438, בעוד ש-15% הנותרים נובעים ממוטציה נקודתית או מ-frameshift mutations. הגן CLN3 מקודד לחלבון שכנראה משחק תפקיד בהומאוסטאזיס של ה-pH הליזוזומלי. יתרה מכך, מחקרים עדכניים מדגישים את תפקיד חלבון זה בחסר של cathepsin D. צורת ה-NCL הבוגר הדומיננטית: בין 1.3 ו-10% הם צורת המחלה הבוגרת. תסמיני צורה זו מופיעים בגילים 6-62 שנה. שתי תת-קבוצות תוארו בצורה הבוגרת: אפילפסיה מיוקלונית מתקדמת (type A), ושיטיון עם הפרעות מוטוריות כגון תסמינים אקסטרה-פירמידליים במוחון ודיסקינזיה (type B). שלא בדומה ל-NCLs אחרים, אין בצורה הבוגרת ניוון של הרשתית. מבחינה פתולוגית, ה-ceroid-lipofuscin מצטבר בעיקר בנוירונים ומכיל את תת-יחידה C של ה-ATP synthase המיטוכונדריאלי. שתי משפחות בלתי-תלויות נמצאו עם מוטציות בגן DNAJC5, כאשר אחת ממשפחות אלו הכילה מוטציה עם transversion והמשפחה השנייה הכילה מוטציית שמט.
טיפול
מדכאי מערכת החיסון: בשנת 2007 דיווחו David Pearce וחב' שהתכשיר Cellcept, מדכר חיסון המשמש לרוב במקרים של השתלות מח-עצם, עשוי להיות יעיל בהאטה של התקדמות של juvenile NCL.
Cstagon: בשנת 2001 תכשיר ששימש לטיפול ב-cystinosis, נמצא יעיל בטיפול בצורה האינפנטילית של NCL. ניסויים ראשוניים דיווחו שתכשיר זה ניקה באופן מוחלט חומר אגירה מתאי דם של 6 מטופלים, וכן האט את הניוון נוירולוגי המהיר של NCL אינפנטילי.
תאי אב: באוקטובר 2005 ה-FDA אישר ביצוע ניסוי קליני ב-phase 1 לבחינת היעילות של טיפול עם תאי-אב נוירליים בצורה האינפנטילית והאינפנטילית המאוחרת של מחלת Batten. מדכא הכאבים flupirtine, המשמש במספר מדינות באירופה, הוצע כמאט של התקדמות NCL, בעיקר של צורות האינפנטיליות והאינפנטיליות המאוחרות, אף ניסוי לא אישר הנחה זו. תכשיר זה משמש בגרמניה, באוניברסיטת Duke, ובבית חולים לילדים בטורונטו. בניסוי באורגון טיפול זה יהיה הראשון בהשתלת תאי-אב עובריים שיתבצע בבני-אדם. תרפיה זו מפותחת על ידי חברת Stem Cells Inc וישתתפו בה 6 מטופלים. ניסויים בפינלנד שבחנו את היעילות של השתלות מח-עצם ב-NCL אינפנטילי הניבו תוצאות מאכזבות.
תרפיה גנית: תרפיה זו תוך שימוש בנגיף Adeno כווקטור ידוע כ-AAV2CUhCLN2 החלה ביוני 2004 בניסיון לטפל ב-NCL אינפנטילי מאוחר. הניסוי נערך במרכז הרפואי של אוניברסיטת Cornell. במאי 2008 דווח שתרפיה גנית זו נמצאה בטיחותית ובממוצע האטה משמעותית את התקדמות המחלה לאחר מעקב של 18 חודשים. ניסוי שני שנערך ב-Cornell של תרפיה גנית לטיפול ב-NCL אינפנטילי מאוחר תוך שימוש בנגיף Adeno שמוצאו בקוף rhesus macaque, והקרוי AAVrh.10 החל באוגוסט 2010, ונמצא הרבה יותר יעיל מבחינה קלינית ומאריך את ההישרדות.
אפידמיולוגיה
ייתכן שוני גדול בהופעת המחלה בין מדינות. בגרמניה מחקר אחד דיווח על 1.28 מקרים ל-100,000 (Claussen ב-Am J Med Genet משנת 1992). מחקר באיטליה דיווח על 0.56 מקרים ל-100,000 (Cardona ו-Rosati באותו כתב עת משנת 1995), ומחקר בנורווגיה דיווח על 3.9 מקרים ל-100,000 בין השנים 1978-1999, עם שכיחות נמוכה יותר בשנים הקודמות (Augestad ו-Flanders ב-J Child Neurol משנת 2006).
היסטוריה
המאה ה-19: המקרה הראשון של המחלה דווח ב-1826 על ידי החוקר הנורווגי Christian Stengel (Altia ב-Biochim Biophys Acta משנת 2006, Stengel ב-Eyr משנת 1826, ו-Brean ב-Tidsskr Nor Laegeforen משנת 2004), שתאר 4 ילדים חולים בכפר מכרות בנורבגיה. למרות שלא בוצעו כל מחקרים פתולוגיים בילדים אלה תיאורי המחלה הם כה משכנעים באופן שמחלת Sjogren מוצדקת לחלוטין. תצפיות יותר מבוססות דווחו על ידי Batten בשנת 1902 ב-Transac Ophthalmol Soc UK, ועל ידי Vogt ב-Monatsschrift für Psychiatrie und Neurologie משנת 1905). הם ביצעו מחקרים קליניקו-פתולוגיים במספר משפחות. יתרה מכך, Batten הדגיש שהמפגע שהוא תאר היה שונה ממחלת Tay-Sachs, שהוא אב-טיפוס של מפגע אגירה ליזוזומלי. באותה עת Walther Spielmeyer תאר בשנת 2007 שלושה מקרים עם צורת ה-juvenile. בשנת 1913 Max Bielschowsky תאר את הצורה האינפנטילית המאוחרת של NCL (Goebel וחב' ב-Brain Pathol משנת 1996). בשנת 1931 היה זה Torsten Sjögren הפסיכולוג והגנטיקאי השוודי שהציג 115 מקרים מבוססים היטב גנטית וקלינית עם המסקנה שצורת ה-juvenile שונה גנטית ממחלת Tay-Sachs.
תיאור שיטת הבדיקה
סוג הדגימה: טיפת דם יבשה. הנייר הסופג עליו יש ליבש את הטיפה הוא: PerkinElmer 226 filter paper ,Whatman Protein Saver 903 Paper ,Munktell filter paper. יש לשלוח למעבדה 2 טיפות מיובשות. יש לדקור את האצבע לתינוקות מעל גיל שנה, ולהטביע את האצבע על נייר הפילטר בטמפרטורת החדר ולהשאיר את הנייר לפחות למשך 3 שעות. אין לחשוף את הטיפה לחום או לקרני שמש. אין לערום ניירות פילטר עם טיפות דם לא מיובשות לחלוטין. יש לשמור על יובש נייר הפילטר. יש לפסול את הדגימה כאשר הטיפות היבשות מראות טבעות נסיוב או שהן רב-שכבתיות, או כאשר הטיפה המיובשת אינה שלמה, או כאשר הטיפה מיובשת על נייר לא מאושר.
דגימת טיפה מיובשת אחת מודגרת עם תערובת של המצע ושל internal standard עבור iduronate 2-sulfatase ,heparan N-sulfatase ,alpha-N-acetylglucosaminidase arylsulfatase B ,beta-galactosidase ,beta-glucoronidase כמו גם tripeptidyl peptidase 1. טיפה מיובשת אחרת מודגרת עם מצע ו-internal standard עבור acetyl-CoA:alpha-glucosaminide N-acetyltransferase, וטיפה מיובשת שלישית מודגרת עם מצע ו-internal standard עבור palmitoyl-protein thioesterase 1. לאחר הדגרה של 12 שעות, הדגימות מאוחדות, עוברות מיצוי ואנליזה על ידי tandem mass spectrometry או (LC-MS/MS). לבידוד אופטימלי של לויקוציטים מומלץ שהדגימה תגיע למעבדה מקוררת תוך 6 ימים מנטילת הדם. את הדם יש ליטול במבחנה כימית (פקק צהוב) או במבחנת ספירת-דם (EDTA, פקק סגלגל). יש לשלוח למעבדה את הדם במבחנה המקורית ללא aliquoting.
ראו גם
המידע שבדף זה נכתב על ידי פרופ' בן-עמי סלע, המכון לכימיה פתולוגית, מרכז רפואי שיבא, תל-שומר;
החוג לגנטיקה מולקולארית וביוכימיה, פקולטה לרפואה, אוניברסיטת תל-אביב (יוצר הערך)
