כניסה 
עקבו אחרינו בפייסבוק הבדלים בין גרסאות בדף "Iduronate-2-sulfatase"
בן עמי סלע (שיחה | תרומות) |
|||
| שורה 5: | שורה 5: | ||
|תמונה= | |תמונה= | ||
|כיתוב תמונה= | |כיתוב תמונה= | ||
| − | |מעבדה= | + | |מעבדה=גנטיקה/[[כימיה בדם]] |
|תחום=אבחון [[תסמונת Hunter]] | |תחום=אבחון [[תסמונת Hunter]] | ||
|יחידות מדידה= | |יחידות מדידה= | ||
גרסה מ־05:36, 7 בדצמבר 2015
| מדריך בדיקות מעבדה | |
| Iduronate-2-sulfatase | |
|---|---|
| שמות אחרים | Alpha-L-Idopyranosyluronic Acid 2-Sulfate Sulfahydrolase; I2S; IDS |
| מעבדה | גנטיקה/כימיה בדם |
| תחום | אבחון תסמונת Hunter |
 | |
| טווח ערכים תקין | מעל 1.5 nmol/h/ml |
| יוצר הערך | פרופ' בן עמי סלע |
מטרת הבדיקה
אבחון של מחלתHunte r או mucopolysaccharidosis II תוך שימוש בדגימות דם מיובשות על נייר סופג, או בדגימות פלזמה.
תסמונת Hunter
תסמונת Hunter או mucopolysaccaridosis II וגם PMP II, היא מחלת אגירה ליזוזמאלית הנובעת ממוטציה בכרומוזום X, הגורמת לחסר האנזים iduronate-2-sulfatase או IDS. המוקופוליסכרידוזות הן משפחת מפגעים הנגרמים מחסר של כל אחד מהאנזימים הקשורים בביקוע הרב-שלבי של גליקוזאמינוגליקנים (GAGs) כמו dermatan sulfate, ,heparan sulfate keratan sulfate ו-chondroitin sulfate. הצטברות של GAGs (שבעבר כונו מוקופוליסכרידים) בליזוזומים פוגעת בתפקוד של תאים, רקמות ואיברים. MPS II נגרם על ידי חסר מלא או על ידי רמה מופחתת של האנזים IDS, מה שגורם למפגע של תסמונת Hunter.
המאפיינים הקליניים וחומרת התסמינים מראים שוֹנוּת ניכרת בטווח שבין מחלה חמורה ביותר, לבין צורה מתונה יותר של התסמונת, שמופיעה בדרך כלל בשלב מאוחר יותר בחיים, עם ביטוי קליני מתון יותר. כללית, התסמינים יכולים לכלול תווי פנים גסים, קומה נמוכה, טחול וכבד מוגדלים, קול צרוד, מפרקים מוקשחים, מחלת לב, ומעורבות נוירולוגית בולטת הקשורה לפיגור התפתחותי ואף נסיגה. כיוון שתסמונת Hunter קשורה לפגם בכרומוזום X, היא מופיעה כמעט באופן בלעדי בזכרים השכיחות מוערכת של מקרה אחד ל-120,000 לידות זכר, אם כי היו דיווחים גם על נשים נשאיות תסמוניות. החלופות הטיפוליות כוללות השתלת תאי גזע המאטו-פויאטיים או תרפיה המבוססת על עירוי אנזים ריקומביננטי.
התפקוד התקין של הגן IDS
גן זה מקודד לאנזים iduronate-2-sulfatase האחראי לפירוק מולקולות סוכריות פולימריות כגון GAGs. באופן ספציפי אנזים זה מבקע שייר סולפאט מהמולקולה הידועה כ-sulfated α-L-iduronic acid, המהווה מרכיב ב-2 מולקולות ה-GAG, הידועות כ-heparan sulfate ו-dermatan sulfate. מיקומו המדויק של הגן IDS הוא על הזרוע הארוכה של כרומוזום X בעמדה 28, בין bp 149,478,764 ל-bp 149,505,354.
אבחון המחלה
האנזים IDS פועל כ-exosulfatase בליזוזומים ומבצע הידרוליזה של הקשר האסטרי C2-sulfate, בקצה הלא-מחזר של שיירי iduronic acid בהפרן סופאט ובדרמטן סולפאט IDS הוא אחד מתוך משפחה של לפחות 9 סולפטאזות שמבקעות סולפאט-אסטרים בתאי אדם. חסר האנזים מביא להצטברות שני ה-GAGs האמורים, ולהפרשתם המשמעותית בשתן. מחלת Hunter הנגרמת כתוצאה מכך יכולה להופיע במגוון של חומרת התסמינים, זאת בגלל המגוון הגדול של מוטציות בגן IDS.
עד לפרסום של Stenson וחב' ב-Hum Mut משנת 2003 היה ידוע כבר על לפחות 309 מוטציות שונות בגן זה, מה שמסביר מגוון כה גדול בפנוטיפ הקליני של תסמונת Hunter. יחד עם זאת, מחקרים על הגנוטיפ/פנוטיפ לא סיפקו את המתאם הנדרש לנבא במדויק את חומרת התסמונת והתקדמותה בכל הלוקים בה (Froissart וחב' ב-Acta Paediatr Supple משנת 2002). בדרך כלל הצורה החמורה של התסמונת מתגלה בגיל 2-4 שנים, ויכולה להתבטא בפיגור התפתחותי מוטורי ונוירולוגי קשים, התנהגות חריגה ביותר, ומוות לפני הגעה לגיל בגרות. לעומת זאת, בלוקים בגרסת התסמונת המתונה, נשמרת רמת משכל תקינה, ואלה שורדים עם תוחלת חיים כמעט זהה לזו של אנשים בריאים (Young וחב' ב-J Med Genet משנת 1982). בשנת 1990 פרסמו Wilson וחב' ב-Proc Natl Acad Sci USA, על הבידוד והריצוף של cDNA שגודלו 2.3kb, וזיהוי 550 חומצות האמינו המופיעות באנזים IDS. אנליזה של רצץ חומצות האמינו מצאה בקצה ה-N טרמינאלי signal sequence של 25 חומצות אמינו, ולאחריו 8 חומצות אמינו המורחקות מהקודמן (precursor) של preproprotein.
ביקוע פרוטאוליטי מתרחש בכבד על מנת להביא ליצירת אנזיםIDS בּשל, בגודל של 42,000 דלטון. ראוי לציין שהרצף של החומצות אמינו ב-IDS, הוא בעל הומולוגיה ניכרת עם אנזימי sulfatase אחרים באדם, כגון סוגי A, B, ו-C של arylsulfatase, וכן glucosamine-6-sulfatase, מה שמרמז לכך שאנזימי sulfatase מהווים משפחת אנזימים קרובה אבולוציונית, שמקורה בגן קדמון ממנו היא התפלגה בתהליך של gene duplication. מחקרי המשך מצאו שאורכו של הגן IDS הוא כ-kb24, והוא מכיל תשעה exons ושמונה introns (על פי Flommen וחב' ב-Hum Mol Genet משנת 1993).
מוטציות בגן IDS
מחקרים מולקולאריים בשיטת Southern blotting, וריצוף של cDNA, הראו ספקטרום רחב של שינויים גנטיים החלים בגן IDS באדם (Hopwood וחב' ב-Hum Mutat משנת 1993, וכן Jonsson וחב' ב-Am J Hum Genet משנת 1995 ו-Rathmann וחב' ב-Am J Hum Genet משנת 1996). המסקנה הייתה שבחולי Hunter עם מוטציות חסר (deletions) כצפוי הופיע פנוטיפ המחלה הקשה, ואילו באלה עם מוטציות עם מוטציות נקודתיות התסמונת קלה יותר. מחקר של Li וחב' ב-J Med Genet משנת 1999, באנליזה הידועה כ-SSCP או single strand conformation polymorphism המלווה על ידי RT-PCR, לצורך גילוי מוטציות ב-cDNA של IDS, בחן 18 חולים בתסמונת Hunter ללא כל קרבה משפחתית.
מחקר זה גילה בנבדקים אלה 17 מוטציות שונות, שכללו 16 מוטציות "קלות" לפי הפירוט הבא: שבע מוטציות סלף (missence) הבאות: S71R, A82E, A85T, R88C, R468W, R468Q ו-E5231V; חמש מוטציות חסר (deletion) לפי הפירוט הבא: ΔR85, 383delAT, 596delAACA, 1148delC ו-1216delCT; שתי מוטציות החדרה (insertion) והן 208insC ו-1063insA; שתי מוטציות שׅחבּוּר (splicing) והן 1006+5g→c ו-1122→T באקסון 8; מוטציה אחת של חסר תוך-גני באקסונים 4, 5, 6 ו-7. מוטציית 596delAACA התגלתה בשני חולים שאינם קרובי משפחה. אנליזה של המוטציות A85T, R88C, R468Q, R468W ו-438C/T, לא מצאה כל פולימורפיזם לארבעת מוטציות הסלף, אך נמצאה 36% הטרוזיגוטיות של המוטציה השקטה 438C/T . תוצאות אלו מספקות עדות נוספת להטרוגניות במוטציות בגן של IDS.
גישות מעבדתיות לבחון תסמונת Hunter
הלוקים בתסמונת זו באופן אופייני מכילים בשתן שלהם כמויות מוגברות של GAGs ורמות מוגברות של dermatan sulfate ושל heparan sulfate. פעילות מופחתת או חסרה של IDS בפיברובלסטים, בלויקוציטים ו/או בנסיוב, יכולה לאשר אבחון של MPS II. יחד עם זאת, בחינה אנזימטית אינה אמינה על מנת לזהות נשאים של הפגם הזה. בחינה גנטית-מולקולארית של הגן IDS מאפשר זיהוי המוטציה הגורמת למחלה בנבדקים הפגועים, וכן זיהוי של נשאי המוטציה בקרב נשים הקרובות מדרגת קרבה ראשונה. עד כה לא נקבע קשר ברור בין הגנוטיפ והפנוטיפ בתסמונת זו.
יש לשים לב שרמת האנזים IDS יכולה להיות מופחתת גם בתסמונת הידועה כ- MSD או multiple sulfatase deficiency. אם אבחון זה הוא בעל סבירות גבוהה יש לשקול מבחן ביוכימי/גנטי של סולפטאזות נוספות, או לבצע מבחן גנטי-מולקולארי של הגן SUMF 1 על מנת לשלול MSD.
היסטוכימיה ומיקרוסקופיה
כמו במוקופוליסכרידוזות אחרות גם בתסמונת Hunter ניתן להשתמש בגישה היסטוכימית ובחינת תאים בהם יש הצטברות של ה-GAG הרלוונטי. באופן אופייני ניתן להבחין בווקואולות רבות בכל שטח התא. צביעת משטחים תאיים אלה עם ריאגנטים בעלי זיקה לשיירים חומציים כגון סולפאט (SO4-) או קרבוקסיל (-COO) המהווים מרכיבים של ה-GAGs השונים, מתקבל צביעה בצבע סגול בולט (מטאכרומזיה). שימוש במיקרוסקופ אלקטרוני מאפשר לראות בבירור את הווקואולות הגדולות שאינן אלא ליזוזומים תפוחים מאוד המכילים חומר אמורפי מגורגר האופייני לאגירת פוליסכרידים שונים (Neufeld ו-Munenzer ב-Metabolic & Basis of Inherited Diseases משנת 2001).
שיטות אבחון שונות של אגירת MPS II
כאשר מתעורר חשד לתסמונת Hunter ניתן בשלב הראשון לנסות ולאתר הפרשת MPS II בשתן, זאת על ידי כרומטוגרפיה על רובד דק (TLC) של צלולוז-אצטאט וצביעת הפלטות בהשלמת ההרצה עם הריאגנט Alcian Blue. ההפרדה אינה אידיאלית במובן שקשה להשיג הפרדה טובה בין ה-GAGs האחרים לבין MPS II.
מקובל יותר לבצע אבחון אנזימטי בתמצית של לויקוציטים, לאחר בידודם מהדם המלא. ניתן לבצע בדיקה אנזימטית גם בתרבית תאים, כגון תרבית של פיברובלסטים, תאים שמבודדים מהנוזל האמניוטי לאחר איסוף מי שפיר, או שמבצעים בדיקה אנזימטית זו בחומר של סיסי-שליה (chorionic villi). בדיקה אנזימטית בתאי מי השפיר או בסיסי שליה, מאפשרים לגלות עובר פגוע בבדיקה טרום לידתית, במשפחה עם היסטוריה של ילדים קודמים עם תסמונת Hunter.
המבדק הפלואורימטרי האנזימטי לקביעת פעילות IDS
בשנת 2001 תיארו Voznyi וחב' ב- J Inherit Metab Dis, שיטה פלואורומטרית לקביעת פעילות האנזים. הם סנתזו מצע ספציפי, 4-methylumbelliferyl-α-iduronate 2-sulphate, כדי שישמש למדידת פעילות iduronate-2-sulphate sulphatase הליזוזומאלי. המבדק נעשה בפיברובלסטים, לויקוציטים ובפלזמה שמקורם בחולים שונים המאובחנים עם MPS, ובכל הדגימות האלה נמצאו ערכי פעילות אנזים שהיו נמוכים מ-5% מפעילות האנזים בקבוצת ביקורת.
האבחון של עוברים בסכנה של MPS II בשבוע ה-12-14 של ההיריון, נוסה כבר מסוף שנות ה-60 על ידי מדידת ההצטברות של 35S-mucopolysaccharide בנוזל מי שפיר בתרבית, על ידי Fratantoni וחב' ב-N Eng J Med משנת 1969, ו-Kleijer וחב' ב-Clin Genet משנת 1979). לאחר מכן בוצע אבחון זה על ידי אלקטרופורזה דו-ממדית של GAGs בנוזל מי-שפיר על ידי Mossman ו-Patrick ב-Prenat Diagn משנת 1982, ו-Kleijer וחב' ב-Lancet משנת 1984). בשנת 1979 פרסם Hopwood על הכנת מצע חדש למדידת פעילות האנזים IDS מדובר במצע רדיואקטיבי שהוכן מ-dermatan sulfate והוא 4-O-alfa-L-iduronosyl-D-[3H] anhydromannitol 6-sulfate. אך השיטה הרדיואקטיבית היא בעלת מספר שלבים ומסורבלת יחסית לביצוע, וכן אינה ידידותית לסביבה.
בשנת 2002 דיווחו Kuelemans וחב' ב-Prenat Diagn על שימוש במצע שסנתזו חוקרים אלה קודם לכן, ומדובר ב-4-methylumbelliferyl-alpha-iduronate 2-sulphate המתאים לאנזים IDS, ובעזרתו הם בחנו 174 עוברים שהיו בסכנה ל-MPS II. מתוכם אובחנו 27 עוברים זכרים עם רמה נמוכה ביותר של IDS. בשנת 2006 פרסמו Dean וחב' ב-Clin Chem שיטת מדידה של פעילות IDS הן בשיטת גילוי פעילות האנזים עם מצע ה-4-MU-sulfate וכן על ידי immunoassay. בשיטה האימונולוגית התאפשרה מדידת רמת האנזים בטיפות דם מיובשות ב-2 שלבים, על ידי שימוש בערכה של lanthanide fluorescent immunoassay של DELFIA®. בשיטה זו פלטות microtiter צופו עם נוגדן פוליקלונלי ממקור עז המכוון כנגד IDS. לאחר שטיפות בבופר מתאים, מונחות פיסות הנייר המכיל דם מיובש על גבי בארות הפלטה, לתקופת הדגרה, ולאחר שטיפות נוספות מוסף לבארות נוגדן פןליקלונלי שני המכוון כנגד האנזים IDS אליו קשור היסוד europium מממשפחת הלנטנידים המשמש בגלל ה-phosphorescence שלו שניתן לכימות על ידי DELFIA 1234 fluorometer.
התרשימים למטה מדגימים את תוצאות 2 הגישות של מדידת IDS במחקר של Dean וחב'.
רמת האנזים IDS המבוססת על ריכוזו כחלבון (A) או על פעילותו (B) בטיפות דם של חולים עם MPS II ובאנשים בריאים. (לקוח מ-Dean וחב' ב-Clinical Chemistry משנת 2006). 2202006 2006).
רמת האנזים IDS המבוססת על ריכוזו כחלבון (A) או על פעילותו (B) בדגימות פלזמה בחולים עם MPS II ובאנשים בריאים. (לקוח מ-Dean וחב' ב-Clinical Chemistry משנת 2006).
הוראות לביצוע הבדיקה
הבדיקה יכולה להתבצע בגרסה של טיפת דם מלא המיובש על גבי נייר Guthrie, או על דם מלא הנלקח במבחנה. בשיטת טיפת הדם המיובשת ניתן להשתמש גם בנייר סופג מסוג Whatman Protein Saver 903 Paper, אך ניתן גם להשתמש ב- Ahlstrom 226 filter paperאו ב-Munktell Blood Spot Collection Card (T493). יש לשלוח לפחות 2 טיפות דם מיובשות. חלופת נטילת דם לתינוק מתחת לגיל 1 שנה, היא על ידי שימוש בדוקרן לקבלת מספר טיפות דם מהאצבע.
לאחר האפליקציה של הדם המלא על נייר הבדיקה בטמפרטורת החדר, יש להשאיר את טופס הנייר למשך 3 שעות בעמדה מאוזנת. אין לחשוף את נייר הבדיקה עם הדם המיובש לחום או לקרני שמש ישירות. יש לשמור את טופס נייר הבדיקה במקום יבש בטמפרטורת החדר רצוי במעטפה אטומה עד המשלוח למעבדה. רצוי שהאפליקציה של הדם על נייר הבדיקה תיעשה באופן מלא ורציף, ואין להוסיף טיפת דם נוספת על גבי טיפה שהוספה קודם לכן כדי למנוע מספר שכבות דם שבאות לביטוי בצורת "טבעות" דם נראות לעין. דגימות דם מלא בצורת טיפות מיובשות יציבות בתנאי חושך וטמפרטורת החדר עד 3 חודשים.
אפשרות נוספת היא ביצוע הבדיקה בדם מלא. יש להעדיף נטילת דם במבחנת ספירת-דם (EDTA, פקק סגלגל), אך ניתן גם להשתמש במבחנה כימית (פקק אדום או צהוב). אין לפסול דגימות המוליטיות, ליפמיות ואיקטריות. הדם צריך להישלח למעבדה בקירור (יציב בטמפרטורה זו משך 7 ימים). הבדיקה מתבצעת בשיטה אנזימטית פלואורומטרית; שיטה אחרת היא זו של Tandem Mass Spectrometry על פי Wang וחב' ב-Clinical Chemistry משנת 2007.
ראו גם