נוגדנים כנגד הזרעונים - Anti sperm antibodies

הדפס

מדריך בדיקות מעבדה
נוגדנים כנגד הזרעונים
Anti sperm antibodies
מעבדה	פוריות הגבר.
תחום	מדידת רמות נוגדנים כנגד תאי זרע לבירור אי-פוריות גברית.
יוצר הערך	פרופ' בן-עמי סלע

נוגדנים ונוגדנים עצמיים התגלו בסוף המאה ה-19 על ידי שלושה חתני פרס נובל: אלי מצ'ניקוב, פאול אהרליך וקארל לנדשטיינר. נוגדנים כנגד הזרעון (anti-sperm antibodies (להלן ASA) התגלו בגברים לא-פוריים בראשית שנת 1954 על ידי Wilson שדווח על כך באותה שנה ב-Proceedings of the Society of Medicine Experimenal Biology & שהם אימונוגלובולינים המכוונים כנגד אנטיגנים על פני שטח הפנים של הזרעון (Vazquez-Levin וחב' ב-Am J Reprod Immunol משנת 2014, Mazumdar ו-Levine ב-Fertil Steril משנת 1998, ו-Restrepo ו-Cardona-maya ב-Actas Urol Esp משנת 2013). תאי זרע בשלים ממוקמים באופן נורמלי מאחורי מחסום דם-אשכים, ולפיכך הם אינם חשופים למערכת החיסון הזכרית. כאשר נפרץ המחסום דם-אשכים, או ניזוק כתוצאה מפציעה או מחלה, ייחשפו תאי הנבט הבוגרים נושאי האנטיגנים לפעילות מערכת החיסון מה שעלול להביא להתפתחות ASA (Kaur וחב' ב-Semin Cell Dev Biol משנת 2014).

אף על פי שלא כל ASA פוגעים בתפקוד הזרעונים, הם עלולים לשנות את תנועת הזרעונים, את פעילות ה-acrosome, את האִפְשׁוּר (capacitation) של הזרעונים, ואת יכולת ההפריה שלהם (Francavilla וחב' ב-Front Biosci משנת 2007, ו-Lombardo וחב' ב-Hum Reprod Update משנת 2001). אי-פוריות אימונולוגית מאובחנת כאשר יש ראיות לתפקוד מופרע של הזרעונים כתוצאה מפעילות ASA (מסמך של WHO במהדורה VI שפורסם בז'נבה בשנת 2021). עם זאת, האינדיקציות לבדיקת ASA אינן חדות והמשמעות הקלינית של גילוי ASA בנסיוב, עדיין אינה מוחלטת. שכיחות רבה של ASA דווחה בגברים א-פוריים (3.9 – 15.6%) (על פי Sinisi וחב' ב-Int J Androl משנת 1993, Tuttelmann ו-Nieschlag ב-Male Reprod Health dysfunction משנת 2010, Bozhedomov וחב' ב-J Reprod Immunol משנת 2015, Yasin וחב' ב-J Clin Diagn Res משנת 2016, והנחיות החברה האורולוגית האירופית משנת 2021). אחוזים אלה גבוהים משמעותית מאלה של שכיחות ASA בגברים פוריים (0.9 – 2.5%) (על פי Heidenreich וחב' ב-Am J Reprod Immunol משנת 1994). עם זאת, מחקר עדכני שכלל למעלה מ-10,000 גברים מזוגות עם בעיות פוריות, השכיחות של ASA לא הייתה גבוהה כמצופה, והוערכה כבין 2 – 4% (על פי Barbonetti וחב' ב-Hum Reprod משנת 2019). אך הבדל זה נובע מערך הסף השונה להגדרת החיוביות של מבחן ASA.

השכיחות הנמוכה יחסית של ASA הביאה את האגודה האמריקנית לרפואת הפריון (ASRM) את החברה האורולוגית האמריקנית (AUA) ואת החברה האורולוגית האירופית (EUA) לא לאשר את בדיקת ASA כבדיקת קו-ראשון להערכת אי-פוריות גברית (Schlegel וחב' ב-Fertil Steril משנת 2021). רק 4.7% (25 מתוך 572 מהמרפאות והמעבדות בעלות אקרדיזציה של הקולג' הפתולוגי האמריקני (ACP) עורכות בדיקות ASA ברחבי ארצות הברית.

מחקר עדכני בדק את השימוש של מדידת חלבון על ידי biochip לקביעת ריכוז ASA בנסיוב. בטכניקה זו, שכיחות גבוהה יותר של ASA (20.9%) דווחה בלמעלה מ-300 גברים בלתי פוריים בהשוואה ל-2% של שכיחות ASA בגברים פוריים (Su וחב' ב-Biosci Rep משנת 2020). עם זאת, המשמעות הקלינית של השכיחות הגבוהה של ASA צריכה להיבחן. האימונוגלובולינים IgA ו-IgG שמוצאים לעיתים תכופות בנוזל הזרע, עלולים להפריע לתנועתיות של הזרעונים (Cui וחב' ב-Clin Chim Acta משנת 2015). נוגדני האימונוגלובולין IgM מופיעים רק לעיתים נדירות בגלל גודלם, ומוצאים אותם בעיקר בפאזה החריפה של זיהום באשכים. בנוסף, בזוגות העוברים פרוצדורה של הזרקת זרע ציטופלזמית (שהיא הליך המבוצע במסגרת הפריה חוץ גופית, בה מוזרק תא זרע יחיד ישירות לציטופלזמה של הביצית). בשיטת זו מוותרים על הפריה טבעית של הביצית ומבצעים אותה ידנית. ההיריון האנושי הראשון שנוצר בעזרת הזרקת זרע ציטופלזמטית בוצע בשנת 1991 על ידי ג'יאנפיירו פלרמו וצוותו, אך בדיקת ASA במקרה זה אינה מומלצת (Zini וחב' ב-J Reprod Immunol משנת 2011).

גורמים להופעת נוגדנים אנטי-זרעונים ואי-פוריות גברית אימונולוגית

תאי Sertoli אחראיים ליצירת מחסום דם-אשכים שהוא מחסום פיזי בין כלי הדם לבין האבוביות נושאות הזרע ((seminiferous tubules שהם צינוריות זעירות ומפותלות בתוך האשכים בהן מיוצרים תאי הזרע. מחסום זה מונע את התפתחות הזרעונים מתאי הנבט בכך שהוא מחלק את האפיתל הסמיניפרוסי לשני חלקים, בזלי ואפיקלי (או אדלומינלי). תאי הנבט ממוקמים בחלק האפיקלי של האפיתל הסמיניפרוסי מוגנים באופן פיזיולוגי מפני חשיפה למערכת החיסון. בהתאם, זרעונים בשלים מוגנים מפני זיהוי על ידי מערכת החיסון. לפיכך, תגובה אוטו-אימונית כנגד הזרעונים, עלולים להתרחש רק לאחר פגיעה באשכים או באפידידימוס המאפשר חשיפה של הזרעונים למערכת החיסון. טראומה ניתוחית לאשכים או לשק האשכים במהלך ,vasectomy תסביב אשך (testicular torsion) (שהוא סיבוב פתאומי של חבל הזרע ( (spermatic cord) אשר מספק דם לאשך, מה שגורם לירידה באספקת הדם לאשך, שעלול לאבד את חיותו), סרטן האשכים, אשכים טמירים, או מצבים של דלקת אורו-גניטלית או varicocele (דליות האשך שהן הרחבה פתולוגית של הוורידים המנקזים את האשך). ב-90% מהמקרים ההרחבה נמצאת באשך השמאלי הנמוש כגוש רך, נכרכו מצבים שלASA (Bonyadi וחב' ב-J Reprod Infertil משנת 2013, Hellema וחב' ב-Clin Exp Immunol משנת 1979, Mahmoud וחב' ב-Andrologia משנת 1996, Kosar וחב' ב-Eur Urol משנת 1999, Hobarth וחב' ב-Urol Int משנת 1994, Sinisi וחב' ב-J Urol משנת 1998, Domagala וחב' ב-Arch Androl משנת 2006).

גם חסימה בצינור הזרע obstructive azospermia) ) כרוכה בחוזקה עם ASA (Lee וחב' ב-J Urol משנת 2009) ואכן ASA מופיע ב-70-100% מהגברים לאחר ניתוח קשירת צינורות הזרע (vasectomy) (Parslow וחב' ב-Am J Reprod Immunol משנת 1983). נמצא שאחדים מבין הזיהומים הבקטריאליים הכרוניים עלולים להיות מלווים על ידי ASA. לדוגמה, גברים עם prostatitis כרונית מפתחים ASA פי-3 יותר מאשר גברים ללא זיהום זה (Jiang וחב' ב-J Reprod Immunol משנת 2016, ו-Condorelli וחב' ב-J Endocrinol Invest משנת 2017). הוצע, ש-ASA יכול להיווצר במהלך ריאקציות אימוניות כנגד אנטיגנים חיצוניים של חיידקים, נגיפים, פטריות או אלרגנים (Kalaydjiev וחב' ב-Andrologia משנת 2007, Thaper ו-Prabha ב-Scand J Immunol משנת 2018, ו-Dimitrova-Dikanarova וחב' ב-Biotechnol Equip משנת 2017). מחקר עדכני אחד הראה שזיהום עם נגיף פפילומה אנושי(HPV) בגברים כרוך בסיכון גדול יותר לפתח ASA (Piroozmand וחב' ב-J Reprod Infertil משנת 2020). ייאמר עם זאת שברבים מהמקרים של גילוי ASA הגורם אינו ברור.

בדיקת ASA בנוזל הזרע:

הוריות לביצוע בדיקת ASA במקרים של אי-פוריות גברית, מבוססות בדרך כלל על ההיסטוריה של המטופל וממצאים שגרתיים באנליזה של נוזל הזרע. מספר פרמטרים בנוזל הזרע יכולים להצביע על נוכחות .ASA אגלוטינציה של זרעונים הוא אינדיקטור חשוב לביצוע מדידת ASA, גם אם הקשר בין אגלוטינציה של זרעונים ומציאת ASA אינו חזק, שהרי אגלוטינציה זו יכולה להתרחש מסיבות שאינן נוכחות נוגדנים לזרעונים (Dimitrov וחב' ב-J Reprod Immunol משנת 1994). מחקר שהתבצע עם 195 גברים עם ASA בנוזל הזרע שלהם, בחן את הקשר בין אגלוטינציה של זרעונים ו-ASA (Veron וחב' ב- Am J Reprod Immunol משנת 2016). נמצא שלמעלה משליש ממשתתפי המחקר הכילו ASA בנוזל הזרע, בהשוואה לפחות מ-3% מבין הנבדקים ללא אגלוטינציה של זרעונים. הנוכחות של ASA כרוכה משמעותית עם ירידה במספר תאי הזרע, עם תנועתם ועם החיוניות שלהם, וכמו שנמצא במטה-אנליזה, ירידה באיכות הזרע ((asthenozoospermia מהווה אינדיקציה למדידת ASA. לעומת זאת, מחקר אחר עם מדגם גדול של נבדקים עם ASA, קבע שתנועתיות הזרעונים אינה כרוכה בנוכחות של IgA, ולכן לא ברור האם מדידת ASA צריכה להתבצע בכל המקרים של asthenozoospermia. מספר מחקרים קבעו שמדידת ASA צריכה להישקל רק במקרים של asthenozoospermia בהם יש אגלוטינציה של תאי זרע וריכוז נורמלי של תאים אלה (Schlegel וחב' בהנחיות של ה-AUA משנת 2020).

שיטות לקביעת ASA בנוזל הזרע:

ASA בנוזל הזרע שייך באופן בלעדי לשני איזוטיפים אימונוגלובוליניים: IgA ו-IgG. נוגדנים מסוג IgA הם כנראה בעלי חשיבות קלינית גדולה יותר מזו של ,IgG אך למעלה מ-95% מהמקרים עם נוגדני IgA בנוזל הזרע, הם גם חיוביים ל-IgG. ASA יכולה להימדד בשיטה ישירה או בלתי-ישירה: שתי בדיקות ישירות מגלות ASA על פני הזרעונים. הריאקציה האנטי-גלובולינית המעורבת (להלן MAR) מבוצעת על דגימת נוזל זרע טרי ואלו בדיקת ה-immunobead עושה שימוש בזרעונים שטופים. בבדיקות הישירות, הדגימה עוברת הדגרה עם חלקיקי latex מצופים עם נוגדנים anti-human. אם בדגימה יש נוכחות של ASA הנוגדנים anti-human שעל פני ה-beads ייקשרו לנוגדנים על פני הזרעונים, ובבחינה מיקרוסקופית זרעונים נעים יראו מכוסים עם אותם beads. בהתבסס על נוגדני anti-human הקשורים ל-beads, מתאפשר לחקור באופן סלקטיבי את הנוכחות של IgA או של IgG עם אנטי-סרום ספציפי לכל נוגדן. האחוזים של זרעונים בעלי כושר תנועה עם ה-beads הספוחים עליהם, נספרים. בדיקות ישירות אלו מספקים מידע על הנוכחות של האימוגלובולינים, על סוג הנוגדנים ועל המיקום הספציפי שלהם על ראש הזרעון, על חלקו המרכזי או על זנב הזרעון, או אולי על כל שלושת חלקי הזרעון. חלק מהנוזל הסמינלי מודגר עם ביקורת נורמלית (שנמצאה קודם לכן שלילית למציאות נוגדנים), בדיקות ישירות תלויות בנוכחות של זרעונים הנמצאים בתנועה, ולכן במקרים של מספר לא מתאים של זרעונים נעים (פחות מ-100 בשדה המיקרוסקופ), יש לבצע בדיקות בלתי ישירות. הבדיקה הבלתי ישירה מתבצעת על מנת למדוד אימונוגלובולינים ספציפיים לזרעון בנוזלים נטולי זרעונים כגון פלזמה סמינלית או נסיוב שעבר אינאקטיבציה בחימום, או ריר אגני מומס, הבדיקה הבלתי-ישירה עושה שימוש בנוזל החשוד שעובר הדגרה עם זרע חופשי מ-ASA של תורם בריא שעבר שטיפה להתנקות מהנוזל הסמינלי המקורי. יש להמתין פרק זמן לאפשר אינטראקציה בין הזרעונים לבין הנוגדן, אף על פי שהתלות בתנועתיות של הזרעון, עלולה להפריע בדיוק הבדיקה. כאשר דגימת הנבדק מעוטת זרעונים או כאשר היא אסתנוזואוספרמית, במקרים של חסימת זרע, או כאשר אין אפשרות לבדיקה מיידית של הדגימה, הבדיקה הלא-ישירה יכולה להתבצע ונוזל הזרע יכול להיות מוקפא ולהישמר בהקפאה עד ביצוע הבדיקה.

תיאור גרפי של זרעונים העוברים אגלוטינציה עם חלקיקי latex בבדיקת ה-immunobeads.

בדיקת MAR ישירה ל-IgA:

לאחר ההמסה, ריכוז הזרעונים בדגימת נוזל זרע טרייה ותנועתיותם מחושבים. ניתן להשתמש בערכת SpermMar של חברת FertiPro מבלגיה: חלקיקי latex מפוליסטירן בקוטר של 2 מיקרון, המצופים עם נוגדנים חד-שבטיים כנגד IgA אנושי נשמרים בתמיסה בקירור. דגימה טרייה של 10 ממ"ק של נוזל זרע מונחת על פני זכוכית נושא, ועליה מטפטפים 10 ממ"ק של חלקיקי IgA . מערבבים את חלקיקי IgA עם הנסיוב של הנבדק ועל תערובת טיפתית זו מניחים זכוכית מכסה, ומניחים את זכוכית הנושא בתוך תא לחות למשך 3 דקות, לפני הבדיקה במיקרוסקום פאזות בהגדלת אובייקטיב של 40X עם פילטר ירוק. מונים 200 זרעונים נעים ואת האחוז של הזרעונים הנעים הקשורים ל-beads. על פי הקריטריונים של WHO משנת 2010, ערך הרפרנס לבדיקת ASA חיובית הוא 50% של IgG ו-IgA. קישור חלקיקים לזנב הזרעונים אינו כרוך באי-פוריות וניתן למצוא כמותו בגברים פוריים. יתרה מכך הנחיות WHO הן שכל מעבדה תגדיר את תחומי הנורמה שלה, על ידי מדידה של מספר מספיק גדול של גברים נורמליים מבחינת פוריותם. עם זאת, היצרן של ערכת SpermMar ממליץ שהאבחנה האימונולוגית של אי-פוריות היא כאשר 40% או יותר מהזרעונים נקשרים לחלקיקי ה- latex, בעוד שפחות מ-40% מדווחים כתוצאה שלילית שאינה מצביעה על אי-פוריות.

בדיקת MAR ישירה ל-IgG:

בדיקה זו מתבצעת בדרך דומה לזו של IgA. פרט לריאגנטים השונים המשמשים. לבדיקת IgG, יש 2 תמיסות שונות של SpermMar של חלקיקי IgG latex, ו-SpermMar anti-serum, שהוא אנטי-סרום מונו-ספציפי המכוון כנגד המקטע Fc של IgG אנושי. לצורך של בדיקה פנימית של המעבדה, הערכה של בדיקת Mar מכילה גם דגימות ביקורת חיוביות ושליליות של SpermMar IgG. אלה מורכבות מדגימת נסוב של הנבדק מהולות במדיום Ferticult Flushing ללא אלבומין של נסיוב אדם (נפח של 2.5 מ"ל). הרטיאגנטים, והביקורות החיוביות והשליליות חייבות להיות מובאות לטמפרטורת החדר, או להיות מאוחסנות בקירור אם לא עושים בהן שימוש מיידי.