כניסה 
עקבו אחרינו בפייסבוק אלו-איזולאוצין - Alloisoleucine
| מדריך בדיקות מעבדה | |
| אלו-איזולאוצין | |
|---|---|
| alloisoleucine | |
| שמות אחרים | Allo-isoleucine, allo-ile. |
| מעבדה | כימיה בדם וכימיה בשתן |
| תחום | בדיקה לזיהוי MSUD |
 | |
| יוצר הערך | פרופ' בן-עמי סלע |
מטרת הבדיקה
הערכה של דגימות סקר יילודים החיוביות עלייה ברמת חומצות אמינו מסועפות (branched chain) וניטור של מטופלים עם מחלת סירופ מייפל (להלן Maple Syrup Urine Disease או MSUD.
הקשר בין MSUD לבין alloisoleucine
מחלת סירופ מייפל היא מחלה תורשתית רצסיבית קשה שסימניה הם הידרדרות נוירולוגית, חמצת מטבולית ושתן בעל ריח דמוי סירופ מייפל, או חילבה. חומצות אמינו מסועפות שרשרת מכילות שייר צד אליפטי מסועף (אטום פחמן הקשור ליותר משני אטומי פחמן). שלוש מבין חומצות האמינו לאוצין, איזולאוצין וואלין, הן בין 8 חומצות האמינו החיוניות לאדם שאותן הגוף לא מסוגל לסנתז בעצמו והן מושגות על ידי פירוק חלבונים מהמזון דוגמת חלב, בשר וביצים. מחלה זו נגרמת מפגם גנטי בקומפלקס חלבונים המפרקים חומצות α-keto מסועפות שרשרת (Branched-chain alpha-ketoacid dehydrogenase complex או BCKDC). כאשר קומפלקס מפרקי חומצות -α קטו מסועפות שרשרת לא מתפקד או מתפקד באופן פגום, הן עלולות להצטבר באופן רעיל בדם ובשתן. שכיחותה של מחלה זו היא 1 מתוך 100,000 לידות-חי, אך היא שכיחה יותר ביהודים, מנוניטים וכת האמיש, בין היתר בגלל founder effect. שכיחות המוטציה הנבדקת היא 1:113 ביהודים ממוצא אשכנזי. הידרדרות במצב התינוק יכולה להתרחש כבר בימים הראשונים עקב דיאטה שגויה, הזנה בחלב אם או בתרכובת מזון לתינוקות. במקרים של הזנה שגויה מצטברות בגוף התינוק חומצות מסועפות שרשרת, שגופו אינו מסוגל לפרק. ללא טיפול, התינוקות מתים כבר בגיל חודש. סימני המחלה: הקאות, חוסר רצון לאכול, עייפות, פרכוסים, תרדמת ומוות.
אף על פי שכל חומצות האמינו מלבד גליצרין, מכילות מרכז של α-פחמן כירלי, רק איזולאוצין וטראונין מכילות גם מרכז של β פחמן כירלי באותה מידה. במצב של תנאי מטבוליזם נורמלי, (+)α-keto-β-methylvaleric acid (להלן KMV) עובר דה-קרבוקסילציה חמצונית, ואינו מצטבר בפלזמה (Dancis וחב' ב-The Metab Basis Inherit dis משנת 1978). ב-MSUD שלב הדה-קרבוקסילציה נחסם, ורמת KMV ברקמות ובפלזמה מוגברת ביותר. בתנאים אלה, הוצע שהאנוליזציה של KMV (+) יוצרת KMV (-) כאשר האחרון עובר בדיעבד רה-אמינציה ליצירת L-alloisileucine.
בשנת 1970, Halpern ו-Pollock פרסמו ב-Biochem Med ששימוש בקולונת גז כרומטוגרפיה קפילרית הביא אותם למסקנה ש-L-alloisoleucine ולא צורת ה-D נמצאים בפלזמה של מטופל עם MSUD. מבין ארבעת הסטריאו-איזומרים האפשריים של איזולאוצין, L ו-D איזולאוצין, כמו גם L ו-D אלוֹ-איזולאוצין, הסטריאו-איזומר היחיד המופיע באופן נורמלי בדם הוא L-isoleucine. אך כאשר הריכוז של L-isoleucine בפלזמה מוגבר באופן ניכר כמו ב-MSUD, ניתן לזהות בפלזמה גם את L-alloisoleucine (Snyderman וחב' ב-Pediatrics משנת 1964). חומצת אמינו זו, שבעבר טעו וסברו שהיא מייצגת מתיונין כיוון ששתי חומצות אמינו אלו יוצאות ביחד בהפרדה בקולונה של מחליף-יונים (Westall וחב' ב-Am J Pediar משנת 1957), זוהתה לראשונה באופן חיובי כ-alloisoleucine על ידי Norten וחב' ב-Lancet משנת 1962). שנתיים לאחר מכן, אותה קבוצת חוקרים סיפקה ראייה לא ישירה שרק ,L-allisoleucine ולא D-alloisoleucine מופיע בפלזמה של חולי MSUD, שם הוא נוצר בדרך הבאה:
בשנת 1977, Jacobs וחב' פרסמו ב-J Chromatog שעל ידי שימוש בגז-כרומטוגרפיה קפילרית הם זיהו כמויות כמעט שוות של (+)- ושל (-)-KMV בשלושה מטופלים עם MSUD. חוקרים אלה סיפקו ראייה תאורטית בדבר היצירה האנדוגנית של L-alloisoleucine ב-MSUD, אך אימות ישיר של המנגנון בתרשים שלמעלה נותר עדיין ספקולטיבי. Matthews וחב' פרסמו ב-Pediatr Res משנת 1980 הוכחה חזקה שאכן יצירת L-alloisoleucine ב-MSUD מתרחשת דרך טאוטומריזציה של שייר keto-enol של KMV. הוכחה זו הושגה על ידי עירוי של שני מטופלים עם MSUD עם L-[N15] leucine, ומדידה לאחר מכן של האינקורפורציה של N15 לתוך איזולאוצין ו-alloisoleucine בפלזמה. תוצאות מחקר זה במבוגרים, בילדים בתינוקות ובמטופלים ללא MSUD, אישרה תוצאות מחקרים קודמים לפיהן alloisoleucine הוא מרכיב שכיח בפלזמה של חולי MSUD (Schdewaldt וחב' ב-J Inherit Metab Dis משנת 1990, ו-Schadewaldt וחב' ב-J Chromatog B משנת 1996). אך ריכוזי alloisoleucine נמוכים מדי כדי שניתן יהיה לזהותם באנליזה שגרתית באנלייזר של חומצות אמינו. תינוקות במחקר זה נמצאו בעלי רמות נמוכות משמעותית של alloisoleucine בפלזמה בהשוואה למבוגרים, זאת למרות הגברה של הריכוזים הממוצעים של חומצות אמינו מסועפות שרשרת אחרות. מסת השריר הנמוכה יחסית בילדים עם MSUD בהשוואה לזו של מבוגרים עם מחלה זו, יכולה לספק הסבר להבדלים אלה של alloisoleucine במסת השריר בין תינוקות למבוגרים. בסבירות גבוהה, alloisoleucine מיוצר כתוצר נלווה של פעילות isoleucine transaminase (Mamer ו-Reimer ב-J Biol Chem משנת 1992), והפעילות של ה-aminotransferase של חומצות אמינו מסועפות שרשרת באדם ממוקמת בעיקר ברקמת השריר (Suryawan וחב' ב-Am J Clin Nutr משנת 1998).
התוצאות בחולי סוכרת מראות שעליה מתונה בריכוז של חומצות אמינו מסועפות שרשרת, אינן מעלות כשלעצמן את ריכוזי alloisoleucine. בדומה, אמינו-אצידמיה חולפת של חומצות אמינו מסועפות שרשרת, יכולה להתרחש לדוגמה בתרחיש היפו-גליצמיה קטוטית ורעב, נראית לא כרוכה בעליה בריכוז של alloisoleucine (Hambraeus וחב' ב-Acta Pediatr Scand משנת 1972, Held וחב' ב-Monatsschr Kinderheilkd משנת 1976, Carlsten וחב' ב-Acta Med Scand משנת 1966, Felig וחב' ב-Diabetes משנת 1970, Abibi ב-J Appl Physiol משנת 1968, ו-Felig וחב' ב-J Clin Invest משנת 1969). באופן דומה, העלייה החולפת של בערך פי-2 בריכוז isoleucine בפלזמה, אינה משפיעה משמעותית על ריכוזי alloisoleucine. ההשפעה של עלייה ב-alloisoleucine הייתה קלה למרות עליה של פי-30 בשיא של איזולאוצין בפלזמה. ממצאים אלה מצביעים על כך שעלייה ברמת איזולאוצין בפלזמה ותרומת איזולאוצין בדיאטה שגרתית הם בעלי השפעה זעירה על רמות alloisoleucine בפלזמה בנבדקים בריאים. מלבד תסריט של מינון גבוה של איזולאוצין, לא נמצאו בפלזמה רמות alloisoleucine גדולות מ-5 מיקרומול/ליטר באנשים בריאים. לפיכך, הריכוז האחרון נלקח כערך cutoff טנטטיבי לצורך אנליזה רטרוספקטיבית במטופלים עם MSUD.
התובנה הכללית שנוכחות של alloisoleucine אופיינית למצב של MSUD (Bremer וחב' ב-Disturbances of Aminoacid Metab משנת 1981, ו-Gibson וחב' ב-Disorders of leucine Metab משנת 1996), למעשה לא הוערכה באופן כמותי. על פי הנתונים העכשוויים, ריכוזי alloisoleucine מתחת לערך ה-cutoff, נדירים ביותר ב-MSUD קלאסי, ומופיעים רק כאשר המטופל מצויים בדיאטה מוגבלת מדי. באופן כללי, alloisoleucine מוגבר מתקיים אפילו כאשר רמות איזולאוצין נמוכות ביותר (פחות מ-1 מיקרומול/ליטר). התרחיש האחרון אינו מצופה ב-MSUD, כיוון שהראו שרמת האחרון בפלזמה עולה תוך מספר שעות לאחר העמסת איזולאוצין, אך יורדת באיטיות תוך ימים או אף שבועות (Wendel וחב' ב-Pediatr Res משנת 1989, Snyderman וחב' ב-Pediatrics משנת 1964 ו-Schadewaldt וחב' ב-Pediatr Res משנת 1991). בשתי הדגימות (מתוך 2,453) בהן רמת alloisoleucine בפלזמה הייתה נמוכה מ-5 מיקרומול/ליטר, המטופלים היו תחת דיאטה מוגבלת ביותר, ואיזולאוצין היה למעשה חסר בפלזמה. בניסוי של Schadwaldt וחב' רמות מוגברות של alloisoleucine נמצאו ב-78% של אלה עם MSUD. באשר למשמעות של רמות מוגברות בפלזמה של חומצות אמינו מסועפות לצורך האבחון של MSUD, לאוצין, ואלין ואיזולאוצין אמורות להיות גבוהות מ-400, 600 ו-250 מיקרומול/ליטר, בהתאמה, כדי לאפשר אבחון מבדיל של הגברה ברמת חומצות אמינו אלו ב-MSUD, מהפרעות שניוניות הנגרמות למטבוליזם של חומצות אמינו מסועפות שרשרת המתרחשות בהיפוגליקמיה קטוטית.
בחולי MSUD קלאסיים, הסך הכללי של דגימות בהן ריכוזי חומצות האמינו המסועפות נמצאים מעל ערכי הסף שלמעלה, היה 43% עם לאוצין, 2% עם ואלין ו-20% עם איזולאצין, בהשוואה ליותר מ-99% של דגימות המראות רמות מוגברות של alloisoleucine. בווריאנטים של MSUD אחוזי הדגימות עם רמות מוגברות של חומצות אמינו מסועפות שרשרת היו 28% עם לאוצין, 3% עם ואלין, ו-14% עם איזולאוצין, בהשוואה ל-94% של alloisoleucine. הגברות סימולטניות של לאוצין, ואלין ואיזולאוצין, מעל ערכי הסף האמורים, נמצאו רק ב-2% מהדגימות של חולי MSUD קלאסיים, וב-3% מהדגימות של ווריאנטים של מחלה זו. כל הנתונים הללו מצביעים על alloisoleucine כסמן הרגיש והספציפי ביותר של MSUD קלאסי ובווריאנטים שלו, זאת אפילו באפיזודות של תסמינים קליניים מתונים, עוד לפני הופעת משבר מטבולי חמור. אך נתון חשוב נוסף הוא שמדידת alloisoleucine בפלזמה רגישה יותר מזו בשתן, זאת בגלל מגוון של הפרשות חומצת אמינו זו בשתן בגלל שינויים בהפרשתו בגלל תפקוד כלייתי משתנה (Schadewaldt וחב' ב-J Inher Metab Dis משנת 1999). כאשר מתבססים על ערכי cutoff של 5 מיקרומול/ליטר לאבחון של MSUD קלאסי או של ווריאנטים שלו, בהיעדר תסמינים קליניים, הערכת רגישות המדידה היא מעל 90%, ומעל 99%, בהתאמה. הרגישות של מדידה זו בנוכחות של תסמינים והספציפיות של הבדיקה מתקרבים ל-100%.
הפרדה וזיהוי של alloisoleucine
בשיטת הזיהוי לאחר הפרדה ניתן לזהות חומצות אמינו כואלין, iso-leucine ולאוצין. חומצות אמינו המסועפות שרשרת (להלן BCAA) עוברות מיצוי של טיפת דם מיובשת מכתם דם בממדים של 0.5 ס"מ, כאשר נוזל המיצוי הוא מים:מתנול ביחס של 1:1, הכולל גם את ה-internal standards. לאחר טלטול של נוזל המיצוי על פלטה אורבּיטלית למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, החומר מועבר לפלטת 96 בארות, ומיובש תחת חנקן, ולאחר מכן עוד המסה נוספת בפאזה המובּילית המימית. ה-BCAA מופרדות ומזוהות על ידי liquid chromatography-tandem mass spectrometry (להלן LC-MS/MS). הכרומטוגרפיה מתבצעת תוך שימוש בקולונת C18 (שממדיה 4.6X150 מ"מ) עם mobile phases של 0.1%formic acid:0.01% heptofluorobutyric acid:water, ו-0.1% formic acid:0.01% HFBA: acetonitrile. זמן האנליזה הכללי הוא 15 דקות כולל ה-re-equilbration של הקולונה (Oglesbee וחב' ב-Clin Chem משנת 2008, ו-Stroek וחב' ב-JIMD Rep משנת 2020).
סיבות לפסילת דגימות
טיפת דם יבש קטנה מדי; טיפת דם המורכבת ממספר שכבות; טיפה לא אחידה שנראות בה מספר טבעות. יציבות הדגימות: טיפת דם מיובש שמגיעה בטמפרטורת החדר (מועדפת), טיפת דם מגיעה בקירור, או טיפת דם המגיעה על כרטיס קפוא-כולן יציבות למשך 49 יום.
ראו גם
המידע שבדף זה נכתב על ידי פרופ' בן-עמי סלע, המכון לכימיה פתולוגית, מרכז רפואי שיבא, תל-שומר;
החוג לגנטיקה מולקולארית וביוכימיה, פקולטה לרפואה, אוניברסיטת תל-אביב (יוצר הערך)