כניסה 
עקבו אחרינו בפייסבוק בדיקת N-acetyl-aspartic acid בשתן
| מדריך בדיקות מעבדה | |
| בדיקת N-acetyl-aspartic acid בשתן | |
|---|---|
| שמות אחרים | NAA |
| |
| מעבדה | כימיה בשתן. |
| תחום | אבחון מחלת Canavan |
 | |
| טווח ערכים תקין | פחות מ-50 מילימול/מול קראטינין. |
| יוצר הערך | פרופ' בן-עמי סלע |
מטרת הבדיקה
אבחון וניטור חולים במחלת Canavan. מעקב כמותי של מוגברות של החומצה האורגנית N-acetylaspartic acid.
NAA היא נגזרת של חומצה אספרטית, עם נוסחה אמפירית של C6H9NO5 ומשקל מולקולרי של 5.14. NAA היא המולקולה השנייה במעלה כמולקולה המרוכזת ביותר במוח לאחר חומצת האמינו גלוטמאט. במוח הבוגר היא מתגלה בנוירונים (Simmons וחב' ב-Neuroscience משנת 1991), באוליגו-דנדרוציטים ובמיאלין (Nordengren וחב' ב-Brain Structure & Function משנת 2015), והיא מסונתזת במיטוכונדיה מחומצה אספרטית ו-acetyl-coenzyme A (Patel ו-Clark ב-Biohem J משנת 1979).
התפקוד של NAA
התפקודים המוצעים הראשוניים כוללים: שימושם כאוסמוליטים נוירונליים הכרוכים במאזן הנוזלים במוח. כמו כן NAA הוא מקור של אצטאט לסינתזה של ליפידים ושל מיאלין באוליגו-דנדרוציטים ובתאי glia האחראים למיאלינציה של האקסונים של הנוירונים. NAA משמש גם כקודמן עבור סינתזת N-Acetylaspartylglutamic acid שהוא דיפפטיד נוירונלי. בנוסף, NAA תורם ליצירת אנרגיה מחומצת האמינו גלוטמאט במיטוכונדריה של הנוירונים. במוח, NAA נמצא בעיקר בגופי התא הנוירונלי, שם הוא משמש סמן נוירונלי (Chatham ו-Blackband ב-ILAR Journal משנת 2001), אך הוא חופשי לעבור דיפוזיה דרך הסיבים הנוירונליים (Najac וחב' ב-Brain Structure & Function משנת 2014).
אפליקציות
הממצא העדכני של ריכוז גבוה יותר של MNAA במיאלין ובאוליגו-דנדרוציטים מאשר בנוירונים, מעלה את השאלה האם ראוי להשתמש ב-NAA כסמן נוירונלי. NAA נותן את הסיגנל הגדול ביותר בבדיקת magnetic resonance spectroscopy של מוח האדם. ריכוזי NAA הנמדדים במוח, פוחתים במספר מצבים נוירופתולוגיים החל מפגיעה מוחית וכלה בשבץ מוחי ובמחלת אלצהיימר. עובדה זו הופכת את NAA למולקולה בעלת פוטנציאל אבחוני בנבדקים עם נזק מוחי או עם מחלה מוחית. ריכוזים גבוהים של NAA בהיפוקמפוס כרוכים בשיפור ביצועי ה-working memory באדם (Kozlovskiy וחב' ב-Int J Psychol משנת 2012). רמות NAA במוח כולו נמצאו תואמים חיובית עם רכישת השכלה במבוגרים (Glodzik וחב' ב-Psychiat Res משנת 2012). NAA יכול לתפקד כנוירוטרנסמיטור במוח על ידי פעולתו על קולטני גלוטמאט מטבוטרופיים (Yan וחב' ב-Epilepsia משנת 2003).
למעשה, עם ריכוזי NAA ב-CNS בתחום של מילימולר, NAA הוא בין המטבוליטים האורגניים השכיחים ביותר במוחות יונקים והוא מייצג מטבוליזם סגמנטרי ביותר. NAA מיוצר בנוירונים על ידי N-acetyltransferase 8-like (להלן NAT8L) מחומצה אספרטית ו-acetyl-CoA, ועובר הידרוליזה לחומצה אספרטית ולאצטאט על ידי aspartoacylase (להלן ASPA) באוליגודרוציטים (Rae ב-Neurochem Res משנת 2014). ראיות קליניות מצביעות על כך ששינויים במטבוליזם של NAA אינם נסבלים. איבוד הפעילות של NAT8L מבטלת את הייצור של NAA והוא אחראי למפגע הנוירו-התפתחותי hypoacetylaspartia, המתבטא בפרכוסים, שיגשון (ataxia) ומיקרוצפליה (Martin וחב' ב-Ann Neurol משנת 2001). והיפוכו של דבר, חסר של קטבוליזם של NAA הנגרם על ידי מוטציות missense בגן ASPA גורם ל-leukodystrophy של מחלת Canavan, המאופיין על ידי הצטברות של NAA במוח, בדם ובשתן. מחלת Canavan היא מפגע נוירו-דגנרטיבי קטלני בו הנפגעים נכשלים להשיג מטרות התפתחותיות, ובאה לביטוי בפרכוסים, מאקרוצפליה, vacuolization נרחבת של ה-CNS והיפו-מיאלינציה (Kaul וחב' ב-Nat Genet משנת 1993, ו-Madhavarao וחב' ב-Proc Natl Acad Sci משנת 2005). בגלל חסר של חלופות תרפויטיות, נוסתה החדרה של הגן ASPA בחולי Canavan (ללLeone וחב' ב-Sci Transl med משנת 2012). הטיפול הקליני הניסויי תוך שימוש בווקטורים נגיפיים מהדור הראשון היה בטיחותי אך תוצאיו הריפויים היו שוליים. זמינות חלופות של תרפיה גנית בחולי Canavan, תוך שימוש בווקטורים של נגיף adeno עם יכולת לחצות את מחסום דם-מוח (BBB) שימשו בניסויים עם החדרת הגן ASPA (Simonato וחב' ב-Nat Rev Neurol משנת 2013). החדרת גן זה לתוך מוחות של עכברים יילודים מנע מחלת Canavan עד גיל 3 חודשים (Francis וחב' ב-Neurobiol Dis משנת 2016). יתרה מכך, יצירה של בולען אקטופי של NAA בנוירונים או באסטרוציטים תוך שימוש בווקטור adeno, נמצא יעיל במודל של מחלת Canavan בעכברים (Ahmed ב-Neurobiol Dis משנת 2013, ו-Gessler וחב' ב-JCI Insight משנת 2017). ב-CNS ביטוי יתר של ASPA באוליגודנדרוציטים שנוי במחלוקת, אם כי ביטוי יתר של גן זה בנוירונים ובתאי microglia דווח בחולדות (Cahoy וחב' ב-J Neurosci משנת 2008, Madhavarao וחב' ב-J Comp Meurol משנת 2004, ו־Moffett וחב' ב-Glia משנת 2004). הגן ASPA מבוטא בשפע באיברים היקפיים (Mersmann וחב' ב-PLoS One משנת 2011), ודיווח עדכני גילה מפגעים חיסוניים במודל Canavan של עכברים (Ahmed וחב' ב-Mol Ther משנת 2016), מה שמצביע על הבנה טובה יותר של התרומה של ASPA חוץ-מוחי הנדרשת לזהות את הרקמה החשובה לתרפיה. ניסויים של החדרה קדם-קלינית של גן זה, כמו גם ראיות מעכברי knockout כפול של Nat8l/Aspa, מספקות עדות לכך שהאטיולוגיה של מחלת Canavan נגרמת על ידי עודף NAA הגורם לטוקסיות, בעוד שתת-אספקה של אצטאט הנובע מ-NAA גורמת לתת-מיאלינציה (Guo וחב' ב-Ann Neurol משנת 2015, Mayer וחב' ב-J Neurosci משנת 2015, ו-Sohn וחב' באותו כתב עת משנת 2017). מחקרים אלה הראו שבהיעדר של ASPA, רמות NAA תואמות את החומרה של פתולוגיה במחלת Canavan. בצד האחר של הספקטרום, שימוש בעכברים המבטאים ביתר את Nat8l בוירונים, נמצא שרמות NAA מוגברות אינן נוירו-טוקסיות כשלעצמן. ממצאים אלה תורגמו קדם-קלינית על ידי החדרה בעזרת נגיף adeno של הגן ASPA מתוך התמקדות באוליגודנדרוציטים בעכברים עם תסמיני מחלת Canavan. טיפול זה גרם לרגרסיה כמעט מלאה של הפתולוגיה ב-CNS, ולשיפורים נוירולוגיים ונוירו-מטבוליים ארוכי טווח.
היסטולוגיה, אימונו-היסטוכימיה, Western blot ו-PCR
צביעות היסטוכימיות כגון Hematoxilin & Eosin, Cresyl Violet ו-Luxol Fast Blue בוצעו על מקטעים מטופלים עם פרפין ועברו דיגיטציה על ידי Mirax או על ידי Aperio כמתואר קודם לכן. גילוי בטכנולוגיה של אימונו-פלואורוצנטיות כמתואר, תוך שימוש בנוגדנים הבאים: rabbit anti-ASPA serum, כמו גם mouse anti-NeuN (Merck), וכן anti-MBP (Abcam), ובנוסף עם chicken anti-β-Gal (Abcam), וגם mouse anti-Flag ו-rabbit anti-Neurofilament 200 (Sigma), כאשר אלה מלווים על ידי נוגדנים שניוניים Alexa-488/594 conjugated של חברת Thermo-Fisher. שלב הזיהוי על ידי אימונו-פראוקסידאז בוצע על פי Chen וחב' ב-J Neurosci משנת 2013, תוך שימוש עם anti-APC של Merck), ועל ידי rabbit anti-NeuN, וכן נוגדן שעבר ביוטינילציה וערכה של Vectastain Elite (חברת Vector Labs). פעולת immunoblot בוצעה על פי Frohlich ב-Neurobiol Dis משנת 2017.
פרוצדורה של phenotyping של עכברים עם knockout כפול של Nat8l/Aspa מראה שהמחלה נמנעת אם NAA מבוטל. עם זאת, לצורך אישוש יותר מלא של הפוטנציאל התרגומי של תוצאות אלו הוחלט לחקור את התוצאות הנוירו-פיזיולוגיות של השמטת NAA. נעשה שימוש ב־flash visual evoked potentials (להלן fVEPs), טכניקה שהיא שימושית לצורך זיהוי של פגיעה בתפקוד של המערכת האופטית במצבים של היפו-מיאלינציה (Lehman ו-Harrison ב-Doc Ophthalmol משנת 2002). ההַשְׁהָיָה המשוחזרת של fVEP בעכברים עם knockout כפול אישרה מצב של מיאלינציה תקינה של עצב הראייה ושל המסלול האופטי. תוצאות אלו תומכות בנתונים ההיסטולוגיים והביוכימיים של מיאלינציה במערכת זו. ירידה במִשְׂרַעַת (אמפליטודה) של fVEP יכולה להיות מיוחסת לירידה במספר או ברגישות של נוירונים במסלול הרטינו-קורטיקלי, והוא מהווה אינדיקטור של הפגיעה הוויזואלית.
נחקרו גם תגובות גזע המוח (auditory brainstem responses או ABR) הידועות כבעלות השהיה קצרה של 5 מילי שניות בעכברי ביקורת. בעכברים שהם knockout ל-Aspa עם היפו-מיאלינציה לאורך מסלול השמיעה המרכזי נגרמים עיכובים משמעותיים ב-mid- to late-ABR waves. על מנת ללמוד עוד את עיבוד המידע הסנסורי-מוטורי לאורך ציר גזע המוח הפונטו-מדולרי לקראת הנוירונים המוטוריים, נבחנה התגובה האקוסטית הבהולה (ASR). עכברים נורמליים, ואלה שהם knockout לגבי מדד אחד או שניים, נמצאו בעלי רפלקס מופחת באופן ניכר, בהשוואה לעכברי-בר תקינים. בניגוד להיבטים אחרים של הפתולוגיה במחלת Canavan שעברו שיקום בעכברים עם knockout כפול, ה-ASR מחת באופן ניכר בעכברים עם knockout כפול. יתרה מכך, המספר וההופעה של נוירונים ענקיים בגרעין הרטיקולרי של ה-caudal pontine, המהווים חלק מתחנת המִמְסָר במסלול ה-ASR, אינם עוברים שינוי.
חסר של NAA גורם לתפקוד לקוי ב-CNS
מחקרים עדכניים הצביעו על כך ש-Nat8l יכול להיות מטרה תרפויטית לטיפול של מחלת Canavan. גישה זו החישה מחקר פרטני של התוצאות הכרוכות עם שינוי רמות Nat8l במערכת in vivo. כמצופה, נמצא שחסר Nat8l בעכברים טרנסגניים שהם Nat8l knockout או שהם Nat8l/Aspa double-knockout, גרם לחסר מוחלט של NAA ושל הנגזרת שלו N-Acetylaspartylglutamate (להלן NAAG). נתון זה מצביע על כך ש-NAA שיכול לתרום ל-osmoregulation, למיאלינציה ולהומאוסטאזיס של האנרגיה ושל pH במוח, אינו חיוני לתהליכים אלה (Singhal וחב' ב-Exp Brain Res משנת 2016, Schoenfeld וחב' ב-Mitochondrion משנת 2010, ו-Videen וחב' ב-J Clin Invest משנת 1995) ההפחתה המשמעותית בתגובה השמיעתית למרות התנהגות מוטורית תקינה, מצביעה על תפקיד אפשרי של NAA במסלולים הלימביים המגינים על הגוף מפני התקפים טורפניים או של טראומה פתאומית. ההגדלה ברמת אספרטאט נובעת מחסר של NAT8L על ידי הצטברות המצע. שינוי זה יכול להשפיע על ה-malate–aspartate shuttle מה שגורם לשינויים במיקום של גלוטמאט תת-תאי ובהומאוסטאזיס של האנרגיה הנוירונלית. למעשה, חסר של נשא נוירונלי של אספרטאט-גלוטמאט כרוך בהיפר-רפלקסיה (Wibom וחב' ב-N Eng J Med משנת 2009). בנוסף, אספרטאט יכול להשפיע על התפקוד המגרה של תאים GABA-ארגיים ולסייע להפרשת GABA דרך השפעול הסלקטיבי של קולטני NMDA (ללKubrusly וחב' ב-Neurochem Int משנת 1998).
ברוב גדול של מקרים, הופעת התסמינים הפתולוגיים מקדימה את האבחון. על ידי השגת ביטוי טרנסגני של SPA באוליגודנדרוציטים מעבר לגיל של 9 חודשים, הגורמים לנורמליזציה של ריכוזי NAA יכול שיפור בתסמיני Canavan. בעוד שתרפיה גנית הייתה יעילה ביותר במטופלי Canavan צעירים, הנתונים הקדם-קליניים מצביעים על נוכחות של חלון תרפויטי שעשוי להיות רלוונטי לניסויים קליניים בעתיד. התוצא התרפויטי המיטבי ישתפר כנראה על ידי שילוב של הזרקות תוך-פרנכימליות עם החדרה תוך-צרברו-וטיקולרית של ASPA לשיפור ביטויו של האחרון בגזע המוח הדורסלי ובחוט השדרה.
בהתבסס על היעדר של פנוטיפ מולקולרי או תאי בעכברים בהם הצטברות NAA מוגבלת באוליגודנדרוציטים בגין תפקוד נורמלי של ASPA, נחקר האם הגברת ריכוז NAA ב-CNS על ידי מחיקה של הגן ASPA באופן בלעדי באוליגונדנרוציטים מגרה פתולוגיה דמוית מחלת Canavan. כדי להתמודד עם בעיה זו פותחו עכברים עם חסר של הגן ASPA באופן בלעדי באוליגודנדרוציטים (Aspa ∆OL) על ידי הצלבה של עכברי knockout שהם 2′,3′-cyclic nucleotide 3′ phosphodiesterase (Cnp) Cre recombinase (להלן CNP-Cre) עם עכברים מוטנטים בהם ה-exon השני בגן Aspa היה מוקף על ידי loxP Cre binding sites (להלן Aspa fl/fl). בחינה היסטולוגית גילתה שהתגובה החיסונית כנגד Aspa הייתה אפסית במוח של עכברי Aspa ∆OL. אסטרוגליוזיס נרחבת אפילו ב-striatum, אזור במוח שאינו מושפע על ידי וקואוליזציה, נפגעה פתולוגית. אנליזה על ידי immunoblot מאשרת שחסר של Aspa באוליגודנדרוציטים בעכברי Aspa ∆OL ביטל את ביטוי Aspa במוח בה בשעה שהביטוי של Aspa באיברים היקפיים כולל הכליות, נותר ללא שינוי. רמת החלבון הבסיסי של מיאלין (MBP) נמצאה מופחתת בעכברי Aspa ∆OL, מה שמצביע על דה-מיאלינציה. כימות של המטבוליטים בגזע המוח של עכברי Aspa ∆OL הראתה עלייה בולטת של NAA, של myo-inositol ושל גלוטמין. היפו-מיאלינציה אושרה על ידי כמויות מופחתות של galactosylceramide בתמציות של המוח כמו גם צביעה מופחתת של מיאלין בחתכים היסטולוגיים. בתלמוס של עכברי Aspa ∆OL, אזור במוח עם וקואוליזציה בולטת, המספר של נוירונים ושל אוליגודנדרוציטים היה מופחת בהשוואה לעכברי Aspa fl/fl. בהשוואה לעברי AKO באותו גיל, עכברי Aspa ∆OL הראו באופן יחסי וקואוליזציה מתונה, אפילו בגיל 9 חודשים. עם זאת, לא נמצאה תמותה טרם-עת בגיל 3 שבועות, מה שמרמז לתפקיד של ASPA היקפי בהישרדות של עכברים צעירים. הפעילות המוטורית שנמדדה בגיל שבין 3 חודשים לשנה, השתבשה באופן פרוגרסיבי בעכברי Aspa ∆OL בהשוואה לביקורת. כמו כן, בהשוואה לעכברי AKO, החומרה של הפעילות המוטורית בעכברי Aspa ∆OL הייתה מתונה יותר עד גיל 6 חודשים, אך החמירה מאוחר יותר בעכברים אלה שלקו בשלב זה בשיתוקים ובפרכוסים.
בעכבר, שהוא יונק קצר-חיים, החדרה של הגן ASPA בתיווך נגיף אדנו הראתה הצלחה תרפויטית גדולה. אף על פי כן, פעילות חיסונית ומגבלות ביצועיות פוגעות בהחדרה הסיסטמית באמצעות נגיף אדנו של הגן המדובר לטיפול באדם במפגעים של ה-CNS בקליניקה.
החדרה מוחית ישירה של גן זה על ידי נגיף אדנו נמצאה בטיחותית, Aspa מבוטא באופן אקסקלוסיבי באוליגודנדרוציטים ותאים אלה נמצאים בשורשי הפתולוגיה של מחלת Canavan. הועלתה אז השערה שיעילות תרפויטית מושלמת וארוכת טווח תושג על ידי שחזור של ביטוי ASPA באוליגודנדרוציטים, התאים שמבטאים באופן את האנזים ב-CNS. בהסכמה עם השערה זו, החדרה לתוך הראש לנוירונים של ה-CNS של הגן ASPA על ידי נגיף אדנו הראתה יעילות מוגבלת (Klugmann וחב' ב-Mol Ther משנת 2005), אם כי מחקר עדכני של החדרת serotype על ידי נגיף אדנו לעכברים יילודים, המדביקה באופן מובהק אוליגודנדרוציטים, מנעה התפתחות של מחלת Canavan בעכברים מסוג ASPAnur7/nur7, לפחות עד גיל שלושה חודשים (Francis וחב' ב-Neurobiol Dis משנת 2016).
הוראות לביצוע הבדיקה
יש לאסוף 10 מ"ל של שתן אקראי ראשון של בוקר. אין להוסיף חומרים משמרים לשתן. היציבות של שתן ששהה בטמפרטורת החדר 14 יום; היציבות של שתן מקורר או מוקפא (מועדף) היא של 90 יום. שיטת הבדיקה היא Gas Chromatography Mass Spectrometry (GC-MS).
ראו גם
המידע שבדף זה נכתב על ידי פרופ' בן-עמי סלע, המכון לכימיה פתולוגית, מרכז רפואי שיבא, תל-שומר;
החוג לגנטיקה מולקולארית וביוכימיה, פקולטה לרפואה, אוניברסיטת תל-אביב (יוצר הערך)
